CN104777302A - 瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条 - Google Patents

瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种瓜类细菌性果斑病的免疫层析检测试条，包括置于最下层的支撑底板，依次连接设置于该支撑底板上的样品缓冲层、覆载有标记蛋白的承载层、包被吸附层和液体吸收层，且在所述包被吸附层上设有至少一条测试线和质控线。所述瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条的特异性强，且快速、简便，应用范围广，便于推广应用，能够在基层地区广泛使用。

Description

瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条
技术领域
本发明涉及一种检测瓜类细菌性果斑病的器具，特别是涉及一种瓜类细菌性果斑病的免疫层析检测试条。
背景技术
瓜类细菌性果斑病病原为嗜酸菌属西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp.citrulli），病菌菌体短杆状，革兰氏染色阴性，不产生荧光，严格好氧，单根极生鞭毛；能在41℃下生长，不能在4℃下生长；在KB培养基上呈现乳白色、圆形、光滑、全缘、隆起、不透明菌落，菌落直径1～2mm。该病菌引起烟草过敏反应结果不一致，不产生精氨酸水解酶，明胶液化力弱，氧化酶和2－酮葡糖酸试验阳性。该病菌可附着在西、甜瓜种子表面，也可能侵入种子的内部组织，存活于种皮下的胚乳表层，在种子中的存活时间长，抗逆能力强。带菌种子为初次感染源，种子发芽后感染子叶和真叶，借助雨水、灌溉、田间操作使病菌自然接种到同株叶片或邻近的植株上而传播，幼果受感染后病斑不明显，但到果实成熟前病斑迅速扩大而失去商品价值，对西、甜瓜生产造成难以挽回的损失。
瓜类细菌性果斑病为典型的种传病害，从苗期到成株期均可发生，病果、病株、染病果皮及接触带菌果实的健康果实都会成为菌源，具有潜伏时期长、传播快和不易识别等特点，对西、甜瓜的种植造成巨大的威胁。现在该病已成为瓜类作物一种严重的世界性病害，在美国、澳大利亚、巴西、土耳其、泰国、以色列等国家和我国河北、山西、新疆、河南等多个省份和地区发生，因此我国也将细菌性果斑病定为检疫对象，进口或引种时应严格进行种子检疫。国内瓜类细菌性果斑病的检测方法主要有血清学检测和分子检测，血清学检测主要有ELISA法，其缺点是检测精度低、假阳性高，分子检测有免疫检测、PCR法、荧光定量PCR等，其优点是灵敏、准确、快速，缺点是对实验技术要求较高，对技术设备且需特定的仪器设备和专业技术人员。以上这些方法虽然有各自的优点，但是也都存在着明显的缺陷，很难在基层生产上推广。因此，瓜类细菌果斑病检测如何向快速、简便、高效又能够在基层广泛使用成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种特异、快速、简便的瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条，该检测试条应用范围广，便于推广应用，能够在基层地区广泛使用。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：
设计一种瓜类细菌性果斑病的免疫层析检测试条，包括置于最下层的支撑底板，提供整个产品骨架，依次连接设置于该支撑底板上的样品缓冲层、覆载有标记蛋白的承载层、包被吸附层和液体吸收层，且在所述包被吸附层上设有至少一条测试线和质控线。
根据上述的免疫层析检测试条，所述标记蛋白为抗细菌果斑病单克隆抗体IgG，所述测试线对应地由兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG制成；或者所述标记蛋白为兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG，所述测试线对应地由抗细菌果斑病单克隆抗体IgG制成。
