CN113311156A - 一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用，制备方法包括以下步骤：分别制备抗牛乳蛋白特异性单克隆抗体和抗羊乳蛋白特异性单克隆抗体，分别记作：Anti‑CC和Anti‑SC；制备抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体，记作：Anti‑total；将抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体标记胶体金获得抗体胶体金标记物；通过抗体胶体金标记物制备二联检测卡。该二联检测卡包括PVC背衬，所述PVC背衬上依次设置有样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，并且所述二联检测卡的样品垫上设置有样品孔；所述反应垫上设有检测线。本发明的检测卡特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确性好，重复性好，可现场快速鉴定食品中的牛乳蛋白和羊乳蛋白。

Description

一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及乳品检测技术领域，具体涉及一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用。
背景技术
羊奶等特种乳品因其独特的口感、营养价值或者低致敏性受到越来越多的消费者欢迎。2018年，我国羊奶生产企业超过500家，年产值超过200亿元。目前羊奶生乳收购价格分别超过牛奶的4倍。一些不法养殖户和厂家由于利益的驱使常在这些高价值乳品中掺入牛乳。
目前鉴定牛乳蛋白及羊乳蛋白的方法主要包括基因方法及蛋白方法。然而，因为乳蛋白中的DNA主要来源于牛脱落的乳腺细胞，和乳蛋白的含量无比例关系，所以依据牛DNA为指标只能定性判定，不能定量。
蛋白质作为基因表达的产物，具有反映物种遗传特征的信息，是良好的掺伪定量标志物。蛋白的特异性检测方法主要有质谱法和免疫法。免疫法因其快速，简便，成本低等优势，成为现场快检的首选方法之一。以乳品中的标志蛋白为靶标，制备特异性识别抗体建立免疫检测方法，是解决特种乳品掺伪快速定量检测的有效技术手段。乳蛋白主要分为乳清蛋白和酪蛋白。乳清蛋白容易在杀菌过程中热变性，而酪蛋白是哺乳动物乳汁中的主要蛋白质，不易热变性(变性温度140℃)，其含量和乳总蛋白含量正向关，是理想的乳蛋白特异性定量标志物。但由于这两个物种酪蛋白同源性较高，暂时没有快速便捷的方法鉴定牛乳蛋白和羊乳蛋白。
发明内容
针对目前国内牛乳蛋白和羊乳蛋白快速鉴别技术的空白，本发明提供一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法，包括以下步骤：
分别制备抗牛乳蛋白特异性单克隆抗体和抗羊乳蛋白特异性单克隆抗体，分别记作：Anti-CC和 Anti-SC；
制备抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体，记作：Anti-total；
将抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体标记胶体金获得抗体胶体金标记物；
通过抗体胶体金标记物制备二联检测卡。
进一步地，所述制备抗牛乳蛋白特异性单克隆抗体，具体包括：
(1)通过软件设计得到牛乳β-酪蛋白半抗原的氨基酸序列为：EVMGVSKVKEAMA-Asp(SEQ ID NO：1)；
(2)将所述牛乳β-酪蛋白半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗牛乳蛋白单克隆抗体，该抗体识别位点为抗牛乳β-酪蛋白的EVMGVSKVKEAMA 氨基酸序列。
进一步地，所述制备抗羊乳蛋白特异性单克隆抗体，具体包括：
(1)通过软件设计得到羊乳β-酪蛋白半抗原的氨基酸序列为：EIMGVSKVKETMV-Asp(SEQ ID NO： 2)；
(2)将所述羊乳β-酪蛋白半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗羊乳蛋白单克隆抗体，该抗体识别位点为羊乳β-酪蛋白的EIMGVSKVKETMV氨基酸序列。
进一步地，所述制备抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体，具体包括：
(1)根据牛乳β-酪蛋白和羊乳β-酪蛋白共同位点，通过软件确定该共同位点的半抗原氨基酸序列为： PFTESQSKTKTDVE-Asp(SEQ ID NO：3)；
(2)将所述牛乳蛋白和羊乳蛋白共同位点的半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体，该抗体识别位点为抗牛乳β-酪蛋白和抗羊乳β-酪蛋白共同位点的PFTESQSKTKTDVE氨基酸序列。
进一步地，所述通过抗体胶体金标记物制备二联检测卡，具体包括：
(1)将Anti-total和胶体金制备成抗体胶体金标记物，将抗体胶体金标记物用PBS溶液稀释至7～8μg/mL，在玻璃纤维素膜上均匀铺开，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，得到结合垫；
(2)取还原剂预处理硝酸纤维素膜的反应区，再使用戊二醛预处理硝酸纤维素膜的反应区，再将Anti-CC和Anti-SC分别包被于反应区作为检测线，得到反应垫；
(3)将样品垫浸泡于封闭液中进行封闭处理，之后于37℃真空干燥并封装；
(4)依次将样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫粘附于PVC背衬上，即得。
