CN104991069B - 果斑病菌免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株 - Google Patents

果斑病菌免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的金标垫、金标垫上与金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于纤维素膜另一端的吸水垫，纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其中，在金标垫上设置有与胶体金耦联的单克隆抗体，单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.10413的杂交瘤细胞株分泌产生，检测线由单克隆抗体构成，单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.10413的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明的果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条，由于采用了新筛选的单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，对果斑病菌的检测特异性和灵敏性均较高。本发明还涉及用于上述试纸条的单抗及其杂交瘤细胞株。<!-- 2 -->

Description

果斑病菌免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种瓜类细菌性果斑病菌，具体来说是一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株。
背景技术
瓜类果斑病是一种严重的细菌性病害，20世纪80年代后期该病因在美国数个州的西瓜上出现破坏性爆发而受到广泛关注，自此，瓜类细菌性果斑病在世界范围内传播开来。其病原为革兰氏阴性菌的嗜酸菌属燕麦种西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli,Aac)，是一种具有高度破坏性的种传病菌。到目前为止，并无可以完全抵抗该病菌的商业化的培育品种。
瓜类果斑病菌又称果斑病菌，它可以引起西瓜、甜瓜、南瓜等葫芦科植物患病，据报道，在番茄、茄子等茄科植物的种子中也检测到了该病原菌，它可侵染果实、植株及种子，主要依靠带菌种子传播。带菌种子播种后会使幼苗患病，出现褐色坏死斑。带菌果实在采后贮藏运输过程中会感染健康果实，表面会出现水渍状斑点，最终导致整个果实腐烂，严重影响瓜类产量。
目前市场上用于检测果斑病菌的试纸是来自美国Agdia公司，国内报道较少，且现有技术中的免疫胶体金试纸条所使用的抗体往往是使用单克隆抗体作为金标抗体和多克隆抗体作为检测抗体配合使用，因此存在着检测精度低和交叉反应高、试纸条有效期短等问题，对检测的精度和准确度造成了一些影响。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，所述的这种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条解决了现有技术中的试纸条检测瓜类细菌性果斑病菌灵敏度不高的技术问题。
本发明提供了一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的金标垫、所述的金标垫上与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫，所述的纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其中，在所述的金标垫上设置有与胶体金耦联的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.10413的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的检测线由单克隆抗体构成，所述的单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.10413的杂交瘤细胞株分泌产生。
进一步的，所述的质控线由羊抗鼠抗体组成。
进一步的，在所述的胶体金耦联的单克隆抗体中，单克隆抗体与胶体金在质量体积比为24μg:1mL。
进一步的，所述的试纸条背面可设置一个起支撑作用的背板。
进一步的，所述的试纸条装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有检测孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
本发明还提供了一种单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNO.10413的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCCNO.10413。
本发明的一种杂交瘤细胞株，分类命名：抗瓜类细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrullii)杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2015年3月19日，保藏号为CGMCCNO.10413。
本发明的检测原理与结果判断过程为：若样本中有待测细菌，测定时样品处理液加在样品垫上，样品处理液按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的方向移动，流经金标垫时，使金标垫上的与胶体金耦联的单克隆抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜、吸水垫移动，与胶体金耦联的单克隆抗体可与样品中的细菌结合，形成免疫复合物，此免疫复合物流至检测线时，即被检测线的单克隆抗体所捕获，形成细菌+金标抗体+抗体的复合体，在硝酸纤维素膜上的检测线位置显出红色检测线条；此免疫复合物流经质控线时，即被质控线的固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜上的质控线位置显出红色质控线条。
阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。