根据上述的免疫层析检测试条，所述测试线的制成方法如下：用生理盐水将抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG或兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG配制成0.5～10mg/mL的溶液，再用单向喷点仪将该溶液按照0.5～1.5μL/cm的用量喷射在包被吸附层上，形成测试线。
根据上述的免疫层析检测试条，所述标记蛋白采用量子点标记法进行标记，且用于量子点标记的材料采用以下方法制备：选用Cd或Zn作为阳离子前驱体，Se或Te作为阴离子前驱体，以多官能团巯基小分子巯基乙酸、巯基丙酸、谷胱甘肽或半胱氨酸作为保护剂，通过加热回流三者混合溶液使量子点逐渐成核并生长，即得。
根据上述的免疫层析检测试条，所述标记蛋白在承载层上覆载方法如下：将量子点标记蛋白的重悬液用缓冲液稀释2倍，然后用单向喷点仪将其按照3～15μL/cm的用量喷射在承载层上，且使其喷到承载层上后能扩散成2～8mm宽，然后45℃鼓风干燥1小时后，即成；所述缓冲液含100mmol/L pH8.0 Tris-HCl、5wt% BSA、0.1wt% Triton X-100、5wt%蔗糖。
根据上述的免疫层析检测试条，所述质控线由抗种属特异性二抗IgG制成。
根据上述的免疫层析检测试条，所述质控线经由以下方法制成：用单向喷点仪将兔抗鼠或羊抗兔二抗蛋白按照0.5～1.5μL/cm的用量喷射在包被吸附层上形成对应的质控线。
根据上述的免疫层析检测试条，所述支撑底板由不吸水的硬质纸条或PVC材料制成，且其一面带有胶水涂层；所述包被吸附层由硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素膜、FUSION 5、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述承载层由玻璃纤维膜、FUSION 5或聚酯膜制成；所述液体吸收层由吸水纸、FUSION 5或吸水纤维制成；所述样品缓冲层由玻璃纤维膜、FUSION 5或聚酯膜制成。
根据上述的免疫层析检测试条，所述免疫层析检测试条的外部还设有保护材料层，由塑料胶膜或成型塑料制成。
根据上述的免疫层析检测试条，所述测试线和质控线的组合排列为“∣∣”、“··”或“+”形式。
本发明的积极有益效果：
(1)结果直观、可分级定量：本发明检测试条以鲜艳的红色或橙色（需在紫外光源激发下观测）“∣∣”、“··”或“+”等形式的印迹线作为结果显示，出现的检测线强度在一定范围内与被测样品中细菌性果斑病病原菌含量高低密切相关，结果判定直观准确。
(2)操作简便、快速：使用本发明检测试条时无需任何其它试剂，只要将其插入用稀释液稀释好的待检样品中10秒左右，在10分钟内即可在紫外光源激发下观测判定检测结果。不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。
(3)特异性强：本发明以量子点标记细菌性果斑病单克隆抗体（或多克隆抗体），测试线为细菌性果斑病多克隆抗体（或单克隆抗体）为基础制备而成，因此就保证了该免疫层析检测试条的反应特异性。
(4) 应用范围广，便于推广应用：本发明检测试条操作简单，不需要专业技术人员操作，按照使用说明人人可以操作，包括植物检疫、种植合作社到个体种植等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
附图说明
图1为本发明瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条的结构示意图。
图2为本发明瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条的俯视图。
图中，1：样品缓冲层，2：包被吸附层，3：液体吸收层，4：支撑底板，5：承载层，6：质控线，7：测试线。
具体实施方式
制备本发明瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条，首先需制备量子点标记的细菌性果斑病单克隆抗体IgG或多克隆抗体IgG，配合抗体测试线的细菌性果斑病多克隆抗体IgG或单克隆抗体IgG，从而制备蛋白标记承载材料层和测试线及质控线。
