CN101379398B - 恙虫病诊断制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用恙虫混合抗原的恙虫病诊断试剂盒。更具体地，所述恙虫病诊断试剂盒包括测试条带，其包含吸收样品的样品垫；与样品中人类抗体结合的金结合垫；测试膜，其包括含有恙虫混合抗原的测试线和含有对照蛋白的对照线；吸收剩余样品的吸收垫。在本发明的诊断试剂盒中，抗恙虫的抗体能够在不使用任何仪器的情况下被简便地检测，由此通过肉眼可以确定东方恙虫(Orientiatsutsugamushi)的感染。

Description

恙虫病诊断制剂
技术领域
本发明涉及恙虫病的诊断试剂盒，其中使用东方恙虫(Orientiatsutsugamushi)的混合抗体检测生物样品中的抗东方恙虫抗体。
背景技术
恙虫病是由东方恙虫引起的一种急性发热疾病，东方恙虫属于立克次氏体科(Rickettsiaceae)恙虫病属(scrub typhus)，并通过幼虫期恙螨(trombiculidmite)的叮咬传播。诸如发冷、发烧和头疼的症状在被幼虫期恙螨叮咬后大约10天(1到3周)发生，并且皮疹在症状发生后约一周开始出现在人体躯干上，随后呈离心状扩散到四肢。水泡在幼虫期恙螨的叮咬部位出现，随后是大小为0.5到0.8cm的溃疡的形成。溃疡被黑色的痂覆盖，其称为焦痂。一些患者会发生呼吸道症状，其中胸部X光检查显示患者中大约一半出现肺浸润(pulmonary infiltration)。在一些严重的病例中，中枢神经系统可能被感染，导致失去知觉或死亡。
恙虫病在世界范围内发生，但是在亚洲，包括日本、中国、马来西亚、泰国、越南等地特别普遍(《韩国的恙虫病(Tsutsugamushi disease in Korea)》，WooHyun Jang编辑，Seoheung Co.出版，第21-27页，1994)。该疾病在10月发生最频繁，通常在秋季，9月到12月早期(Kim等，Infection 20；105-116，1988)。在野外工作或野营的人可能有患恙虫病的风险。
东方恙虫的致病性是由于攻击血管内皮细胞产生的系统性血管炎(systemic vasculitis)引起的。侵入血液后，东方恙虫在血管内皮细胞中复制，引起血管损伤，或微血管血栓和血管周围的炎症。因此，该疾病在组织病理学上的特征为多种器官的血管被损伤，其可以引起皮肤坏死、皮疹、脑膜炎、脱发、心肌炎和心力衰竭。而且，已经报道了由于血管内凝结引起的低纤维蛋白原血症(hypofibrinogenemia)的病例。在一些情况下，该疾病的症状或传染病学特征根据东方恙虫的每个血清变型而不同。属于相同血清型的恙虫菌彼此在血清学上相关，并且在属于不同血清型的细菌之间没有或仅有很弱的血清学交叉反应性。东方恙虫被分类为一个种。然而，存在许多有不同抗原性的血清型，并且根据抗原性，它们被分类为各种血清型，诸如Gilliam、Karp和Kato菌株。在韩国的传染性菌株中，已经分离出了具有与已知传染性原型菌株(epidemic prototype strain)Gilliam和Karp不同血清学反应性的Kangwon和Boryong。
这样的血清型多样性取决于东方恙虫的膜蛋白抗原，如种特异抗原(species-specific antigen)和血清型特异抗原(serotype-specific antigen)。抗原从东方恙虫中纯化，并随后用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析。结果，发现大小为70kDa、60kDa、54到56kDa和46到47kDa的主要抗原存在(Takahashi K等，Microbiol.Immunol.29：475，1985)，大小为46到47kDa、54到56kDa和70kDa的每种抗原都具有很强的抗原性，并且大小为70kDa和46到47kDa的每种抗原都是菌株特异性抗原(strain-specific antigen)(Tamura A等，Microbiol.Immunol.26：321，1982)。
普遍认为恙虫病不显示严重的临床症状，并且临床诊断很容易从典型的症状和标志上辨识出。然而，非典型症状和标志已经在很多病例中有报道。因此，在恙虫病的特定症状，如系统性淋巴增生和焦痂形成没有观察到的病例中，难以区分恙虫病与其它急性发热疾病，如细螺旋体病、鼠型斑疹伤寒和带有肾综合症的出血热。
有一些通过使用培养物分离病原体或使用免疫荧光测试鉴定抗体来诊断恙虫病的精确方法。然而在使用免疫荧光测试的诊断方法中，需要细胞培养以获得立克次氏体抗原，而且长时间储存这些抗原是困难的。诊断也需要荧光显微镜，该诊断仅能在拥有荧光显微镜的实验室中进行。因此，对患者可能经常发生的农村地区的医院来说进行免疫荧光测试是困难的。
发明公开
技术方案
为了克服上述困难，发明人对恙虫病的诊断试剂盒进行了详尽的研究，其中不需要细胞培养，来自顺序连接的三种血清型每个基因的嵌合重组蛋白是提高诊断灵敏性的基本抗原，这是与单一血清型基因的重组抗原相比，并且额外制备的来自其它两种血清型的每一单个基因的重组蛋白作为抗原被加入以极大地提高灵敏性。
因此，本发明的一个目的是提供恙虫病的诊断试剂盒，其包括含有恙虫混合抗原的测试条带(test strip)。
