CN113122507B - 一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心elisa方法 - Google Patents

一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心elisa方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。本发明通过筛选不同配对抗体得到最佳配对抗体LBJ 3D4和TBU 1A7，以LBJ 3D4作为包被抗体，TBU 1A7‑HRP作为酶标抗体建立双抗体夹心ELISA方法。该方法具有较高的灵敏度，对铜绿假单胞菌具有较好的特异性，而对其他常见的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，即大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、空肠弯曲杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌没有交叉反应。本发明方法可用于食品及水中铜绿假单胞菌的检测，具有实际应用价值。

Description

一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
铜绿假单胞菌引发的各种类型的感染日益成为全球主要的健康问题。铜绿假单胞菌是机会病原体，可引起多种感染，包括败血症，呼吸道感染，心内膜炎，尿路感染和中枢神经系统感染，尤其是在患有严重烧伤或由于癌症或囊性纤维化免疫受损的患者中。铜绿假单胞菌的扩散是由于患者通过接触受污染的物体或使用受污染的食物和水而引起的。更重要的是，铜绿假单胞菌是一种普遍存在的细菌，大多数普遍存在于潮湿的环境中，例如土壤，水和某些食物中。此外，根据欧洲共同体和食品法典委员会的规定，所有水和食物中均应不含铜绿假单胞菌。因此，为了确保食品安全并保护人类健康，迫切需要一种快速，特异性和灵敏的铜绿假单胞菌检测方法。
一种基于“金标准”培养的铜绿假单胞菌的传统检测方法应用于铜绿假单胞菌的检测。然而，该方法不能达到所需的期望灵敏度，并且该方法涉及一系列繁琐的过程，包括样品制备，富集，细菌培养和目标细菌鉴定。整个过程本质上是劳动密集型且耗时的，因此不适用于某些情况，并且可能导致2-3天的检测延迟。基于核酸的方法已被广泛使用，包括聚合酶链反应(PCR)、多重PCR和回路介导的等温扩增(LAMP)。基于核酸的方法涉及复杂的步骤，例如DNA提取，PCR扩增和凝胶电泳。尽管已知PCR方法可以为病原体检测提供敏感的结果，但是它需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，这使其不适合现场检测。由于生物传感器的高灵敏度和特异性，它已被广泛认为是一种非常有希望的病原体检测分析工具。但高度依赖于复杂的仪器和分析系统。另外，生物传感器方法还面临高成本，对食物基质的敏感性以及可再现性差的问题。作为一种选择，基于抗原-抗体相互作用的免疫学检测方法因其高灵敏度，特异性和简单性而被广泛用于病原体的检测。它们具有许多优势，例如高通量检测，使用相对便宜的设备以及测试结果的准确性。基于双抗夹心的酶联免疫吸附测定(ELISA)最常用于微生物检测，其中需要一对抗体(标记的捕获单克隆抗体和固定的检测单克隆抗体)来鉴定不同的抗原结合位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，其稳定性好、成本低、能同时检测大批量样本，为检测食品中和水中铜绿假单胞菌提供了免疫学方法。
本发明的技术方案如下：为实现上述目的，本发明建立了一种基于单克隆抗体的检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，包括对检测方法的优化。
其中，单克隆抗体是采用灭活的铜绿假单胞菌作为免疫原免疫6-8周龄的BALB/c小鼠并经杂交瘤技术融合、筛选得到的。
所述灭活的铜绿假单胞菌具体包括铜绿假单胞菌(CICC 21625)，铜绿假单胞菌(CICC 10351)，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，铜绿假单胞菌(ATCC 15442)，铜绿假单胞菌(ATCC 25619)和铜绿假单胞菌(CICC 10299)，均为公开菌株。
其中，用于配对的抗体是通过优化不同配对抗体浓度进行夹心法配对，并通过多次重复试验确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。具体如下：
一株铜绿假单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株LBJ 3D4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCCNo.20781。
一种铜绿假单胞菌杂交瘤细胞株LBJ 3D4单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.20781的杂交瘤细胞株LBJ 3D4分泌产生，具体由灭活铜绿假单胞菌免疫制备而得。
一株铜绿假单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株TBU 1A7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCCNo.20782。
一种铜绿假单胞菌杂交瘤细胞株TBU 1A7单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.20782的杂交瘤细胞株TBU 1A7分泌产生，由灭活铜绿假单胞菌免疫制备而得。
本发明方法的检测分析原理是：酶标板上包被了识别包被抗体LBJ 3D4，该抗体识别铜绿假单胞菌可特异性捕获铜绿假单胞菌。
本发明检测时，洗板2-4次，洗去未结合的抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板2-4次，加入样品和对照，37℃孵育1h；洗板2-4次，加入酶标抗体TBU 1A7-HRP，37℃孵育1h；TBU 1A7-HRP识别铜绿假单胞菌，可与板上的铜绿假单胞菌反应。洗板2-4次，加入显色液显色12min。
如果样品含有铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌被包被抗体LBJ 3D4捕获并与酶标抗体TBU 1A7-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸光值(P/N≥2.1)，并被判定为阳性；如果样品中铜绿假单胞菌浓度较低(P/N＜2.1)，被判定为阴性。
具体步骤如下：
(1)铜绿假单胞菌单克隆抗体细胞株的制备：用灭活的铜绿假单胞菌为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选采用不同的铜绿假单胞菌菌株及常见的革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌测试细胞株的交叉反应并挑选具有高特异性的细胞株进行亚克隆，最终得到了10株铜绿假单胞菌特异性单克隆抗体；
