CN105004857B - 乙型副伤寒和爪哇变种沙门菌试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

乙型副伤寒和爪哇变种沙门菌试剂盒、制备及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及沙门菌属中乙型副伤寒沙门菌和乙型副伤寒爪哇变种沙门菌的鉴定方法，主要解决在临床腹泻病例和环境、食品标本中快速筛选甄别乙型副伤寒沙门菌技术难题。技术方案为：乙型副伤寒沙门菌和乙型副伤寒爪哇变种沙门菌鉴定试剂盒，其特征是：包括1）、沙门菌B群免疫兔抗血清：含沙门菌O:4、O:5因子抗体的稀释血清；2）、沙门菌H相免疫兔抗血清：分别含沙门菌H相b和2因子抗体的稀释血清；3）、酒石酸钾生化鉴别管：蛋白胨10.0g，酒石酸钾钠10.0g，氯化钠5.0g，酚红0.024g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml；4）、灭菌矿物油；5）、H相专用诱导软琼脂：胰大豆胨蛋白胨10.0g，酪蛋白5.0g，硝酸钾1.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水1000.0ml；6）、H相b因子诱导血清：含有诱导血清H:b因子。

Description

乙型副伤寒和爪哇变种沙门菌试剂盒、制备及使用方法
技术领域
本发明涉及沙门菌属中乙型副伤寒沙门菌和乙型副伤寒爪哇变种沙门菌的鉴定方法，即利用血清诊断结合生化反应鉴定的试剂盒、制备和使用方法。
背景技术
沙门菌是重要的食源性感染性病原菌，在养殖动物和环境中广泛存在，有近2000多种血清型，其中和人感染有关的亚属Ⅰ的沙门菌多数需要依靠血清分型诊断，其中有些血清型的抗原式相同。如：乙型副伤寒沙门菌（4,5,12:b:1,2）和乙型副伤寒爪哇变种沙门菌（4,5,12:b:1,2）两者具有相同H相抗原，因此不能单纯凭借血清学方法鉴别。《中华人民共和国传染病防治法》对两者引发疾病的生物危害分级和公共卫生学意义不同：乙型副伤寒沙门菌属乙类病原菌，可引起类伤寒样疾病，具有较重要的临床诊断学和公共卫生意义；爪哇变种沙门菌属丙类传染病，可通过粪-口传播引发食源性感染或者腹泻的散发或聚集病例，其引发的公共卫生学意义相对较小。长期以来，临床实验室和公共卫生实验室由于两者在抗原上的相似性而无法鉴别和准确报告鉴定结果，或者因为抗原的诱导试验而延误正确的报告时间，直接影响国家传染病报告系统对乙型副伤寒的精准病例数据和传染病流行评估。国外的专业实验室通常使用分子生物学方法（PCR）检测两者的d-酒石酸钾调控子（dt基因，dt阳性者为爪哇变种，dt阴性者为乙型副伤寒），但该技术需要分子诊断实验室的配置要求，对大多数国内基层实验室来说存在应用普及障碍。有鉴于此，我们设计了一种简易血清配置改良生化试验组成的试剂盒可满足临床、公共卫生和其他农林水产实验室在常规工作中筛选并鉴别乙型副伤寒沙门菌的技术需要，省时、省力，易于操作，综合费用低廉，具有很好的社会和经济效益。
发明内容
本发明的目的是公开一种即用型乙型副伤寒和爪哇变种沙门菌鉴别诊断试剂盒、制备及使用方法。主要解决在临床腹泻病例和环境、食品标本中快速筛选甄别乙型副伤寒沙门菌技术难题。
本发明的技术方案为：乙型副伤寒沙门菌和乙型副伤寒爪哇变种沙门菌鉴定试剂盒，其特征是：包括
1）、沙门菌B群免疫兔抗血清：含沙门菌O:4、O:5因子抗体的稀释血清；
2）、沙门菌H相免疫兔抗血清：含沙门菌H:b、H:2因子抗体的稀释血清；
3）、酒石酸钾生化鉴别管：蛋白胨10.0g，酒石酸钾钠10.0g，氯化钠5.0g，酚红0.024g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml；
4）、灭菌矿物油；
5）、H相专用诱导软琼脂：胰大豆胨蛋白胨10.0g，酪蛋白5.0g，硝酸钾1.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水1000.0ml；
