CN104593332B - 一种检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明“一种检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒及方法”，属于植物病原检测技术。包括试纸条和微孔板，所述试纸条包括底板、样本吸收垫、反应膜和吸水垫；所述样本吸收垫、反应膜、吸水垫依次黏贴安装在所述底板上；其特征在于：所述微孔板的微孔中有冻干的微孔试剂，所述微孔试剂指胶体金标记权利要求2所述的单克隆抗体而得的金标抗体；所述反应膜分为检测区和质控区，所述检测区包被有小麦矮腥黑粉菌多克隆抗体，所述质控区包被有抗抗体。本发明的试剂盒具有良好的特异性和非常低的检测限，适合于小麦矮腥黑粉菌的防控或检疫。
Description
技术领域
本发明涉及植物病原检测技术，特别是涉及检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒和方法。
技术背景
小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn，简称TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产具有毁灭性危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一(王圆.小麦矮腥黑穗病菌[M].中国进境植物检疫有害生物选编,中华人民共和国动植物检疫局和农业部植物检疫实验所编,北京:中国农业出版社,1997,95～98)。在小麦矮腥黑穗病流行年份引起的产量损失一般为20～50％，严重时可达75～90％，甚至绝产。病菌抗逆性极强，其冬孢子在土中可存活3～7年，包裹在菌瘿中的冬孢子甚至可保持活力长达10年以上。此病害一旦发生，很难防治或根除，所以国际上有15个国家将其列为检疫对象加以防范。我国从20世纪60年代开始一直将此病害列为一类对外检疫对象。在腥黑粉菌中，TCK与其近缘种小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等在形态学上极为相似，难于区别。
传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，利用分子生物学手段快速、准确地鉴别小麦矮腥黑粉菌具有重要的理论意义和实用价值。1996年Ferreira等(FerreiraM.A.,Tooley P.W.,Hatziloukas E.etc.Isolation of a species specificmitochondrial DNA sequence for identification of Tilletia indica,the Karnalbunt of wheat fungus[J].Application Environment Microbiology,1996,62:87～93)首次将PCR技术引进到印度腥黑穗病(Tilletia indicaMitra)的鉴定中来，他们选择了印度腥黑粉菌线粒体DNA的一个2.3kb的EcoRⅠ片段进行了克隆和测序，设计的特异性引物Ti1/Ti4从25种腥黑穗病菌菌株中鉴定出了印腥。另外，Smith 等(Smith O.P.,PetersonG.L.Beck R.J.etc.Development of a PCR-based method for identification ofTilletia indica,causal agent of karnal bunt of wheat[J].Phytopathology,1996,86:115～122)通过克隆印度腥黑粉菌线粒体DNA的DraⅠ片段，进行了序列分析，设计了两套寡核苷酸引物对Ti17/M1和Ti17/M2，能分别从印度腥黑粉菌中扩增出大小为825bp和118bp特异性片段，也实现了对印度腥黑穗病的检测鉴定工作。2000年Frederic等(FrederickR.D.,Snyder K.E.,Tooley P.W.Identification and Differentiation of Tilletiaindica and T.walkeri using the Polymerase Chain Reaction[J].Phytopathology,2000,90:951-960.)根据线粒体的差异设计了5对针对印度腥黑粉菌的特异性引物和3对针对黑麦草腥黑粉菌的特异性引物，分别能将印度腥黑粉菌菌株和黑麦草腥粉菌病菌株从其近缘属种中鉴别出来。张竞宇等(张竞宇,张正光,郑小波,等.小麦印度腥黑穗病菌的分子检测[J].高技术通讯，2004,1:31～36)利用核糖体ITS序列上的差异在Tilletia属20个种中设计了一对特异性引物T1/T2，能将T.indica和T.walkeri从其它种中区分开来，而后又根据T.indica和T.walkeri线粒体之间的差异设计了一对特异性引物M1/M2,可以将二者区分开来，为了使反应更为灵敏，建立了套式PCR技术，以便于提供更简单的鉴定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，张国珍，等.腥黑粉菌属3种检疫性真菌rDNA 2IGS区的扩增及其序列分析[J].植物病理学报，2006，36(5):407-412)依据核糖体的IGS1区特性，设计了一对特异性引物，可以将小麦光腥黑粉菌菌株从其近缘属种中鉴别出来。2004年高强(高强.小麦矮腥黑穗病的分子检测[D].长沙，湖南农业大学，2004)利用RAPD技术找到了一条可以将小麦网腥黑粉菌菌株和小麦矮腥黑粉菌菌株区别于其它黑粉菌株的条带，但是很遗憾在矮腥黑粉菌和网腥黑粉菌之间没有找到有差异的条带，没能将二者分开。2006年周业琴，刘素萍等(周业琴,刘素萍,周国梁,等.水稻腥黑粉病菌的单孢检测[J]。植物检疫,2006,20:38～41)应用核糖体ITS序列的通用引物Til1/Til4和两对特异性引物(Hor2/Hor9；Hm1/Hm5)结合建立了套式PCR技术，可以将水稻腥黑粉菌标定出来。本实验室陈万权、刘太国、刘建华利用AFLP技术，找到了小麦矮腥黑粉菌的特异性片段，能将小麦矮腥黑粉菌从其近缘属种中区分开来，该技术已经获得国家发明专利，专利号为：200510080073.7，但未报道其检测的灵敏度，尚未在海关检疫中应用。