本发明的另一个目的是提供恙虫病的诊断试剂盒，其中两个测试条带在塑料装置中相连，以同时检测IgM和IgG抗体。
附图简述
图1是显示10％SDS-PAGE结果的图片，以证实纯化表达的重组抗原蛋白的过程。
图2是显示使用点印记免疫测定方法显示从转化的大肠杆菌中纯化的蛋白(cr56、r21和kr56的混合物)与来自患者的血清之间的反应性的图片，以证实其作为诊断抗原的适合性。
图3显示了依据本发明的诊断试剂盒中的测试条带的结构，其通过引入免疫色谱技术制造。
图4显示了用塑料盖起的诊断试剂盒最终样品的结构和在本发明的诊断试剂盒中分析其结果的方法。
图5是显示本发明诊断试剂盒的灵敏性和特异性的图，其中(A)显示了使用来自由IFA诊断的患者(n＝30)的血清评估快速诊断试剂盒灵敏性的结果，且(B)显示了使用来自健康患者(n＝10)的血清、来自患有鼠型斑疹伤寒患者(n＝11)的血清、来自患有细螺旋体病患者(n＝7)的血清、及来自患有肾综合症出血热患者(n＝8)的血清来评估特异性的结果。
实施本发明的最佳方式
在一种实施方式中，本发明涉及恙虫病诊断试剂盒，其包括测试条带，该测试条带含有恙虫的混合抗原。
特别地，本发明涉及恙虫病诊断试剂盒，其包括检测生物样品中抗东方恙虫抗体的测试条带，其中测试条带包括：
(a)吸收样品的样品垫(sample pad)；
(b)与样品中人类抗体结合的金结合垫(gold conjugation pad)；
(c)测试膜(test membrane)，包含含有恙虫混合抗原的测试线(test line)和含有对照蛋白的对照线(control line)；和
(d)吸收剩余样品的吸收垫(absorption pad)。
如图3所示，本发明用于恙虫病的诊断试剂盒优选地包括含有样品垫、金结合垫、测试膜和吸收垫的的测试条带。样品垫叠置在金结合垫上，形成第一重叠部分，并且金结合垫叠置在膜上，形成第二重叠部分。此外，膜和吸收垫形成第三重叠部分。当生物样品被逐滴加入到样品垫上时，该样品通过毛细作用迁移穿过金结合垫，例如含有金标记的蛋白A的金结合垫。金标记的金颗粒优选地具有20到55nm的直径，更优选地20到40nm，并且充当指示染料(indicator dye)。当生物样品迁移通过金结合垫时，样品中的抗体与金标记的蛋白A或类似物结合形成复合体(complex)，并且该复合体沿膜迁移。
术语“生物样品”用在此处表示来自哺乳动物，包括疑似患有恙虫病的人类的血清或血浆。生物样品在逐滴加入到本发明诊断试剂盒的样品垫上之前可以被稀释或未被稀释。在生物样品中存在恙虫抗体的情况下，当样品迁移穿过诊断试剂盒中含有恙虫混合抗原的测试线时，抗体与恙虫混合抗原结合从而使得测试线上颜色发生变化，这种变化可以用肉眼观察到。然而，在生物样品中不存在恙虫抗体的情况下，恙虫混合抗原无法与抗体结合，因而不会使测试线上产生颜色变化。
特别地，在本发明优选的实施方式中，恙虫抗体在膜上与测试线中固定的恙虫混合抗原结合。该抗原-抗体复合物通过金颗粒形成为指示染料。结果，观察到红紫色的条带，这表示阳性反应，也就是说生物样品中存在恙虫抗体。
术语“恙虫混合抗原”用在此处表示从东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株中衍生的重组抗原蛋白、从Kangwon菌株中衍生的抗原蛋白和从Boryong菌株中衍生的抗原蛋白的混合物，其中每个菌株都会引起恙虫病。也就是说，恙虫的混合抗原是从重组融合基因中衍生的嵌合重组蛋白的混合物，其中编码东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株的抗原表位的基因依次相连，并且每个重组蛋白是由编码东方恙虫Kangwon和Boryong菌株抗原的基因衍生得到的。
特别地，在本发明中，可以通过一步方法生产、分离并纯化融合蛋白抗原，其中编码标准血清型Gilliam、Karp和Kato菌株中56kDa蛋白片段的基因通过聚合酶链反应(PCR)扩增，扩增的DNA片段被依次连接，重组DNA被克隆进蛋白表达载体中以在大肠杆菌中表达，并且表达的蛋白被分离和纯化，用作诊断恙虫病的抗原，这是基于韩国专利申请号2002-0020281，其公开了东方恙虫的56kDa蛋白具有抗原性，因此可以被有用地用作诊断蛋白。
而且，在本发明中，除了东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株，编码东方恙虫Kangwon菌株的56kDa抗原蛋白的基因和编码东方恙虫Boryong菌株的21kDa抗原蛋白的基因通过PCR扩增，扩增的DNA片段被克隆进蛋白表达载体以在大肠杆菌中表达，并且表达的蛋白被分离和纯化，与由东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株衍生的56kDa嵌合重组蛋白一起用作诊断蛋白，以便提高对恙虫病的诊断灵敏性。
在一种优选的实施方式中，在本发明的诊断试剂盒中，东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株的56kDa重组嵌合蛋白，东方恙虫Kangwon菌株的56kDa重组蛋白和东方恙虫Boryong菌株的21kDa重组蛋白以1mg/ml的浓度分别制备，随后它们以5∶2∶1的体积比混合。将1mg/ml的恙虫混合抗原被逐滴加入到测试线上。
