CN101449165A - 用于检测黄病毒特异性抗体的竞争性酶联免疫吸附测定（c-elisa） - Google Patents

用于检测黄病毒特异性抗体的竞争性酶联免疫吸附测定（c-elisa） Download PDF

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Abstract

开发了一种使用黄病毒成员特异性免疫试剂的竞争性酶联免疫吸附测定(C－ELISA)，以检测表明暴露于黄病毒的黄病毒成员特异性抗体。该测试是基于在黄病毒阳性血清存在下，对使用抗黄病毒IgA捕获的黄病毒被膜蛋白上表位结合的竞争作用。该测试与病毒中和测试(VNT)具有相当的灵敏度、特异性和速度。C－ELISA是一种用途广泛的技术，其可具有多种应用。将该实验步骤稍加改变可以得到基于C－ELISA的继发感染检测方法或者可用于血清型特异性的血清流行病学研究和/或疫苗评价的方法。所述针对C－ELISA开发的操作方法已通过使用登革热裂解物抗原和登革热特异性单克隆抗体得到验证。该测定可用于其它黄病毒，对日本脑炎(Japanese encephalitis)病毒的测定结果举例说明了这点。

Description

用于检测黄病毒特异性抗体的竞争性酶联免疫吸附测定(C-ELISA)
技术领域
本发明特别地涉及检测人和/或动物对黄病毒或其等价物的暴露的技术。更特别地，本发明涉及对取自对象(动物或人)的生物样品进行快速简便的分析，从而确定该对象先前是否暴露于黄病毒科的成员或其等价物。本发明还提供了基于血清分析而对黄病毒暴露进行血清分型，并提供了针对黄病毒成员或其等价物感染的医学诊断试剂盒以及鉴别性血清评价。本发明对于检测黄病毒继发感染、确定先前感染的血清分型、血清流行病学和疫苗评价尤为重要。
背景技术
黄病毒科(Flavividae)包括许多导致人类疾病并且通常经蚊和蜱传播的病毒。黄病毒属(Flavivirus genus)包括多种病毒，其包括导致相应疾病的黄热病病毒(yellow fever virus，YF)、登革热病毒、西尼罗河(West-Nile，WN)和日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)病毒。
登革热是世界上最常见和广泛的节肢动物传播的黄病毒感染，每年有超过120万例登革热感染发生，另外有25亿生活在世界上登革热流行区的人有患此病的风险(WHO/TDR，2005年4月)。登革热病毒包括4种不同的病毒血清型，其中每种都能产生多种迹象和症状，并且4种血清型中其一的原发感染会导致对该血清型的持久免疫。然而，仍存在对不同血清型的继发感染机会。
尽管登革热是大多数热带和亚热带国家的地方性疾病，然而它主要发生在缺少卫生保健基础设施或财力而不能有效及时地诊断登革热的发展中国家。在新加坡，这两种媒介物(vector)的不均匀分布导致人口中不均匀的登革热传播(Ooi等，2001)。通过血清学调查，发现易感登革热的地区可能已发生变化。这一发现可有助于修正针对新的传播区域的媒介物控制计划(vector control program)。但是，到目前为止只完成了4项血清流行病学的调查。造成进行的调查如此少的原因是实验室检测的高额花费或所需试剂的缺乏。
传统上，使用血凝抑制(hemagglutination inhibition，HAI)来检测针对登革热的抗体。但是，该方法需要小鼠脑源性抗原，由于这样的细胞难于培养使得所述抗原不易获取。另一常用方法是补体结合，但其需要生命期短的抗体。越来越多的实验室采用商品化的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。然而，这些测试都不是特异性针对登革热抗体的，它们与同一地区共同流行的其它黄病毒成员(如日本脑炎、西尼罗河、丙型肝炎、黄热病、墨累山谷脑炎病毒等)发生交叉反应。
