CN110068686A - 一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸 - Google Patents

一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫吸附伪狂犬病病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗伪狂犬病病毒gE和gB单克隆抗体mAb1和mAb2，检测膜上含有强毒检测线T1“|”、疫苗毒检测线T2“|”和质控线C“|”印迹，强毒检测线T1为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体mAb3印迹，疫苗毒检测线T2为抗伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体mAb4印迹，质控线C为兔抗小鼠IgG抗体pAb1或金黄色葡萄球菌SPA印迹“|”。该试纸实现了伪狂犬病病毒感染和免疫抗体的快速检测和实时监测，感染与免疫鉴别检测以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，易于大范围推广应用。

Description

一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸
技术领域
本发明涉及一种家畜疫病感染与免疫抗体检测器具，特别是涉及一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种动物共患传染病，可感染牛、猪、犬、羊、狐狸和猫等。猪是伪狂犬病的传染源和自然贮存宿主，猪感染PRV后表现为发热，仔猪神经症状、高死亡率，大中猪呼吸道症状，母猪流产等临床特点。在2010年，伪狂犬病是我国规模化猪场进行疫病控制最为理想的疾病之一，许多猪场已经达到免疫无感染状态。然而在2011年，一些Bartha-K61疫苗免疫的猪场出现了变异的伪狂犬病病毒，表明传统的gE基因缺失疫苗已经不能提供足够的免疫保护。河南省猪群伪狂犬病的感染率自2005年以来呈现整体下降趋势，临床上以散发或非典型病例为主。但是，从2011年底开始，我省部分猪场突发伪狂犬疫情，很快在省内各地爆发，广泛流行；而且，部分猪场附近的羊、犬、猫、狐狸等动物也出现感染死亡状况。因此，现阶段我国伪狂犬病的防控变得更为棘手和复杂。
PRV属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，α-疱疹病毒亚科(Alpha Herpesvirinae)的成员，基因组为线性双链DNA，大小约150kb。整个PRV基因组至少含有70个基因，编码70-100余种蛋白。目前研究发现PRV可编码11个糖蛋白：gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN。gB、gH、gL和gM蛋白在疱疹病毒科中比较保守，而且gB、gH和gL对所有疱疹病毒在细胞培养物中的复制都是必需的。gB蛋白能够诱导中和抗体的产生，与免疫保护相关。gE蛋白最早被称为gI蛋白。1960年筛选制备的PRV疫苗株如Bartha株及BUK株等均存在gE基因缺失。20世纪80年代中期，通过DNA重组技术构建了gE基因缺失的PRV突变株；在此基础上，将TK基因进行缺失使PRV病毒得到进一步弱化。许多gE基因缺失疫苗均能够预防攻毒感染或减轻攻毒感染所造成的临床症状。虽然当前也存在gC基因和gG基因缺失的PRV疫苗，但在许多国家仅允许猪群使用gE基因缺失疫苗。
从1990年到2011年底，我国80％以上猪群均使用了gE基因缺失疫苗Bartha-K61进行免疫接种。gE疫苗和gE抗体诊断配套使用用于PRV净化的前提是所有流行毒株均表达gE蛋白，而且流行株感染的动物均产生gE蛋白的抗体。目前几乎所有PRV野毒株均表达gE蛋白。通过gE基因缺失疫苗与gE抗体诊断方法的联合使用，一些欧洲国家如德国、奥地利、瑞典、丹麦和英国及美国已成功在家养猪群中净化了伪狂犬病。我国政府在2011年制订了《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》，提出到2015年，原种猪场伪狂犬病达到净化标准；到2020年，全国所有种猪场伪狂犬病达到净化标准的目标。然而病原体的净化是一项长期而且艰巨的任务。如果要实现完全净化或接近净化状态可能需要100年时间甚至更长；例如美国的伪狂犬病首次出现在1909年，其净化计划始自1989年，到2005年绝大多数净化项目得以完成。即便如此，野猪群中PRV病毒的存在也对家猪再次感染PRV造成了很大的威胁。因此，建立简便、快速、特异、敏感的鉴别诊断方法区分疫苗免疫动物及病毒感染动物十分必要。
伪狂犬病的鉴别诊断方法包括聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等，其中ELISA试剂盒是市场上最为常用的鉴别诊断商品。商品化的ELISA试剂盒分别使用间接或阻断ELISA，由于临床血清较为复杂，间接ELISA的特异性相对于阻断ELISA稍差。阻断ELISA使用临床猪血清阻断gE蛋白特异性单抗的结合，特异性与敏感性较高；然而，阻断ELISA也存在先天的缺点。阻断ELISA使用的单抗针对的是在猪体内具有免疫优势的表位，一旦PRV病毒的gE基因发生变异就有可能使得单抗识别无效。虽然阻断ELISA仍然能够特异检测出我国新出现的变异PRV病毒抗体，但单抗识别无效的可能性依旧存在。所以，依据现阶段的PRV变异毒株开发新的鉴别诊断方法势在必行。
免疫层析试纸是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型体外检测技术，是理想的即时检测(point-of-care test,POCT)和现场检测技术，具有更加灵敏、特异、简便、快速等优点，尤其是可实现“傻瓜式”操作，即不需要任何附加仪器设备即可进行现场检测，并在1～5分钟内判定结果，广泛应用于各种分析物的定性和半定量快速检测，包括抗原、半抗原、抗体和核酸等，已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一。因此研制动物疫病病原和抗体检测胶体试纸产品具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是研制适用于家畜伪狂犬病抗体检测与疫苗免疫评价的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，本试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫吸附伪狂犬病病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗伪狂犬病病毒gE和gB单克隆抗体mAb1和mAb2，检测膜上含有强毒检测线T1“|”、疫苗毒检测线T2“|”和质控线C“|”印迹，强毒检测线T1为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体mAb3印迹，疫苗毒检测线T2为抗伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体mAb4印迹，质控线C为兔抗小鼠IgG抗体pAb1或金黄色葡萄球菌SPA印迹“|”。