1.细菌性果斑病细菌的培养
细菌性果斑病Pslb-86菌株为中国农业科学院植物保护研究所赵廷昌研究员提供，菌株采样地点为新疆（2003年6月），寄主作物甜瓜，经常规方法纯化后置于取-80℃保存。
培养皿用报纸包起来，灭菌；取-80℃Pslb-86甘油菌株，将灭菌后的培养基倒入平板中，琼脂凝固后，倒置；接种环在酒精灯的火焰上烧红后，降温，取一环菌，在平板上划线；划线后的平板，倒置放入培养箱中进行活化培养；经LB固体平板37℃活化培养24～48h，接种于LB液体培养基中，于37°C震荡培养18h，获得菌液。
2.抗细菌性果斑病单克隆抗体的制备
以培养的细菌性果斑病细菌，按20μg/只的剂量免疫8周龄Balb/c小鼠，首免后每次加强免疫间隔2周，皮下和腹腔注射，第三次加强免疫2周后，ELISA测定血清抗体效价。最后一次加强免疫后间隔4周以上，细胞融合前4d，尾静脉和腹腔各注射免疫抗原50μg，用灭菌PBS稀释至体积为200μL。
细胞融合备用小鼠超免后第3天，拔下眼球放血，收集血清做阳性对照。断颈致小鼠死亡，75%酒精消毒体表。于超净台中，破开腹腔取出小鼠脾脏，用预热至37℃的GNK溶液洗1次；然后，将脾脏置于包裹120目尼龙纱布的小烧杯上，加少许基础培养基，用小剪刀剪碎并研磨脾脏，使脾细胞呈单个状态滤至小烧杯中，加适量GNK溶液并转至50mL尖底玻璃离心管中，用0.2%台盼蓝溶液染色计数法计数，并计算细胞活性，1000r/min离心8分钟洗涤细胞2次。要求细胞数量达1×108，细胞活性大于80%。将脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合于50mL离心管中，加35mL GNK溶液，1000r/min 离心8分钟，弃上清，打散细胞团。将此融合管放入37℃ 水浴中，用1mL吸管将预热的50% PEG（pH 8.0）缓慢滴加到融合管中，边加边轻轻摇动离心管，1分钟内滴加完毕，并继续在水浴中缓缓摇动融合管1～2分钟。立即缓慢滴加37℃ 预温的GNK溶液20mL。加入步骤依次为：1mL30s，3mL/30s，11mL/30s。慢慢补加GNK 溶液至50mL，37℃ 静置水浴5分钟，1000r/min 离8分钟，弃上清。加40mLHAT 吹打混匀，打散细胞团，加到含饲养细胞的96 孔细胞培养板上，每孔100μL，置37℃，5%CO2 培养箱中培养。融合后第7天用HAT半量换液一次，第10天 吸取20μL细胞培养上清，用间接ELISA 筛选，并补加HAT；第14天 用HT半量换液，同时对筛选阳性孔的细胞可转至24 孔培养板中扩大培养，准备亚克隆。在筛选的过程中可将HT逐渐换为RPMI-1640/10。间接ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。选择强阳性、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化。体外培养，将克隆化的细胞株扩大培养，待细胞浓度达5×105个/ mL时停止换液，直至细胞全部死亡，收集培养液，测定其ELISA效价。体内诱生腹水，给注射液体石蜡10天的小鼠腹腔注射克隆化细胞株106~107个细胞，2 周后抽取腹水，饱和硫酸铵提纯mAb IgG，核酸蛋白测量仪测定IgG含量后分装-20℃保存备用，并用间接ELISA法测单抗IgG效价。
3.抗细菌性果斑病多克隆抗体的制备
以纯化后的细菌性果斑病细菌，按200μg/只的剂量免疫健康兔，21d后二免，二免后16d按常规方法采血，分离血清饱和硫酸铵提纯IgG，核酸蛋白测量仪测定IgG含量后分装-20℃保存备用，并用间接ELISA法测定IgG效价。
4.量子点标记抗细菌性果斑病单克隆抗体
取500μL CdTe量子点溶液，缓慢滴加10mg/mL的EDC溶液100μL，室温下活化30min，然后加入待标记的抗细菌性果斑病单克隆抗体mAb IgG（浓度5.0mg/mL，使用前经10000r/min离心20分钟，除去沉淀）200μL。继续室温低速搅拌反应2h。然后加入10%的酪蛋白溶液200μL封闭，继续室温低速搅拌反应30min。反应结束后，收集溶液经0.22μm针头式滤器将样品过滤除团聚。之后收集流出液对0.01mol/L PBS pH7.4透析24h，收集透析后液体置冰箱避光冷藏备用。
