CN1795268A - 使用单个抗原特异性b淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法以及单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用单个抗原特异性B淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法和单克隆抗体的制备方法。制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法包含：选择1个与某种抗原特异性反应的B淋巴细胞(抗原特异性B淋巴细胞)，对所选择的抗原特异性B淋巴细胞进行培养，使培养增殖的抗原特异性B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。使用由该方法制备的杂交瘤制备单克隆抗体。
Description
技术领域
本发明涉及使用单个抗原特异性B淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法以及单克隆抗体的制备方法。
背景技术
一直以来，为了制备单克隆抗体，要制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤。以往的杂交瘤的制备方法中，在制备杂交瘤后，要对产生抗原特异性抗体的杂交瘤克隆进行筛选。但是，杂交瘤的制备并不能高效地进行。也就是说，不是所有的B淋巴细胞都可生成杂交瘤，仅是与骨髓瘤发生细胞融合的B淋巴细胞的一部分生成杂交瘤。另外，即使使用通过抗原刺激的脾细胞制备杂交瘤，也不是只得到产生抗原特异性抗体的杂交瘤，所得杂交瘤的大部分都是生产无关的抗体，而不生产所需抗体本身。
例如，根据以往的方法来发现生产目标抗体的杂交瘤时，要使用从免疫小鼠中挑取的脾细胞，与骨髓瘤进行细胞融合，铺10片左右的96孔板。也可以使用全部细胞铺更多的板，但一个人进行筛选时有时间的限制，余下的要通过冷冻等保存。由该方法通常有约500个孔的杂交瘤可增殖。
但是，来自500个孔的杂交瘤并不是完全以相同的速度进行增殖，有增殖快的，也有增殖慢的。因此无法同时检查全部500个杂交瘤的增殖。首先要在显微镜下检查哪一个孔的细胞增殖了，还要检查是否增殖到适合检查抗体的细胞数。在此基础上还要由适当的孔中采集细胞上清，检查是否生产了抗原特异性抗体。所述细胞的检查和细胞上清的检查必须尽快地进行。这是由于杂交瘤不断增殖，如果放置不管，则过度增殖，培养基的营养状态恶化，发生死亡。因此必须在所需杂交瘤死亡之前结束筛选。
另外，如果发现了目标杂交瘤进行了增殖的孔时，该孔通常除产生目标抗体的杂交瘤之外，还常有产生其他抗体的杂交瘤增殖。还有，杂交瘤是一边缺失杂交瘤自身的染色体一边进行增殖，因此产生了抗体的杂交瘤由于丧失抗体的染色体而可能不再制备抗体。这样的细胞的增殖通常大多比产生抗体的杂交瘤还快，放置不管，则培养的大部分细胞都是不产生抗体的细胞。因此如果发现了所需杂交瘤增殖的孔，必须立即将该孔的细胞以一个孔中一个细胞地重新铺于96孔板中(有限稀释法)，再次重新筛选产生所需抗体的杂交瘤(二次筛选)。检出目标杂交瘤后，必须迅速地、在状态没有恶化之前结束二次筛选。
如上所述，由于不会对所有制备的杂交瘤进行筛选，而只使用一部分进行筛选，因此对于出现率低的产生抗原特异性抗体的杂交瘤则难以获得。
更具体地说，当为人的抗原特异性抗体时，有用EB病毒转化末梢血B淋巴细胞，形成细胞株，然后对生产抗原特异性抗体的细胞进行筛选的方法(淋巴球机能检索法(修订5版)矢田纯一、藤原道夫编著、中外医学社、1994年；“EB病毒转化B细胞在人单克隆抗体制备中的应用”水野文雄、大里外誉郎、381-391页)。该方法中，可建立的淋巴细胞细胞株的出现率低，因此可得到产生抗原特异性抗体的B淋巴细胞株的概率非常低。另外，细胞株的建立需要花费1个月左右的时间。并且所建立的B淋巴细胞细胞株所生产的抗体量少。采用小鼠时，可以制备杂交瘤，但为人时，尚未制成高效的杂交瘤体系。