所述试纸以单克降抗体阻断模式检测伪狂犬病感染和免疫抗体，在检测膜显现三条红色条带“|||”，且检测线T1和T2显色强度与空白对照相当，为伪狂犬病抗体阴性；显现三条红色条带“|||”，但检测线T1和T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病感染抗体弱阳性；仅显现一条红色条带“|”，为伪狂犬病感染抗体强阳性；显现三条红色条带“|||”，且检测线T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病免疫抗体弱阳性；显现两条红色条带“||”，为伪狂犬病疫苗免疫抗体强阳性。
单克隆抗体mAb1和mAb3特异识别伪狂犬病病毒强毒株，但不与疫苗毒株反应，分别识别伪狂犬病病毒gE蛋白的不同抗原表位；单克隆抗体mAb2和mAb4特异识别伪狂犬病病毒强毒株和疫苗毒株，分别识别伪狂犬病病毒gB蛋白的不同抗原表位。
单克隆抗体mAb1和mAb3、mAb2和mAb4的制备方法为：
(1)伪狂犬病病毒免疫抗原的制备
(1.1)伪狂犬病病毒gE重组蛋白的制备
以PCR扩增PRV gE蛋白的表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gE基因重组表达质粒pET-gE，经0.4mol/L IPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gE重组蛋白，Western blot检测表明gE表达蛋白均能被PRV强毒阳性血清特异识别，采用Ni柱亲和层析纯化技术获得纯化的gE重组蛋白；
(1.2)伪狂犬病病毒gB重组蛋白的制备
以PCR扩增PRV gB蛋白的中和表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gB基因重组表达质粒pET-gB，经1mol/L IPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gB重组蛋白，Western blot检测表明gB表达蛋白均能被PRV阳性血清特异识别，采用Ni柱亲和层析纯化及稀释复性技术获得纯化的gB重组蛋白；
(2)抗伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备
(2.1)杂交瘤细胞株的建立
以伪狂犬病病毒gE和gB重组蛋白为免疫抗原，免疫小鼠，分别建立抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株和gB蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株；
(2.2)单克隆抗体的制备
(2.3)单克隆抗体的鉴定
(2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价；
(2.3.2)单克隆抗体的特异性
用PRV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株感染仓鼠肾细胞BHK-21，以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定gE和gB单抗与PRV流行毒株和疫苗株的反应性；
(2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定
利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分别测定gE和gB蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白亚型；
(2.3.4)单克隆抗体识别抗原表位分析
以叠加ELISA对PRV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定，gE单克隆抗体叠加ELISA结果显示，两个单抗的AI值小于40％，识别gE蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb1用于胶体金标记；若两个单抗的AI值大于40％，识别gE蛋白不同抗原表位，作为单克隆抗体mAb3用于强毒检测线T1印迹；gB单克隆抗体叠加ELISA结果显示，两个单抗的AI值小于40％，识别gB蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb2用于胶体金标记抗体；若两个单抗的AI值大于40％，且二者之间AI值大于40％，分别识别gB蛋白不同的抗原表位，作为单克隆抗体mAb4用于疫苗毒检测线T2印迹；
(2.4)单克隆抗体的纯化
以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。
伪狂犬病病毒检测抗原为伪狂犬病病毒抗原、gE和gB蛋白重组抗原。
伪狂犬病病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的伪狂犬病病毒浓缩液。
伪狂犬病病毒抗原的具体制备方法为：以伪狂犬病病毒汤阴株感染BHK-21细胞，48h后将病变细胞与-80℃和37℃反复冻融3次，4℃10000r/min离心30min，取上清，测病毒TCID50达到10-6/0.1mL以上；在PRV病毒液中加入终浓度0.1％～0.5％甲醛溶液充分混匀，置37℃灭活48h，制备PRV灭活病毒抗原。
gE和gB蛋白重组抗原为利用大肠杆菌表达纯化的gE和gB重组蛋白。
抗原垫的制备方法如下：
将玻璃纤维棉按规格切成条状，以含0.1mol/L NaCl、0.2％Tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH 7.2)溶液，分别将PRV病毒抗原做系列稀释，并以15μL/cm的用量将PRV检测抗原喷点于玻璃棉，干燥；将抗原垫置塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用；利用吸附检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度猪抗PRV阳性血清测定试纸阻断效果，通过对抗原不同浓度的筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原为100μg/mL，重组抗原为200μg/mL。