酶联免疫检测方法，具有速度快，特异性好等优点，在病原菌检测中多有应用，但是该技术的特异性和灵敏性依赖于采用的抗体－抗原之间的特异性识别及捕获性能，以及影响胶体金显色的一些因素。具体在检测一种病原时，需要筛选或者制备得到特异性好的单克隆抗体，并对影响因素进行调整才有可能获得好的特异性和灵敏性。
发明内容
本发明基于酶联免疫检测技术，提供一种适用于检测矮腥黑粉菌的单克隆抗体，以及依赖该抗体的特异性好，灵敏度高的检测方法和试剂盒。具体方案如下：
一株杂交瘤细胞，其特征在于:用于分泌对小麦矮腥黑粉菌(Tilletiacontroversa Kühn)的单克隆抗体，名称为：F-2-1,其保藏号为CGMCC No.9714。
一种对小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn)的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞所分泌。
所述单克隆抗体在检测小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn)或者检测小麦矮腥黑穗病中的用途。
一种检测小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn)的试剂盒，包括试纸条和微孔板，
所述试纸条包括底板、样本吸收垫、反应膜和吸水垫；所述样本吸收垫、反应膜、吸水垫依次黏贴安装在所述底板上；
其特征在于：所述微孔板的微孔中有冻干的微孔试剂，所述微孔试剂指胶体金标记权利要求2所述的单克隆抗体而得的金标抗体；
所述反应膜分为检测区和质控区，所述检测区包被有小麦矮腥黑粉菌多克隆抗体，所述质控区包被有抗抗体。
所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。
一种检测小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于采用上述试剂盒对待测物进行检测，其步骤如下：
(1)制备待测样本溶液
(2)向所述微孔中滴加样本溶液，混匀，将所述试纸条上对应样本吸收垫的一端插入微孔中并接触到其中的微孔试剂，读取所述试纸条的检测结果判断待测样品是否含有小麦矮腥黑粉菌。
所述待测物为疑似携带小麦矮腥黑粉菌的小麦植株或其组织，所述制备待测样本溶液指：取小麦植株或其组织5g放入10mL PBS缓冲溶液中，并加入终浓度为质量体积百分比0.2％的助溶剂聚乙二醇2000，超声提取5-10分钟，取上清。
上述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)准备对小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体及多克隆抗体
(2)制备微孔试剂，样本吸收垫、反应膜和吸水垫，
(3)将样本吸收垫，反应膜和吸水垫依次黏贴安装在底板上；
其特征在于制备微孔试剂包括如下几部分：
胶体金溶液：在100ml质量百分比为0.01％的氯金酸水溶液中，加入1.5ml 1％的柠檬酸三钠溶液，加热搅拌冷却得胶体金溶液；
准备小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物：在磁力搅拌下，在所述胶体金溶液中加入0.2mol/L碳酸钾调pH值至7.2，按1ml胶体金加60μg抗体的标准向胶体金溶液中加入所述小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体，继续搅拌混匀30min,加入10％BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为体积百分含量为1％，静置30min；12000rpm、4℃离心30min,弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液重悬沉淀，得到的小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物溶液，置4℃备用；
所述复溶缓冲液：pH7.2，含牛血清白蛋白、吐温-20的0.05mol/L磷酸盐溶液，其中牛血清白蛋白的终浓度为体积百分含量0.05-0.10％，吐温-20的终浓度为质量百分含量0.05％；
微孔试剂：向微孔板的微孔中加入50μl所述小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，得到冻干有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
所述反应膜为醋酸纤维素膜，所述制备反应膜的工艺如下：
用pH为7.2、0.01mol/L磷酸盐缓冲液将小麦矮腥黑粉菌多克隆抗体稀释到1mg/mL，按照0.8μl/cm2的量包被，用点膜仪将其包被于醋酸纤维素膜上的检测区；用0.01mol/L、pH 7.4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到1mg/ml，按照0.8μl/cm的量包被，用点膜仪将其包被于醋酸纤维素膜上的质控区，将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥10h，备用。
所述制备样本吸收垫指将样本吸收垫置于pH为7.2，含体积百分含量0.5％牛血清白蛋白的0.02mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡，37℃烘2h备用。
本发明提供用于检测小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体，基于该单克隆抗体的对小麦矮腥黑粉菌的胶体金试纸条、检测方法以及试纸条的制备方法。