为小鼠时可以制备杂交瘤。以往，杂交瘤的制备采用以下方法：用抗原免疫小鼠，由该小鼠摘取脾脏或淋巴结，制备淋巴细胞，用聚乙二醇或者施加电压，使制备的约108个淋巴细胞与约107个骨髓瘤细胞融合，在HAT等选择培养基上培养，使用ELISA、流式细胞仪等，对增殖的杂交瘤是否生产了特异性抗体进行筛选，选择产生抗原特异性抗体的杂交瘤(淋巴球机能检索法(修订5版)矢田纯一、藤原道夫编著、中外医学社、1994年；“通过B细胞杂交瘤进行的单克隆抗体的制备方法”成内秀夫、574-576页；“Monoclnal antibodies in”Antibodies：A Laboratory Manual”、Harlow和David Lane编著，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，139-244页，1988)。通过采用该方法，可以有300-400孔增殖杂交瘤，但其中生产抗原特异性抗体得杂交瘤发生增殖的孔数为几个百分比。该数目随所使用的抗原而不同，但当产生抗原特异性抗体的B淋巴细胞的出现率低时，难以通过该方法制备杂交瘤。
因此，本发明的目的在于提供不管是出现率较高的抗原特异性淋巴细胞，还是出现率低的抗原特异性淋巴细胞，都可简便地选择与特定抗原特异性反应的淋巴细胞，由该选择的抗原特异性B淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法。
本发明还提供由所制备的产生抗原特异性抗体的杂交瘤制备单克隆抗体的方法。
发明内容
本发明涉及制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法，该方法包含：选择单个与某种抗原特异性反应的B淋巴细胞(以下成为抗原特异性B淋巴细胞)，对所选择的抗原特异性B淋巴细胞进行培养，使培养增殖的抗原特异性B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。
上述制备方法中，上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在抗CD40抗体或CD40配体(CD40L)以及包括白细胞介素4(IL-4)的白细胞介素共存下进行；
上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在可使B淋巴细胞增殖的促细胞分裂原(例如LPS等)共存下进行；或
上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在抗CD40抗体或CD40L以及包含IL-4的白细胞介素和促细胞分裂原(例如LPS等)共存下进行；
上述单个抗原特异性淋巴细胞的选择使用流式细胞仪或微孔板阵列芯片进行；
上述单个抗原特异性淋巴细胞的选择如下进行：向抗原特异性淋巴细胞检测用微孔板阵列芯片的各微孔中添加抗原，然后检出与抗原反应的淋巴细胞，从微孔中挑取检出的抗原特异性淋巴细胞，其中上述微孔板阵列芯片中具有多个含单个受检淋巴细胞的微孔；以及
抗原特异性淋巴细胞的出现率可为0.1％或以下。
本发明还涉及使用由上述本发明的方法制备的杂交瘤制备单克隆抗体的方法。
附图简述
图1是通过使用Ca离子依赖性荧光染料来测定细胞内Ca离子的浓度变化的方法说明图。
图2是使用荧光染料的方法中，对于向微孔板阵列芯片进行细胞分注、抗原刺激、挑取操作的说明图。
图3是通过ELISA测定OVA免疫的小鼠血清中抗OVA抗体的结果。
图4是通过ELISA测定用本发明的方法建立的产生OVA特异性抗体的杂交瘤培养上清中的抗体的结果。
实施发明的最佳方案
血液中的淋巴细胞每一个分别与抗原反应。因此，本发明中，检测与抗原特异性反应的B淋巴细胞，由该B淋巴细胞制备杂交瘤。
以往的杂交瘤制备中，由免疫小鼠制备的脾细胞不经任何处理，直接与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤，生产抗原特异性抗体，或者在杂交瘤增殖之后开始研究。与此相对，本发明的方法中，首先检测并采集制备抗原特异性抗体的B淋巴细胞，使用所采集的抗原特异性B淋巴细胞制备杂交瘤。