5.量子点标记抗细菌性果斑病多克隆抗体
取500μL CdTe量子点溶液，缓慢滴加10mg/mL的EDC溶液100μL，室温下活化30min，然后加入待标记的抗细菌性果斑病多克隆抗体pAb IgG（浓度5.0 mg/mL，使用前经10000r/min离心20分钟，除去沉淀）200μL。继续室温低速搅拌反应2h。然后加入10%的酪蛋白溶液200μL封闭，继续室温低速搅拌反应30min。反应结束后，收集溶液经0.22μm针头式滤器将样品过滤除团聚。之后收集流出液对0.01mol/L PBS pH7.4透析24h，收集透析后液体置冰箱避光冷藏备用。
6.质控线、测试线和蛋白标记垫的制备
以抗体蛋白（抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG或多克隆抗体IgG），用生理盐水配制成0.5mg/mL～10mg/mL，然后用Bio-Dot X-only单向喷点仪将蛋白按照0.5～1.5μL/cm的用量喷射在包被吸附材料上，可根据需要做1条或多条隐形测试线，用Bio-Dot X-only单向喷点仪将兔抗鼠或羊抗兔二抗蛋白按照0.5～1.5μL/cm的用量喷射在包被吸附材料上做质控线。
用缓冲液（100mmol/L pH8.0 Tris-HCl，5% BSA，0.1% Triton X-100，5% 蔗糖溶液）将量子点标记蛋白的重悬液作2倍稀释。然后用Bio-Dot X-only单向喷点仪将蛋白标记的重悬液按照3~15μL/cm的用量喷射在预先裁好的规格为8mm×300mm的蛋白标记承载材料上，调节合适的气流大小及气动喷头喷嘴开度，使喷到蛋白标记承载材料上后能扩散成2～8mm宽，然后45℃鼓风干燥1小时后，制成蛋白标记垫，加入干燥剂密封、干燥、避光4℃保存。
7.抗兔IgG二抗的制备
以兔IgG免疫健康羊，21d后二免，二免后16d按常规方法采血，分离血清饱和硫酸铵提纯IgG，核酸蛋白测量仪测定IgG含量后分装-20℃保存备用，并用间接ELISA法测IgG效价。所得即为羊抗兔二抗。
8.细菌性果斑病免疫层析检测试条实施检测的反应原理
标记蛋白及配套测试线选择的组合模式一：用生理盐水稀释的待检样品（种子处理液、瓜皮处理液、或叶片处理液等）滴加到细菌性果斑病免疫层析检测试条的加样区，样品顺样品缓冲材料水平层析，会依次流过测试线以及质控线，最后到达液体吸收区。待检样品中：如果存在细菌性果斑病细菌，则与标记的抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG结合形成“细菌-量子点标记单抗”复合物，同时向液体吸收区移动，流经测试线（抗细菌性果斑病多克隆抗体IgG，pAb）时与多抗IgG再次发生特异性结合，形成“多抗-细菌-量子点标记单抗”复合物被拦截而聚集显色，通过调节测试线的浓度实现不同的拦截效率及拦截总量；样品中不存在细菌性果斑病细菌时，样品与标记的抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG同时向液体吸收区移动，流经测试线（抗细菌性果斑病多克隆抗体IgG）时不能被多抗IgG特异性结合，因而检测线不显色。无论样品中是否含细菌性果斑病细菌，到达质控线时标记的抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG均会被质控线（兔抗鼠IgG）所特异拦截显色而证明本次测试的有效性。
标记蛋白及配套测试线选择的组合模式二，反应原理如下：