将小麦叶锈菌、小麦条锈菌用pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释。用试纸条进行检测，结果显示小麦叶锈菌、小麦条锈菌50mg/L浓度时，试纸条检测区不显色，呈阴性，可以得出试纸条未对这些相似病菌发生交叉反应，即对小麦矮腥黑粉菌具有特异性。本发明提供的试纸条具有对小麦矮腥黑粉菌的特异性，该试纸条的检测限能到10mg/L
基于本发明所提供的单克隆抗体对小麦矮腥黑粉菌所具有的良好的特异性，该单克隆抗体还可以用于基于酶联免疫反应原理的其它方法。
杂交瘤细胞保藏信息：
生物材料名称：F-2-1
分类命名：对小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体杂交瘤细胞株
保藏日期：2014年9月29日
保藏号:CGMCC No.9714
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
附图说明
图1本发明试纸条的结构剖示图
图2本发明试纸条的俯视图
图3本发明试纸条所显示的各种检测结果
具体实施方式
实施例1.测小麦矮腥黑粉菌胶体金试纸的制备
检测小麦矮腥黑粉菌胶体金试纸的构成
一、微孔试剂
微孔上具有微孔塞；微孔底部冻干有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物，冻干量50μl；
二、试纸条(图1)：
所述试纸条是由底板、样本吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；
所述样本吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上，样本吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样本吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；
所述试纸两端黏贴有保护膜。
保护膜7-1覆盖在吸水垫上手柄端，保护膜7-2覆盖在样本吸收垫上的检测端，在检测端保护膜上应有MAX字样(图2)。
所述反应膜上有检测区4和质控区5，检测区和质控区均为与所述试纸条的长相垂直的条带状，检测区位于近于有MAX标记线的保护膜的一侧，质控区位于远离所述有MAX标记的保护膜的一侧。检测区包被有小麦矮腥黑粉菌是多克隆抗体，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。
底板为PVC底板；样本吸收垫为玻璃纤维；吸水垫为吸水纸；反应膜为醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜。
检测小麦矮腥黑粉菌胶体金试纸的制备方法
该试纸的制备方法主要包括如下步骤：
1)制备冻干有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2)制备具有小麦矮腥黑粉菌的检测区和包被羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；
3)将2)制备好的反应膜与样本吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；
4)将1)小麦矮腥黑粉菌金标抗体微孔试剂进行封装，将3)试纸组装：反应膜贴于底板上，然后再依次贴上样品垫、吸水垫和保护膜，最后剪切成条即可，如图1所示。
下面分步详细叙述：
(一)各部件的制备
1.小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体的制备
a.动物免疫
选取6-8周龄健康Balb/c小鼠，按照免疫剂量为200μg/只进行皮下多点注射免疫。首次免疫时取等量弗氏完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5881)与免疫原(TCK1冬孢子)均匀混合，后续免疫时与等量弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5506)混合。
b.细胞融合和克隆化
采用间接竞争ELISA法测定小鼠血清的效价，包被原稀释1000倍，当血清测定效价高于3000时，取其脾细胞，按9:1比例(数量比)与SP2/0骨髓瘤细胞(购自中国遗传与发育生物学研究所)融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
经筛选得到小麦矮腥黑粉菌的小鼠杂交瘤细胞株F-2-1。该杂交瘤细胞株于2014年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.9714。该杂交瘤细胞株分泌的抗体针对黑粉菌特异性良好，灵敏度能达到5mg/L。
c.细胞冻存和复苏
将黑粉菌杂交瘤细胞株F-2-1用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的制备与纯化
将杂交瘤细胞株F-2-1置于pH7.4，含有20％小牛血清和0.2％碳酸氢钠的RPMI-1640培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
2.多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔(购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂)作为免疫动物，以黑粉菌作为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐(来源同上)混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂(来源同上)混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用辛酸-饱和硫酸铵法纯化得到多克隆抗体。