[抗原特异性淋巴细胞的选择]
单个抗原特异性淋巴细胞的选择，例如可使用流式细胞仪或者微孔板阵列芯片进行。
使用流式细胞仪进行的单个抗原特异性淋巴细胞的选择可通过常规方法进行。
使用微孔板阵列芯片的方法例如可如下进行：例如向抗原特异性淋巴细胞检测用微孔板阵列芯片的各微孔中添加抗原，然后检出与抗原反应的淋巴细胞，从微孔中挑取检出的抗原特异性淋巴细胞，由此得到单个抗原特异性淋巴细胞，其中上述微孔板阵列芯片中具有多个含有单个受检淋巴细胞的微孔。以下对该方法进行更具体的说明。
(微孔板阵列芯片)
微孔板阵列芯片可使用具有多个微孔、且各微孔可含有1个受检淋巴细胞的产品。各微孔含有1个受检淋巴细胞，则可以在细胞水平确定抗原特异性淋巴细胞。即，使用该微孔板阵列芯片，则微孔中含有的受检淋巴细胞为1个，因此可以将与抗原反应的受检淋巴细胞确定为1个细胞，结果，可以检出作为单个细胞的抗原特异性淋巴细胞。然后挑取所检出的1个抗原特异性淋巴细胞，用于制备杂交瘤。
不过，同一微孔中，受检淋巴细胞外的细胞可以与受检淋巴细同时存在。这是因为淋巴细胞以外的细胞不与抗原反应，也不会被检出。
微孔的形状、尺寸没有特别限制，微孔的形状例如可以是圆筒形，除圆筒形外，也可以是长方体、倒圆锥形等。另外，圆筒形微孔的尺寸例如直径可为5-100μm、优选5-15μm，深度为5-100μm、优选5-30μm。
一个微孔板阵列芯片所具有的微孔的数并没有特别限定，抗原特异性淋巴细胞的出现率为每105个中有1个或以上时可以有约500个微孔，从该角度考虑，例如可以是1cm2有2,000-100,000个微孔的范围。
微孔中，受检淋巴细胞与培养液一起存放。培养液例如可以为以下。
1.137mM NaCl、2.7mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、1mg/ml葡萄糖、1mg/ml BSA、20mM HEPES(pH7.4)
2.含10％FCS(胎牛血清)的PRMI 1640 MEM培养基
3.含1mg/ml BSA的PRMI 1640 MEM培养基
4.含10％FCS(胎牛血清)的Dulbecco’s培养基
5.含1mg/ml BSA的Dulbecco’s培养基
受检淋巴细胞可以来自血液，例如可以是B淋巴细胞或T淋巴细胞。除此之外还可以来自扁桃腺(淋巴结)、脾脏等淋巴组织的淋巴细胞、癌浸润淋巴细胞等病变部位浸润淋巴细胞等。
(抗原特异性淋巴细胞的检测方法)
抗原特异性淋巴细胞的检测方法包含向上述微孔板阵列芯片的各个微孔中添加抗原，刺激细胞，检出与抗原反应的细胞。
向各微孔添加抗原可如下进行。
1.用移液管添加抗原液，以覆盖整个微孔板阵列芯片。
2.用自动点样仪向每一个孔添加抗原液。
由该方法检测的抗原没有特别限定，例如可以是蛋白质、肽、DNA、RNA、脂质或糖链等。另外，抗原可以是细菌、病毒、自主抗原、癌抗原或变应原等。
细胞的培养例如可如下进行：将淋巴细胞悬浮于培养液，分注孔中，然后在室温或37℃、在空气中或CO2培养箱内进行培养。
与抗原反应的细胞的检出可如下进行。
例如，抗原与B淋巴细胞的抗原受体(免疫球蛋白)结合，则首先发生细胞内信号传导，接着细胞增殖，生成抗体。因此，通过各种方法探测细胞内信号传导、细胞增殖、抗体生成，这样可以检测与抗原反应的细胞。
通过检测细胞内信号传导而检测与抗原反应的细胞，这例如可通过使用Ca离子依赖性荧光染料检测细胞内Ca离子的浓度变化来进行。
细胞内Ca离子浓度变化的检测使用Fura-2、Fluo-3或Fluo-4作为荧光染料，使用荧光显微镜或微阵列扫描仪作为检测装置进行。
具体来说，如图1所示，向B淋巴细胞中导入Ca离子依赖性荧光染料Fura-2、Fluo-3或Fluo-4。接着用抗原刺激B淋巴细胞，则细胞内Ca离子浓度上升。结果，Ca离子与Ca离子依赖性荧光染料结合，荧光强度得到增强。Ca离子浓度低，则显示发蓝的颜色，浓度高则显示发红的颜色。该方法中，可使用微孔板阵列芯片来检出B淋巴细胞(抗原特异性)，其中所述B淋巴细胞中因抗原刺激而使得Ca离子浓度上升。
