CN1274085A - 一种蛋白芯片及其制备方法并用其筛选单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白芯片及其制备,并用其筛选单克隆抗体的灵敏方法,包括步骤:①用组织匀浆免疫BALB/c小鼠;②取BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合;③用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞,扩增培养;④制备蛋白芯片,用来鉴定产生的抗体,同时建立杂交瘤细胞库;⑤制备筛选用蛋白芯片,用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体。本发明用于单克隆抗体的大规模快速筛选。
Description
本发明属分子生物学领域，涉及一种蛋白芯片及其制备方法，并用其来大规模快速地筛选单克隆抗体的灵敏的方法。
单克隆抗体技术发明于1975年，其制备过程基本如下：
①用抗原免疫小鼠，②取小鼠的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，③杂交瘤细胞克隆化，④筛选特异的单克隆抗体。
克隆化方法有：①有限稀释法，②软琼脂培养法，③单细胞显微操作法，④单克隆细胞集团显微操作法，⑤萤光激活细胞分类仪(流式细胞仪)分离法。
经典的筛选特异性单克隆抗体的方法有：①免疫酶技术、②免疫荧光技术、③放射免疫测定、④化学发光免疫分析、⑤间接凝血试验。其中免疫酶技术用得最多，现以免疫酶技术的一种技术——间接酶联免疫分析(ELISA)来说明筛选过程。用抗原包被载体，加入待测的单克隆化杂交瘤细胞的培养上清液，若上清液中有对应的单克隆抗体，则与包被的抗原结合；洗涤后再加入酶标记的第二抗体，形成固定化的抗原-抗体-酶标记的第二抗体复合物；依据底物显色反应的强度，可对待测的单克隆抗体样品进行定性或定量分析。
经典的筛选特异性单克隆抗体的方法最大的缺点是得到的数个克隆中只能筛选出一种抗原的单克隆抗体、浪费大、效率低。
应用蛋白芯片能快速检测大量抗原抗体的结合反应。如果用组织匀浆免疫小鼠，把克隆化的杂交瘤细胞分泌的抗体固化到载体(通常为尼龙膜、硝酸纤维膜或玻片)上，用不同抗原和其多克隆抗体便可筛选到不同抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。从理论上讲，如果克隆化的杂交瘤细胞库足够大，可筛选到所有蛋白质的单克隆抗体。
经检索提供的对比文献及参考目录附后。
本发明的目的是发明一种蛋白芯片，通过其制备方法产生的蛋白芯片，能用于大规模快速地筛选单克隆抗体，方法简单，成本低，并且同时建立杂交瘤细胞库；本发明还涉及建立用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体的方法。
为了实现本发明的目的采取的方案：
①用组织匀浆免疫BALB/c小鼠；
②取BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合；
③用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞，扩增培养；
④制备蛋白芯片，用来鉴定产生的抗体，同时建立杂交瘤细胞库；
⑤制备筛选用蛋白芯片，用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体。
结合附图对本发明进一步具体的说明：
所谓蛋白芯片即将大量特定的抗原(抗体)，有序地固化在载体上，载体可以是硝酸纤维素膜、尼龙膜或玻片等其它载体，利用抗原抗体的亲和反应检测对应的抗体(抗原)的阵列。
本发明的流程和经典单克隆抗体制备的流程比较见图1。图中1为经典的杂交瘤抗体制备的流程图，2为本发明流程图，图中本发明①-⑤为五个操作步骤为：
①用组织匀浆免疫BALB/c小鼠；
②取BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合；