用生理盐水稀释的待检样品（种子处理液、瓜皮处理液、或叶片处理液等）滴加到细菌性果斑病免疫层析检测试条的加样区，样品顺样品缓冲材料水平层析，会依次流过测试线以及质控线，最后到达液体吸收区。待检样品中：如果存在细菌性果斑病细菌，则与标记的抗细菌性果斑病多克隆抗体IgG结合形成“细菌-量子点标记多抗”复合物，同时向液体吸收区移动，流经测试线（抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG，mAb）时与单抗IgG再次发生特异性结合，形成“单抗-细菌-量子点标记多抗”复合物被拦截而聚集显色，通过调节测试线的浓度实现不同的拦截效率及拦截总量；样品中不存在细菌性果斑病细菌时，样品与标记的兔抗细菌性果斑病多克隆抗体IgG同时向液体吸收区移动，流经测试线（抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG）时不能被单抗IgG特异性结合，因而检测线不显色。无论样品中是否含细菌性果斑病细菌，到达质控线时标记的抗细菌性果斑病多克隆抗体IgG均会被质控线（羊抗兔IgG）所特异拦截显色而证明本次测试的有效性。
以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明，实施例中均以细菌性果斑病免疫层析检测试条为模板来具体说明实施案例。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条，参见图1、图2，包括置于最下层的支撑底板4，提供整个产品骨架，依次连接设置于该支撑底板4上的样品缓冲层1、覆载有标记蛋白的承载层5、包被吸附层2和液体吸收层3，且在所述包被吸附层2上设有测试线7和质控线6。
所述样品缓冲层1为玻璃纤维膜，包被吸附层2由硝酸纤维素膜制成，液体吸收层3为由吸水纸制成，支撑底板4为由单面带胶水涂层的硬质PVC条制成，承载层5由聚酯膜制成，其上喷涂有量子点标记的抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG，质控线6由兔抗鼠IgG制成，测试线7由兔抗细菌性果斑病多克隆抗体IgG制成，所述测试线和质控线的组合排列为“∣∣”。保护材料层由塑料胶膜制成，包裹在试条外表面，由于仅涉及到产品外观的形式，其核心内容一样，所以本示意图中未画出。
取种子处理液、瓜皮处理液或叶片处理液等用生理盐水做1: 10稀释作为待测样品。
检测操作方法：取待测种子或瓜皮或叶片1克，加生理盐水9mL，经充分剪碎或匀浆后静置分层取上清100μL加入细菌性果斑病免疫层析检测试条的样品缓冲层1，将细菌性果斑病免疫层析检测试条水平放置10分钟，观察反应结果。
检测结果判断：如果在包被吸附层2上只有图1中位置7未显色，表明检测样品中不含细菌性果斑病，为阴性结果；位置7出现一条检测条带，表明检测样品中含有细菌性果斑病，为阳性结果，且在一定范围内检测线强度和样品中细菌性果斑病含量呈正相关，即含量越高检测线强度越强；无论哪种情况，只要位置6的质控线未出线均表明本次检测无效，需重新检测。
实施例2
一种瓜类细菌性果斑病免疫层析检测试条，参见图1、图2，包括置于最下层的支撑底板4，提供整个产品骨架，依次连接设置于该支撑底板4上的样品缓冲层1、覆载有标记蛋白的承载层5、包被吸附层2和液体吸收层3，且在所述包被吸附层2上设有测试线7和质控线6。
所述样品缓冲层1为玻璃纤维膜，包被吸附层2由硝酸纤维素膜制成，液体吸收层3为由吸水纸制成，支撑底板4为由单面带胶水涂层的硬质PVC条制成，承载层5由聚酯膜制成，其上喷涂有量子点标记的兔抗细菌性果斑病多克隆抗体IgG，质控线6由羊抗兔IgG制成，测试线7由抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG制成，所述测试线和质控线的组合排列为“∣∣”。
取种子处理液、瓜皮处理液或叶片处理液等用生理盐水做1: 10稀释作为待测样品。
检测操作方法：取待测种子或瓜皮或叶片1克，加生理盐水9mL，经充分剪碎或匀浆后静置分层取上清100μL加入细菌性果斑病免疫层析检测试条的样品缓冲层1，将细菌性果斑病免疫层析检测试条水平放置10分钟，观察反应结果。
检测结果判断：如果在包被吸附层2上只有图1中位置7未显色，表明检测样品中不含细菌性果斑病，为阴性结果；位置7出现一条检测条带，表明检测样品中含有细菌性果斑病，为阳性结果，且在一定范围内检测线强度和样品中细菌性果斑病含量呈正相关，即含量越高检测线强度越强；无论哪种情况，只要位置6的质控线未出线均表明本次检测无效，需重新检测。