通过检测细胞增殖来检出与抗原反应的细胞，这例如可通过使用活细胞特异性荧光染料测定细胞数来进行。其具体方法是：用抗原刺激B淋巴细胞，在37℃、在CO2培养箱内培养3天，细胞增殖。细胞增殖后，向培养液中加入二乙酸荧光素(FDA)或羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)溶液。这些试剂透过活细胞膜，在细胞内被酯酶分解，生成膜不透过性的荧光染料。该荧光染料的发光与细胞数成比例，因此，通过使用荧光显微镜或微阵列扫描仪测定孔内活细胞发出的荧光强度的和，可以测定活细胞数量。
通过测定抗体生成，可以检测与抗原反应的细胞。抗体生成可通过免疫化学方法测定抗体来检测。
具体来说，用抗原刺激B淋巴细胞，在37℃、在CO2培养箱内培养1周，则抗体分泌到培养液中。通过ELISA法(酶标免疫吸附法)检测分泌到培养液中的抗原特异性抗体。
该检测方法中，可以使用促细胞分裂原、凝集素、抗体、细胞因子、PMA、Ca离子载体，也可以检测信号传导、细胞增殖、抗体生成。
以下参照图2，对使用荧光染料的方法中向微孔板阵列芯片进行细胞分注、抗原刺激、挑取的操作进行说明。
(1)细胞的分注
向每一个孔中注入细胞。
向孔中注入的细胞可如下获得：经由抗原免疫的小鼠脾脏、淋巴结中分离淋巴细胞组分，然后进一步分离纯化B淋巴细胞组分。
接着使细胞悬浮于Fluo3/AM(2μM)溶液中，在室温下放置30分钟，再用缓冲液漂洗细胞，除去细胞内不能负载的染料。
然后将该细胞分注到微孔中。
芯片的两侧贴上塑料片，在其上放置盖玻片，注满缓冲液以防干燥。
(2)荧光测定
首先测定未刺激的细胞的荧光。测定此时的荧光强度(A)。
接着将抗原溶液流入载玻片和盖玻片之间的空隙，与缓冲液交换，测定经抗原刺激的细胞的荧光。测定刺激1-2分钟后的荧光强度(B)。选择刺激前后的荧光强度比值(B/A)高的孔的细胞。
(3)与抗原刺激发生反应的细胞的挑取
向载玻片和盖玻片之间的空隙通入空气，这样盖玻片容易剥离。通过未刺激的细胞的荧光强度和经抗原刺激的细胞的荧光强度比(B/A)，选择与抗原刺激发生反应的细胞并挑取。
[杂交瘤的制备]
本发明的方法中，培养所选择的单个抗原特异性B淋巴细胞，使培养增殖的抗原特异性B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。只由单个B淋巴细胞制备杂交瘤，这事实上是困难的。因此，首先培养单个抗原特异性B淋巴细胞，使其增殖。抗原特异性B淋巴细胞的培养例如可以在抗CD40抗体或CD40配体(CD40L)以及包括白细胞介素4(IL-4)的白细胞介素共存下进行。该方法中，通过CD40和IL-4的刺激，抗原特异性B淋巴细胞增殖。其增殖方法本身是公知的(Banchereau J，de Paoli P，Valle A，Garcia E，Rousset F.Long-termhuman Bcell lines dependent on interleukin-4 and antibody to CD40.Science 251：70-72，1991)。但是，尚没有采用该方法制备杂交瘤的先例。
B淋巴细胞的培养可以是在可使B淋巴细胞增殖的促细胞分裂原(例如脂多糖(LPS)等)共存下进行，或者在抗CD40抗体或CD40配体(CD40L)以及包括白细胞介素4(IL-4)的白细胞介素和LPS共存下进行。诱导B细胞的增殖的物质除LPS以外，例如还有PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)、Ca离子载体、抗免疫球蛋白抗体等。
使用用LPS等促细胞分裂原刺激的B淋巴细胞制备杂交瘤，这是公知的(例如参照(1)Van Snick JL，Coulie P，Monoclonal anti-IgGautoantibodies derived from lipopolysaccharide-activated spleen cells of129/SV mice.Journal of experimental Medicine，155：219-230.1982.(2)Lange M，Le Guern C，Cazenave PA，Covalent coupling of antigens tochemically activated lipopolisaccharide：a tool for in vivo and in vitrospecific B cell stimulation.Journal of Immunological Methods，63：123-131，1983)。但是还没有使单个抗原特异性B淋巴细胞增殖，应用于制备杂交瘤的例子。