以伪狂犬病病毒gE和gB重组蛋白为免疫抗原，通过杂交瘤细胞技术生产鉴定抗伪狂犬病病毒gE和gB蛋白单克隆抗体，利用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选区分伪狂犬病病毒强毒和疫苗毒的单克隆抗体，以叠加酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选识别不同抗原表位的单克隆抗体。筛选鉴定的gE蛋白单克隆抗体mAb1和mAb3特异识别伪狂犬病病毒强毒株，但不与疫苗毒株反应，识别伪狂犬病病毒gE蛋白的不同抗原表位，分别用于胶体金标记和强毒检测线T1印迹；gB蛋白单克隆抗体mAb2和mAb4特异识别伪狂犬病病毒强毒株和疫苗毒株，识别伪狂犬病病毒gB蛋白的不同抗原表位，分别用于胶体金标记和疫苗毒检测线T2印迹；以小鼠IgG为免疫抗原制备兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAb1、pAb1或金黄色葡萄球菌SPA可用于质控线C印迹；以甲醛或β-丙内脂灭活伪狂犬病病毒浓缩液，制备成病毒抗原，用于抗原垫。
本发明有益的积极效果：
伪狂犬病抗体阻断检测试纸实现了伪狂犬病病毒感染和免疫抗体的快速检测，可实现对伪狂犬病病毒感染和免疫抗体水平的实时监测，感染与免疫鉴别检测以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。检测试纸条具有下列各项优点：
(1)感染与免疫抗体评价。传统试纸以间接法检测抗体，只能检测总的抗体水平，无法检测中和抗体水平；伪狂犬病抗体阻断检测试纸基于单克隆抗体阻断模式对伪狂犬病病毒感染与免疫抗体进行检测，可有效检测感染抗体或免疫抗体的抗体水平，为伪狂犬病疫苗免疫的免疫保护评价以及感染与免疫的鉴别检测提供新的技术手段。
(2)特异性强，敏感性高。伪狂犬病抗体阻断检测试纸利用特异性检测抗原和单克隆抗体以抗体阻断模式制备而成，单克隆抗体的特异性强和敏感性高，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对标记抗体的反应性影响很小，且具有较高的标记率。因此，抗体阻断检测试纸具有较高的特异性和敏感性。
(3)操作简便快速。使用抗体阻断检测试纸时无需任何其它试剂，待检样品加入试纸加样孔，5～10min即可判定检测结果，而常规ELISA不仅操作复杂，而且检测时间需1～2h，因此显著优于ELISA试验。
(4)显示检测结果形象、直观准确。抗体阻断检测试纸以单克降抗体阻断模式检测伪狂犬病感染与免疫抗体，以在检测膜显现三条红色条带“|||”，且检测线T1和T2显色强度与空白对照相当，为伪狂犬病抗体阴性；显现三条红色条带“|||”，但检测线T1和T2显色强度明显弱于空白对照，或仅显现一条红色条带“|”，为伪狂犬病感染抗体阳性，表示被检血清样品含有伪狂犬病感染抗体；显现三条红色条带“|||”，且检测线T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病免疫抗体弱阳性，表示被检血清样品含有低水平伪狂犬病毒免疫抗体；显现两条红色条带“||”为伪狂犬病免疫抗体强阳性，表示被检血清样品含有高水平伪狂犬病毒免疫抗体，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(5)成本低，投资少。使用抗体阻断检测试纸，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
附图说明
图1为PRV gE蛋白的表达、纯化与鉴定。A：SDS-PAGE；B：Western blot(His单抗)；C：Western blot(PRV阳性血清)；M：蛋白Marker；1、2：gE纯化蛋白；3、4：gE蛋白/His单抗；5、6：gE蛋白/PRV血清。
图2为PRV gB蛋白的表达、纯化与鉴定。M：蛋白marker；1：gB诱导；2、3：gB纯化蛋白；4、5：gB未诱导和诱导/PRV血清。
图3为gE和gB单克隆抗体的阻断IPMA检测。
图4为gE单克隆抗体的IPMA检测。a：PRV汤阴株/猪阳性血清；b：PRV汤阴株/10C3；c：PRV疫苗株Bartha/10C3；d：BHK-21/10C3。
图5为gB单克隆抗体的IPMA检测。a：PRV汤阴株/10C7；b：PRV疫苗株Bartha/10C7；c：BHK-21/10C7。
图6为伪狂犬病抗体阻断检测试纸的剖视结构示意图。
图7为伪狂犬病抗体阻断检测试纸卡的俯视结构示意图。图中，1：支撑板，2：抗原垫，3：金标垫，4：检测膜，5：吸水垫，6：检测线T1印迹，7：检测线T2印迹，8：质控线C印迹，9：试纸卡，10：加样孔。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
伪狂犬病抗体阻断检测试纸可广泛应用于多种动物伪狂犬病感染抗体和免疫抗体水平监测和免疫评价。制备伪狂犬病抗体阻断检测试纸，首先需制备伪狂犬病病毒免疫抗原，进而制备抗伪狂犬病病毒gE和gB蛋白单克隆抗体，识别猪伪狂犬病病毒gE和gB蛋白的单克隆抗体mAb1和mAb2用于制备胶体金标记物，识别猪伪狂犬病病毒gE和gB蛋白不同抗原表位的单克隆抗体mAb3和mAb4分别用于印制强毒检测线T1印迹“|”和疫苗毒检测线T2印迹“|”，其次需制备兔抗小鼠IgG抗体pAb1或金黄色葡萄球菌SPA，用于印制质控线C印迹“|”，最后需制备经灭活的伪狂犬病病毒抗原或gE和gB蛋白重组抗原，用于制备抗原垫。
(1)伪狂犬病病毒免疫抗原的制备
(1.1)伪狂犬病病毒gE重组蛋白的制备
以PCR扩增PRV gE蛋白的表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gE基因重组表达质粒pET-gE，经0.4mol/L IPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gE重组蛋白，Western blot检测表明gE表达蛋白均能被PRV强毒阳性血清特异识别，具有良好的反应性。采用Ni柱亲和层析纯化技术获得纯度约90％的gE重组蛋白(12mg/L)(图1)。
(1.2)伪狂犬病病毒gB重组蛋白的制备