优选地，所述步骤(2)的还原剂为0.01g/mL的硫氢化钠溶液。
进一步地，所述步骤(2)还包括将正常羊抗鼠IgG包被于反应区作为质控线。
进一步地，所述步骤(3)的封闭液为含1％BSA、0.5％鱼明胶、3％海藻糖的0.05mol/LPBS缓冲液。
第二个方面，本发明提供一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡，是通过上述制备方法获得，并且所述二联检测卡的样品垫上设置有样品孔；所述反应垫上设有检测线。
进一步地，所述反应垫上还设有质控线。
第三个方面，本发明提供上述牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的应用方法，包括：
(1)将液态乳或乳粉用蒸馏水制成样品检测溶液；
(2)取出牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡，将样品检测溶液滴入样品垫的样品孔中，5～10min观察检测结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.所选取的Anti-CC、Anti-SC和Anti-total免疫氨基酸序列具有强免疫原性，并且具备极高的特异性，产生的抗体不和其他物种的乳蛋白发生交叉反应。
2.使用苯甲酸修饰的多聚赖氨酸作为免疫载体，免疫原性更强，获得的抗体效价更高。
3.使用还原剂将NC膜的硝基进行还原，从而将两种单克隆抗体直接共价交联到NC膜上。对比传统的物理吸附包被检测卡，共价交联法制备的检测卡保质期更长。
4.本检测卡可特异性同时检测牛乳蛋白和羊乳蛋白，并且适用于鲜乳及其制品。特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确性好，重复性好；样品的前处理简单，检测操作简单，不需要使用分析仪器。该卡片小巧，易于携带，可现场快速鉴定食品中的牛乳蛋白和羊乳蛋白。
附图说明
图1为牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡结构示意图，其中，1、样品垫，2、结合垫，3、反应垫，4、吸水垫，5、PVC背衬，11、样品孔，31、检测线A，32、检测线B，33、质控线。
图2为牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡结果判断示意图，其中(a)表示结果阴性，(b)表示结果牛乳阳性，(c)表示结果羊乳阳性，(d)表示结果牛乳/羊乳均阳性，(e)～(h)表示结果无效。
具体实施方式
本发明实施例进行牛乳β-酪蛋白半抗原、羊乳β-酪蛋白半抗原、牛乳β-酪蛋白和羊乳β-酪蛋白共同位点的半抗原氨基酸序列设计的软件为DiscoveryStudio2.5。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
目标抗原(免疫原)的制备。
根据对牛乳β-酪蛋白抗原的表位的预测结果，综合特异性，抗原性分析，通过Discovery Studio2.5软件设计牛乳β-酪蛋白半抗原的氨基酸序列：EVMGVSKVKEAMA-Asp(SEQ ID NO：1)，将所述牛乳β-酪蛋白半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原。偶联方法如下：
多聚赖氨酸活化：选用100mg分子量为40kDa的多聚赖氨酸，溶解于10ml纯水中，作为A液。1mg苯甲酸，1mg NHS，1mg EDC，溶解于1ml DMF中作为B液。A液和B液混合搅拌24小时，使用截留为4kDa的透析袋透析纯化。冻干保存。
偶联：碳二亚胺、多肽各称取1mg溶解于1mL二甲亚砜中，逐步滴加至溶解有0.1g苯甲酸预活化的多聚赖氨酸的1mL 0.01M pH7.4PBS中，室温反应12小时。用0.01M pH7.4PBS透析72小时，冻干保存。得到牛乳β-酪蛋白免疫原。
同样的设计氨基酸序列为：EIMGVSKVKETMV-Asp(SEQ ID NO：2)的羊乳β-酪蛋白半抗原，以及确定氨基酸序列为：PFTESQSKTKTDVE-Asp(SEQ ID NO：3)的牛乳β-酪蛋白和羊乳β-酪蛋白共同位点的半抗原，使用上述相同的方法制备目标抗原。
实施例2
抗体的制备和纯化。
用实施例一制备的免疫原分别免疫6周雌性balb/c鼠，每组3只。首次免疫注射时，分别100μg/mL 的免疫抗原100μL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周后，取用样的抗原，与100μL 不完全佐剂乳化，同样方法注射。
在细胞融合前1d或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70％酒精中，体表消毒；用大头针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完全培养液(由GIBICO RPMI-1640基础培养液加入15％胎牛血清而得)，用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液(由74.25mL RPMI-1640完全培养液加入0.75mL 100×HAT液而得)中，用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0.5mL，置于37℃CO2培养箱中。
小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70％酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI-1640基础培养液(购自GIBICO，货号为A10491-01)中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于100目的不锈钢筛内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心。