抗原特异性B淋巴细胞的培养可具体如下进行。
1.将由微孔回收的抗原特异性B淋巴细胞转移到预先铺有抗CD40抗体或CD40配体(CD40L)的96孔板的孔中。该孔中还预先装有含200μl白细胞介素4(IL-4)的细胞培养液(含10％FCS的RPMI1640培养基)。
2.将96孔板转移至CO2培养箱(5％CO2)，在37℃进行1周-10天的细胞培养。
3.由孔中回收根据CD40和IL-4的信号而增殖的B淋巴细胞，按照常规方法，使其与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。
4.要加入CD40和IL-4信号时，可预先将因导入了CD40L和IL-4基因而产生CD40L和IL-4的贴壁细胞在96孔板的孔中培养，以取代使用可溶性的抗CD40抗体或CD40L，然后再培养回收的抗原特异性B淋巴细胞。
5.除IL-4之外，还可以加入IL-2、IL-5、IL-6等。
本发明的杂交瘤的制备方法中，向微孔板阵列芯片中加入经由抗原免疫的小鼠制备的淋巴细胞，施加抗原刺激，由此，首先进行抗原特异性B淋巴细胞的鉴定。将经过该鉴定的单个抗原特异性B淋巴细胞进行增殖，用于制备杂交瘤。由此可以预想：增殖并生产抗体的杂交瘤的大部分可生产抗原特异性抗体。使用微孔板阵列芯片的抗原特异性B淋巴细胞的检测方法可以检测出出现率低的抗原特异性B淋巴细胞，因此可以生产以往难以制备的产生抗原特异性抗体的杂交瘤。
以往的杂交瘤的制备方法中需要花费人工和时间，但通过使用微孔板阵列芯片，可以在短时间内进行抗原特异性B淋巴细胞的检测，因此可以节约人工和时间。
实施例
以下通过实施例更进一步详细说明本发明。
1.淋巴细胞的分离
从经抗原免疫的小鼠脾脏和淋巴结中分离淋巴细胞组分，再使用AutoMACS(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)进一步由淋巴细胞组分中分离纯化B淋巴细胞组分。
2.将Fluo3导入细胞(参照图1)
将2×106个B淋巴细胞悬浮于2μM Fluo3/AM(同仁、熊本)/加样缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、1mg/ml葡萄糖、1mg/ml BSA、20mM HEPES(pH7.4))，在室温下培养30分钟。用加样缓冲液漂洗细胞，除去未导入细胞内的Fluo3/AM。然后将细胞悬浮于PRMI 1640/10％FCS溶液。
3.微孔板阵列芯片(参照图2)
微孔板阵列芯片使用聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)或有机硅制作，在2cm×2cm的芯片上以纵、横30μm的间隔(微孔的中心到中心的距离为40μm)设置直径10μm、深度20μm的微孔。芯片的两侧贴有厚度为1mm、宽度约1mm、长度2cm的片。
4.微阵列扫描仪
主体装置基本上采用日立ソフトエンジニアリング(横滨市)的微阵列扫描仪(CRBIO IIe)，做以下变动。将内置激光器(Cy3用，532nm；Cy5用，635nm)中的一套(Cy5用，635nm)换为473nm的激光器。
5.使用微孔板阵列芯片检测活性B淋巴细胞(参照图2)
向上述微孔板阵列芯片中添加上述细胞悬浮液，静置5分钟。用PRMI 1640/10％FCS溶液冲洗掉未进入微孔的细胞。淋巴细胞的直径约为10μm，而所使用的微孔的直径为10μm，因此，一个微孔中装入1个淋巴细胞。将盖玻片置于上述片材上，芯片和盖玻片之间充满PRMI1640/10％FCS溶液。将该微孔板阵列芯片插入微阵列扫描仪，以2.5μm分辨率进行扫描，保存数据(抗原刺激前的荧光数据：A)。
