CN105137075B - 空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条 - Google Patents

空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条 Download PDF

Info

Publication number
CN105137075B
CN105137075B CN201510573621.3A CN201510573621A CN105137075B CN 105137075 B CN105137075 B CN 105137075B CN 201510573621 A CN201510573621 A CN 201510573621A CN 105137075 B CN105137075 B CN 105137075B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gold
monoclonal antibody
pad
campylobacter jejuni
line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510573621.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105137075A (zh
Inventor
方水琴
万绍业
杨标
郭慧琴
胡永辉
刘箐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI HUIYUN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Original Assignee
SHANGHAI HUIYUN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI HUIYUN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD filed Critical SHANGHAI HUIYUN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority to CN201510573621.3A priority Critical patent/CN105137075B/zh
Publication of CN105137075A publication Critical patent/CN105137075A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105137075B publication Critical patent/CN105137075B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的金标垫、所述的金标垫上与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫，所述的纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其中，在所述的金标垫上设置有与胶体金耦联的单克隆抗体，所述的与胶体金耦联的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8457的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的检测线由单克隆抗体构成，所述的检测线的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8766的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对空肠弯曲菌的检测特异性和灵敏性均较高。

Description

空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种空肠弯曲菌，具体来说是一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条。
背景技术
空肠弯曲菌(campylobacter jejuni enteritis)是1973年Butzler等自腹泻病人粪便中分离出来，目前已认识其为人类腹泻的主要致病菌之一。空肠弯曲菌肠炎的发病率在发达国家超过细菌性痢疾，在发展中国家发病率几乎等同于细菌性痢疾。本菌作为重要的食源性致病菌，随着食物进入肠道后在含微量氧环境下迅速繁殖，主要侵犯空肠、回肠和结肠，侵袭肠粘膜，造成充血及出血性损伤，近年来观察到有些菌株能产生类似霍乱肠毒素，引起肠腔内液体分泌增加。
目前空肠弯曲菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但国内外目前尚无可运用于检测实践的快速检测产品。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，所述的这种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条解决了现有技术中检测空肠弯曲菌操作复杂，周期长的技术问题。
本发明提供了一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金标垫和所述的硝酸纤维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水垫紧密相连，所述的纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其中，在所述的金标垫上设置有与胶体金耦联的单克隆抗体，所述的与胶体金耦联的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8457的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的检测线由单克隆抗体构成，所述的检测线的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8766的杂交瘤细胞株分泌产生。
进一步的，所述的质控线由羊抗兔抗体或者羊抗鼠抗体组成。
进一步的，在所述的与胶体金耦联的单克隆抗体中，单克隆抗体与胶体金的质量体积比为12μg:1mL。
进一步的，检测线上单克隆抗体的浓度≥20μg/mL。
进一步的，所述的试纸条背面可设置一个起支撑作用的背板。
进一步的，所述的试纸条装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有检测孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
本发明还提供了上述空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品空肠弯曲菌中的应用。
附图说明
图1是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图；
图2是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金pH结果；
图3是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金结合量结果；
图4是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图；
图5是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的不同抗体组合结果；