3.羊抗鼠抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
4.小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的制备
(1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成0.01％(质量百分含量)，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml 0.01％氯金酸加入1.5ml 1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
(2)小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.2，按60μg抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体，继续搅拌混匀30min,加入10％BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置30min。12000rpm、4℃离心30min,弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物溶液，置4℃备用。
复溶缓冲液：含牛血清白蛋白、吐温-20的0.05mol/L、pH7.2的磷酸盐溶液，其中牛血清白蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.05-0.10％(体积百分含量)，吐温-20在复溶缓冲液中的终浓度为0.05％(质量百分含量)。
5.将小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上
向微孔试剂微孔板(96孔酶标板可拆式，深圳金灿华公司)中加入50μl小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，封装待用。
6.样本吸收垫的准备：将样本吸收垫置于含0.5％(体积百分含量)牛血清白蛋白、pH为7.2、0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡，37℃烘2h备用。
7.反应膜的制备
包被过程：用pH为7.2、0.01mol/L磷酸盐缓冲液将小麦矮腥黑粉菌多克隆抗体稀释到1mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于醋酸纤维素膜上的检测区，按照0.8μl/cm的量包被；用0.01mol/L、pH 7.4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到1mg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于醋酸纤维素膜上的质控区，按照0.8μl/cm的量包被。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥10h，备用。
(二)各部件的组装
试纸的组装：
1)将所述样本吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序黏贴在所述底板上；样本吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样本吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好试纸两端黏贴保护膜；
2)将上述步骤1)得到试纸与微孔试剂组装：组装同上
实施例2.小麦矮腥黑粉菌胶体金试纸的检测限和特异性检验
(一)检测限试验
将小麦矮腥黑粉菌标准品(TCK1冬孢子)稀释成0、5、10、20mg/L，所用的稀释液为pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。
用胶体金试纸进行检测。每次向微孔试剂中滴加200μl样本，混匀，孵育5min后，将试纸插入检测，结果为：滴试0、5mg/L小麦矮腥黑粉菌时，试纸条质控区显色，检测区不显色，呈阴性；当滴试10、20mg/L小麦矮腥黑粉菌时，试纸条质控区和检测区均显色，呈阳性；表明，试纸条对小麦矮腥黑粉菌的检测限为10mg/L。
(二)特异性试验
特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将小麦叶锈菌(Puccinia triticina PHT)、小麦条锈菌(Puccinia striiformisf.sp.tritici CY32)用pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释。用试纸条进行检测，结果显示小麦叶锈菌、小麦条锈菌50mg/L浓度时，试纸条质控区显色，检测区不显色，呈阴性，可以得出试纸条未对这些药物发生交叉反应。
实施例3.小麦矮腥黑粉菌胶体金试纸的应用
一、用试纸检测小麦矮腥黑粉菌
试纸条可以检测小麦矮腥黑粉菌。检测方法如下：
1、检测方法
向微孔试剂中滴加需检测的样本溶液(PBS缓冲液与助溶剂)，混匀后，孵育5min，将试纸有MAX线标记端朝下插入微孔试剂，在5min内观看结果。
2、检测结果判定
小麦矮腥黑粉菌在样本中浓度高于或等于10mg/L时，胶体金抗体与小麦矮腥黑粉菌结合，从而在检测区内由于双抗夹心反应而出现红色条带，呈阳性。小麦矮腥黑粉菌在样本中浓度低于10mg/L时，在检测过程中由于缺少抗体抗原反应，检测区未出现红色条带。如图3所示。
阳性：当质控区(C)和检测区(T)均显示红色条带时，判为阳性。如图3a所示
阴性：当质控区(C)显示出红色条带，检测区(T)未显示红色条带，判为阴性。如图3b所示
无效：当质控区(C)不显示出红色条带，则无论测试区(T)显示出红色条带与否，该试纸判为无效。如图3c、3d所示