以PCR扩增PRV gB蛋白的中和表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gB基因重组表达质粒pET-gB，经1mol/L IPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gB重组蛋白，Western blot检测表明gB表达蛋白均能被PRV阳性血清特异识别，具有良好的反应性。采用Ni柱亲和层析纯化及稀释复性技术获得纯度约90％的gB重组蛋白(15mg/L)(图2)。
(2)抗伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备
(2.1)杂交瘤细胞株的建立
分别将伪狂犬病病毒gE和gB重组蛋白与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，以50～100μg/只免疫Balb/c系小鼠3次，每次间隔15～30d；第3次加强免疫后3～4d，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％(v/v)酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108个的脾细胞与2～5×107个的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min，弃上清，在37℃的水浴中将0.7～1mL的40％～50％(w/v)PEG 4000(pH8.5-9.0)缓缓加入细胞，温育1min后，缓慢加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基中(1×105个/mL)，并加入96孔培养板(100～200μL/孔)，置37℃5％CO2培养箱中培养。培养7～10d后，取杂交瘤细胞培养上清以酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选阳性杂交瘤细胞，并利用PRV阳性血清以阻断ELISA和IPMA验证。以伪狂犬病病毒标准强毒感染仓鼠肾细胞(BHK-21)，经甲醇固定后，5％(w/v)脱脂奶37℃封闭1h；加待检细胞培养上清50μL/孔，设HAT培养基和小鼠免疫血清为阴性和阳性对照；加1:500辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体(50μL/孔)，37℃作用30min；每步反应后均用含0.05％Tween-20的PBS充分洗涤；以底物AEC室温显色10～20min，用水冲洗中止显色后，在显微镜下观察显色结果。选取强阳性、细胞生长旺盛的克隆孔进行连续3次有限稀释克隆化，扩大培养后冻存细胞，分别建立抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株6株(3E6、7C5、7E1、10C3、14C1和15C1)和gB蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株5株(1C1、2F11、5D2、5G8和10C7)(图3、表1和表2)。
表1 gE蛋白单抗的阻断ELISA检测
表2 gB蛋白单抗的阻断ELISA检测
(2.2)单克隆抗体的制备
以体内诱生腹水制备单抗，取经降殖烷或液体石蜡致敏的经产Balb/c小鼠，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞1×107个/只，7～10d后抽取腹水，离心后取上清，分装，冻存。
(2.3)单克隆抗体的鉴定
(2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的ELISA效价分别在1:640和1:5×105以上，IPMA效价分别在1:16和1:8000以上，gE和gB单克隆抗体的亲和常数见表3。
表3 gE和gB单克隆抗体亚型及亲和力常数
(2.3.2)单克隆抗体的特异性
用PRV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株感染仓鼠肾细胞(BHK-21)，以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定gE和gB单抗与PRV流行毒株和疫苗株的反应性，6株gE蛋白单克隆抗体均特异识别PRV标准毒株和流行毒株，但不识别疫苗毒株(图4)；5株gB蛋白单克隆抗体特异识别PRV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株(图5)。
(2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定
利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分别测定gE和gB蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白亚型，11株单克隆抗体的亚型分别IgG1、IgG2a和IgG2b亚型(表3)。
(2.3.4)单克隆抗体识别抗原表位分析
以叠加ELISA对PRV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定。首先利用抗原包被酶标板以间接ELISA测定各单抗的工作浓度，绘制抗原饱和曲线。在叠加ELISA试验中，根据抗原饱和曲线适当稀释单抗，并配对加入酶标板各孔，37℃孵育1～2h；分别加入酶标二抗和TMB进行显色，读取各孔OD450值，按下列公式计算叠加系数(AI)：AI＝[2×OD1+2/(OD1+OD2)-1]×100％，其中OD1+2为配对单抗孔的OD450值，OD1和OD2为两个独立单抗孔的OD450值。两个单抗的AI值小于40％判为识别相同或相近抗原表位；AI值大于40％判为识别不同抗原表位。gE单克隆抗体叠加ELISA结果显示，单抗3E6、7C5、14C1和15C1的AI值小于40％，识别gE蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb1用于胶体金标记；7E1和10C3与上述单抗的AI值大于40％，识别gE蛋白不同抗原表位(表4)，作为单克隆抗体mAb3用于强毒检测线T1印迹。gB单克隆抗体叠加ELISA结果显示，单抗1C1、2F11和5G8的AI值小于40％，识别gB蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb2用于胶体金标记抗体；5D2和10C7上述单抗的AI值大于40％，且二者之间AI值大于40％，分别识别gB蛋白不同的抗原表位(表5)，作为单克隆抗体mAb4用于疫苗毒检测线T2印迹。
表4 PRV gE单抗识别的差异表位鉴定
表5 PRV gB单抗识别的差异表位鉴定
(2.4)单克隆抗体的纯化