最近，已对6种市售免疫测定系统用于检测血清中登革热病毒特异性免疫球蛋白M(IgM)和IgG抗体(Goren等，2000)的灵敏度进行了评估。所评估的登革热病毒特异性测定针对IgM的灵敏度为71％～100％，针对IgG的灵敏度为52％～100％，其特异性分别为86％～96％以及81％～100％。这些测试的总测试时间为7～480分钟。此外，除Pan-bio RIT以外，所有测试都需要实验室设备来支持，而Pan-bio RIT对于登革热IgG测定的灵敏度和特异性非常低(分别为75％和52％)。然而，这些研究中所评估的测试均不能检测登革热特异性抗体，而是与其它黄病毒发生交叉反应。因此，目前检测早期继发感染还非常困难，因为只有在急性感染期(发热)出现登革热特异性IgG才表明是继发登革热感染(Schilling等，2004)。
血清流行病学研究表明，通过抗体依赖性综合征增强(antibodydependent syndrome enhancement，ADE)，继发感染是引起登革出血热和登革休克综合征的主要风险因素(Halstead等，1973，Halstead S.B.，1988)。对于流行病学和病理学研究而言，区分原发和继发病毒感染以及确定过去与当前感染的登革热血清型是很重要的。
最广泛使用的登革热诊断技术是对可疑样品的血清学分析。但是，该技术相当复杂，其原因如下：(i)由于缺乏交叉保护的中和抗体，患者可能具有4种登革热病毒血清型的多重和连续感染；(ii)在两种或更多种黄病毒共同流行的地区，由于预先存在的抗体和原始抗原原罪性影响(antigenic sin)(许多对首次黄病毒感染应答的B细胞克隆在之后的每一次黄病毒感染中受到再次刺激而合成早期抗体，这些抗体与首次感染病毒的亲和力较之与当次感染病毒的亲和力更高)的存在，多重和连续的黄病毒感染使鉴别诊断难于进行；(iii)IgG抗体对同源和异源的黄病毒抗原具有高水平的交叉反应性；以及(iv)在许多登革热继发感染患者中，由于IgG抗体的长期存在(≥10个月，如通过E/M-特异性捕获IgG ELISA(E/M-specific capture IgG ELISA)测量的；或终生，如通过E/M-抗原包被的间接IgG ELISA测量的)，难于对过去、近来和当前的登革热病毒感染进行血清学诊断(Gubler，D.J.1996和Innis等，1989)。
因此，在那些可以通过血清学进行诊断的病毒感染中，登革热病毒感染是最具有挑战性的一种。但是，由于开发了针对不同结构和非结构(nonstructural，NS)蛋白的用于登革热病毒感染血清诊断和血清流行病学研究的多种方法，对分析复杂的病毒抗原和抗体应答近来取得了很大的进展。
传统上，使用血凝抑制来区分原发和继发登革热感染。由于该测试存在固有缺陷，目前已不常用(Innis等，1989和Shu等，2003)。相反地，由于高灵敏度和特异性，捕获IgM和IgG ELISA已成为区分原发和继发感染最有效的方法(Innis等，1989，1997)。但是，对于登革热感染的血清分型、特别是血清流行病学研究来说，由于在登革热血清型抗体中存在交叉中和抗体，因而捕获IgM ELISA和IgG ELISA均不可用。
病毒中和测试(VNT)是目前可用的区分登革热和其它黄病毒的黄金标准技术(WHO手册2002)。VNT也用于区别登革热的血清型(1-4血清型)。针对任一种病毒得到的血清抗体可以中和所有登革热血清型甚至其它黄病毒，但是较之中和异源病毒来说，其以更高的效价中和同源病毒(Makino等，1994)。遗憾的是，在感染早期产生的抗登革热抗体(IgM)引起对所有登革热血清型的同等水平的中和；因此，该阶段的继发感染不能用VNT来测定(Nawa等，2000)。另一方面，VNT具有如下缺点：
i.需要精密的细胞培养实验室和训练有素的人员；
ii.测试持续时间超过一周；
iii.由于登革热的交叉反应抗体所致，来自登革热感染少于6个月的患者的血清不能进行血清分型；
iv.难于检测多种登革热血清型；
v.10％血清对细胞培养物有毒性作用。
Innis等(1989)首先提出通过测定登革热病毒IgM抗体单位与登革热病毒IgG抗体单位的比值来区别原发和继发感染。他们指出，原发登革热病毒感染患者的急性期血清具有较高的IgM/IgG比值，而继发感染的患者具有较低的IgM/IgG比值。该方法对于分析登革热患者的免疫状况有很大帮助。最近，Shu等，2003改良并简化了上述方法，使用直接IgM/IgG读数的比值来区分原发和继发登革热病毒感染(分别地，>1.2表明是原发感染，或者<1.2表明是继发感染)，而无需通过使用标准对照来计算抗体单位。