下面具体举例：
取小麦矮腥黑粉菌(TCK1)含量大于10mg/L的小麦样本和小麦矮腥黑粉菌含量小于10mg/L的小麦样本各15份，用3个批次试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。
小麦样本的制备：取小麦麦穗样品5g放入10mL PBS缓冲溶液中，并加入终浓度为质量体积百分比0.2％的助溶剂聚乙二醇2000，超声提取5-10分钟，取上清。
表1.检测阳性样本结果
表2.检测阴性样本结果
结果表明：用3个批次试纸条检测阳性样本时，阳性符合率为100％；检测15份阴性样本时，阴性符合率为100％。
Claims (9)
1.一株杂交瘤细胞，其特征在于:用于分泌特异性识别小麦矮腥黑粉菌(Tilletiacontroversa Kühn)的单克隆抗体，名称为：F-2-1,其保藏号为CGMCC No.9714。
2.一种特异性识别小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn)的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞所分泌。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn)或者检测小麦矮腥黑穗病中的用途。
4.一种检测小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn)的试剂盒，包括试纸条和微孔板，
所述试纸条包括底板、样本吸收垫、反应膜和吸水垫；所述样本吸收垫、反应膜、吸水垫依次黏贴安装在所述底板上；
其特征在于：所述微孔板的微孔中有冻干的微孔试剂，所述微孔试剂指胶体金标记权利要求2所述的单克隆抗体而得的金标抗体；
所述反应膜分为检测区和质控区，所述检测区包被有小麦矮腥黑粉菌多克隆抗体，所述质控区包被有抗抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。
6.一种检测小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于采用权利要求4或5所述的试剂盒对待测物进行检测，其步骤如下：
(1)制备待测样本溶液
(2)向所述微孔中滴加样本溶液，混匀，将所述试纸条上对应样本吸收垫的一端插入微孔中并接触到其中的微孔试剂，读取所述试纸条的检测结果判断待测样品是否含有小麦矮腥黑粉菌。
7.根据权利要求6所述的方法，所述待测物为疑似携带小麦矮腥黑粉菌的小麦植株或其组织，所述制备待测样本溶液指：取小麦植株或其组织5g放入10mL PBS缓冲溶液中，并加入终浓度为质量体积百分比0.2％的助溶剂聚乙二醇2000，超声提取5-10分钟，取上清。
8.权利要求4或5所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)准备特异性识别小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体及多克隆抗体
(2)制备微孔试剂，样本吸收垫、反应膜和吸水垫，
(3)将样本吸收垫，反应膜和吸水垫依次黏贴安装在底板上；
其特征在于制备微孔试剂包括如下几部分：
胶体金溶液：在100ml质量百分比为0.01％的氯金酸水溶液中，加入1.5ml 1％的柠檬酸三钠溶液，加热搅拌冷却得胶体金溶液；
准备小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物：在磁力搅拌下，在所述胶体金溶液中加入0.2mol/L碳酸钾调pH值至7.2，按1ml胶体金溶液加60μg抗体的比例向胶体金溶液中加入所述特异性识别小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体，继续搅拌混匀30min,加入10％BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为体积百分含量为1％，静置30min；12000rpm、4℃离心30min,弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液重悬沉淀，得到的小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物溶液，置4℃备用；
所述复溶缓冲液：pH7.2，含牛血清白蛋白、吐温-20的0.05mol/L磷酸盐溶液，其中牛血清白蛋白的终浓度为体积百分含量0.05-0.10％，吐温-20的终浓度为质量百分含量0.05％；
微孔试剂：向微孔板的微孔中加入50μl所述小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，得到冻干有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，
所述反应膜为醋酸纤维素膜，所述制备反应膜的工艺如下：
用pH为7.2、0.01mol/L磷酸盐缓冲液将小麦矮腥黑粉菌多克隆抗体稀释到1mg/mL，按照0.8μl/cm2的量包被，用点膜仪将其包被于醋酸纤维素膜上的检测区；用0.01mol/L、pH7.4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到1mg/ml，按照0.8μl/cm的量包被，用点膜仪将其包被于醋酸纤维素膜上的质控区，将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥10h，备用。
9.根据权利要求8所述的制备方法，所述制备样本吸收垫指将样本吸收垫置于pH为7.2，含体积百分含量0.5％牛血清白蛋白的0.02mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡，37℃烘2h备用。
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