恙虫病的阳性结果是除了对照线外，在测试线上显示出颜色的情况。对照线是确定该诊断试剂盒是否工作的。在恙虫病阴性反应中，仅在对照线上显示出颜色。对照线含有与金标记抗体结合的对照蛋白。金标记抗体的例子包括兔抗山羊IgG多克隆抗体，山羊抗人IgG多克隆抗体或山羊抗人IgM多克隆抗体。对照线可能含有0.1mg/ml到1mg/ml的对照蛋白。
在一种优选的实施方式中，本发明的诊断试剂盒进一步包括含有不表达恙虫抗原蛋白的大肠杆菌提取物的预测试线(pre-test line)。在使用大肠杆菌衍生的东方恙虫抗原蛋白的本发明的诊断试剂盒中预测试线允许去除任何由非特异结果产生的误诊的可能性，所述非特异结果来自人体中的大肠杆菌衍生的抗体对在纯化的恙虫抗原蛋白中污染的大肠杆菌蛋白的反应。该预测试线可能含有浓度为0.5mg/ml到0.6mg/ml的大肠杆菌提取物。
测试膜可以含有合适的材料，如标准尺寸为10×500nm的硝酸纤维素膜(MoliporeTM XA3J072100)。在测试膜中，预测试线、测试线和对照线优选地以这种顺序排列。预测试线、测试线和对照线被排列为间隔2.0到4.5mm，优选地2.5到3.0mm。
金结合垫可以含有合适的检测标记。标记的实例包括金标记的蛋白A，金标记的抗人IgG抗体和金标记的抗人IgM抗体。金结合垫优选地被置于样品垫附近。在金结合垫含有过量金标记的标记物的情况下，在恙虫抗体的下限浓度中产生的被过度放大的信号增加，从而引起假阳性的结果。因此，在本发明中，金胶体溶液被稀释到1到6的光密度(OD)，优选地2到4。吸收垫被置于膜上相对立的一端并通过毛细作用吸收沿膜迁移的生物样品，如血清或血浆。
在一种特定的实施方式中，本发明的诊断试剂盒可以包括测试条带。可选地，如图4所示，本发明的诊断试剂盒可以包括两个条带——从样品垫分开的第一条带和第二条带。此时，第一条带可以被用于检测人IgG抗体，且第二条带可被用于检测抗恙虫抗原蛋白的人IgM抗体。第一条带可以包括含有山羊抗人IgG抗体或蛋白A的金结合垫，和含有兔抗山羊IgG多克隆抗体的对照线。第二条带可以包括含有山羊抗人IgM抗体的金结合垫和含有山羊抗人IgM多克隆抗体的对照线。如图4所示，第一条带和第二条带优选地可以平行排列，但是并不限于这样。第一条带和第二条带可以被顺序连接，以相反方向或以多种方向排列。
测试条带可以用环形盒(surrounding case)包装以确保每一个本发明诊断试剂盒的安全性。诊断试剂盒可以长时间(至少12个月或更长)储存在室温下，而无诊断活性的任何损失。
在一种特定的实施方式中，诊断耗费5到10分钟，不超过15分钟。诊断结果表明患者是否被恙虫感染。举例来说，如果生物样品是从被恙虫感染的患者收集的，那么本发明的诊断试剂盒给出阳性反应，借此该患者可以被诊断为患有恙虫病。如果生物样品是从未被恙虫感染的患者收集的，那么本发明的诊断试剂盒给出阴性反应，借此该患者可被诊断为未患恙虫病。
使用间接荧光抗体技术、点印记免疫分析和酶联免疫吸附测定(ELISA)，评估恙虫混合抗原对恙虫病的灵敏性和特异性。结果，发现从东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株衍生的56kDa重组融合蛋白和从东方恙虫Boryong菌株衍生的21kDa蛋白具有95％或更高的灵敏性和特异性。而且，在使用含有上述蛋白和从东方恙虫Kangwon菌株衍生的56kDa蛋白的试剂盒检测显示非常弱的阳性信号的血清的情况下，阳性信号变强，也就是说，其灵敏性得到提高(100％)。因此，本发明中使用的恙虫混合抗原被发现具有优良的灵敏性和特异性。
在一种实施方式中，本发明提供了恙虫病的诊断组合物，其含有从东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株衍生的56kDa融合蛋白，从东方恙虫Kangwon菌株衍生的56kDa蛋白，和从东方恙虫Boryong菌株衍生的21kDa蛋白作为恙虫混合抗原。
在一种优选的实施方式中，在恙虫混合抗原中从东方恙虫Kangwon菌株衍生的56kDa蛋白具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，从东方恙虫Boryong菌株衍生的21kDa蛋白具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
一般地，人体中东方恙虫的存在必须被确认，以便诊断疑似患有恙虫病的人是否被感染。当前恙虫病的诊断使用免疫荧光抗体技术进行。有利之处在于该技术具有高灵敏性和特异性，并通过分别测量IgG和IgM区分原发感染和再感染。然而，不利之处在于需要细胞培养的设备，由于其复杂的过程，只有高度熟练的专家才能进行，以及也需要高额成本和时间。相反，由于本发明的诊断方法通过抗原-抗体反应使用免疫色谱法进行，恙虫病可在短时间内，约10分钟，被准确且简便地诊断。因此，本发明的诊断方法可以说比传统诊断方法更好。