接着，除去芯片和盖玻片之间的PRMI 1640/10％FCS溶液，向其中加入溶解于PRMI 1640/10％FCS溶液中的抗原(10μg/mL)。加入抗原1分钟后，将微孔板阵列芯片插入微阵列扫描仪，以2.5μm分辨率进行扫描，保存数据(抗原刺激后的荧光数据：B)。
计算刺激前后的荧光强度比(B/A)，确定比值大的孔。该孔中存在抗原特异性B淋巴细胞。
6.由微孔中分取细胞
使用显微操作器，通过使用毛细管，在显微镜下分取细胞。
7.杂交瘤的制备方法
1)在96孔板的孔中加入10μg/mL抗CD40抗体(eBioscience公司制造)，温育过夜，使抗CD40抗体铺于孔中。将分离的细胞加到预先加入96孔板的孔中的培养基(含10％FCS的PRMI 1640、100U/ml重组IL-4(eBioscience公司制造))中，在37℃、5％CO2存在下培养约1周至10天。
2)将细胞由孔中回收，转移至Eppendorf管中。向其中加入约200个小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653)，以2000转离心2分钟。
3)不要将细胞沉淀打散，小心地去除上清，加入1ml PRMI 1640培养基(不含FCS)，使细胞悬浮，以2000转离心2分钟。
4)不要将细胞沉淀打散，小心地去除上清，再以2000转离心10秒钟。
5)不要将细胞沉淀打散，小心地完全去除上清。
6)加入20μl 30％聚乙二醇(Sigma)，轻轻搅拌细胞。
7)以2000转离心5分钟。加入500μl PRMI 1640培养基(不含FCS)，使细胞悬浮。接着添加500μl含20％FCS PRMI 1640培养基，使细胞悬浮。
8)以2000转离心5分钟后，除去上清，将细胞悬浮于1ml含20％FCS的HAT选择培养基中。再加入20ml含20％FCS的HAT选择培养基，分别取2ml添加到24孔板的孔中。
HAT选择培养基：PRMI 1640、1×10-4M次黄嘌呤、4×10-7M氨基蝶呤、1.6×10-5M胸苷
9)在37℃、5％CO2存在下培养约7-8天。
10)光学显微镜下观察杂交瘤的增殖，用ELISA法等检测培养上清中的抗体。
8.杂交瘤的制备方法(其它方法)
1)将B淋巴细胞用含有[50,000个经放射线照射(50Gy)的EL4细胞、500U/mL人IL-2、5ng/mL PMA、PWM刺激的人T细胞的培养上清(5％v/v)]的含10％FCS PRMI 1640培养基(200μL/孔)培养1周(37℃、5％CO2)。
2)去除100μl培养上清后，向其中加入10,000个经放射线照射(50Gy)的、表达CD40配体的贴壁细胞和5ng/mL人IL-4，用含有[500U/mL人IL-2、5ng/mL PMA、PWM刺激的人T细胞的培养上清(5％v/v)]的含10％FCS PRMI 1640培养基(200μL/孔)培养1周(37℃、5％CO2)。
3)去除100μl培养上清后，向其中加入10,000个经放射线照射(50Gy)的、表达CD40配体的贴壁细胞，用含有[5ng/mL人IL-4，500U/mL人IL-2、5ng/mL PMA、PWM刺激的人T细胞的培养上清(5％v/v)]的含10％FCS PRMI 1640培养基(200μL/孔)培养1周(37℃、5％CO2)。
以下，重复与上述“7.杂交瘤的制备方法”中的2)-10)的操作同样的操作，检测杂交瘤。
(产生抗OVA抗体的杂交瘤的制备)
以下例举产生抗OVA抗体的杂交瘤的制备例子。
免疫
将10μg卵清蛋白(OVA)与完全弗氏佐剂混合，将其注入BALB/c小鼠皮下。2周后，将10μgOVA与不完全弗氏佐剂混合，将其注入同一只小鼠皮下。再过2周后，将10μgOVA与不完全弗氏佐剂混合，将其注入该小鼠皮下。然后采集小鼠血清，用ELISA，根据以下的方法检查是否产生抗OVA抗体。
血清中的抗OVA抗体的检测如下进行。