以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。取1mL小鼠腹水，加入2mL 0.06mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0)，以0.1mol/L HCl调至pH 4.5；于室温搅拌下逐滴加入33μL辛酸，4℃静置2h，15000r/min离心30min，弃沉淀；在离心上清中加入1/10体积0.01mol/L PBS(pH7.4)，以0.1mol/L NaOH调至pH 7.4；于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至终浓度45％，4℃静置2h，10000r/min离心30min，弃上清；以适量PBS重悬沉淀，对PBS透析过夜，换液3次。以分光光度计法或考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定纯化单克隆抗体IgG的蛋白含量在1mg/mL以上，以酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定小鼠腹水和纯化IgG的抗体效价在1:5×105和1:4000以上，分装，冻存。
(3)兔抗小鼠IgG多克隆抗体的制备
以纯化小鼠IgG免疫2.0kg左右健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射，50μg/只，共免疫3次，每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原肌肉注射，最后一次加强免疫2周后，以琼脂扩散试验(AGP)测定免疫血清抗体效价高于1:40时，采集高免兔全血，分离血清，以辛酸-硫酸铵法纯化兔抗小鼠IgG，方法同(2.4)单抗纯化，辛酸用量为45μL/mL血清，测定抗体效价和蛋白浓度(10～20mg/mL)，所制备兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAb1可用于质控线C印迹。
(4)检测抗原的制备
(4.1)病毒抗原
以伪狂犬病病毒汤阴株感染BHK-21细胞，48h后将病变细胞于-80℃和37℃反复冻融3次，4℃10000r/min离心30min，取上清，测病毒TCID50达到10-6/0.1mL以上。在PRV病毒液中加入终浓度0.1％～0.5％甲醛溶液充分混匀，置37℃灭活48h，取灭活病毒液按常规方法接种BHK-21细胞，并盲传三代，检测病毒是否完全灭活。通过病毒灭活试验确定以终浓度0.4％甲醛溶液37℃灭活48h可完全灭活病毒，以PRV抗原检测试纸测定其抗原活性，制备PRV灭活病毒抗原。
(4.2)重组抗原
伪狂犬病病毒gE和gB重组蛋白的制备见(1)伪狂犬病病毒免疫抗原的制备。
(5)单克隆抗体的胶体金标记
(5.1)胶体金的制备
取100mL超纯水置于500mL洁净的锥形瓶，加入1mL 1％(w/v)氯金酸煮沸；在搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1mL 1％(w/v)柠檬酸钠溶液，煮沸约3min至溶液颜色由黄色变为紫红色，继续煮沸2min；待溶液冷却至室温，补超纯水至100mL，以0.2mol/L K2CO3调pH至9.0，4℃避光可保存数月。
(5.2)最适标记蛋白浓度测定
取待标记抗PRV单抗IgG对20mmol/L硼酸钠溶液(pH 8.0)4℃过夜透析。在微孔板中以25μL超纯水1:2、1:4、1:8……倍比稀释待标记PRV单抗；各孔加入125μL胶体金溶液，室温静置5min；加入125μL 1mol/L NaCl溶液；各孔颜色随蛋白浓度的降低而由红色变为蓝色。以颜色未变蓝的单抗最高稀释度的蛋白浓度为胶体金最适标记浓度，胶体金标记时，蛋白浓度增加20％。
(5.3)单克隆抗体的胶体金标记
取2mL最适蛋白浓度的待标记单抗IgG(抗gE蛋白单克隆抗体mAb1和抗gB蛋白单克隆抗体mAb2)，加入10mL胶体金溶液(pH 9.0)，迅速混匀，室温作用10～15min；加入1/10体积含10％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的20mmol/L硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10～15min；4℃15000g离心30min，小心移去上清；以含1％(w/v)BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，同上离心，弃上清；重复洗涤1次，以1mL含1％(w/v)BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，4℃保存备用。
(6)抗原垫的制备
将玻璃纤维棉(Millipore C048)按规格切成15mm×300mm的条状，以含0.1mol/LNaCl、0.2％Tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH 7.2)溶液分别将PRV病毒抗原做系列稀释，利用Airjet Quanti 3000以15μL/cm将PRV检测抗原喷点于玻璃棉；置于50℃干燥箱干燥30min；将抗原垫置塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用。利用吸附检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度猪抗PRV阳性血清测定试纸阻断效果，通过对抗原不同浓度的筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原100μg/mL，重组抗原200μg/mL。
(7)金标垫的制备
将玻璃棉切成1.5cm×30cm的长条，置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；取1mL胶体金标记物加入2mL含2％(w/v)BSA、3％(w/v)蔗糖、0.6mol/L NaCl、0.2％(v/v)Tween 20和0.1％(w/v)叠氮钠的20mmol/L硼酸钠溶液(pH 8.0)；利用Airjet Quanti 3000以15μL/cm分别将抗gB和gE蛋白单克隆抗体胶体金标记物溶液喷点于玻璃棉；置于50℃干燥箱干燥30min；将胶金垫置塑料袋，加干燥剂4℃密闭保存备用。
(8)检测膜的制备
将2.0cm×30cm的Millipore SHF1800420硝酸纤维素膜(NC)置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；用PBS(pH 7.2)将抗gE蛋白单克隆抗体mAb3、抗gB蛋白单克隆抗体mAb4和兔抗鼠IgG或SPA稀释至1.0mg/mL，并分别放于贮存池；利用Biojet Quanti 3000以1μL/cm分别将抗gE蛋白单克隆抗体mAb3、抗gB蛋白单克隆抗体mAb4和兔抗鼠IgG或SPA溶液喷点于检测膜中央，形成强毒检测线T1、疫苗毒检测线T2和质控线C印迹，检测线与质控线相距0.5cm；置于42℃干燥箱30min或室温自然干燥；将检测膜置塑料袋，加干燥剂4℃密闭保存备用。