③用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞，扩增培养；
④制备蛋白芯片，用来鉴定产生的抗体，同时建立杂交瘤细胞库；
⑤制备筛选用蛋白芯片，用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体。
图1中：
3、组织匀浆 4、特种抗原 5、脾细胞 6、杂交瘤细胞
7、克隆 8、单克隆抗体 9、流式分离仪分离单个杂交瘤细胞
10、蛋白芯片鉴定产生的抗体，建立杂交瘤细胞库
11、蛋白芯片筛选特异性单克隆抗体 12、融合
13、骨髓瘤细胞。
经典的制备方法也对应五个步骤，如图1中以上所注。
用蛋白芯片鉴定产生的抗体的原理见图2。
图2中：
1、为蛋白芯片筛选特异性单克隆抗体的示意图：
黑色圆点表示对应的孔有抗体产生；白色圆点表示无抗体产生，为哑克隆。
2、为显示无抗体产生时不显色的原理，当克隆中无小鼠的抗体IgG(免疫球蛋白)时，FITC(异硫氰酸荧光素)标记的抗小鼠IgG抗体不能结合，在洗涤时洗去，对应点无荧光显示。
3、为显示有抗体产生显色的原理，当克隆中有小鼠的IgG抗体时，把杂交瘤细胞培养的上清液顺序点印在玻片上，点印密度为1000点/cm2，IgG会被固化在玻片上特定的位置；用FITC标记的兔抗鼠IgG在玻片上孵育，有鼠IgG的点便会有荧光，通过此方法可方便去掉大量的哑克隆。
4为有效抗体，5为无效抗体，6为FITC标记的小鼠IgG抗体。
蛋白芯片筛选特异的抗体以AFP(甲胎球蛋白)为例，原理见图3，把产生IgG抗体的克隆上清液点印在玻片上，点印密度为1000点/cm2，用AFP及标记FITC的免疫AFP多克隆抗体，在玻片上孵育，如果玻片上某点有AFP的单克隆抗体存在便会在激发光下产生荧光。
图3中，1为蛋白芯片筛选特异性单克隆抗体的结果示意图，黑色表示阳性克隆，白色为阴性；2为无抗体不产生显色原理图，非特异性单克隆抗体不能识别特异性抗原，故不能形成特异性单克隆抗体-抗原-多克隆抗体-荧光复合物，故对应点无荧光；3为有抗体产生荧光显色原理图，特异性单克隆抗体能识别特异性抗原，故能形成特异性单克隆抗体-抗原-多克隆抗体-荧光复合物，故对应点有荧光；4为特异性抗体，5为非特异性抗体，6为FITC标记的特异性抗原的抗体。
具体方法可细分为五部分：
1、用组织匀浆免疫BALB/c小鼠；
2、取BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合；
3、用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞，扩增培养；
4、制备蛋白芯片，用来鉴定产生的抗体，同时建立杂交瘤细胞库；
5、制备筛选用蛋白芯片，用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体。
1、用组织匀浆免疫BALB/c小鼠：
取2克组织(各种正常组织及肿瘤组织均可)制成匀浆，离心，去掉大的细胞碎片，按常规免疫。
2、取BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合：
取免疫BALB/c小鼠的脾细胞和适量的骨髓瘤细胞，用PEG(聚乙二醇)融合，融合后立即将细胞移入HAT培养液[含次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中，4-5天换HT培养液，6-7天后换普通培养液。
3、用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞，扩增培养；
收集融合杂交瘤细胞，并培养7-8天，制备成悬液；用流式细胞仪分离单个细胞，收集在384孔培养板中，培养孔中需预先加入培养液和饲养细胞(通常用小鼠腹腔巨噬细胞)；培养5天，检测是否有抗体产生，培养8天再检测一次。
4、制备蛋白芯片，用来鉴定产生的抗体，同时建立杂交瘤细胞库；
①制备蛋白芯片：取培养细胞的上清液，转移到新的384孔板，用点样器把培养的上清液点在玻片上形成1000点/cm2的阵列；(用不同的点样器，点印的密度和上清液的体积不同)；每个点对应一个孔，每个点为0.2-1μl的上清液。IgG的浓度为1-100Pg/ml。