在96孔板上铺OVA蛋白，进行封闭，以使其不发生非特异性结合。将由免疫小鼠得到的血清进行稀释，添加到上述各孔中，在室温下反应2小时，然后漂洗，添加碱性磷酸酶标记抗小鼠免疫球蛋白，再在室温下反应2小时。漂洗后加入碱性磷酸酶的底物，在室温下反应15分钟，然后测定414nm的吸光度。结果如图3所示。
荧光染料负载干细胞
2周后，腹腔内注射10μg溶解于PBS的OVA。4天后摘取脾脏，制备脾细胞。将脾细胞悬浮于含有1μM Fluo-4AM、1μM CellTrackerOrange、0.02％Pluronic F-127的缓冲液A(20mM HEPES，pH7.4，137mM NaCl、2.7mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、1mg/ml葡萄糖、1mg/ml BSA)，使细胞密度为107/mL，在室温下培养30分钟。然后用该缓冲液A漂洗细胞，除去未被细胞摄入的Fluo-4和CellTrackerOrange，然后悬浮于含10％FCS PRMI 1640液(缓冲液B)中，细胞密度为105/μL。
OVA特异性B淋巴细胞的检测
向微孔板阵列芯片(有机硅制、孔直径10μm、孔深度约15μm、孔间距20μm、约24万个孔)中添加负载有荧光染料的脾细胞(105/μL)，除去未进入孔中的剩余细胞。用盖玻片覆盖芯片，然后将其插入日立Soft Ware Engineering(株)制造的CRBIO IIe-FITC，在473的激发波长、535nm的荧光波长扫描Fluo-4的荧光，接着用535nm的激发波长、585nm的荧光波长扫描CellTracker Orange的荧光。接着，将芯片由扫描仪中取出，除去芯片与盖玻片之间的缓冲液B，向其中添加溶解于缓冲液B的OVA(100μg/mL)。将芯片插入扫描仪，添加OVA1分钟后，以2.5μm分辨率进行扫描。计算刺激前和刺激后的Fluo-4荧光的比，确定荧光的比值增大5-10倍的细胞的地址。
OVA特异性B淋巴细胞的回收和培养
除去芯片与盖玻片之间的缓冲液B，取掉盖玻片。然后向芯片中添加缓冲液B，使其不干燥。将芯片置于荧光显微镜下，一边在显微镜下观察一边用显微操作器在其上回收用扫描器鉴定的OVA特异性B淋巴细胞。
将回收的B淋巴细胞用含有[50,000个经放射线照射(50Gy)的EL4细胞、500U/mL人IL-2、5ng/mL PMA、PWM刺激的人T细胞的培养上清(5％v/v)]的含10％FCS PRMI 1640培养基(200μL/孔)培养1周(37℃、5％CO2)。去除100μl培养上清后，向其中加入10,000个经放射线照射(50Gy)的、表达CD40配体的贴壁细胞，和5ng/mL人IL-4，用含有[500U/mL人IL-2、5ng/mL PMA、PWM刺激的人T细胞的培养上清(5％v/v)]的含10％FCS PRMI 1640培养基(200μL/孔)培养1周(37℃、5％CO2)。再去除100μl培养上清，向其中加入10,000个经放射线照射(50Gy)的、表达CD40配体的贴壁细胞，用含有[5ng/mL人IL-4，500U/mL人IL-2、5ng/mL PMA、PWM刺激的人T细胞的培养上清(5％v/v)]的含10％FCS PRMI 1640培养基(200μL/孔)培养1周(37℃、5％CO2)。
杂交瘤的制备
用光学显微镜观察B淋巴细胞的增殖，从有细胞增殖的孔中回收细胞，转移至Eppendorf管中。向其中加入约200个小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653)，以2000转离心2分钟。不要将细胞沉淀打散，小心地去除上清，加入1ml PRMI 1640培养基(不合FCS)，使细胞悬浮，以2000转离心2分钟。不要将细胞沉淀打散，小心地去除上清，再以2000转离心10秒钟。不要将细胞沉淀打散，小心地完全去除上清。加入20μl 30％聚乙二醇(Sigma)，轻轻搅拌细胞，然后以2000转离心5分钟。加入500μl PRMI 1640培养基(不含FCS)，使细胞悬浮。接着添加500μl含20％FCS PRMI 1640培养基，使细胞悬浮。