CN104034899B - 一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列，包括一个基片，基片上固定有致病菌、阳性对照和阴险对照，致病菌为金黄色葡萄球菌、出血性大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌中的一种或一种以上的组合。本发明可以进行多靶标的筛选，利用本发明2.5h内即可完成几十株杂交瘤细胞的筛选工作，大大缩短了食源性致病菌单克隆抗体的制备周期，降低了生产成本。

Description

一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抗原宏阵列，具体来说是一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列。
背景技术
食品安全是关系国计民生的重大公共安全问题，也是国家行政机关监管工作的重点之一。近年来国内食品安全事故层出不穷，而食源性致病菌污染是食品安全中最常见的问题。据世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)报道，全球每年发生腹泻病的病例数高达1.5亿，其中70％病例与各种致病性微生物污染的食品有关。我国CDC的研究资料也显示，微生物是食源性疾病的主要病原，占46.4％。所以，食品中的致病菌污染在国内外都是影响食品安全的最主要原因。就食源性致病菌检测而言，标准方法包括生化鉴定、分子生物学鉴定、免疫学鉴定三大技术体系。而免疫学检测体系的建立又依赖于大量高灵敏度、高特异性的致病菌单克隆抗体。目前，市面上所售的单克隆抗体较为昂贵，这显然制约了该检测体系的建立与发展，其中原因是，单克隆抗体的制备步骤繁琐、杂交瘤细胞的筛选周期长等。
单克隆抗体技术，是指将某种抗原诱导产生的特异性B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经融合，形成杂交瘤细胞，并分离筛选出单个杂交瘤细胞，再将其扩增，最终分离纯化制得单克隆抗体。杂交瘤细胞具有双重特性，既能如骨髓瘤细胞般持续繁殖，又能如B淋巴细胞般分泌针对单一抗原决定簇的特异性抗体，即单克隆抗体。尽管单克隆抗体越来越广泛地应用于各个研究领域，但是自1975年问世以来，制备单克隆抗体一直沿用传统方法，成为这一经典技术发展的瓶颈。制备单克隆抗体包括抗原制备、动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆、冻存复苏、杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定以及单克隆抗体的大量生产等一系列复杂步骤，一般要花费6个月以上的时间。其中杂交瘤细胞的筛选这一步骤最为耗时。
目前筛选单克隆抗体杂交瘤细胞，都是采用间接酶联免疫法(间接ELISA法)筛选出无交叉反应、高灵敏度的杂交瘤细胞，而且实验人员需要丰富的经验。就食源性致病菌杂交瘤细胞特异性筛选这一试验，通常需要对实验前期所获得的几十株杂交瘤细胞的几十种致病菌抗原及致病菌抗原类似物进行交叉反应的试验。即把靶抗原以及不能有交叉反应的靶抗原类似物包被在96孔酶标板上，逐一用融合后的阳性杂交瘤细胞去筛选每种抗原，选择那些只针对靶抗原有阳性反应，而放弃那些和靶抗原反应弱，或者和靶抗原类似物有交叉反应的杂交瘤细胞。而且要获得特异性高、亲和力高、稳定性好的杂交瘤细胞通常需要3、4轮的筛选，这种逐一筛选的方法将耗费大量时间。就食源性致病菌单克隆抗体的制备来说，在杂交瘤细胞制备过程中，通常一次融合，一般会有1000多孔杂交瘤细胞，融合较好的时候100％的孔里都有杂交瘤细胞生长，但是最终只有不到10％的孔里面含有目标杂交瘤细胞，所以要从如此多的杂交瘤细胞中筛选出目标杂交瘤细胞，其筛选量是非常巨大的。一轮筛选通常需要对几十种致病菌抗原及致病菌抗原类似物进行交叉反应测试，需要进行几十次间接ELISA实验，花费数周时间，这大大增加了食源性致病菌单克隆抗体的制备周期，也增加了生产成本。最终，限制了食源性致病菌单克隆抗体制备技术的发展以及相关免疫学鉴定技术体系的建立与发展。
抗原宏阵列是生物芯片的一种，其是将多种免疫杂交反应中的抗原成分固定于一张基片上所制成的生物芯片，可用来进行类似间接酶联免疫分析反应。
发明内容
针对上述现有食源性致病菌杂交瘤细胞筛选技术中存在的缺陷，本发明提供了一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列，所述的这种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列要解决现有食源性致病菌杂交瘤细胞筛选技术成本高、筛选过程耗时、复杂、繁琐的技术问题。
本发明一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列，包括一个基片，所述的基片上固定有致病菌、阳性对照和阴险对照，所述的致病菌为金黄色葡萄球菌、出血性大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌中的任意一种或者一种以上的组合。