②用制备的蛋白芯片鉴定产生的抗体，同时建立杂交瘤的细胞库：在蛋白芯片上加FITC标记的兔抗鼠IgG抗体(效价为1∶50-1∶1000)，37℃湿盒孵育30-60分钟，用荧光显微镜观察结果(也可用其它方法获得图像，如激光扫描仪)，
③建立杂交瘤细胞库：在荧光显微镜下，挑选有荧光的点；标记对应的杂交瘤细胞孔，取适量细胞，扩增培养，液氮冻存细胞，建立杂交瘤细胞库。
蛋白芯片鉴定产生抗体的荧光显微图象见图4，明亮斑点对应的杂交瘤产生抗体，否则为哑克隆。
用FITC标记的兔抗鼠IgG只是一种鉴定方法，其它方法包括用荧光分子标记的其它抗小鼠IgG多克隆抗体，或者抗小鼠IgG多克隆抗体不标记，再偶联荧光标记的第二抗体；另一种方法为先加入抗小鼠IgG多克隆抗体，偶联生物素标记的第二抗体，再用荧光分子标记的亲和素显示荧光，以提高灵敏度。
5、制备筛选用芯片，用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体。
①制备蛋白芯片：用384孔板复苏冻存细胞，培养5-10天，收集上清液，用点样器把培养细胞的上清液点在玻片上形成1000点/cm2的阵列，每个点对应一个孔，每点为0.2-1μl上清液，IgG的浓度为1-100Pg/ml，一次可制备多张蛋白芯片。
②筛选特异性单克隆抗体：
1)在蛋白芯片上加抗原，浓度为0.1-100Pg/ml，37℃湿盒中孵育30-60分钟；
2)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗芯片3-5次；
3)在蛋白芯片上加兔抗特异性多克隆抗体，抗体用FITC标记，抗体效价为1∶5-1∶1000，37℃湿盒孵育30-60分钟；
4)荧光显微镜下观察蛋白芯片，挑选荧光显色的斑点，从杂交瘤细胞库中取出对应的杂交瘤细胞，扩增培养，并鉴定，筛选出单克隆抗体；
5)换另一种抗原和其荧光标记的多克隆抗体，重复1)-4)步骤，可筛选另一种单克隆抗体。
实施例：
用胎肝匀浆免疫制备甲胎球蛋白(AFP)和肌动蛋白(Actin)的单克隆抗体。
实施例分五部分：
1、用胎肝匀浆液免疫BALB/c小鼠；
2、用BALB/c小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合；
3、用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞，扩增培养；
4、制备蛋白芯片，去掉哑克隆，建立杂交瘤细胞库；
5、制备筛选用蛋白芯片，用AFP筛选AFP的单克隆抗体，用Actin筛选Acin的单克隆抗体。
1、用胎肝匀浆液免疫BALB/c小鼠；
取2g流产胎儿胎肝组织，加10ml磷酸盐缓冲液研磨，超声破碎1-5分钟，离心去掉沉淀，用1升磷酸盐缓冲液透析3次，匀浆浓缩到1ml，免疫小鼠。免疫BALB/c小鼠5只，间隔2-4周再一次免疫，4周后静脉加强免疫。
2、取BALB/c小鼠脾细胞和骨髓细胞融合：
①制备小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；
②5只BALB/c免疫小鼠，摘眼球放血，同时将小鼠处死；
无菌操作取脾，用网孔挤压法得到分散的脾细胞；
③融合前36-48小时，将骨髓瘤细胞扩大培养；
④分别取含1×108个脾细胞和2-3×107个骨髓瘤细胞，加PEG融合，用HAT培养液筛选培养。
3、用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞，扩增培养；
①将细胞悬液加入已铺有饲养细胞层的70cm培养皿，置于37℃，含5-8％ CO2的培养箱培养；
②融合当天HAT培养液培养，每天观察一次，第四天出现融合细胞的小集落克隆，立即换HT培养液，一天后再换普通完全培养液；
③制备小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞，384孔板中每孔105个饲养细胞；
④在融合后的第六天，轻轻吹吸杂交瘤细胞，制成悬液；
⑤悬液用流式细胞仪分离成单个细胞，每孔中加入一个细胞，共100个384孔板；