图6是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条灵敏度结果；
图7是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果；
图8是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的模拟带菌结果。
具体实施方式
本发明的检测原理与结果判断过程为：若样本中有待测细菌，测定时样品处理液加在样品垫上，样品处理液按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的方向移动，流经金标垫时，使金标垫上的与胶体金耦联的单克隆抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜、吸水垫移动，与胶体金耦联的单克隆抗体可与样品中的细菌结合，形成免疫复合物，此免疫复合物流至检测线时，即被检测线的单克隆抗体所捕获，形成细菌+金标抗体+抗体的复合体，在硝酸纤维素膜上的检测线位置显出红色检测线条；此免疫复合物流经质控线时，即被质控线的固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜上的质控线位置显出红色质控线条。阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。
本发明的与胶体金耦联的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8457的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的检测线的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8766的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明包括具有与抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3、3G2D8H3G9的相应氨基酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
对于本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。抗空肠弯曲菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗空肠弯曲菌单克隆抗体CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab‘)2片段；抗体重链；抗体轻链。
本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，利用杂交瘤细胞系(CGMCC No.8457)或(CGMCC No.8766)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC12法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgC12。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3、3G2D8H3G9，其效价高(可以达到1:100000)，能够特异性地、高效地检测空肠弯曲菌，与出血性大肠杆菌O157:H7、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌、伊氏李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、火鸡沙门氏菌、宋内氏志贺、福氏志贺氏菌、阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌等共计91种病原细菌均无交叉反应，此为本发明的最大创新点。上述单克隆抗体3G2D8H3G9可以用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、纳米金颗粒标记，专一性地作为检测抗体使用。
本发明和已有技术相比较，其技术进步是显著的。本发明由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对空肠弯曲菌的检测特异性和灵敏性均较高。
以下结合附图介绍本发明的具体实施例：
首先介绍本发明实施例中所使用的试剂与仪器：
主要试剂
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG、TWEEN-20Sigma；BSA购于上海世泽生物科技有限公司；胶体金溶液购于上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135SMillipore；羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔购于上海生工生物工程股份有限公司；单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购于ZYMED Cat：90-6550；Lot.60907259。
空肠弯曲菌等标准菌株购买自美国菌物保藏中心(ATCC)、中国医学微生物保藏中心(CMCC)、中国工业微生物保藏中心(CICC)、质检总局检验检疫微生物保藏中心(IQCC)。
主要仪器
酶标仪SpectraMax M2购自Molecular Devices；Nanodrop 2000C购自ThermoScientific；点样仪AD6010购自BIO-DOT；扫描仪Phantom V9购自MICROTEK；恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogicTM LP 358BR5057购自BIO-RAD；单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
实施例1空肠弯曲菌单克隆抗体制备
1.免疫原和阳性标准品的准备
空肠弯曲菌(CICC No.22937)接种在布氏肉汤上，37℃、150r/min厌氧条件振荡培养17h，计数，加入0.3％甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整空肠弯曲菌(CICCNo.22937)浓度至5×109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为108cfu/ml作为阳性对照标准品，布氏肉汤为阴性对照标准品。
2.单克隆抗体的制备过程
(1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
(2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
(3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
(4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
(5)杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
(6)克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3－4次，直至阳性率达到100％。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2×106个杂交瘤细胞，7～10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体。