(2)单克隆抗体的配对筛选：10株铜绿假单胞菌单克隆抗体纯化后分别标记辣根过氧化物酶HRP，非间接竞争ELISA鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体浓度4μg/mL；包被液为pH 9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度107CFU/mL；标品稀释液pH 7.4、0.01M的PBS；酶标抗体浓度2μg/mL，在此条件下，最高P/N值为14.75的配对抗体为LBJ 3D4和TBU 1A7；
(3)铜绿假单胞菌夹心ELISA方法的建立：用包被抗体LBJ 3D4和酶标抗体TBU1A7-HRP建立了铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA分析方法；具体参数如下：
包被抗体LBJ 3D4包被浓度：4μg/mL；
包被液：pH 9.6、0.01M碳酸盐缓冲液；
标品稀释液：pH 7.4、0.01M的PBS；
酶标抗体TBU 1A7-HRP浓度：2μg/mL；
反应时间：包被、封闭：37℃、2h；标准品：37℃、1h；酶标抗体37℃、1h；显色：12min。
该ELISA对铜绿假单胞菌(CICC 21625)，铜绿假单胞菌(CICC 10351)，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，铜绿假单胞菌(ATCC 15442)，铜绿假单胞菌(ATCC 25619)，铜绿假单胞菌(CICC 10299)均具有交叉反应。另外，与大肠杆菌O157：H7，金黄色葡萄球菌，单增生李斯特菌，阪崎肠杆菌，副溶血性弧菌，空肠弯曲杆菌，鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌无交叉反应。
该ELISA的检测限(P/N≥2.1)为1.37×104CFU/mL，检测范围为1.37×104CFU/mL～1.0×107CFU/mL。
本发明的有益效果：本发明提供的铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，对铜绿假单胞菌具有较好的特异性，稳定性好、成本低、能同时检测大批量样本，为检测食品中和水中铜绿假单胞菌提供了免疫学方法。本发明的成果可用于食品及水中铜绿假单胞菌的检测，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株铜绿假单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株LBJ 3D4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20781。
一株铜绿假单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株TBU 1A7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCCNo.20782。
附图说明
图1铜绿假单胞菌的双抗夹心ELISA标准曲线。
图2铜绿假单胞菌的双抗夹心ELISA交叉反应。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例中所述的铜绿假单胞菌菌株购于中国工业微生物保藏中心(CICC)，中国普通微生物保藏中心(CGMCC)，美国模式培养物集存库(ATCC)。单克隆抗体细胞株保存于中国普通微生物保藏中心(CGMCC)。
实施例1单克隆抗体的制备：
(1)实验动物：选用6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫；
(2)完全抗原的制备：将铜绿假单胞菌接入100mL LB肉汤培养基中，180rpm，37℃下搅拌过夜，然后将铜绿假单胞菌在100℃的水浴中加热灭活15min，4℃，5000×g离心20min，从100mL过夜培养物中收获细菌，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于5mL PBS中，-20℃保存。
所述铜绿假单胞菌具体包括铜绿假单胞菌(CICC 21625)，铜绿假单胞菌(CICC10351)，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，铜绿假单胞菌(ATCC 15442)，铜绿假单胞菌(ATCC25619)和铜绿假单胞菌(CICC 10299)。
(3)乳化：将铜绿假单胞菌完全抗原与等体积弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。
(4)动物免疫：第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。
(5)采血：第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5μL+995μL抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价，选择效价高的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
(6)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1～4﹚×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(7)细胞筛选：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA(ic-ELISA)筛选出阳性细胞孔，第二步选用铜绿假单胞菌及其他常见的革兰氏阳性菌和阴性菌，用ic-ELISA对阳性细胞进行交叉反应的测定。选择对铜绿假单胞菌有较好特异性且对其他细菌无交叉反应的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。
(8)单克隆抗体的纯化与保存：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体，置于-20℃保存。
实施例2单克隆抗体效价测定
ic-ELISA反应过程，即抗体效价测定步骤：
(1)包被抗原用包被缓冲液稀释包被于96孔微孔板(100μL/孔)，37℃下孵育2h。随后，用洗涤缓冲液洗涤3次；
(2)将200μL封闭缓冲液添加到每个孔中，并在37℃下孵育2h。洗涤烘干待用，将血清系列稀释对应加入到酶标板的1-7行，第8行加入阴性血清，100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤、拍干；