以上实施方式仅用于帮助本领域技术人员更加全面的理解本发明，但并不对本发明作任何限制。凡依照本发明的内容所做出的任何本领域等同的替换均属于本发明保护的范围之内。

Claims (10)

1. 一种瓜类细菌性果斑病的免疫层析检测试条，其特征在于：包括置于最下层的支撑底板，依次连接设置于该支撑底板上的样品缓冲层、覆载有标记蛋白的承载层、包被吸附层和液体吸收层，且在所述包被吸附层上设有至少一条测试线和质控线。
2. 根据权利要求1所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述标记蛋白为抗细菌果斑病单克隆抗体IgG，所述测试线对应地由兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG制成；或者所述标记蛋白为兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG，所述测试线对应地由抗细菌果斑病单克隆抗体IgG制成。
3. 根据权利要求2所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述测试线的制成方法如下，
用生理盐水将抗细菌性果斑病单克隆抗体IgG或兔抗细菌果斑病多克隆抗体IgG配制成0.5～10mg/mL的溶液，再用单向喷点仪将该溶液按照0.5～1.5μL/cm的用量喷射在包被吸附层上，形成测试线。
4. 根据权利要求2所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述标记蛋白采用量子点标记法进行标记，且用于量子点标记的材料采用以下方法制备：
选用Cd或Zn作为阳离子前驱体，Se或Te作为阴离子前驱体，以多官能团巯基小分子巯基乙酸、巯基丙酸、谷胱甘肽或半胱氨酸作为保护剂，通过加热回流三者混合溶液使量子点逐渐成核并生长，即得。
5. 根据权利要求2所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述标记蛋白在承载层上覆载方法如下：
将量子点标记蛋白的重悬液用缓冲液稀释2倍，然后用单向喷点仪将其按照3～15μL/cm的用量喷射在承载层上，且使其喷到承载层上后能扩散成2～8mm宽，然后45℃鼓风干燥1小时后，即成；所述缓冲液含100mmol/L pH8.0 Tris-HCl、5wt% BSA、0.1wt% Triton X-100、5wt%蔗糖。
6. 根据权利要求2所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述质控线由抗种属特异性二抗IgG制成。
7. 根据权利要求6所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述质控线经由以下方法制成：
用单向喷点仪将兔抗鼠或羊抗兔二抗蛋白按照0.5～1.5μL/cm的用量喷射在包被吸附层上形成对应的质控线。
8. 根据权利要求1所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述支撑底板由不吸水的硬质纸条或PVC材料制成，且其一面带有胶水涂层；所述包被吸附层由硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素膜、FUSION 5、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述承载层由玻璃纤维膜、FUSION 5或聚酯膜制成；所述液体吸收层由吸水纸、FUSION 5或吸水纤维制成；所述样品缓冲层由玻璃纤维膜、FUSION 5或聚酯膜制成。
9. 根据权利要求1所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述免疫层析检测试条的外部还设有保护材料层，由塑料胶膜或成型塑料制成。
10. 根据权利要求1所述的免疫层析检测试条，其特征是：所述测试线和质控线的组合排列为“∣∣”、“··”或“+”形式。
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