本发明人的研究表明，以西瓜斑菌菌株作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到保藏号为CGMCCNO.10413的杂交瘤细胞株，纯化后的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的效价可达到1:12800，其能够特异性、高效地与8种西瓜斑菌菌株结合，与3种Aac近缘植物病原菌均无交叉反应。
本发明和已有技术相比较，其技术进步是显著的。本发明的果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条，由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果表明，对果斑病菌的检测特异性和灵敏性均较高。
附图说明
图1是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图。
图2是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的腹水及纯化后抗体效价，其中2A表示腹水抗体的效价，2B表示纯化后抗体的效价。
图3是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金pH结果。
图4是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金结合量结果。
图5是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。
图6是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体组合配对结果。
图7是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条灵敏度结果。
图8是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条检测8种果斑病菌及交叉反应结果，其中8a表示试纸条检测8种果斑病菌的检测结果，8b表示试纸条检测3种Aac近缘植物病原菌的检测结果。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明的具体实施方式：
首先介绍本发明实施例中所使用的试剂与仪器：
主要试剂：
PEG、TWEEN-20来自Sigma；BSA来自上海世泽生物科技有限公司；胶体金溶液来自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135S来自Millipore；羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔来自生工生物工程股份有限公司。
主要仪器：
酶标仪SpectraMaxM2购自MolecularDevices；Nanodrop2000C购自ThermoScientific；点样仪AD6010购自BIO-DOT；扫描仪PhantomV9购自MICROTEK；恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogicTMLP358BR5057购自BIO-RAD；单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
实施例1果斑病菌单克隆抗体制备
1.免疫原准备
8种西瓜斑菌菌株先在脑心浸液液体培养基进行增菌培养，后在其固体培养基划线，挑单菌落于脑心浸液液体培养基中培养后进行PCR鉴定，并测定600nm处OD值，选取生长较快一株作为免疫菌株。灭菌生理盐水离心重悬3次，并调整菌浓度为108CFU/mL。
2.单克隆抗体的制备过程
1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.4mL免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
4)细胞融合：待融合小鼠摘眼球取血，分离血清作为阳性对照。小鼠脊椎脱臼处死取脾脏，用注射器研磨获得脾细胞悬液，与SP2/0细胞分别用无血清培养基离心重悬3次，并经血球计数板计数，按5:1混合后离心去上清，50％PEG进行融合，按105个/孔铺于已铺饲养层细胞的96孔板中，杂交瘤细胞采用HAT培养基筛选，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
5)杂交瘤细胞筛选：待细胞铺满孔底70％～80％时，取上清采用间接ELISA法测定，将强阳性孔再克隆，如此反复3～4次，直至阳性率达到100％。亚克隆过程改用HT培养基培养，间接ELISA法筛选，每次克隆筛选到的阳性孔扩大培养后冻存于液氮中。
6)抗体制备：将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2×106个杂交瘤细胞，7～10天小鼠腹部隆起，收集腹水，采用饱和硫酸铵及Protein-G柱亲和层析纯化腹水。
筛选出4株稳定分泌抗果斑病菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为6F、6D、7E、4F，分别进行亚类及亚型鉴定、测定浓度、效价、纯度，并对制备的单克隆抗体进行特异性验证。
3.单克隆抗体的亚型鉴定
通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定各抗体亚类、亚型，由间接ELISA测定结果可得，亚类均为IgG2a，轻链亚型均为κ。
4.单克隆抗体的纯化、纯度及效价检测
腹水先用饱和硫酸铵粗提后，再用ProteinGSepharose亲和层析法纯化，将制备纯化所得抗体6F、6D、7E、4F通过Nanodrop2000C测定仪测得浓度如表1，6F浓度为12mg/mL，6D浓度为4mg/mL，7E浓度为2mg/mL，4F浓度为10mg/mL。
表1单克隆抗体浓度
抗体编号 6F 6D 7E 4F
浓度(mg/mL) 12 4 2 10
用SDS-PAGE分析纯度，5％积层胶，10％分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色液脱色。图1是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图。如图所示，M为Marker，1、2、3、4分别为6F、6D、7E、4F电泳结果，可见，4株单克隆抗体分别都有一条约为50KDa的重链、一条约为25KDa的轻链，无多余的杂条带，表明腹水抗体中杂蛋白已经被除去，纯化后抗体纯度较高。
腹水及纯化后单克隆抗体效价测定的步骤如下：
1)将108CFU/mL细菌抗原在对应的孔中加入100μL，37℃2h。
2)倒空液体并拍干残留液体，用230μLPBST洗液清洗3次。
3)每个孔中加220μL3％BSA，37℃封闭1h。