使用上述恙虫病诊断试剂盒检测抗恙虫病抗体的方法如下。首先，当待分析的生物样品被逐滴加入到诊断试剂盒的样品垫——吸收样品的部分——时，该生物样品通过毛细作用迁移至金结合垫。此时，生物样品中的抗体与金结合垫中的标记物，如金标记的蛋白A、金标记的抗人IgG抗体或金标记的抗人IgM抗体结合，以形成胶体。待分析的生物样品未被固定在金结合垫中，而是继续迁移至测试线，恙虫的混合抗原被固定在测试线中。在样品来自感染恙虫病的患者的情况下，该样品与恙虫混合抗原反应，以产生抗原-抗体反应。也就是说，与金结合垫中的特异性标记物结合的抗恙虫抗体与固定在测试线中的恙虫混合抗原结合形成红紫色条带。因此，该条带可用肉眼观察。金结合垫中未与测试线反应的剩余标记物迁移至对照线与对照蛋白反应。接着，形成红紫色条带，借此确保测试的一致性。如上文所述，本发明的诊断试剂盒通过抗原-抗体反应使用免疫色谱法进行，借此可用肉眼观察结果而不需要任何仪器。而且，该诊断试剂盒的预测试线消除了任何误诊的可能性——其可能是由于人血清中而非东方恙虫中存在的抗大肠杆菌抗体而出现，从而提高了恙虫病诊断的准确性。
在下文中，将根据实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅仅是出于示例性的目的，并且本发明并非意欲被这些实施例限制。
本发明的实施例
实施例1：抗原蛋白的表达和分离
1-1.56kDa嵌合重组蛋白(cr56)的表达
含有东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株主要表位的嵌合重组蛋白(cr56)按照与韩国专利号2002-0020281中公开的实施例相同的方式进行表达、分离和纯化。
特别地，东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株在小鼠L-929细胞中培养，收集并纯化。纯化的细胞用酶消化，随后其DNA用苯酚和乙醇提取。基于东方恙虫56kDa蛋白的基本序列，选择Boryong和Gilliam、Karp及Kato血清型中具有30％或更高氨基酸序列同源性的每个DNA部分，并且为Gilliam、Karp和Kato菌株的每一个制备一对寡核苷酸引物。用每对引物和作为模板的东方恙虫的纯化DNA进行PCR，以扩增Gilliam、Karp和Kato菌株的DNA片段。PCR产物被纯化并克隆，以连接在pTYB12载体的限制性酶消化位点。首先，Gilliam菌株的DNA片段被引入pTYB12载体以制备载体pTG3，随后Karp菌株的DNA片段被引入pTG3载体以制备载体pTGP1。Kato菌株的DNA片段被引入pTGP1载体以制备载体pTGPT2。此外，与Gilliam、Karp和Kato菌株的DNA序列顺序连接的DNA片段被从pTGPT2载体中切下。该DNA片段被引入pET22b(+)载体中以制备载体pETb7。用制备的表达载体转化大肠杆菌，随后培养转化的大肠杆菌以诱导融合蛋白的表达。该融合蛋白使用电泳和蛋白质印迹法确认，分离并纯化。
1-2.东方恙虫Boryong菌株的21kDa重组蛋白(r21)的表达
东方恙虫Boryong菌株中具有种特异抗原性的基因在大肠杆菌中表达，以根据以下方法分离并纯化重组蛋白(r21)。
(1)东方恙虫DNA的纯化
被东方恙虫Boryong菌株感染的小鼠L细胞被离心以收集细胞沉淀物(pellet)。该细胞沉淀物用磷酸盐缓冲液洗涤3次，并纯化全DNA待用。含有1％SDS和蛋白酶K(100μg/ml)的Tris-HCl缓冲液(10mM pH8.0，10mM EDTA，150mMNaCl)被加入到细胞沉淀物。该细胞沉淀物在56℃反应1小时以溶解，随后与相同量的酚-氯仿-异戊醇混合物反应3次以纯化。
(2)PCR扩增
包括Nde I和Xho I限制性位点的修饰引物(表1)被加入到100ng纯化的储存DNA中，至20pmol。用10×Tag聚合酶缓冲液(100mM Tris-HCl，15mMMgCl2，500mM KCl，1mg/ml明胶，pH8.3)、dNTPs和Tag聚合酶进行PCR。DNA的扩增通过1.2％琼脂糖凝胶电泳证实。
[表1]
克隆Boryong菌株21kDa重组蛋白的引物序列
*质粒pET22b表达组氨酸标记的融合蛋白
(3)基因克隆
由聚合酶链反应扩增的DNA通过1.2％的琼脂糖电泳分离，并随后使用QIAGEN凝胶洗脱试剂盒(QIAGEN Inc.，USA)回收。正确大小的扩增DNA条带被在紫外透射仪上切出。该条带被转移至微量管中并用NaI溶液(琼脂糖凝胶体积的3倍)在60℃完全溶解5分钟。向其中加入玻璃乳(glass milk)，并旋转微量管10秒钟。溶液在室温下以17,000g(Hanil，AL5S-24，12,000rpm)离心1分钟以去除上清。洗脱缓冲液被加入到剩余溶液中，接着微量管被旋转并在17,000g(12,000rpm)离心。新上清液被转移到新的微量管。40ng纯化的DNA被克隆进pET22b(+)载体中。
(4)感受态细胞的制备与转化
在LB培养基中培养18小时的大肠杆菌BL21细胞用LB培养基稀释100倍。大肠杆菌BL21细胞被重新培养至在600nm处的吸收值为0.3。置于冰上30分钟后，除去上清液。0.1M CaCl2被加入至培养基体积的一半，随后细菌被悬浮。悬浮的细菌被置于冰上1小时，并在2,000g(4,100rpm)离心10分钟。沉淀物在培养基体积十分之一的0.1M CaCl2中悬浮用于转化。
上文制备的连接产物与感受态细胞混合并置于冰上，随后在42℃热休克。向其中加入LB培养基并在37℃培养1小时。该培养基被涂布在LB琼脂平板上，在37℃培养。
(5)蛋白表达和分离