筛选出2株稳定分泌抗空肠弯曲菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为4C9E1G7H3(CGMCC No.8457，简称H3)和3G2D8H3G9(CGMCC No.8766，简称G9)，经过初步抗体配对实验后，对H3和G9进行亚类及亚型鉴定、测定浓度、相对分子质量，并对制备的单克隆抗体通过交叉反应进行特异性验证。
3.单克隆抗体纯化及鉴定
腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用Protein G Sepharose亲和层析法纯化；纯化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价(见表1)；再用SDS-PAGE分析纯度，5％积层胶，10％分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察结果(见图1(Lane1:4C9E1G7H3，Lane3:3G2D8H3G9))。
表1.两株单克隆抗体效价测定结果(OD450)
4.单克隆抗体的亚型鉴定
(1)抗原包被:用0.01M PBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50μl，4℃包被过夜，次日弃去孔内液体，洗板3遍。
(2)封闭:每孔加入1％BSA 200μl，4℃封闭过夜。次日拍干板子不洗板。
(3)加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50μl。37℃，孵育1h。
(4)洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM，κ，λ，37℃孵育1h。
(5)洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG(H+L)，37℃，孵育30min。
(6)洗板4遍后，加入100μl底物显色液，37℃，避光显色10min。于450nm波长下读取结果。
如表2所示，H3属于IgG2a亚类，G9属于IgG1亚类，轻链亚型均为κ。
表2.两株单克隆抗体亚类鉴定结果
5.单克隆抗体交叉反应的测定
(1)抗原包被:将96种108cfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌加3各孔，每孔100μl，4℃，包被过夜。
(2)封闭:洗板3遍后，每孔加入3％BSA 200μl，37℃孵育2h。
(3)洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100μl，37摄氏度孵育1h。
(4)洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μl，37摄氏度孵育1h。
(5)洗板4遍。加入底物显色液，37℃，避光显色15min。于450nm波长下读取结果，结果见表4。
表4.两株单克隆抗体交叉反应检测结果
实施例2胶体金试纸条抗体最优组合的确定
1.各抗体偶联胶体金的最佳pH的确定
分别取100μL胶体金溶液于96孔板8个孔中，并调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每孔加入10μL浓度为1mg/mL的单克隆抗体。反应5min，各孔加入10μL 10％NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。
图2中各组从左到右的孔中pH值依次为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。由图2得知，A组为不同pH值下单克隆抗体H3胶体金标记的结果，当pH为7.5-8.0时，孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即H3单抗偶联胶体金最佳pH范围为7.5-8.0；B组为不同Ph值下单克隆抗体G9胶体金标记结果，当pH为7.5时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即G9偶联胶体金最佳pH为7.5。
2.各抗体偶联胶体金的最佳结合量的确定
调节胶体金溶液pH至步骤(1)中得到的各抗体偶联的最佳pH值，各取100μL于96孔板中，按表5加入各抗体，反应5min，各孔加入10μL10％NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，结果如图3所示。取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/mL，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+x×20％为最佳结合量。
表5抗体与胶体金偶联最佳结合量
编号 1 2 3 4 5 6 7
胶体金溶液(μL) 100 50 100 100 100 100 100
抗体质量/金溶液体积(μg/mL) 0 0 5 10 15 20 25
10％NaCL(μL) 10 0 10 10 10 10 10
由图3得知，抗体质量/金溶液体积为0μg/mL时，加入10％NaCl后各组孔1中胶体金均出现聚沉，颜色由红色变灰，最后变为无色；各组孔2为50μL胶体金原液作对照。当抗体质量/金溶液体积由5μg/mL增加至25μg/mL时，各组孔中胶体金颜色依次变红变深，其中，A组H3抗体添加量≥10μg/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3，即H3最小结合量为10μg/mL，则其最佳结合量为12μg/mL；B组G9抗体添加量≥20μg/mL时，颜色变化较小，且均红于孔3、4、5，即G9最佳结合量为24μg/mL。
3.抗体的胶体金标记
胶体金pH调节至最佳pH值，按步骤(2)中确定的最佳结合量吸取抗体以40μL/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌30min，加入金溶液1/10体积的含10％BSA的PBS溶液，搅拌1h，移入离心管4000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清13000rpm离心25min，弃上清，沉淀用重悬液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用，如需保存较长时间，可加入0.3％叠氮化钠。
4.空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的组装及测定
图4是本发明空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。
如图4所示，空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条10包括：样品垫14、金标垫13、硝酸纤维素膜12、检测线16，质控线15以及吸水垫11，在吸水垫11与金标垫13的中间设置硝酸纤维素膜12，硝酸纤维素膜也称NC膜。硝酸纤维素膜12上具有质控线15和检测线16，检测线16靠近样品垫14一侧。另外空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条10还具有背衬(图中未显示)，用于承载上述的样品垫14等结构。