(9)吸水垫的制备
将吸水滤纸切成18mm×300mm条状，制备吸水垫，室温保存备用。
(10)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC支撑板，切成7.5cm×30cm的长板，制备支撑板。
(11)试纸的组装
分别将检测膜、金标垫、抗原垫和吸水垫依次粘贴于支撑板上，组装成检测试纸：将硝酸纤维素检测膜平贴于75mm×300mm支撑板的中央，两端边距各为21mm；将8mm×300mm的金标垫平贴于检测膜检测线的下方，重叠检测膜2mm，然后均匀平压；将15mm×300mm的抗原垫平贴于胶体金抗原棉的下方，重叠胶体金抗原棉下端2mm；将18mm×300mm吸水滤纸平放于检测膜质控线的一端，重叠检测膜上端2mm。
(12)切割和包装
将组装好的半成品放入CM4000切割机中进行切割，规格为2.8mm×60mm，显色区应平整无压痕，有三条隐形线，分别是强毒检测线(T1线)、疫苗毒检测线(T2线)、质控线(C线)，靠近样品端的为T线，靠近手柄端的为C线。切割好的试纸被装入预先制备好的试纸卡中，并用压壳机封好。制成的试纸卡用铝箔袋包装好，封口机封口后打上日期和批次，室温保存备用。
(13)伪狂犬病抗体阻断检测试纸的实施结构
参见图6～7，1为支撑板用不吸水薄片条，实施中可采用塑胶薄片条或采用不吸水的硬质纸片材，反应试剂载体吸附层由抗原垫2、金标垫3、检测膜4、吸水垫5组合而成，依次粘贴在支撑板1上；其中抗原垫为吸附检测抗原的玻璃纤维棉，检测抗原为灭活的伪狂犬病病毒或gE和gB重组蛋白，金标垫为吸附胶体金标记抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体mAb1和抗gB蛋白单克隆抗体mAb2的金标玻璃纤维棉，可采用精制玻璃纤维棉，检测膜实施中可采用硝酸纤维素膜，手柄端的吸水垫采用吸水纸，如滤纸或其它吸水纸均可，试纸条总长8cm，宽度0.4cm，强毒检测线T1印迹6为抗gE蛋白单克隆抗体mAb3在硝酸纤维素膜上印制的检测线印迹“|”，疫苗毒检测线T2印迹为抗gB蛋白单克隆抗体mAb4在硝酸纤维素膜上印制的检测线印迹“|”，质控线C印迹8为兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAb1或金黄色葡萄球菌SPA在硝酸纤维素膜上印制的质控线印迹“|”，在检测膜上的检测线印迹和质控线印迹组合排列为“|||”，9为试纸卡，在试纸样品端有加样孔10。
(14)伪狂犬病抗体阻断检测试纸实施检测反应原理
当待检样品加入伪狂犬病抗体阻断检测试纸加样孔后，待检溶液溶解抗原垫中的检测抗原，并通过虹吸带动待检抗体、检测抗原及金标gE蛋白单克隆抗体mAb1和gB蛋白单克隆抗体mAb2一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中。当待检样品中不含有PRV抗体时，溶液中的检测抗原在扩散过程中与金标抗体mAb1和mAb2结合，金标抗体-抗原复合物在检测膜上被检测印迹中的gE蛋白单克隆抗体mAb3和gB蛋白单克隆抗体mAb4拦截，形成两条红色检测线T1和T2“||”，多余的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上被质控印迹中的pAb1或SPA拦截，生成红棕色标记“|”，三种标记组合叠加，形成三条红色阴性标记“|||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，表示样品中不含有PRV抗体；当待检样品中含有PRV强毒抗体时，样品中的PRV抗体先与检测抗原结合，封闭检测抗原与金标抗体mAb1和mAb2的结合位点，抑制或完全阻断金标抗体-抗原复合物的形成，导致检测膜上的强毒检测印迹mAb3和疫苗毒检测印迹mAb4不能有效拦截金标复合物而使检测线T1和T2显色减弱，表示样品中含有PRV抗体，抗体水平越高，检测线T1、T2越弱直至完全消失，试纸形成检测线T1、T2明显弱于空白对照的红色标记“|||”或只显示一条质控线C红色标记“|”为PRV感染抗体阳性；当待检样品是疫苗免疫时，样品中只含有PRV gB抗体而不含gE抗体，样品中的PRV gB抗体先与检测抗原结合，封闭检测抗原与金标抗体mAb2的结合位点，抑制或完全阻断金标抗体mAb2-抗原复合物的形成，导致检测膜上的疫苗毒检测印迹mAb4不能有效拦截金标复合物而使疫苗毒检测线T2显色减弱，表示样品中含有PRV gB抗体，抗体水平越高，检测线T2越弱直至完全消失，而强毒检测线T1没有影响，试纸形成检测线T2明显弱于空白对照的红色标记“|||”，为PRV免疫抗体弱阳性，只显示强毒检测线T1和质控线C红色标记“||”为PRV免疫抗体强阳性。如果检测膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。
(15)伪狂犬病抗体阻断检测试纸检测实例操作方法
(15.1)检测血清样品的制备：采集待检血清，取100μL血清样品加入300μL PBS或生理盐水进行1:2、1:4、1:8……倍比稀释后检测。
(15.2)试纸检测：取1:2稀释的待检血清样品100μL，将伪狂犬病抗体阻断检测试纸样品端浸入待检溶液中，静置5～10min，观察结果。
(15.3)检测结果判定：试纸显现三条红色条带“|||”，且检测线T1和T2显色强度与空白对照相当，为伪狂犬病抗体阴性，表示待检样品中不含有伪狂犬病抗体；显现三条红色条带“|||”，但检测线T1和T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病感染抗体弱阳性，表示待检样品中含有低水平感染抗体；仅显现一条红色条带“|”，为伪狂犬病感染抗体强阳性，表示待检样品中含有高水平感染抗体；显现三条红色条带“|||”，且检测线T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病免疫抗体弱阳性，表示待检样品中含有低水平伪狂犬病免疫抗体；显现两条红色条带“||”，为伪狂犬病疫苗免疫抗体强阳性，表示待检样品中含有高水平伪狂犬病疫苗免疫抗体；试纸未显现任何条带，表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。
(16)伪狂犬病抗体阻断检测试纸性能评价
(16.1)敏感性