(3)每孔加入100μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育30min后洗涤四次、拍干；
(4)将100μL显色液(TMB：底物溶液＝1：5)，并在黑暗中于37℃孵育15min。随后加入2M硫酸(50μL/孔)终止反应。用酶标仪测定450nm处吸光值。最后得到最高P/N值为14.75的配对抗体为LBJ 3D4和TBU 1A7。
实施例3铜绿假单胞菌双抗体夹心ELISA测定步骤
(1)包被：用浓度为4μg/mL的单克隆细胞株编号为LBJ 3D4的抗体包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜；
(2)洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板；
(3)封闭：加入200μL/孔封闭液，37℃孵育2h；
(4)洗涤：同(2)；
(5)样品：用PBS将铜绿假单胞菌稀释成107CFU/mL，再三倍进行梯度稀释；另设一个PBS空白对照。每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；
(6)洗涤：同(2)；
(7)加酶标抗体(TBU 1A7-HRP，2μg/mL)，100μL/孔，37℃反应1h；
(8)洗涤：同(2)；
(9)显色：加底物TMB 100μL/孔，显色12min；
(10)终止：加终止液50μL/孔；
(11)测定：用酶标仪检测OD450nm。
溶液的配置：碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/L pH7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween–20；
PBST：含0.05％Tween–20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
交叉反应测定：总共使用了铜绿假单胞菌(CICC 21625)，铜绿假单胞菌(CICC10351)，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，铜绿假单胞菌(ATCC 15442)，铜绿假单胞菌(ATCC25619)，铜绿假单胞菌(CICC 10299)和其他八种常见的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌菌株即大肠杆菌O157：H7，金黄色葡萄球菌，单增生李斯特菌，阪崎肠杆菌，副溶血性弧菌，空肠弯曲杆菌，鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌来评估该ELISA的特异性。将所有测试菌株在0.01M PBS中稀释至1.0×108CFU/mL。
试验结果如下：
1、标准曲线：本发明建立的铜绿假单胞菌双抗体夹心ELISA方法的检测限(P/N≥2.1)为1.37×104CFU/mL，检测范围为1.37×104CFU/mL～1.0×107CFU/mL。铜绿假单胞菌双抗夹心ELISA标准曲线如图1所示。
2、交叉反应：对铜绿假单胞菌(CICC 21625)，铜绿假单胞菌(CICC 10351)，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，铜绿假单胞菌(ATCC 15442)，铜绿假单胞菌(ATCC 25619)，铜绿假单胞菌(CICC 10299)均具有交叉反应。另外，与大肠杆菌O157：H7，金黄色葡萄球菌，单增生李斯特菌，阪崎肠杆菌，副溶血性弧菌，空肠弯曲杆菌，鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌无交叉反应。铜绿假单胞菌的双抗夹心ELISA交叉反应如图2所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一株铜绿假单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株LBJ 3D4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCCNo.20781。
2.一种铜绿假单胞菌杂交瘤细胞株LBJ 3D4单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No. 20781的杂交瘤细胞株LBJ 3D4分泌产生。
3.一株铜绿假单胞菌单克隆抗体杂交瘤细胞株TBU 1A7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCCNo.20782。
4.一种铜绿假单胞菌杂交瘤细胞株TBU 1A7单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求3所述保藏编号为CGMCC No. 20782的杂交瘤细胞株TBU 1A7分泌产生。
5.一种用于检测铜绿假单胞菌的检测试剂盒的制备方法，其特征是：具体用权利要求2所述铜绿假单胞菌LBJ 3D4单克隆抗体作为包被抗体，权利要求4所述铜绿假单胞菌TBU1A7单克隆抗体作为酶标抗体，采用铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法，进行检测。
6.权利要求5所述用于检测铜绿假单胞菌的检测试剂盒的应用，其特征是：通过快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心ELISA方法检测其在食品中的残留，步骤如下：
（1）包被：用铜绿假单胞菌LBJ 3D4单克隆抗体作为包被抗体包被酶标反应板，100μL /孔，4℃过夜；用PBST洗涤反应板2-4次，然后甩干反应板；加入200μL/孔封闭液，37℃孵育2h；再次用PBST洗涤反应板2-4次，然后甩干反应板；
（2）加样品：准备待测样品，另设一个PBS空白对照；每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；用PBST洗涤反应板2-4次，然后甩干反应板；
（3）加酶标抗体：在反应板内添加辣根过氧化物酶HPR标记的铜绿假单胞菌TBU 1A7单克隆抗体作为酶标抗体，100μL/孔，37℃反应1h；用PBST洗涤反应板2-4次，然后甩干反应板；
（4）显色：加TMB显色液100μL /孔，显色12min；加终止液50μL /孔；最后用酶标仪检测OD450nm。
7.根据权利要求6所述用于检测铜绿假单胞菌的检测试剂盒的应用，其特征在于：当P/N≥2.1时被判定为阳性，反之，P/N＜2.1则判定为阴性。
8.根据权利要求6所述用于检测铜绿假单胞菌的检测试剂盒的应用，其特征在于具体参数如下：
包被抗体LBJ 3D4包被浓度：4μg/mL；包被液：pH 9.6、0.01 M碳酸盐缓冲液；标品稀释液：pH7.4、0.01M的PBS；酶标抗体TBU 1A7-HRP浓度：2μg/mL。
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