进一步的，所述的金黄色葡萄球菌的来源为ATCC29213或者ATCC27660；所述的出血性大肠杆菌O157：H7的来源为ATCC43895或者ATCC43889；所述的单核细胞增生李斯特菌的来源为ATCC43251、或者ATCC13932、或者ATCC19112、或者ATCC19114、或者ATCC19116、或者ATCC19117、ATCC19115、或者CMCC54002、或者CICC21633、或者MAS20110421187；所述的猪霍乱沙门氏菌的来源为CICC21493；所述的鼠伤寒沙门氏菌的来源为CICC22956、或者ATCC14028、或者CMCC(B)50115；所述的肠炎沙门氏菌的来源为ATCC13076、或者IQCC10512、或者IQCC10528；所述的福氏志贺氏菌的来源为ATCC12022或者CMCC51572；所述的宋内氏志贺氏菌的来源为ATCC25931或者CMCC51592；所述的痢疾志贺氏菌的来源为ATCC13313或者CMCC51105；所述的鲍氏志贺氏菌的来源为ATCC9207或者CMCC51346；所述的副溶血性弧菌的来源为ATCC17802；所述的阪崎肠杆菌的来源为ATCC29004、ATCC29554、或者ATCC12858；所述的小肠结肠炎耶尔森氏菌的来源为ATCC23715或者CMCC52207；所述的空肠弯曲菌的来源为CICC22937；所述的伤寒沙门氏菌的来源为CMCC(B)50071；所述的甲型副伤寒沙门氏菌的来源为CMCC(B)50093；所述的乙型副伤寒沙门氏菌的来源为CMCC(B)50094。
进一步的，所述的基片上设置有39种食源性致病菌，分别为第1种菌株为金黄色葡萄球菌，其来源为ATCC29213；第2种菌株为金黄色葡萄球菌，其来源为ATCC27660；第3种菌株为出血性大肠杆菌O157：H7，其来源为ATCC43895；第4种菌株为出血性大肠杆菌O157：H7，其来源为ATCC43889；第5种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC43251；第6种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC13932；第7种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19112；第8种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19114；第9种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19116；第10种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19117；第11种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19115；第12种菌株为猪霍乱沙门氏菌，其来源为CICC21493；第13种菌株为鼠伤寒沙门氏菌，其来源为CICC22956；第14种菌株为鼠伤寒沙门氏菌，其来源为ATCC14028；第15种菌株为肠炎沙门氏菌，其来源为ATCC13076；第16种菌株为福氏志贺氏菌，其来源为ATCC12022；第17种菌株为宋内氏志贺氏菌，其来源为ATCC25931；第18种菌株为痢疾志贺氏菌，其来源为ATCC13313；第19种菌株为鲍氏志贺氏菌，其来源为ATCC9207；第20种菌株为鲍氏志贺氏菌，其来源为CMCC51346；第21种菌株为副溶血性弧菌，其来源为ATCC17802；第22种菌株为阪崎肠杆菌，其来源为ATCC29004；第23种菌株为阪崎肠杆菌，其来源为ATCC29554；第24种菌株为阪崎肠杆菌，其来源为ATCC12858；第25种菌株为小肠结肠炎耶尔森氏菌，其来源为ATCC23715；第26种菌株为小肠结肠炎耶尔森氏菌，其来源为CMCC52207；第27种菌株为空肠弯曲菌，其来源为CICC22937；第28种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为CMCC54002；第29种菌株为鼠伤寒沙门氏菌，其来源为CMCC(B)50115；第30种菌株为伤寒沙门氏菌，其来源为CMCC(B)50071；第31种菌株为甲型副伤寒沙门氏菌，其来源为CMCC(B)50093；第32种菌株为乙型副伤寒沙门氏菌，其来源为CMCC(B)50094；第33种菌株为福氏志贺氏菌，其来源为CMCC51572；第34种菌株为宋内氏志贺氏菌，其来源为CMCC51592；第35种菌株为痢疾志贺氏菌，其来源为CMCC51105；第36种菌株为单核细胞增生李斯特氏菌，其来源为CICC21633；第37种菌株为单核细胞增生李斯特氏菌，其来源为MAS20110421187；第38种菌株为肠炎沙门氏菌，其来源为IQCC10512；第39种菌株为肠炎沙门氏菌，其来源为IQCC10528。
具体的，上述的菌株均为市售菌株，具体生物学的特征不在此赘述。
进一步的，所述的基片为具有三维空间结构的硝酸纤维素膜。
本发明的一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列，可解决现有食源性致病菌杂交瘤细胞筛选技术中成本高、筛选过程耗时、复杂、繁琐的技术问题。利用本发明所述的这种抗原宏阵列来筛选食源性致病菌杂交瘤细胞，2.5h内即可完成几十株杂交瘤细胞的筛选工作，这大大缩短了食源性致病菌单克隆抗体的制备周期，降低了生产成本。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明可以进行多靶标的筛选，一次可以筛选39个致病菌及致病菌类似物。
附图说明
图1为一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列的点样示意图。