将步骤3中制备好的金标抗体分别喷涂于多个检测试纸条的金标垫上，记为H3-Au-pad、G9-Au-pad，将各抗体均稀释至1mg/mL，分别包被硝酸纤维素膜12上作为Testline，即检测线，也称T线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠抗体作为金标单抗试纸条的Control line，即控制线，也称C线。也可以用以羊抗兔抗体作为金标多抗试纸条的Control line。按表6中的组合方式对金标垫和检测线喷涂抗体，组装试纸条，将培养好的菌液用生理盐水稀释至108、107、106CFU/mL进行测定，无菌生理盐水作阴性对照，选择最优的抗体组合。表5中金标垫一列中的H3-Au-pad代表将单克隆抗体H3作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，G9作为检测线；G9-Au-pad代表将单克隆抗体G9作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，H3作为检测线。
表6抗体不同配对组装试纸条
图5是本发明空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体组合配对结果。如图5所示，其中，A为H3-G9组合结果；B为G9-H3组合结果。
图5中各组试纸条中从左至右分别为采用108、107、106、CFU/mL以及无菌生理盐水进行测试的结果，由图5可知，A组合灵敏度可达106CFU/mL，且无假阳性，效果较好；B组合灵敏度可达107CFU/mL，且无假阳性，但其T、C线显色均较A组浅，综上，选用抗体组合效果较好的A组，即H3偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，G9喷涂于NC膜作T线来制作本发明的空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条。
5.试纸条灵敏度测定
将培养好的菌液用生理盐水依次稀释至108、107、106、105CFU/mL，不同浓度菌液均以35μL分别滴加至使用A组单抗组合制作的试纸条的样品垫上进行检测，使用无菌生理盐水为阴性对照，并重复三次。
由图6可知，滴加浓度为108、107、106CFU/mL菌液后，试纸条T线显色，滴加105CFU/mL菌液T线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达106CFU/mL，三次重复结果均为106CFU/mL，灵敏度稳定性较好。
6.试纸条交叉反应实验
利用以下食源性致病菌对制备的试纸条进行交叉反应实验：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC 29213、ATCC 27660)、大肠杆菌O157:H7Escherichia coliO157:H7(ATCC 43895、ATCC 43889)、单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes(ATCC 43251、ATCC 13932、ATCC 19112、ATCC 19114、ATCC 19116、ATCC 19117、ATCC19115)、猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis(CICC 21493)、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhiumukriunm(CICC 22956、ATCC 14028)、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis(ATCC 13076)、福氏志贺氏菌Shigella flexneri(ATCC 12022)、宋内氏志贺氏菌Shigella sonnei(ATCC 25931)、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae(野生分离株)、鲍氏志贺氏菌Shigella boydii(ATCC 9207)、小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersiniaenterocolitica(ATCC 23715、CMCC 52207)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus(ATCC 17802)、坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii(ATCC 29004、ATCC 29554)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni enteritis)(CICC 22937、ATCC 29428、ATCC33291、ATCC33560、CICC 6071)、乙型溶血性链球菌(Streptococcus Hemolyticsβ)(ATCC10373)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylor)(ATCC 43504)。
用制备好的试纸条检测31株培养至108CFU/mL的细菌并观察结果。
图7是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果。
由图7可知，35μL浓度为108CFU/mL的空肠弯曲菌(CICC 22937、ATCC 29428、ATCC33291、ATCC 33560、CICC 6071)菌液滴加到样品垫后，T线均显色，其他26株细菌相同浓度相同体积加样后，T线均未显色，结果表明，该试纸条可以专一检测空肠弯曲菌，而和其它食源性致病菌无交叉反应，且试纸条性能稳定，是一种较好的空肠弯曲菌快速检测产品。
实施例3免疫胶体金试纸条模拟带菌实验
为了进一步验证本发明的胶体金试纸条的实际检测性能，培养空肠弯曲菌浓度至108CFU/mL，用生理盐水梯度稀释至103CFU/mL后各取100μL分别加入到25g(mL)的市售面包、果冻及牛奶中，按照国标GB 4789.9-2014《食品微生物学检验空肠弯曲菌》分别向各样品中加入225mL布氏肉汤，36℃微需氧培养22h，期间每隔1h各取10mL样品待检，分别取各样品各时间段培养物40μL滴加至样品垫进行检测。实验结果在图7中依次左至右排列，用PBS作为阴性对照(每组排列在最后一个)。
由图8可知，A组面包样品增菌2-5h时，试纸条T线无显色，增菌6-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU空肠弯曲菌的面包样品在增菌液中增菌6h即可被检出；B组牛奶样品增菌2-6h时，T线无显色，增菌7-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU空肠弯曲菌的牛奶样品在增菌液中增菌7h可被检出；C组果冻样品增菌2-7h时，T线无显色，增菌8-12h，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU空肠弯曲菌的果冻样品在增菌液中增菌8h可被检出，三组模拟带菌检测中作为阴性对照的PBS均未显色。以上结果说明本发明的空肠弯曲菌对实际样品具有很好的检测能力。
综上所述，本发明筛选出了二株单克隆抗体，并通过实验验证，从中选取了综合效果最好的两株单克隆抗体，其中H3作为金标抗体，G9作为检测抗体，制成免疫胶体金试纸条。实验表明此种试纸条具有无交叉反应和灵敏度高的特点，并且在实际空肠弯曲菌检测中表现出良好的检测性能和运用价值。
生物材料的保藏
本发明的一种杂交瘤细胞株，分类命名：抗空肠弯曲菌杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2013年11月15日，保藏号为CGMCC NO.8457。