4)倒空液体并拍干残留液体，用230μL洗液清洗3次。
5)每个孔中加100μL抗体(2mg/mL稀释1000倍)，37℃孵育1h。
6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加230μL洗液洗涤3次。
7)每个孔中100μL的HRP标记的二抗(sigma)，室温孵育1h。
8)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加230μL洗液洗涤3次。
9)每个孔中加100μL底物，显色15min，加终止液100μL并立即在OD450nm读数。
由图2所示，腹水抗体效价分别为1:102400、1:102400、1:25600、1：51200(图2A)，纯化后单抗(2mg/mL)效价分别为1:12800、1:6400、1:3200、1:6400图2B)。
5.单克隆抗体特异性测定
间接ELISA测定4株抗体对8种果斑病菌及3种Aac近源植物病原菌结合情况，结果见表2。
表2单克隆抗体的特异性
注：“+”为能结合，“-”为不结合
产生经过上述鉴定的果斑病菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6D4C5E9B9于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码：100101)，分类命名为“抗瓜类细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrullii)杂交瘤细胞株”，保藏号为CGMCCNo.10413。
二、胶体金试纸条抗体最优组合的确定
由于不同的抗体组合对胶体金试纸条检测灵敏度及品质优劣影响较大，因此，需对制备胶体金试纸条过程中所用抗体进行配对择优选择。
1.各抗体偶联胶体金的最佳pH的确定
分别取100μL胶体金溶液于96孔板8个孔中，并调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每孔加入5μL浓度为2mg/mL的单克隆抗体。反应5min，各孔加入10μL10％NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。
图3中各组从左到右的孔中pH值依次为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。由图3得知，a组当pH为7.5-8.0时，孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即6F单抗偶联胶体金最佳pH范围为7.5-8.0；b组当pH为7.5时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即6D偶联胶体金最佳pH为7.5；c组当pH为7.5时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无变色现象，即4F偶联胶体金最佳pH为7.5；7E标记失败。
2.各抗体偶联胶体金的最佳结合量的确定
调节胶体金溶液pH至步骤(1)中得到的各抗体偶联的最佳pH值，各取100μL于96孔板中，按表3加入各抗体，反应5min，各孔加入10μL10％NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/mL，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+x×20％为最佳结合量。
表3抗体与胶体金偶联最佳结合量
编号 1 2 3 4 5 6 7
胶体金溶液(μL) 100 50 100 100 100 100 100
抗体质量/金溶液体积(μg/mL) 0 0 5 10 15 20 25
10％NaCl(μL) 10 0 10 10 10 10 10
由图4得知，抗体质量/金溶液体积为0μg/mL时，加入10％NaCl后各组孔1中胶体金均出现聚沉，颜色由红色变灰，最后变为无色；各组孔2为50μL胶体金原液作对照。当抗体质量/金溶液体积由5μg/mL增加至25μg/mL时，各组孔中胶体金颜色依次变红变深，其中，a组6F抗体添加量≥10μg/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3，即6F最小结合量为10μg/mL，则其最佳结合量为12μg/mL；b组6D抗体添加量≥20μg/mL时，颜色变化较小，且均红于孔3、4、5，即6D最佳结合量为24μg/mL；c组4F抗体添加量≥15μg/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3、4，即4F最佳结合量为18μg/mL。
3.抗体的纳米金标记
胶体金pH调节至最佳pH值，按步骤(2)中确定的最佳结合量吸取抗体以40μL/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌30min，加入金溶液1/10体积的含10％BSA的PBS溶液，搅拌1h，移入离心管4000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清13000rpm离心25min，弃上清，沉淀用重悬液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用，如需保存较长时间，可加入0.3％叠氮化钠。
4.果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的组装及测定
图5是本发明果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。
如图5所示，果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条10包括：样品垫14、金标垫13、检测线16，质控线15以及吸水垫11，在吸水垫11与样品垫14的中间采用硝酸纤维素膜12，硝酸纤维素膜也称NC膜。硝酸纤维素膜12上具有质控线15和检测线16，检测线16靠近样品垫一侧。另外，果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条10还具有背衬(图中未显示)，用于承载上述的样品垫等结构。
将步骤3中制备好的金标抗体分别喷涂于多个检测试纸条的金标垫上，记为6F-Au-pad、6D-Au-pad、4F-Au-pad，将各抗体均稀释至2mg/mL，分别包被硝酸纤维素膜12上作为Testline，即检测线，也称T线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠作为金标单抗试纸条的Controlline，即控制线，也称C线。按表4中的组合方式对金标垫和检测线喷涂抗体，组装试纸条，将培养的果斑病菌SD01用生理盐水稀释至108、107、106CFU/mL进行测定，无菌生理盐水作阴性对照，选择最优的抗体组合。