图2为一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列的结果实物图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1志贺氏菌杂交瘤细胞的筛选
本发明将常见的39种食源性致病菌固定于一张16mm×16mm的硝酸纤维素膜上，对食源性致病菌的杂交瘤细胞进行交叉反应实验，从而筛选出特异性好、亲和力高的致病菌杂交瘤细胞。
具体方法如下：
(一)抗原宏阵列的制备
结合图1所示，将表1中39种食源性致病菌以及阳性对照、阴性对照用点样仪在硝酸纤维素膜上进行点样，制成该抗原宏阵列。
所述的基片上固定有如表1所列的39种常见的食源性致病菌，以及阳性对照、阴性对照。
所述基片大小为16mm×16mm，所固定的样点阵列如图1所示，第一行依次为为1-7号致病菌；第二行依次为8-14号致病菌；第三行依次为15-21号致病菌；第四行依次为22-28号致病菌；第五行依次为29-35号致病菌；第六行依次为36-39号致病菌，以及3个阴性对照；第七行全部为阳性对照。
表1固定于基片上的39种食源性致病菌
编号 菌株名称 来源
1 金黄色葡萄球菌 ATCC29213
2 金黄色葡萄球菌 ATCC27660
3 出血性大肠杆菌O157：H7 ATCC43895
4 出血性大肠杆菌O157：H7 ATCC43889
5 单核细胞增生李斯特菌 ATCC43251
6 单核细胞增生李斯特菌 ATCC13932
7 单核细胞增生李斯特菌 ATCC19112
8 单核细胞增生李斯特菌 ATCC19114
9 单核细胞增生李斯特菌 ATCC19116
10 单核细胞增生李斯特菌 ATCC19117
11 单核细胞增生李斯特菌 ATCC19115
12 猪霍乱沙门氏菌 CICC21493
13 鼠伤寒沙门氏菌 CICC22956
14 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028
15 肠炎沙门氏菌 ATCC13076
16 福氏志贺氏菌 ATCC12022
17 宋内氏志贺氏菌 ATCC25931
18 痢疾志贺氏菌 ATCC13313
19 鲍氏志贺氏菌 ATCC9207
20 鲍氏志贺氏菌 CMCC51346
21 副溶血性弧菌 ATCC17802
22 阪崎肠杆菌 ATCC29004
23 阪崎肠杆菌 ATCC29554
24 阪崎肠杆菌 ATCC12858
25 小肠结肠炎耶尔森氏菌 ATCC23715
26 小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52207
27 空肠弯曲菌 CICC22937
28 单核细胞增生李斯特菌 CMCC54002
29 鼠伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50115
30 伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50071
31 甲型副伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50093
32 乙型副伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50094
33 福氏志贺氏菌 CMCC51572
34 宋内氏志贺氏菌 CMCC51592
35 痢疾志贺氏菌 CMCC51105
36 单核细胞增生李斯特氏菌 CICC21633
37 单核细胞增生李斯特氏菌 MAS20110421187
38 肠炎沙门氏菌 IQCC10512
39 肠炎沙门氏菌 IQCC10528
(二)抗原宏阵列的封闭
将上述制备好的抗原宏阵列置于封闭液(含3％脱脂奶粉的PBST)中，进行封闭处理，封闭30min，后用洗液洗涤3次。
(三)与杂交瘤细胞上清液反应
将该抗原宏阵列置于准备好的志贺氏菌杂交瘤细胞上清液(含志贺氏菌的单克隆抗体)进行孵育，进行免疫杂交反应，孵育30min，后用洗液洗涤3次。
(四)与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠抗体反应
将该抗原宏阵列置于适宜浓度的HRP标记的抗鼠抗体中进行孵育，进行免疫杂交，孵育30min，后用洗液洗涤3次。
(五)显色
将该抗原宏阵列置于DAB(二氨基联苯胺)显色液中，显色反应5min，用双蒸水终止显色反应，后置于暗室中阴干。
(六)结果判定
因采用可视化显色技术，所以在样点处有黑褐色斑点显出，则判断该杂交瘤细胞与固定于此处的致病菌存在特异性的反应，若无，则判断该孔杂交瘤细胞与固定于此处的致病菌不存在特异性的反应。最终所得结果如图2所示，因本实施例需筛选出志贺氏菌的杂交瘤细胞，由表1可知16-20号、33-35号均属于志贺氏菌，可由图2所得的结果中筛选出与其他致病菌无明显交叉反应，且效价较高的杂交瘤细胞继续亚克隆，最终筛选出高特异性、高灵敏度的志贺氏菌杂交瘤细胞。

Claims (4)

1.一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列，包括一个基片，其特征在于：所述的基片上固定有致病菌、阳性对照和阴险对照，所述的致病菌为金黄色葡萄球菌、出血性大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌中的任意一种或者一种以上的组合。