将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5：1的比例加入同一50mL的离心管中，加入37℃温浴的RPMI-1640不完全培养液(购自GIBICO，货号为61870-036)20mL，混合均匀，1500r/min离心6min，弃去上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状；用移液管取37℃预热的PEG1mL，滴入离心管，静置1min后，于37℃水浴中在2min内滴加RPMI-1640完全培养液10mL，1000r/min离心6min，弃去上清，加75mLHAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0.5mL，于37℃、 5％CO2饱和湿度的培养箱中孵育。
融合后6～9d，用HAT培养液半量换液1次，在12～14d后根据增殖情况改用RPMI-1640完全培养液；待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数，取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞。
采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。
无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测；取呈阳性强的亚克隆，如此反复2～5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存。提前一周注射0.5mL 降植烷至Balb/c小鼠腹腔。取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养基悬浮，计数；将细胞(每只小鼠1mL，含3.1×107个细胞)腹腔注射小鼠腹部，10～15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水；2000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，分装-70℃冻存备用。
取腹水离心后的中层部分3mL，加入2倍体积的0.06mol/L、pH4.5醋酸钠缓冲液。将正辛酸逐滴慢慢加入样品中，至终浓度33μg/mL腹水，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，去沉淀(白蛋白和其它非IgG蛋白)。取上清经0.45μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合(10×PBS 由80gNaCl、2gKCl、11.5gNa2HPO4、2gKH2PO4、0.5845gEDTA用950mL蒸馏水溶解后，调pH至7.4 并定容至1000mL而得)，用1mol/L NaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4℃，加硫酸铵至终浓度为 0.277g/mL。搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50～100 倍体积的PBS透析过夜，换液3次。得到纯化抗体，4℃下贮藏备用。其中由EVMGVSKVKEAMA-Asp 构建的抗原所制备的单克隆抗体特异性识别牛β-酪蛋白，命名为Anti-CC；由 EIMGVSKVKETMV-Asp构建的抗原所制备的单克隆抗体特异性识别羊β-酪蛋白，命名为Anti-SC。由 PFTESQSKTKTDVE-Asp构建的抗原所制备的单克隆抗体可同时识别抗牛乳和羊乳β-酪蛋白，命名为 Anti-total。
实施例3
胶体金的制备。
取1％氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.9ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，超纯水定容至100mL。
实施例4
抗体胶体金标记物的制备。
在磁力搅拌下，将100μg/mLAnti-total抗体溶液加入pH6.0的胶体金溶液中。分别取1mlAnti-total 抗体胶体金标记物(实验组)和1ml胶体金原液(对照组)于试管中加10％氯化钠溶液0.1ml，室温静置 1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验。最后，在实验组中加入终浓度为0.2％的聚乙二醇(PEGMW20000)，继续搅拌30min，得到Anti-total抗体胶体金标记物溶液。
实施例5
结合垫的制备。
使用PBS溶液稀释Anti-total抗体胶体金标记物至工作浓度7～8μg/mL，均匀浸于玻璃纤维素膜，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，得到结合垫，4℃密封保存。
实施例6
反应垫的共价交联法制备。
取0.01g/mL硫氢化钠预处理硝酸纤维素膜(NC膜)的反应区，充分反应24小时。再使用5％戊二醛预处理硝酸纤维素膜(NC膜)，充分反应24小时。20μg/ml的Anti-CC抗体用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH7.2)以250μg/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测线A。另外在距离其05mm处以相同的条件包被Anti-BC抗体，定义为检测线B。距离检测线B 5mm远的质控线用dispenser线形包被5mg/ml的正常羊抗鼠IgG，37℃干燥2h，得到反应垫，4℃密封保存存。