转化的大肠杆菌BL21细胞在37℃培养18小时，随后稀释约100倍至OD600为0.5。向其中加入IPTG至浓度为0.3mM，然后培养2小时。转化的大肠杆菌BL21细胞在5,800g(7,000rpm)离心。沉淀物在1×结合缓冲液(5mM咪唑，20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl)中悬浮并用超声发生器(ultrasonicator)在18Hz声波处理15秒，6次。声波处理的溶液在23,000g(14,000rpm)离心。上清液被用作可溶部分，而沉淀物被用作不可溶部分。对每个部分进行SDS-PAGE以确定哪个部分含有重组蛋白。
(6)蛋白纯化
用2ml Hisbind树脂(Novagen)填充柱，并随后用蒸馏水、1×负载缓冲液(charge buffer)和1×结合缓冲液制备。抗原蛋白穿过该柱以后，用1×清洗缓冲液清洗该柱。洗脱缓冲液(100mM到300mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-ClpH7.9)穿过该柱以回收每个1ml的蛋白溶液。用Lowry分析确定每部分中蛋白的浓度。进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法以确定蛋白(SEQ ID NO：3)(图1)。
1-3.56kDa重组Kangwon蛋白(kr56)的表达
参考系统发生分析(phylogenic analysis)的结果(FEMA MicrobiologyLetters，1999，180：163-169)，考虑到东方恙虫被分类为全球原型菌株Karp、Gilliam和Kate，及国内流行血清型，Boryong和Yonchon(与Kangwon最相似)，这五种菌株被认为最适合做抗原。Karp、Gilliam和Kato菌株存在cr56蛋白，Boryong菌株存在r21蛋白作为抗原。而且，Yonchon菌株存在由Kangwon菌株衍生的kr56蛋白，与Yonchon相似。因此，发明人建议使用56kDa重组Kangwon蛋白(kr56)与r21蛋白作为额外抗原，成为嵌合重组蛋白(cr56)。
(1)Kangwon菌株的56kDa重组蛋白(kr56)表达概述
氨基酸序列的一部分，84(250bp)到445(1,335bp)，已知的Kangwon87-61的主要抗原结构域，被修饰以包含Nco I和Sal I限制性位点。然后，制备一对引物(表2)并进行PCR反应。PCR产物和表达载体pET30a用限制性酶Nco I和Sal I消化，并随后彼此连接。用该质粒转化大肠杆菌BL21细胞，随后提取其蛋白。
[表2]
克隆Kangwon菌株56kDa重组蛋白的引物序列
Figure S2007800047896D00091
*质粒pET30a表达组氨酸标记的融合蛋白
(2)基因克隆与表达
由聚合酶链反应扩增的DNA(氨基酸84(250bp)到445(1,335bp)的362个氨基酸(共1,086bp))通过用1.2％的琼脂糖电泳分离，并随后使用QIAGEN凝胶洗脱试剂盒(QIAGEN Inc.，USA)回收。具有正确大小的扩增DNA条带被在紫外透射仪上切出。该条带被转移至微量管中并用NaI溶液(琼脂糖凝胶体积的3倍)在60℃完全溶解5分钟。向其中加入玻璃乳(glass milk)，并旋转该微量管10秒钟。溶液在室温下17,000g(Hanil，AL5S-24，12,000rpm)离心1分钟以去除上清液。该微量管在室温下放置5分钟，并干燥。洗脱缓冲液被加入到其中，接着微量管被旋转并在17,000g(12,000rpm)离心。新上清液被转移到新的微量管中。纯化的PCR产物和pET30a载体用限制性酶Nco I和Sal I消化，并随后使用GeneClean试剂盒II通过相同的方法回收。100ng限制性酶切的载体和100ng限制性酶切的PCR产物互相混合，随后向其中加入10×连接酶缓冲液(250mM Tris-HClpH7.8，100mM MgCl2，20mM DTT和4mM ATP)和连接酶的混合物，接着在4℃反应18小时。
(3)感受态细胞的制备与转化
在LB培养基中培养18小时的大肠杆菌BL21细胞用LB培养基稀释100倍。大肠杆菌BL21细胞被重新培养至在600nm处的吸收值为0.3。置于冰上30分钟后，除去上清液。0.1M CaCl2被加入至培养基体积的一半，随后细菌被悬浮。悬浮的细菌被置于冰上1小时，并在2,000g(4,100rpm)离心10分钟。沉淀物在培养基体积十分之一的0.1M CaCl2中悬浮用于转化。
(4)转化
上面制备的连接产物与感受态细胞混合并置于冰上，随后在42℃热休克1.5分钟。向其中加入LB培养基，并在37℃培养1小时。该培养基被涂布在LB琼脂平板上在37℃培养。
(5)从转化的大肠杆菌中分离质粒DNA
转化的大肠杆菌的单克隆被接种在含有卡那霉素的LB培养基中，并随后在37℃震荡培养。使用AccuPrep质粒提取试剂盒(AccuPrep Plasmid Extractionkit)进行质粒DNA的提取。培养基在室温下以750g(2,500rpm)离心10分钟以回收细胞沉淀物。重悬浮缓冲液被加入到细胞沉淀物，并随后旋转。向其中加入裂解缓冲液，接着在室温下放置5分钟。向其中加入中和缓冲液，在室温下放置，然后以17,000×g(12,000rpm)离心。上清液被转移到结合柱管，然后在室温下以17,000×g(12,000rpm)离心，去除提取的溶液。向其中加入80％的乙醇，离心，然后仅将结合柱放置在新试管中。向其中加入洗脱缓冲液，室温放置，然后离心以将上清液转移到新微量管中。