本发明的一种杂交瘤细胞株，分类命名：抗空肠弯曲菌杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2014年1月9日，保藏号为CGMCC NO.8766。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金标垫和所述的硝酸纤维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸收垫紧密相连，所述的硝酸纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的硝酸纤维素膜上设置检测线，其特征在于：在所述的金标垫上设置有与胶体金耦联的单克隆抗体，所述的与胶体金耦联的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8457的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的检测线由单克隆抗体构成，所述的检测线的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.8766的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.根据权利要求1所述的一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述的质控线由羊抗兔抗体或者羊抗鼠抗体组成。
3.根据权利要求1所述的一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：在所述的与胶体金耦联的单克隆抗体中，单克隆抗体与胶体金的质量体积比为12μg:1mL，检测线上单克隆抗体的浓度≥20μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条背面设置一个起支撑作用的背板。
5.根据权利要求1所述的一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有检测孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
6.根据权利要求1所述的一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品空肠弯曲菌中的应用。
CN201510573621.3A 2015-09-10 2015-09-10 空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条 Expired - Fee Related CN105137075B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510573621.3A CN105137075B (zh) 2015-09-10 2015-09-10 空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510573621.3A CN105137075B (zh) 2015-09-10 2015-09-10 空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105137075A CN105137075A (zh) 2015-12-09
CN105137075B true CN105137075B (zh) 2016-08-17

Family

ID=54722499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510573621.3A Expired - Fee Related CN105137075B (zh) 2015-09-10 2015-09-10 空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105137075B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105759047A (zh) * 2016-04-21 2016-07-13 卢连伟 一种快速检测空肠弯曲菌的免疫层析试纸条及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105137075A (zh) 2015-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69128463T2 (de) Monoklonaler antikörper gegen enterohämorrhagische escherichia coli o157:h7 und 026:h11 sowie nachweisverfahren
CN104316690B (zh) 副溶血性弧菌免疫胶体金快速检测试纸条
CN104991069B (zh) 果斑病菌免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株
CN105137075B (zh) 空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条
CN103792362B (zh) 出血性大肠杆菌o157:h7免疫胶体金快速检测试纸条
CN105777900B (zh) 果斑病菌单抗及其杂交瘤细胞株
CN103940995B (zh) 单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫检测试剂盒
CN105132282B (zh) 空肠弯曲菌免疫pcr检测试剂盒
CN103823062B (zh) 猪霍乱沙门氏菌酶联免疫检测试剂盒
CN103941012B (zh) 李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条
CN103941011B (zh) 检测单核细胞增生性李斯特菌的方法及其单抗
CN105223362B (zh) 空肠弯曲菌酶联免疫检测试剂盒
CN105353128B (zh) 一种同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素 a、b、c、d、e的胶体金试纸条及其制备方法
CN205038219U (zh) 一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条
CN103820549B (zh) 猪霍乱沙门氏菌免疫pcr检测试剂盒
CN104360066B (zh) 检测副溶血性弧菌的方法及其单抗
CN103941006B (zh) 猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条
CN105223363B (zh) 检测空肠弯曲菌的方法及其单抗
CN103937898B (zh) 单核细胞增生性李斯特菌免疫pcr检测试剂盒
CN103866033B (zh) 金黄色葡萄球菌免疫pcr检测试剂盒
CN109735462A (zh) 一种快速检测人畜共患病原菌气单胞菌属的双抗体夹心elisa方法
CN103823060B (zh) 出血性大肠杆菌o157:h7免疫pcr检测试剂盒
CN103823063B (zh) 检测猪霍乱沙门氏菌的方法及其单抗
CN103913572B (zh) 检测金黄色葡萄球菌的方法及其单抗
CN106596952A (zh) 猪霍乱沙门氏菌酶联免疫检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160817