实施例7
样品垫的处理。
将样品垫浸泡于含封闭液中，封闭液为含1％BSA，0.5％鱼明胶，3％海藻糖的0.05mol/L PBS缓冲液中，封闭30min，37℃真空干燥，真空封装，4℃密封保存。
实施例8
牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的组装。
依次将样品垫1、结合垫2、反应垫3和吸水垫4粘附于PVC背衬5上，样品垫设置有样品孔11，反应垫包被有检测线A31，检测线B32和质控线33，如图1所示。结合垫粘附于样品垫之上，并与反应垫相搭接，反应垫与吸水垫相搭接，真空封装，4℃密封保存，可保质1年以上。其结构如图1所示。
实施例9
牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡对牛乳和羊乳及其制品进行检测的方法。
样品前处理：
液态乳：取0.1mL样品，加入0.9mL蒸馏水，颠倒混匀，即为样品检测溶液。
乳粉：称取0.1g样品，加入10mL蒸馏水溶解，震荡混匀，即为样品检测溶液。
牛乳蛋白和羊乳蛋白胶体金检测卡进行检测：取出牛乳蛋白和羊乳蛋白胶体金检测卡，用移液器取样品检测溶液80μl(或用滴管取3-4滴)滴入样品垫的样品孔中，5～10min观察检测结果。图2提供了牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡结果判断示意图。
实施例10
牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的特异性。
使用牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡对食品其他常见蛋白进行检测，结果如表1所示。
表1牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡与食品中其他蛋白成分的交叉反应
Figure RE-GDA0003142728350000061
Figure RE-GDA0003142728350000071
从表1可知，牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡与食品中其他蛋白成分无交叉反应，特异性好，检测结果不会受影响。
实施例11
牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的保质期
将本发明采用共价交联法制备的检测卡和传统的物理吸附法制备的检测卡于37度条件下进行保质期实验。结果见表2。传统的物理吸附法即直接用BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜。
表2本发明提供的共价交联法工艺制备的检测卡和传统物理吸附法工艺制备的检测卡保质期对比
Figure RE-GDA0003142728350000072
Figure RE-GDA0003142728350000081
通过表2的数据可以看出，共价交联法制备的检测卡保质期长度是传统的物理吸附法检测卡的2倍。
实施例12
牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的基质效应
使用牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡对样品(包括阴性样品和阳性样品)中NaCl、葡萄糖和果糖等一些常见干扰物进行基质效应的检测，结果如表3所示。
表3常见干扰物对牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡检测结果的影响
Figure RE-GDA0003142728350000082
由表3可知，在对阴性样品和阳性样品的检测中，质量浓度1％的葡萄糖、1％的果糖、1％的淀粉、 1％的氯化钠对检测结果均无影响，说明本发明提供的胶体金检测卡抗基质干扰效果好，只需对样品进行超声提取和稀释，即可完成样品前处理。
实施例13
牛乳β-酪蛋白多肽半抗原免疫效果对比
通过对合成肽段及牛乳β-酪蛋白进行动物免疫产生抗体，测定抗体对牛乳蛋白的亲和力及交叉反应率，选择亲和力最小，交叉反应率最低的多肽。结果见表4。
表4牛乳β-乳酪蛋白合成多肽交叉反应率及亲和力比较
Figure RE-GDA0003142728350000083
Figure RE-GDA0003142728350000091
根据表4的数据，只有合成肽段1的羊奶交叉反应率<1.0％，并且亲和力在1×10-7，因此，最终选择合成肽段1作为半抗原(氨基酸序列：EVMGVSKVKEAMA)。
羊乳β-酪蛋白多肽半抗原免疫效果对比
通过对合成肽段及羊乳β-酪蛋白进行动物免疫产生抗体，测定抗体对羊乳蛋白的亲和力及交叉反应率，选择亲和力最小，交叉反应率最低的多肽。结果见表5。
表5羊乳β-酪蛋白合成多肽交叉反应率及亲和力比较
Figure RE-GDA0003142728350000092
同样，只有合成肽段1‘的牛奶交叉反应率<1.0％，并且亲和力在3×10-6，因此，最终根据实验结果选择合成肽段1‘作为半抗原(氨基酸序列：EIMGVSKVKETMV)。
综上所述，本检测卡可特异性同时检测牛乳蛋白和羊乳蛋白，并且适用于鲜乳及其制品。特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确性好，重复性好；样品的前处理简单，检测操作简单，不需要使用分析仪器。该卡片小巧，易于携带，可现场快速鉴定食品中的牛乳蛋白和羊乳蛋白。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 申请人 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心）