(6)蛋白表达和分离
转化的大肠杆菌BL21细胞在37℃培养18小时，随后稀释约100倍至OD600为0.5。向其中加入IPTG至浓度为0.3mM，并培养2小时。转化的大肠杆菌BL21细胞在5,800g(7,000rpm)离心。沉淀物在1×结合缓冲液(5mM咪唑，20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl)中悬浮，用超声发生器在18Hz声波处理15秒6次。声波处理的溶液以23,000g(14,000rpm)离心。上清液被用作可溶部分，而沉淀物被用作不可溶部分。对每个部分进行SDS-PAGE以确定哪个部分含有重组蛋白。
(7)蛋白纯化
用2ml Hisbind树脂(Novagen)填充柱，并随后用蒸馏水、1×负载缓冲液和1×结合缓冲液制备。抗原蛋白穿过该柱以后，用1×清洗缓冲液清洗该柱。洗脱缓冲液(300mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl pH7.9)穿过该柱以回收每个1ml的蛋白溶液。用Lowry分析确定每部分中蛋白的浓度。进行SDS-PAGE和蛋白质印迹以确定蛋白(SEQ ID NO：6)(图1)。
实施例2：使用ELISA对纯化的抗原蛋白进行诊断分析
进行本测试是为了确保通过与恙虫病患者血清中的抗体的抗原-抗体反应来诊断恙虫病的可能性，其使用了通过三种东方恙虫原型的融合在大肠杆菌中表达的cr56蛋白，以及由两种血清型Kangwon和Boryong分别表达的kr56蛋白和r21蛋白。
在仅适用cr56蛋白的情况下，在ELISA中其灵敏性和特异性分别为93.2％和94.2％，这是不够的。而且，测量值经常在诊断标准极限的吸光度(OD)附近观察到。结果，r21和kr56蛋白被加入与cr56蛋白混合。通过使用三种蛋白的混合蛋白解决了问题。
纯化的蛋白抗原用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)按表3稀释。96孔板用稀释的抗原包被，随后反应18小时。该板用含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液清洗2次，随后向孔中加入100μl的3％牛血清白蛋白在37℃封闭(block)2小时。对患者的血清进行2倍连续稀释。100μl稀释的血清被用作一抗。过氧化物酶结合的山羊抗人IgG以1∶6,000稀释被用作二抗。100μl制备的二抗被加入孔中。洗涤3次以后，100μl含有1mg/ml OPD(邻苯二胺二氯化氢(o-phenylene diaminedihydrochloride))和0.03％过氧化氢的柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(pH4.9)被加入到孔中。该培养板在室温下避光放置30分钟，随后向其中加入50μl的1M硫酸终止反应。用MicroELISA读数计测量其在490nm下的吸光度。结果显示于表3。发现cr56和r21的混合抗原具有95％或更高的灵敏性和特异性。而且，在加入kr56蛋白的情况下，患者血清中的弱阳性信号变强，也就是说，发现其灵敏性增强(100％)。因此，可以看出kr56蛋白的加入产生增强诊断灵敏性的效果。
[表3]
使用ELISA对纯化抗原蛋白进行抗原性分析
(1)每种抗原蛋白(cr56和r21)被稀释到1.25μg/ml。cr56蛋白与相同量的r21蛋白混合。100μl混合的抗原蛋白被加入到每个孔中。健康人：OD＝0.085±0.042
(2)cr56、r21和kr56抗原蛋白分别被稀释到1.25μg/ml、0.25μg/ml和0.5μg/ml。cr56蛋白与相同量的r21和kr56蛋白混合。健康人：OD＝0.078±0.038
(3)cr56：1.25μg/ml，r21：0.25μg/ml。健康人：OD＝0.081±0.044
(4)kr56：0.6μg/ml。健康人：OD＝0.075±0.035
实施例3：使用点印迹法对纯化的抗原蛋白进行诊断分析
进行本测试是为了确保通过与恙虫病患者血清中的抗体的抗原-抗体反应来诊断恙虫病的可能性，其使用了通过三种东方恙虫原型的融合在大肠杆菌中表达的cr56蛋白，以及由两种血清型Kangwon和Boryong分别表达的kr56蛋白和r21蛋白。1μg纯化蛋白抗原(1μg/μl)被逐滴加到硝酸纤维素膜上，然后在37℃干燥1小时。干燥的膜用含5％脱脂奶的TBST溶液(含0.5％Tween 20的Tris缓冲盐水)封闭(block)1小时。患者的血清以1∶3,000稀释作为一抗，并接着加到膜上。反应进行1小时。过氧化物酶结合的山羊抗人IgG被用作二抗。结果显示于图2和表4。结果，cr56、r21和kr56蛋白的混合抗原被发现具有最高的灵敏性和特异性。
[表4]
使用点印迹法对纯化的抗原蛋白进行抗原性分析
Figure S2007800047896D00131
(1)每种抗原蛋白以(cr56∶r21＝1∶1)混合，并以1μg/μl/点的浓度使用。