表4中金标垫一列中：
6F-Au-pad代表将单克隆抗体6F作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上。
6D-Au-pad代表将单克隆抗体6D作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上。
4F-Au-pad代表将单克隆抗体4F作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上。
表4中的检测线纵列表示分别使用不同的抗体做检测线。
表4抗体不同配对组装试纸条
图6是本发明果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体组合配对结果。如图5所示，其中，a为6F-6F组合结果；b为6F-6D组合结果；c为6F-7E组合结果；d为6F-4F组合结果；e为6D-6F组合结果；f为6D-6D组合结果；g为6D-7E组合结果；h为6D-4F组合结果；i为4F-6F组合结果；j为4F-6D组合结果；k为4F-7E组合结果；l为4F-4F组合结果。
图6中各组试纸条中从左至右分别为采用108、107、106CFU/mL以及无菌生理盐水进行测试的结果，由图5可知，f组灵敏度可达106CFU/mL，且无假阳性，效果较好；a、b、c、e、l组灵敏度也可达106CFU/mL，且无假阳性，但其T、C线显色均较f组浅；d、g、j、k组T线均无显色，为假阴性；h、i组有假阳性出现，j、k、l组C线包被羊抗兔浓度较低或可能胶体金未能标记上多抗导致C线未显色，综上，选用抗体组合效果较好的f组，即6D偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，6D喷涂于NC膜作T线来制作本发明的果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条。
5.对f组，即6D偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，6D喷涂于NC膜作T线的组合，进行灵敏度测定实验。
将培养好的菌液用生理盐水依次稀释至108、107、106、105CFU/mL，不同浓度菌液均以50μL分别滴加至使用f组单抗组合制作的试纸条的样品垫上，进行检测，使用无菌生理盐水为阴性对照，并重复三次。
挑果斑病菌单菌落于培养基中，置于36℃摇床培养12h，平板菌落计数算得纯菌液浓度为4.1×108CFU/mL，由图7可知，滴加浓度为108、107、106CFU/mL菌液后，试纸条T线显色，滴加105CFU/mL菌液T线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达106CFU/mL，三次重复结果均为106CFU/mL，灵敏度稳定性较好。
6.对果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条特异性实验
此时果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条以单克隆抗体6D偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，单克隆抗体6D喷涂于NC膜作T线。用制备好的试纸条检测3株培养至108CFU/mL的细菌并观察结果。
图8中a是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条检测8种果斑病菌结果；b是本发明实施例中果斑病菌的免疫胶体金检测试纸条交叉反应结果。
由图8a可知，50μL浓度为108CFU/mL的8种果斑病菌(99-5，xj112，PSLB1，00-1，plsb91，TW31，ATCC29625，SD01)菌液滴加到样品垫后，T线均显色；由图8b可知，其他3株近源的植物病原菌(NCPPB961，ATCC33996，ATCC19307)相同浓度相同体积加样后，T线均未显色。结果表明，该试纸条可以专一检测8种果斑病菌(99-5，xj112，PSLB1，00-1，plsb91，TW31，ATCC29625，SD01)，特异性较好。
本发明筛选出了四株单克隆抗体，并通过实验验证，从中选取了综合效果最好的一株单克隆抗体，即6D作为金标抗体及检测抗体，制成免疫胶体金试纸条。实验表明此种试纸条无交叉反应，具有灵敏度高的特点。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的金标垫、所述的金标垫上与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫，所述的纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其特征在于：在所述的金标垫上设置有与胶体金耦联的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.10413的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的检测线由单克隆抗体构成，所述的单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.10413的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.根据权利要求1所述的一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述的质控线由羊抗鼠抗体组成。
3.根据权利要求1所述的一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：在所述的胶体金耦联的单克隆抗体中，单克隆抗体与胶体金在质量体积比为24μg:1mL。
4.根据权利要求1所述的一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条背面设置一个起支撑作用的背板。
5.根据权利要求4所述的一种瓜类细菌性果斑病菌免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有检测孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
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