⑥常规培养5-8天，观察克隆生长情况，第8天取培养上清液，转移到新的384孔板。
4、制备蛋白芯片，去掉哑克隆，建立杂交瘤细胞库：
①制备蛋白芯片：用点样器把培养上清液点印到玻片(美国Telechem公司，货号SMA-25)上，每个点0.2μl形成1000点/cm2的阵列，每张玻片点印1920点(对应5块384孔板)，共点印20张玻片，室温干燥24小时，加100mg/ml的牛血清蛋白，室温2小时封闭玻片，双蒸水缓慢冲洗2分钟；
②鉴定产生的抗体：芯片加上FITC标记的兔抗鼠IgG 0.3ml，效价为1∶500，37℃湿盒孵育45分钟，磷酸盐缓冲液冲洗3次。
③荧光显微镜观察：用波长为492nm的光激发，加载525nm滤光片观察结果并照相，结果见图4，明亮斑点对应的杂交瘤有抗体产生，否则为哑克隆；
④建立杂交瘤细胞库：挑选表达IgG的孔(共6500孔)，悬浮细胞，转到新的384孔培养板，共17块板，培养8天，转移上清液到新的384孔板，供制备蛋白芯片用，杂交瘤细胞再扩增培养，编号后冻存。
5、制备筛选用蛋白芯片，用AFP筛选AFP的单克隆抗体；用Actin筛选Actin的单克隆抗体：
①制备筛选用蛋白芯片；用点样器把上述获得的培养上清液点印到玻片上，每张玻片1920点，共4张玻片，重复点印1000套，室温干燥24小时，100mg/ml小牛血清封闭2小时，双蒸水缓慢冲洗2分钟，干燥保存。
②筛选AFP抗体
1)在芯片上加AFP抗原0.3ml浓度为20Pg/ml，37℃湿盒中孵育45分钟，PBS洗芯片三次；
2)用FITC标记兔抗AFP多克隆抗体(美国Chemicon公司，货号AB562)，稀释到效价为1∶100；
3)在芯片上加FITC标记的兔抗AFP多克隆抗体0.3ml，37℃湿盒孵育45分钟；
4)荧光显微镜观察芯片：激发光用492nm，加载525nm滤光片观察，并照相，记录显微荧光的位置，结果见图5，筛选到2株AFP单克隆抗体，分别用1.2表示。
③筛选Actin单克隆抗体：
程序同②，兔抗Actin多克隆抗体购自美国Chemicon公司，货号为AB978，结果见图6，筛选到4株Actin单克隆抗体，分别用1，2，3，4表示，从图中得1，2的亲和力最高，4的亲和力最低。
本发明的优点：
成本低廉：一次建库，用蛋白芯片可筛选到多种抗原的单克隆抗体，总体成本可成倍下降；
操作简单：不重复免疫小鼠，不重复融合，建库后可多次筛选；
自动化：用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞；用蛋白芯片鉴定抗体，最大限度减少人力；能大规模快速地筛选单克隆抗体。
本发明的应用：
用本发明的蛋白芯片能大规模快速地筛选单克隆抗体，同时建立了杂交瘤细胞库。
说明书附图说明：
图1本发明的流程图和经典单克隆抗体制备流程图的比较：
1为经典的杂交瘤抗体制备流程；2为本发明的流程。①-⑤对应五个操作步骤。
①用组织匀浆免疫BALB/c小鼠；
②取BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合；
③用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞，扩增培养；
④制备蛋白芯片，用来鉴定产生的抗体，同时建立杂交瘤细胞库；
⑤制备筛选用蛋白芯片，用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体。
图1中：
3、组织匀浆 4、特种抗原 5、脾细胞 6、 杂交瘤细胞
7、克隆 8、单克隆抗体 9、流式分离仪分离单个杂交瘤细胞
10、蛋白芯片鉴定产生的抗体，建立杂交流细胞库
11、蛋白芯片筛选特异性单克隆抗体 12、融合
13、骨髓瘤细胞。
经典的制备方法也对应五个步骤，如图1中以上所注。
图2蛋白芯片鉴定产生抗体的原理图
1为蛋白芯片检测结果示意图，黑色表示对应的孔有抗体产生，白色表示无抗体产生，为哑克隆。
2、显示无抗体产生时不显色的原理。当克隆中无小鼠的抗体IgG时，FITC标记的抗小鼠IgG抗体不能与其结合，对应的点无荧光显示。