6）、H相b因子诱导血清：含有诱导血清H:b因子。
本发明的有益效果是：本发明利用乙型副伤寒不利用酒石酸钾的生化特性结合抗原初筛结果达到快速、简单的鉴定效果。标准化配方试剂盒可以可满足临床、公共卫生和其他农林水产实验室在常规工作中筛选并鉴别乙型副伤寒沙门菌的检测需要，省时、省力，易于操作，综合费用低廉，具有很好的社会和经济效益。
具体实施方式
即用型乙型副伤寒沙门菌和乙型副伤寒爪哇变种沙门菌的鉴定试剂盒，包括：
1、沙门菌B群免疫兔抗血清，组成成分：O:4、O:5。制法：将O:4免疫抗原菌株（里定沙门菌）和O:5免疫抗原菌株（乙型副伤寒沙门菌）接种普通营养琼脂培养基，经36±1℃培养20h后收集菌苔，用生理盐水制成适宜浓度的菌液，置100℃水浴中煮沸2.5h，破坏鞭毛抗原后制成无鞭毛菌体抗原，按照第1d（50亿菌量）腹腔皮下注射、第3d（100亿菌量）耳静脉注射、第10d（200亿菌量）耳静脉注射、第17d（400亿菌量）耳静脉注射、第24d（800亿菌量）耳静脉注射菌液浓度与时间间隔程序免疫家兔、第25d对家兔行心脏无菌采血或者颈动脉无菌采血术采集兔血，置4℃待血块凝固收缩后分离血清。粗制的抗O血清需要吸收其他非特异性的抗原。血清吸收除去交叉凝集素：取粗制血清以生理盐水作10倍稀释与对应的菌株（按中国生物制品规程标准要求）做玻片凝集试验，如出现其他类属凝集素的交叉反应，必须在血清种加入交叉反应相关的吸收菌（吸收）除去这些交叉凝集素。方法：取粗制抗血清，先用5倍的生理盐水稀释，然后加入适量已洗涤过的吸收菌（吸收菌抗原制法同前：通常O:4的吸收菌为伤寒沙门菌、O:5的吸收菌为里定和山夫登堡沙门菌），置36±1℃保温3h（每隔15min摇匀1次），取出置4℃冰箱过夜，次日离心分离血清，将血清稀释10倍，并用交叉凝集菌株作玻片凝集试验检定。一次吸收不尽时，可以多次吸收，直至不出现交叉凝集。一般需要吸收多次才能制成。试剂盒配置血清分装2ml/瓶，工作稀释度为1:10。
2、沙门菌H相免疫兔抗血清，组成成分：H:b、H:2。制法：将H:b免疫抗原菌株（乙型副伤寒爪哇变种沙门菌）和H:2免疫抗原菌株（乙型副伤寒沙门菌）复苏，单相或者双相抗原性提供玻片凝集测试达到一定的凝集效价后再接种质量百分含量为0.8%软琼脂培养基，36±1℃培养20h后收集菌体，用生理盐水制成适宜浓度的菌液，加入质量百分浓度为0.5%甲醛溶液灭活制成免疫用抗原，按照第1d（50亿）腹腔皮下注射、第3d（100亿）耳静脉注射、第10d（200亿）耳静脉注射、第17d（400亿）耳静脉注射、第24d（800亿）耳静脉注射菌液浓度和时间间隔免疫家兔、第25d对家兔行心脏无菌采血或者颈动脉无菌采血术采集兔血，置4℃待血块凝固收缩后分离血清。粗制的抗H因子血清需要吸收其他非特异性的抗原。血清吸收除去交叉凝集素：取粗制血清以生理盐水作10倍稀释与对应的菌株（按中国生物制品规程标准要求）做玻片凝集试验，如出现其他类属凝集素的交叉反应，必须在血清种加入交叉反应相关的吸收菌（吸收）除去这些交叉凝集素。方法：取粗制抗血清，先用5倍的生理盐水稀释，然后加入适量已洗涤过的吸收菌（吸收菌抗原制法同前：通常H:b的吸收菌为鼠伤寒沙门菌、H:2的吸收菌为乙型副伤寒爪哇变种和汤卜逊沙门菌），置36±1℃保温3h（每隔15min摇匀1次），取出置4℃冰箱过夜，次日离心分离血清，将血清稀释10倍，并用交叉凝集菌株作玻片凝集试验检定。一次吸收不尽时，可以多次吸收，直至不出现交叉凝集。一般需要吸收多次才能制成。试剂盒配置血清分装2ml/瓶，工作稀释度为1:10。
3、酒石酸钾生化鉴别管，成分：蛋白胨10.0g，酒石酸钾钠10.0g，氯化钠5.0g，酚红0.024g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml。制法：将上述成分（除酚红外）混合，加热溶化，调整pH为7.8，加入酚红过滤后分装试管，每管约10.0ml，于115℃20min灭菌，直立冷却。