(2)每种抗原蛋白以(cr56∶r21＝5∶1)混合，并以1μg/μl/点的浓度使用。
(3)kangwon：0.6μg
(4)每种抗原蛋白以(cr56∶r21∶kr56＝5∶1∶2)混合，并以1μg/μl/点的浓度使用。
实施例4：去除纯化抗原中由大肠杆菌衍生的蛋白与人血清中抗体间反应的研究
使用组氨酸结合亲和层析(His-bind affinity chromatography)纯化抗原。然而，由大肠杆菌衍生的蛋白不能被完全除去。也就是说，通过纯化难以完全除去由大肠杆菌衍生的蛋白。因此，不表达恙虫抗原蛋白的大肠杆菌宿主细胞被培养以提取。提取的宿主细胞的蛋白被喷到测试线前的预测试线上，从而除去与人抗体反应的由大肠杆菌衍生的蛋白。
实施例5：诊断试剂盒的杆状样品的制备
为了确定恙虫抗原蛋白(cr56、kr56、r21)作为恙虫病诊断试剂的效力，使用从NANO ENG CO.购买的分液器(dispenser)制造诊断用测试条带样品。该测试条带，如图3所示，由硝酸纤维素膜、样品垫、吸收垫和金结合垫(玻璃纤维)组成。使用的硝酸纤维素膜是从Millipore购买的。为了避免膜损伤，膜的一部分与透明塑料连接。三种蛋白被喷在硝酸纤维素膜上。三种蛋白之一是混合的蛋白——其中在大肠杆菌中表达的cr56、kr56和r21抗原蛋白以合适的量混合，以检测患者血清中抗恙虫的抗体，并用作测试线。三种蛋白中的另一种被用作对照线，以确定发生系统是否工作良好。三种蛋白中的其它一种是不表达恙虫抗原蛋白的大肠杆菌提取物，并用作预测试线以去除与从大肠杆菌衍生的蛋白反应的人抗体。每种蛋白用分液器以合适的量喷在预测试线、测试线和对照线上，随后在37℃干燥2小时。玻璃纤维在5％海藻糖溶液中用胶体金偶联物吸收，随后在真空干燥烘箱中干燥2小时。样品垫和吸收垫被切成预定的尺寸。样品垫在含有1％Tween 20的250mM Tris溶液中浸泡以吸收血清或血浆孔，接着在37℃完全干燥4小时。然后，喷涂有胶体金偶联物的金结合垫(玻璃纤维)被置于硝酸纤维素膜下，并且将样品垫置于其下方。吸收垫置于硝酸纤维素膜的上方。最终的诊断杆(diagnostic stick)被切成4mm宽和60mm高。根据它们的用途制备两种诊断试剂盒样品。这里用的蛋白显示于表5。样品1和2仅能够检测到人血清中抗恙虫抗原蛋白的IgG，而样品3和4仅能够检测到IgM。因此，关于其用途，样品1和2可以是检测中晚期患者的诊断工具，而样品3和4可以用作检测早期患者的诊断工具。在本发明中，两个条带被置于一片塑料中，以便同时诊断。使用患者和健康人的血清对诊断试剂盒的样品进行效力测试。结果，诊断试剂盒的样品被发现对恙虫病是快速、准确且简便的诊断试剂盒。而且，从使用患其它急性发热疾病(肾综合症出血热、鼠型斑疹伤寒、细螺旋体病)患者的血清的检测结果中没有发现产生交叉反应性。因此，本发明中的诊断试剂盒被发现具有比传统试剂盒更高的灵敏性。
[表5]
用于生产诊断试剂盒样品的蛋白
  蛋白 样品1 样品2 样品3 样品4
  对照线 兔抗山羊IgG多克隆抗体 山羊抗人IgG多克隆抗体 兔抗山羊IgG多克隆抗体 山羊抗人IgM多克隆抗体
  测试线 cr56、kr56和r21混合蛋白 cr56、kr56和r21混合蛋白 cr56、kr56和r21混合蛋白 cr56、kr56和r21混合蛋白
  金偶联物 山羊抗人IgG抗体 蛋白A 山羊抗人IgM抗体 山羊抗人IgM抗体
这里制造的测试条带被置于一个塑料装置中以生产如图4所示的最终诊断试剂盒。操作手册如下。患者的血浆或血清用合适的溶液稀释。400μl稀释的血浆或血清被逐滴加到底部小孔，放置10分钟。观察测试线上(标记T的位置)和对照线上(标记C的位置)是否产生红紫色。在两条线都产生红紫色的情况下，结果为阳性。在仅对照线上产生红紫色的情况下，结果为阴性。在两条线中任何一条都未产生红紫色的情况下，显示系统有问题，因此应该用新的诊断试剂盒进行另一次测试。进行测试以获得在诊断试剂盒样品中使用的蛋白的最佳浓度和量。结果如表6所示，确定最佳的蛋白量以制造诊断试剂盒的样品。
[表6]
制造诊断试剂盒的样品(宽度为4mm的条)的最佳蛋白组合
  预测试线   测试线   对照线   金偶联物
  0.2μg   0.1μg到0.4μg   0.04μg到0.4μg   吸收值＝1020μl
实施例6：诊断试剂盒条带样品的效果测试
为了确定制造的诊断试剂盒的条带样品的效力，用65个人的血清进行测试，其中包括患恙虫病的患者、健康人和患其它急性发热疾病的患者。工作手册如下。患者或健康人的血清用合适的溶液稀释。400μl稀释的血清被逐滴加到底部小孔，放置10分钟。观察测试线上(标记T的位置)和对照线上(标记C的位置)是否产生红紫色。在两条线都产生红紫色的情况下，结果为阳性。在仅对照线上产生红紫色的情况下，结果为阴性。结果在图5中示出。发现由IFA诊断患有恙虫病的30位患者的病例的测试结果均为阳性。因此，其灵敏性为100％。而且，30位患者中的11位(37％)的血清中观察到了对IgM的强阳性反应，并在30位患者中的4位患者(13％)的血清中观察到了对IgM的弱阳性反应。因此，可见诊断试剂盒的样品对检测早期病人明显有效。