3、显示有抗体产生时显色的原理，当克隆中有小鼠的IgG抗体时，FITC标记的抗小鼠IgG抗体与其结合，对应点有荧光显示。
4、为有效抗体
5、为无效抗体
6、为FITC标记的兔抗鼠IgG抗体。
图3为蛋白芯片筛选特异性单克隆抗体的原理图。
1、为蛋白芯片筛选特异性单克隆抗体的结果示意图，黑色表示阳性克隆，白色表示阴性克隆。
2、为无抗体不产生显色原理图，非特异性单克隆抗体不能识别特异性抗原，故不能形成特异性单克隆抗体-抗原-多克隆抗体-荧光复合物，故对应点无荧光；
3、为有抗体产生荧光显色原理图，特异性单克隆抗体能识别特异性抗原，故能形成特异性单克隆抗体-抗原-多克隆抗体-荧光复合物，故对应点有荧光。
4、为特异性抗体
5、为非特异性抗体
6、为F1TC标记的特异性抗原的抗体
图4为蛋白芯片鉴定产生的抗体的荧光显微镜图象。
明亮斑点对应的杂交瘤株有抗体产生，否则为哑克隆。
图5为蛋白芯片筛选AFP单克隆抗体。
筛选到2株AFP单克隆抗体，分别用1，2表示。
图6为蛋白芯片筛选Actin单克隆抗体
筛选到4株Actin单克隆抗体，分别用1，2，3，4表示，从图知1，2的亲和力最高而4亲和力最低。
参考文献：
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3、徐志凯等主编：实用单克隆抗体技术；
西安：陕西科学技术出版社，1992：42-73
4：对比文献：徐志凯等主编：实用单克隆抗体技术；
西安：陕西科学技术出版社，1992：65-73
Claims (5)
1、一种蛋白芯片，它是将大量特定的抗原或抗体，有序地固化在载体上，载体可以为硝酸纤维素膜、尼龙膜或玻片，利用抗原抗体的亲和反应检测对应的抗体或抗原的阵列，其特征是利用这种蛋白芯片可以大规模筛选单克隆抗体，是一种快速灵敏的筛选方法，具体分为五个步骤：
①用组织匀浆免疫BALB/c小鼠；
②取BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合；
③用流式细胞仪分离单个杂交瘤细胞，扩增培养；
④制备蛋白芯片，用来鉴定产生的抗体，同时建立杂交瘤细胞库；
⑤制备筛选用蛋白芯片，用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体；这样的筛选流程。
2、根据权利要求1所述的这种蛋白芯片的制备方法：其特征是将免疫过的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞，分离出的单个细胞，培养在384孔板中，取培养杂交瘤细胞的上清液转移到新的384孔板，用点样器把上清液点在玻片上形成1000点/cm2的阵列，每个点对应一个孔，每点为0.2-1μl上清液，IgG的浓度为1-100Pg/ml，一次可以制备多张蛋白芯片。
3、根据权利要求1所述的用这种蛋白芯片鉴定产生的抗体的方法，其特征是用蛋白芯片加FITC即异硫氰酸荧光素标记的兔抗鼠IgG抗体，效价为1∶50-1∶1000，37℃湿盒孵育30-60分钟，在荧光显微镜下观察结果。
4、根据权利要求1所述的用这种蛋白芯片鉴定产生的抗体的方法，其特征是在鉴定产生的抗体的同时，还建立了杂交瘤细胞库，具体方法为：在荧光显微镜下挑选有荧光的点，标记对应的杂交瘤细胞孔，取适量细胞，扩增培养，液氮冻存细胞，建立杂交瘤细胞库。
5、根据权利要求1所述的用这种蛋白芯片筛选单克隆抗体的方法，其特征是用特异性抗原和多克隆抗体筛选对应的单克隆抗体，具体方法为：
1)在蛋白芯片上加抗原，浓度为0.1-100Pg/ml，37℃湿盒孵育30-60分钟；
2)用磷酸盐缓冲液洗芯片3-5次；
3)在蛋白芯片上加兔抗特异性抗原的多克隆抗体，抗体用FITC标记，抗体效价为1∶5-1∶1000，37℃湿盒孵育30-60分钟；
4)荧光显微镜下观察蛋白芯片，挑选荧光显色的斑点，从杂交瘤细胞库中取出对应的杂交瘤细胞，扩增培养，鉴定筛选出的单克隆抗体；
5)换另一种抗原和其荧光标记的多克隆抗体，重复1)-4)步骤，筛选出另一种单克隆抗体。
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