用PBS或生理盐水1:2、1:4、1:8……倍比稀释不同亚型伪狂犬病病毒标准阳性血清，以伪狂犬病抗体阻断检测试纸和阻断ELISA试剂盒进行平行检测，并以TSR3000读条仪测定试纸检测线吸光值(ROD)，计算试纸检测PRV抗体的半数抑制效价，评价伪狂犬病抗体阻断检测试纸的敏感性，结果显示试纸对伪狂犬病抗体半数抑制(弱阳性)的敏感性与阻断ELISA相当。
(16.2)特异性
用PBS或生理盐水1:2稀释伪狂犬病病毒(PRV)、伪狂犬病疫苗免疫、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)和猪圆环病毒2型(PCV2)等标准阳性血清，以伪狂犬病抗体阻断检测试纸进行平行检测，发现对应伪狂犬病病毒阳性血清完全阻断检测线T1、T2显色，为强阳性，伪狂犬病疫苗免疫阳性血清完全阻断检测线T2显色，为强阳性，其他相关病毒阳性血清检测线T1、T2显色无明显变化，为阴性，表明伪狂犬病抗体阻断检测试纸特异性强，与猪相关疫病抗体无交叉反应。
实施例一，伪狂犬病感染抗体监测，采集动物血清，取100μL血清样品加入300μLPBS或生理盐水进行稀释，制备待检血清溶液，以伪狂犬病抗体阻断检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，检测伪狂犬病感染抗体水平。试纸显现三条红色条带“|||”，且检测线T1和T2显色强度与空白对照相当，为伪狂犬病抗体阴性，表示待检样品中不含有伪狂犬病抗体；显现三条红色条带“|||”，但检测线T1和T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病感染抗体弱阳性，表示待检样品中含有低水平感染抗体；仅显现一条红色条带“|”，为伪狂犬病感染抗体强阳性，表示待检样品中含有高水平感染抗体；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。伪狂犬病抗体阻断检测试纸对动物血清PRV感染抗体的检测可实现对动物PRV感染抗体水平的实时监测，试纸强阳性和弱阳性表示血清中含有感染抗体，动物存在或发生过PRV野毒感染，而阴性表示血清PRV感染抗体，动物没有发生PRV野毒感染，为伪狂犬病疫情监测和净化提供技术支撑。
实施例二，伪狂犬病疫苗免疫效果评价，伪狂犬病灭活疫苗免疫后2～3周，采集免疫动物血清，取100μL血清样品加入300μL PBS或生理盐水进行1:2、1:4、1:8……倍比稀释，制备待检血清溶液，以伪狂犬病抗体阻断检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，检测伪狂犬病免疫抗体水平。试纸显现三条红色条带“|||”，且检测线T1和T2显色强度与空白对照相当，为伪狂犬病抗体阴性，表示待检样品中不含有伪狂犬病抗体；显现三条红色条带“|||”，且检测线T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病免疫抗体弱阳性，表示待检样品中含有低水平伪狂犬病免疫抗体；显现两条红色条带“||”为伪狂犬病疫苗免疫抗体强阳性，表示待检样品中含有高水平伪狂犬病免疫抗体；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。伪狂犬病抗体阻断检测试纸对免疫动物血清伪狂犬病免疫抗体的检测可实现对伪狂犬病疫苗(弱毒疫苗和灭活疫苗)免疫抗体水平的实时监测，试纸强阳性表示血清含有高水平抗体，而弱阳性和阴性表示血清含有低水平或不含免疫抗体，不能为动物提供完全保护，实现对免疫伪狂犬病疫苗免疫效果的快速评价，为伪狂犬病疫苗免疫程序制定和调整提供技术指导。
实施例三，伪狂犬病抗体水平监测，在伪狂犬病疫苗免疫后的不同时间段，分别采集免疫动物血清，取100μL血清样品以PBS或生理盐水进行1:2、1:4、1:8……倍比稀释，制备待检血清溶液，以伪狂犬病抗体阻断检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，检测动物伪狂犬病免疫抗体水平动态变化。试纸显现三条红色条带“|||”，且检测线T1和T2显色强度与空白对照相当，为伪狂犬病抗体阴性，表示待检样品中不含有伪狂犬病抗体；显现三条红色条带“|||”，且检测线T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病免疫抗体弱阳性，表示待检样品中含有低水平伪狂犬病免疫抗体；显现两条红色条带“||”为伪狂犬病疫苗免疫抗体强阳性，表示待检样品中含有高水平伪狂犬病免疫抗体；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。伪狂犬病抗体阻断检测试纸对免疫动物血清伪狂犬病免疫抗体的检测可实现对伪狂犬病疫苗(弱毒疫苗和灭活疫苗)免疫抗体水平变化的实时监测，试纸强阳性表示血清含有高水平抗体，而弱阳性和阴性表示血清含有低水平或不含免疫抗体，不能为动物提供完全保护，需要及时进行伪狂犬病疫苗免疫，为伪狂犬病疫苗免疫程序制定和调整提供技术指导。

Claims (9)

1.一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫吸附伪狂犬病病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗伪狂犬病病毒gE和gB单克隆抗体mAb1和mAb2，检测膜上含有强毒检测线T1“|”、疫苗毒检测线T2“|”和质控线C“|”印迹，强毒检测线T1为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体mAb3印迹，疫苗毒检测线T2为抗伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体mAb4印迹，质控线C为兔抗小鼠IgG抗体pAb1或金黄色葡萄球菌SPA印迹“|”。
2.根据权利要求1所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述试纸以单克降抗体阻断模式检测伪狂犬病感染和免疫抗体，在检测膜显现三条红色条带“|||”，且检测线T1和T2显色强度与空白对照相当，为伪狂犬病抗体阴性；显现三条红色条带“|||”，但检测线T1和T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病感染抗体弱阳性；仅显现一条红色条带“|”，为伪狂犬病感染抗体强阳性；显现三条红色条带“|||”，且检测线T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病免疫抗体弱阳性；显现两条红色条带“||”，为伪狂犬病疫苗免疫抗体强阳性。