2.如权利要求1所述的一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列，其特征在于：所述的金黄色葡萄球菌的来源为ATCC29213或者ATCC27660；所述的出血性大肠杆菌O157：H7的来源为ATCC43895或者ATCC43889；所述的单核细胞增生李斯特菌的来源为ATCC43251、或者ATCC13932、或者ATCC19112、或者ATCC19114、或者ATCC19116、或者ATCC19117、ATCC19115、或者CMCC54002、或者CICC21633、或者MAS20110421187；所述的猪霍乱沙门氏菌的来源为CICC21493；所述的鼠伤寒沙门氏菌的来源为CICC22956、或者ATCC14028、或者CMCC(B)50115；所述的肠炎沙门氏菌的来源为ATCC13076、或者IQCC10512、或者IQCC10528；所述的福氏志贺氏菌的来源为ATCC12022或者CMCC51572；所述的宋内氏志贺氏菌的来源为ATCC25931或者CMCC51592；所述的痢疾志贺氏菌的来源为ATCC13313或者CMCC51105；所述的鲍氏志贺氏菌的来源为ATCC9207或者CMCC51346；所述的副溶血性弧菌的来源为ATCC17802；所述的阪崎肠杆菌的来源为ATCC29004、ATCC29554、或者ATCC12858；所述的小肠结肠炎耶尔森氏菌的来源为ATCC23715或者CMCC52207；所述的空肠弯曲菌的来源为CICC22937；所述的伤寒沙门氏菌的来源为CMCC(B)50071；所述的甲型副伤寒沙门氏菌的来源为CMCC(B)50093；所述的乙型副伤寒沙门氏菌的来源为CMCC(B)50094。
3.如权利要求1所述的一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列，其特征在于：所述的基片上设置有39种食源性致病菌，分别为第1种菌株为金黄色葡萄球菌，其来源为ATCC29213；第2种菌株为金黄色葡萄球菌，其来源为ATCC27660；第3种菌株为出血性大肠杆菌O157：H7，其来源为ATCC43895；第4种菌株为出血性大肠杆菌O157：H7，其来源为ATCC43889；第5种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC43251；第6种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC13932；第7种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19112；第8种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19114；第9种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19116；第10种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19117；第11种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为ATCC19115；第12种菌株为猪霍乱沙门氏菌，其来源为CICC21493；第13种菌株为鼠伤寒沙门氏菌，其来源为CICC22956；第14种菌株为鼠伤寒沙门氏菌，其来源为ATCC14028；第15种菌株为肠炎沙门氏菌，其来源为ATCC13076；第16种菌株为福氏志贺氏菌，其来源为ATCC12022；第17种菌株为宋内氏志贺氏菌，其来源为ATCC25931；第18种菌株为痢疾志贺氏菌，其来源为ATCC13313；第19种菌株为鲍氏志贺氏菌，其来源为ATCC9207；第20种菌株为鲍氏志贺氏菌，其来源为CMCC51346；第21种菌株为副溶血性弧菌，其来源为ATCC17802；第22种菌株为阪崎肠杆菌，其来源为ATCC29004；第23种菌株为阪崎肠杆菌，其来源为ATCC29554；第24种菌株为阪崎肠杆菌，其来源为ATCC12858；第25种菌株为小肠结肠炎耶尔森氏菌，其来源为ATCC23715；第26种菌株为小肠结肠炎耶尔森氏菌，其来源为CMCC52207；第27种菌株为空肠弯曲菌，其来源为CICC22937；第28种菌株为单核细胞增生李斯特菌，其来源为CMCC54002；第29种菌株为鼠伤寒沙门氏菌，其来源为CMCC(B)50115；第30种菌株为伤寒沙门氏菌，其来源为CMCC(B)50071；第31种菌株为甲型副伤寒沙门氏菌，其来源为CMCC(B)50093；第32种菌株为乙型副伤寒沙门氏菌，其来源为CMCC(B)50094；第33种菌株为福氏志贺氏菌，其来源为CMCC51572；第34种菌株为宋内氏志贺氏菌，其来源为CMCC51592；第35种菌株为痢疾志贺氏菌，其来源为CMCC51105；第36种菌株为单核细胞增生李斯特氏菌，其来源为CICC21633；第37种菌株为单核细胞增生李斯特氏菌，其来源为MAS20110421187；第38种菌株为肠炎沙门氏菌，其来源为IQCC10512；第39种菌株为肠炎沙门氏菌，其来源为IQCC10528。
4.如权利要求1所述的一种食源性致病菌杂交瘤细胞快速筛选抗原宏阵列，其特征在于：所述的基片为具有三维空间结构的硝酸纤维素膜。
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