<120> 一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 牛乳β-酪蛋白半抗原（人工序列）
<400> 1
Glu Val Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu Ala Met Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊乳β-酪蛋白半抗原（人工序列）
<400> 2
Glu Ile Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu Thr Met Val
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 牛乳β-酪蛋白和羊乳β-酪蛋白共同位点半抗原（人工序列）
<400> 3
Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Lys Thr Lys Thr Asp Val Glu
1 5 10

Claims (10)

1.一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
分别制备抗牛乳蛋白特异性单克隆抗体和抗羊乳蛋白特异性单克隆抗体，分别记作：Anti-CC和Anti-SC；
制备抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体，记作：Anti-total；
将抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体标记胶体金获得抗体胶体金标记物；
通过抗体胶体金标记物制备二联检测卡。
2.根据权利要求1所述的一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备抗牛乳蛋白特异性单克隆抗体，具体包括：
(1)通过软件设计得到牛乳β-酪蛋白半抗原的氨基酸序列为：EVMGVSKVKEAMA-Asp(SEQID NO：1)；
(2)将所述牛乳β-酪蛋白半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗牛乳蛋白单克隆抗体，该抗体识别位点为抗牛乳β-酪蛋白的EVMGVSKVKEAMA氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备抗羊乳蛋白特异性单克隆抗体，具体包括：
(1)通过软件设计得到羊乳β-酪蛋白半抗原的氨基酸序列为：EIMGVSKVKETMV-Asp(SEQID NO：2)；
(2)将所述羊乳β-酪蛋白半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗羊乳蛋白单克隆抗体，该抗体识别位点为羊乳β-酪蛋白的EIMGVSKVKETMV氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体，具体包括：
(1)通过软件设计得到牛乳β-酪蛋白和羊乳β-酪蛋白共同位点的半抗原氨基酸序列为：PFTESQSKTKTDVE-Asp(SEQ ID NO：3)；
(2)将所述牛乳蛋白和羊乳蛋白共同位点的半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗牛乳蛋白和抗羊乳蛋白共同位点的单克隆抗体，该抗体识别位点为抗牛乳β-酪蛋白和抗羊乳β-酪蛋白共同位点的PFTESQSKTKTDVE氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法，其特征在于：所述通过抗体胶体金标记物制备二联检测卡，具体包括：
(1)将Anti-total和胶体金制备成抗体胶体金标记物，将抗体胶体金标记物用PBS溶液稀释至7～8μg/mL，在玻璃纤维素膜上均匀铺开，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，得到结合垫；
(2)取还原剂预处理硝酸纤维素膜的反应区，再使用戊二醛预处理硝酸纤维素膜的反应区，再将Anti-CC和Anti-SC分别包被于反应区作为检测线，得到反应垫；
(3)将样品垫浸泡于封闭液中进行封闭处理，之后于37℃真空干燥并封装；
(4)依次将样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫粘附于PVC背衬上，即得。
6.根据权利要求5所述的一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的还原剂为0.01g/mL的硫氢化钠溶液。
7.根据权利要求5或6所述的一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)还包括将正常羊抗鼠IgG包被于反应区作为质控线。
8.一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡，其特征在于：是通过权利要求1～7任意一项所述的制备方法获得，所述二联检测卡包括PVC背衬，所述PVC背衬上依次设置有样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，并且所述二联检测卡的样品垫上设置有样品孔；所述反应垫上设有检测线。
9.根据权利要求8所述的一种牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡，其特征在于：所述反应垫上还设有质控线。