4、灭菌矿物油，成分：矿物油10ml分装后置100℃烘烤2h。使用方法：用接种环或者接种针挑取纯培养物穿刺酒石酸钾试验管至深层，沿试管壁缓慢加入灭菌石蜡油约1ml后置36±1℃培养24-48h观察结果。阳性者呈黄色，阴性者颜色不变。
5、H相专用诱导软琼脂，成分：胰大豆胨蛋白胨10.0g，酪蛋白5.0g，硝酸钾1.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水1000.0ml。制法：将上述成分混合，加热溶化，调整pH为7.4，分装5ml/支，于110℃15min灭菌备用。
6、诱导血清H:b因子：取经过交叉凝集素吸收后的H:b因子血清分装0.5ml/瓶。
使用方法
取待检的新鲜培养物分别与O:4、O:5和H:b进行玻片凝集，若见明显、粗颗粒的凝集反应时，应立即取1支酒石酸钾生化鉴别管进行穿刺后置36±1℃培养；另外取1支H相诱导软琼脂加热溶解后倾倒于直径5cm的无菌平面中，待冷却至50℃左右加入1滴H:b诱导血清，轻微混匀后置4℃冰箱20min取出，以3点或者5点法将待检菌接种于诱导琼脂平板表面，置36±1℃中16-24h培养。次日取出单相诱导平板未见菌体呈蔓延生长且未与H:2诊断血清凝集者需继续做单相诱导直至第3代为止。
结果解释和书写规范
忽略 H 相单相诱导的简易报告：
1、当O:4、O:5和H:b均凝集且酒石酸钾鉴别管为阴性者报告：乙型副伤寒沙门菌（血清型）（Salmonella serotype Paratyphi B）；
2、当O:4、O:5和H:b均凝集但酒石酸钾鉴别管为阳性者可以立即报告：乙型副伤寒爪哇变种沙门菌（血清型）（Salmonella serotype Paratyphi B var Java）；
最终报告：
1、当O:4、O:5和H:b、H:2（3代内）均凝集且酒石酸钾鉴别管为阴性者报告：乙型副伤寒沙门菌（血清型）（Salmonella serotype Paratyphi B）；
2、当O:4、O:5和H:b均凝集、H:2（3代内）不凝集且酒石酸钾鉴别管为阴性者报告：乙型副伤寒沙门菌单相变种（血清型）（Salmonella serotype Paratyphi B var）；
3、当O:4、O:5和H:b、H:2（3代内）均凝集且酒石酸钾鉴别管为阳性者报告：乙型副伤寒爪哇变种沙门菌（血清型）（Salmonella serotype Paratyphi B var Java）；
4、当O:4、O:5和H:b均凝集、H:2（3代内）不凝集且酒石酸钾鉴别管为阳性者报告：乙型副伤寒爪哇变种沙门菌（血清型）（Salmonella serotype Paratyphi B var Java）。

Claims (2)

1.乙型副伤寒沙门菌和乙型副伤寒爪哇变种沙门菌鉴定试剂盒，其特征是：包括：
1）、沙门菌B群免疫兔抗血清：含沙门菌O:4、O:5因子抗体的稀释血清；
2）、沙门菌H相免疫兔抗血清：含沙门菌H:b、H:2因子抗体的稀释血清；
3）、酒石酸钾生化鉴别管：蛋白胨10.0g，酒石酸钾钠10.0g，氯化钠5.0g，酚红0.024g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml；
4）、灭菌矿物油；
5）、H相专用诱导软琼脂：胰大豆胨蛋白胨10.0g，酪蛋白5.0g，硝酸钾1.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水1000.0ml；
6）、H相b因子诱导血清：含有诱导血清H:b因子。
2.根据权利要求1所述的乙型副伤寒沙门菌和乙型副伤寒爪哇变种沙门菌鉴定试剂盒，其特征为：
所述酒石酸钾生化鉴别管按如下步骤获得：将蛋白胨，酒石酸钾钠，氯化钠，琼脂和蒸馏水混合，加热溶化，调整pH为7.8，加入酚红过滤后分装试管，每管10.0ml，于115℃20min灭菌，直立冷却。
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