3.根据权利要求1所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，单克隆抗体mAb1和mAb3特异识别伪狂犬病病毒强毒株，但不与疫苗毒株反应，分别识别伪狂犬病病毒gE蛋白的不同抗原表位；单克隆抗体mAb2和mAb4特异识别伪狂犬病病毒强毒株和疫苗毒株，分别识别伪狂犬病病毒gB蛋白的不同抗原表位。
4.根据权利要求1所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，单克隆抗体mAb1和mAb3、mAb2和mAb4的制备方法为：
(1)伪狂犬病病毒免疫抗原的制备
(1.1)伪狂犬病病毒gE重组蛋白的制备
以PCR扩增PRV gE蛋白的表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gE基因重组表达质粒pET-gE，经0.4mol/LIPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gE重组蛋白，Western blot检测表明gE表达蛋白均能被PRV强毒阳性血清特异识别，采用Ni柱亲和层析纯化技术获得纯化的gE重组蛋白；
(1.2)伪狂犬病病毒gB重组蛋白的制备
以PCR扩增PRV gB蛋白的中和表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gB基因重组表达质粒pET-gB，经1mol/L IPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gB重组蛋白，Western blot检测表明gB表达蛋白均能被PRV阳性血清特异识别，采用Ni柱亲和层析纯化及稀释复性技术获得纯化的gB重组蛋白；
(2)抗伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备
(2.1)杂交瘤细胞株的建立
以伪狂犬病病毒gE和gB重组蛋白为免疫抗原，免疫小鼠，分别建立抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株和gB蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株；
(2.2)单克隆抗体的制备
(2.3)单克隆抗体的鉴定
(2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价；
(2.3.2)单克隆抗体的特异性
用PRV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株感染仓鼠肾细胞BHK-21，以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定gE和gB单抗与PRV流行毒株和疫苗株的反应性；
(2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定
利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分别测定gE和gB蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白亚型；
(2.3.4)单克隆抗体识别抗原表位分析
以叠加ELISA对PRV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定，gE单克隆抗体叠加ELISA结果显示，两个单抗的AI值小于40％，识别gE蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb1用于胶体金标记；若两个单抗的AI值大于40％，识别gE蛋白不同抗原表位，作为单克隆抗体mAb3用于强毒检测线T1印迹；gB单克隆抗体叠加ELISA结果显示，两个单抗的AI值小于40％，识别gB蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb2用于胶体金标记抗体；若两个单抗的AI值大于40％，且二者之间AI值大于40％，分别识别gB蛋白不同的抗原表位，作为单克隆抗体mAb4用于疫苗毒检测线T2印迹；
(2.4)单克隆抗体的纯化
以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。
5.根据权利要求1所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，伪狂犬病病毒检测抗原为伪狂犬病病毒抗原、gE和gB蛋白重组抗原。
6.根据权利要求5所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，伪狂犬病病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的伪狂犬病病毒浓缩液。
7.根据权利要求6所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，伪狂犬病病毒抗原的具体制备方法为：以伪狂犬病病毒汤阴株感染BHK-21细胞，48h后将病变细胞与-80℃和37℃反复冻融3次，4℃10000r/min离心30min，取上清，测病毒TCID50达到10-6/0.1mL以上；在PRV病毒液中加入终浓度0.1％～0.5％甲醛溶液充分混匀，置37℃灭活48h，制备PRV灭活病毒抗原。
8.根据权利要求5所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，gE和gB蛋白重组抗原为利用大肠杆菌表达纯化的gE和gB重组蛋白。
9.根据权利要求5所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗原垫的制备方法如下：
将玻璃纤维棉按规格切成条状，以含0.1mol/L NaCl、0.2％Tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)溶液，分别将PRV病毒抗原做系列稀释，并以15μL/cm的用量将PRV检测抗原喷点于玻璃棉，干燥；将抗原垫置塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用；利用吸附检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度猪抗PRV阳性血清测定试纸阻断效果，通过对抗原不同浓度的筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原为100μg/mL，重组抗原为200μg/mL。
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