10.权利要求1～7任意一项所述的制备方法获得的牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡或者权利要求8或9所述的牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡的应用方法，包括：
(1)将液态乳或乳粉用蒸馏水制成样品检测溶液；
(2)取出牛乳蛋白和羊乳蛋白二联检测卡，将样品检测溶液滴入样品垫的样品孔中，5～10min观察检测结果。
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Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2027899A6 (es) * 1991-01-24 1992-06-16 Univ Madrid Complutense Deteccion de leche de cabra en mezclas lacteas y en quesos madurados de oveja utilizando anticuerpos policlonales y un elisa indirecto. .
WO1993017042A1 (fr) * 1992-02-28 1993-09-02 Universite Montpellier Ii - Sciences Et Techniques Du Languedoc Moyens pour le controle de produits renfermant des proteines laitieres
WO2001087302A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-22 U.S. Army Medical Research And Material Command Detection of antibodies to squalene in serum
CN101034057A (zh) * 2007-04-03 2007-09-12 浙江大学 检测液态奶中是否含有复原奶的方法
CN101408548A (zh) * 2008-11-13 2009-04-15 浙江大学 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡
CN101449165A (zh) * 2006-03-16 2009-06-03 国家环境局 用于检测黄病毒特异性抗体的竞争性酶联免疫吸附测定（c-elisa）
CN203772872U (zh) * 2013-12-20 2014-08-13 长沙安迪生物科技有限公司 一种β-酪蛋白胶体金检测试纸条
CN204789586U (zh) * 2015-07-23 2015-11-18 深圳市检验检疫科学研究院 用于检测乳品成分的双层免疫层析试纸及试剂盒
CN206740776U (zh) * 2016-12-26 2017-12-12 三诺生物传感股份有限公司 一种糖化血红蛋白检测试条
MX2018004219A (es) * 2017-04-06 2018-11-09 Maroun Cortez Victoria Kit para prueba de elisa indirecto a base de hapteno nativo crudo y controles liofilizados para diagnostico confirmatorio de brucelosis bovina en suero sanguineo y leche por animal y de tanque.
CN109374879A (zh) * 2018-09-18 2019-02-22 北京纳百生物科技有限公司 一种羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的检测试剂盒及其检测方法
CN208969109U (zh) * 2018-10-08 2019-06-11 深圳市绿诗源生物技术有限公司 用于羊奶掺假的快速检测试纸条
CN110068686A (zh) * 2019-05-15 2019-07-30 河南百奥生物工程有限公司 一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸
CN111704667A (zh) * 2020-08-20 2020-09-25 北京金智准科技有限公司 一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用
US20200319158A1 (en) * 2018-06-06 2020-10-08 Nelson-Jameson, Inc. Lateral flow immunoassay (LFIA) system for measuring reombinant bovine somatotrophin (rBST) in whole milk and other dairy products
CN112415204A (zh) * 2020-10-23 2021-02-26 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2027899A6 (es) * 1991-01-24 1992-06-16 Univ Madrid Complutense Deteccion de leche de cabra en mezclas lacteas y en quesos madurados de oveja utilizando anticuerpos policlonales y un elisa indirecto. .