以2000转离心5分钟后，除去上清，将细胞悬浮于1ml含20％FCS的HAT选择培养基(PRMI 1640、1×10-4M次黄嘌呤、4×10-7M氨基蝶呤、1.6×10-5M胸苷)中。再加入20ml含20％FCS的HAT选择培养基，分别取2ml添加到24孔板的孔中。在37℃、5％CO2存在下培养7-10天。光学显微镜下观察杂交瘤的增殖，用如下所示的ELISA法检测培养上清中的抗OVA抗体。图4表示检出的杂交瘤培养上清中的抗OVA抗体的ELISA结果。吸光度根据培养上清的稀释倍数而变化，将可溶性的OVA加入到培养上清中时，与孔底面的抗OVA抗体的结合特异性受阻，因此可知培养上清中产生了抗OVA抗体。
杂交瘤上清中的抗OVA抗体的检测如下进行。
在96孔板上铺OVA蛋白，进行封闭，以使其不发生非特异性结合。将经稀释的杂交瘤上清添加到上述各孔中(PBS)。为了探讨ELISA反应的特异性，在另外的孔中加入杂交瘤的培养上清，同时还添加2μg/mL OVA或者γ-球蛋白。在室温下反应2小时，然后漂洗，添加碱性磷酸酶标记抗小鼠免疫球蛋白，再在室温下反应2小时。漂洗后加入碱性磷酸酶的底物，在室温下反应15分钟，然后测定414nm的吸光度。结果如图4所示。
产业实用性
根据本发明，选择、采集产生抗原特异性抗体的B淋巴细胞，并利用其制备杂交瘤，这与以往的杂交瘤的制备方法相比，可大幅节省产生抗原特异性抗体的杂交瘤的筛选的麻烦，杂交瘤的制备效率得到大幅改善。具体来说，有如下意义。
(a)所使用的细胞数减少，铺板时的孔数减少。所使用的细胞数少，因此筛选所需的时间减少，筛选者的工作负担减轻。
(b)杂交瘤增殖时，不生产抗原特异性抗体的杂交瘤也增殖，但由于首先进行了产生抗原特异性抗体的B淋巴细胞的选择、浓缩，因此这样的阴性细胞的出现率减少。
(c)另外，通过使用微孔板阵列芯片检测并采集出现率低的产生抗原特异性抗体的B细胞，使其增殖，可以确实地制备杂交瘤，可以制备以往不能制备的、来自出现率低的产生抗原特异性抗体的B细胞的杂交瘤。
Claims (8)
1.产生抗原特异性抗体的杂交瘤的制备方法，该方法包括：选择单个与某种抗原特异性反应的B淋巴细胞(以下称为抗原特异性B淋巴细胞)，对所选择的抗原特异性B淋巴细胞进行培养，使培养增殖的抗原特异性B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。
2.权利要求1的方法，其中，上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在抗CD40抗体或CD40配体(CD40L)以及包含白细胞介素4(IL-4)的白细胞介素共存下进行。
3.权利要求1的方法，其中，上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在可使B淋巴细胞增殖的促细胞分裂原共存下进行。
4.权利要求1的方法，其中，上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在抗CD40抗体或CD40L以及包含IL-4的白细胞介素和促细胞分裂原共存下进行。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中，上述单个抗原特异性淋巴细胞的选择使用流式细胞仪或微孔板阵列芯片进行。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中，上述单个抗原特异性淋巴细胞的选择如下进行：向抗原特异性淋巴细胞检测用微孔板阵列芯片的各微孔中添加抗原，然后检出与抗原反应的淋巴细胞，从微孔中挑取检出的抗原特异性淋巴细胞，其中上述微孔板阵列芯片中具有多个含有1个受检淋巴细胞的微孔。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中，抗原特异性淋巴细胞的出现率为0.1％或以下。
8.单克隆抗体的制备方法，该方法使用由权利要求1-7中任一项的方法制备的杂交瘤制备单克隆抗体。
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