用健康人的血清(n＝10)、鼠型斑疹伤寒患者的血清(n＝11)、细螺旋体病患者的血清(n＝7)和肾综合症出血热患者的血清(n＝8)进行特异性测试。结果，在一位细螺旋体病患者的血清样品中观察到了对IgG的阳性反应，而在剩余血清样品中未观察到对IgG的阳性反应。特异性测试的样品数量不足，因此无法断言特异性测试是否准确。对IgG的特异性为97.2％。而且，从与IgM的交叉反应测试的结果可见，对IgM的特异性为100％(μ-特异)。
工业应用
在本发明的恙虫病诊断试剂盒中，使用具有东方恙虫Gilliam、Karp和Kato、Kangwon和Boryong菌株抗原性的蛋白，通过免疫色谱法进行诊断。因此，与传统的免疫荧光抗体技术等相比，诊断结果可以用肉眼简单、准确且快速地观察。
Figure IYZ000004321362500011
Figure IYZ000004321362500021
Figure IYZ000004321362500031

Claims (13)

1.恙虫病的诊断试剂盒，包括测试条带，以检测生物样品中抗恙虫抗原的抗体，其中所述测试条带包括：
(a)吸收所述样品的样品垫；
(b)与所述样品中人类抗体结合的金结合垫；
(c)测试膜，包括含有恙虫混合抗原的测试线和含有对照蛋白的对照线；及
(d)吸收剩余样品的吸收垫，
其中所述恙虫混合抗原包含东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株的56kDa融合蛋白，东方恙虫Kangwon菌株的56kDa蛋白，和东方恙虫Boryong菌株的21kDa蛋白，并且
其中所述东方恙虫Kangwon菌株的56kDa蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的，以及所述东方恙虫Boryong菌株的21kDa蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO：6所示的。
2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，进一步包括预测试线，其被置于所述测试膜上的所述测试线之前，其中所述预测试线包含不表达恙虫抗原蛋白的大肠杆菌提取物。
3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其中所述测试膜包含所述预测试线、所述测试线与所述对照线，其中所述预测试线邻近所述样品垫放置，所述对照线邻近所述吸收垫放置，并且所述测试线置于所述预测试线和所述对照线之间。
4.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其中0.5mg/ml到0.6mg/ml的所述大肠杆菌提取物被吸收在所述预测试线中。
5.根据权利要求1或2所述的诊断试剂盒，其中存在1mg/ml的所述恙虫混合抗原和0.1mg/ml到1mg/ml的所述对照蛋白。
6.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其中所述东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株的56kDa融合蛋白，所述东方恙虫Kangwon菌株的56kDa蛋白，和所述东方恙虫Boryong菌株的21kDa蛋白分别以1mg/ml的浓度制备，并且以5∶2∶1的体积比混合，以制备1mg/ml的恙虫混合抗原。
7.根据权利要求1或2所述的诊断试剂盒，其中所述对照蛋白是兔抗山羊IgG多克隆抗体和/或山羊抗人IgM多克隆抗体。
8.根据权利要求1或2所述的诊断试剂盒，其中所述金结合垫包括至少一种选自金标记的蛋白A、金标记的抗人IgG抗体和金标记的抗人IgM抗体的标记物。
9.根据权利要求1或2所述的诊断试剂盒，其中所述人类抗体是IgG或IgM。
10.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其中所述膜的所述预测试线、所述测试线和所述对照线以2.5到3.0mm的间隔排列。
11.恙虫病的诊断试剂盒，包含在一个塑料装置中连接的两条权利要求1所述的测试条带，其为从样品垫分开的第一条带和第二条带，其中所述第一条带用于检测抗所述恙虫抗原蛋白的人IgG抗体，所述第二条带用于检测抗所述恙虫抗原蛋白的人IgM抗体，所述第一条带包括含有山羊抗人IgG抗体或蛋白A的金结合垫和含有兔抗山羊IgG多克隆抗体的对照线，并且所述第二条带包括含有山羊抗人IgM抗体的金结合垫和含有山羊抗人IgM多克隆抗体的对照线。
12.根据权利要求11所述的诊断试剂盒，其中所述第一条带和第二条带顺序或平行连接。
13.恙虫病的诊断组合物，包括作为恙虫混合抗原的东方恙虫Gilliam、Karp和Kato菌株的56kDa融合蛋白，东方恙虫Kangwon菌株的56kDa蛋白，和东方恙虫Boryong菌株的21kDa蛋白，
其中所述东方恙虫Kangwon菌株的56kDa蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的，以及所述东方恙虫Boryong菌株的21kDa蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO：6所示的。
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