WO1993017042A1 (fr) * 1992-02-28 1993-09-02 Universite Montpellier Ii - Sciences Et Techniques Du Languedoc Moyens pour le controle de produits renfermant des proteines laitieres
WO2001087302A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-22 U.S. Army Medical Research And Material Command Detection of antibodies to squalene in serum
CN101449165A (zh) * 2006-03-16 2009-06-03 国家环境局 用于检测黄病毒特异性抗体的竞争性酶联免疫吸附测定（c-elisa）
CN101034057A (zh) * 2007-04-03 2007-09-12 浙江大学 检测液态奶中是否含有复原奶的方法
CN101408548A (zh) * 2008-11-13 2009-04-15 浙江大学 猪圆环病毒pcv1和pcv2鉴别检测试纸卡
CN203772872U (zh) * 2013-12-20 2014-08-13 长沙安迪生物科技有限公司 一种β-酪蛋白胶体金检测试纸条
CN204789586U (zh) * 2015-07-23 2015-11-18 深圳市检验检疫科学研究院 用于检测乳品成分的双层免疫层析试纸及试剂盒
CN206740776U (zh) * 2016-12-26 2017-12-12 三诺生物传感股份有限公司 一种糖化血红蛋白检测试条
MX2018004219A (es) * 2017-04-06 2018-11-09 Maroun Cortez Victoria Kit para prueba de elisa indirecto a base de hapteno nativo crudo y controles liofilizados para diagnostico confirmatorio de brucelosis bovina en suero sanguineo y leche por animal y de tanque.
US20200319158A1 (en) * 2018-06-06 2020-10-08 Nelson-Jameson, Inc. Lateral flow immunoassay (LFIA) system for measuring reombinant bovine somatotrophin (rBST) in whole milk and other dairy products
CN109374879A (zh) * 2018-09-18 2019-02-22 北京纳百生物科技有限公司 一种羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的检测试剂盒及其检测方法
CN208969109U (zh) * 2018-10-08 2019-06-11 深圳市绿诗源生物技术有限公司 用于羊奶掺假的快速检测试纸条
CN110068686A (zh) * 2019-05-15 2019-07-30 河南百奥生物工程有限公司 一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸
CN111704667A (zh) * 2020-08-20 2020-09-25 北京金智准科技有限公司 一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用
CN112415204A (zh) * 2020-10-23 2021-02-26 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种利用含双特异性抗体的胶体金试纸条检测细菌的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA I. HAZA等: "Use of a Monoclonal Antibody and Two Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Formats for Detection and Quantification of the Substitution of Caprine Milk for Ovine Milk", 《JOURNAL OF FOOD PROTECTION》 *
BOCHAO LIU等: "Rapid detection of cow milk adulteration/contamination in goat milk by a lateral flow colloidal gold immunoassay strip", 《JOURNAL OF DAIRY RESEARCH》 *
C.X.WANG等: "Evaluation of the hydrophilic behaviour of a b-casein peptide by molecular dynamics simulation", 《CHEMICAL PHYSICS》 *
JOHN GATESY等: "Evidence from Milk Casein Genes that Cetaceans are Close Relatives of Hippopotamid Artiodactyls", 《MOLECULAR BIOLOGY AND EVOLUTION》 *
JONGKIT MASIRI等: "Development and Validation of a Lateral Flow Immunoassay Test Kit for Dual Detection of Casein and b-Lactoglobulin Residues", 《JOURNAL OF FOOD PROTECTION》 *
王黎丽等: "酪蛋白胶体金快速检测卡的研制", 《乳业科学与技术》 *
薛海燕等: "羊乳中掺入牛乳的间接ELISA定量检测", 《食品科学》 *

Also Published As

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