近来，Ludoffs等，2002报道了通过使用重组抗原对登革热血清型1至4型感染进行血清学鉴别。用大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的登革热病毒血清型1-4型的B结构域点渍(dot)免疫印迹条带，其用于检测来自41位原发和继发感染患者的成对血清样品中的登革热血清型特异性抗体。尽管观察到与异源血清型的一些交叉反应，结果却显示出93.94％的特异性，但是利用该方法对继发感染进行血清分型是不可靠的。
在登革热病毒中面对的问题在其它黄病毒中也同样遇到，两者共有同样的抗原性特性，从而使确诊变得困难。因此需要一种可以将任意感染阶段的黄病毒特异性抗体与其它黄病毒的抗体进行区分并且在黄病毒血清型之间进行区分的快速、可靠和简单的测试方法。血清学检测方法在区分黄病毒感染与其它类似于黄病毒的传染病的临床诊断中以及在血清监视研究和疫苗评价中具有潜在的作用。这些技术将有助于继发感染的早期检测，可以更好地管理病例、降低病例死亡率和治疗费用。
发明内容
一方面，本发明提供了用于检测对象对黄病毒或其等价物的暴露的方法，所述方法包括：
将来自所述对象的生物样品与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或等价物的组分混合物进行接触；
用竞争性黄病毒特异性免疫试剂处理所述生物样品和抗黄病毒IgA捕获的组分；
在竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时，测定在所述生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣(binding partner)与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成的复合物的存在情况。
本发明源自对开发一种检测当前或先前对黄病毒的特定暴露的快速、低成本和直接测定法的需要。本发明特别地使用了竞争性黄病毒特异性免疫试剂来竞争宿主机体结合伴侣对黄病毒或其血清型特异性的、存在于黄病毒被膜蛋白上的特异表位，其包括抗黄病毒IgA捕获的组分混合物(包括黄病毒颗粒以及指示黄病毒感染的其它抗原)。
因此，与其它常规的和目前最常用的黄病毒IgG间接ELISA或捕获ELISA相比，本发明表现出更高的特异性和灵敏度，其提供了一个能够在感染的任意阶段特异性鉴定针对黄病毒或其免疫学近亲(immunological relative)所产生的抗体(IgG)的平台。
优选地，黄病毒选自黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、丙肝病毒、墨累山谷病毒和圣路易脑炎病毒。
另一方面，本发明提供了用于检测对象对黄病毒或其等价物的暴露的试剂盒，所述试剂盒包含：
抗黄病毒IgA捕获的黄病毒的组分；
竞争性的黄病毒特异性免疫试剂；以及；
至少一种检测试剂，其用于检测在竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时，所述生物样品中存在的结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成的复合物。
本发明还提供了本发明方法中所使用的试剂盒中的各组分，其包括将抗黄病毒IgA捕获的组分固定于其上的固体支持物(如微量滴定板和硝酸纤维素膜)。
本发明还提供了一种评估特定区域(例如，地理区域、居住区、交通工具或用于医学治疗或评估的中心)内一个或多个对象暴露于黄病毒或其等价物的相对风险的方法，其包括：
a)从特定区域内的代表性群体中获取样品；
b)通过包括以下步骤的方法来评估样品群体中各成员对黄病毒或其等价物的暴露的证据：
i)将来自对象的生物样品与源自黄病毒或其等价物的组分进行接触，从而在所述组分与所述生物样品中含有的所述组分的源自对象的伴侣之间形成复合物；
ii)测定所述复合物的存在，其中存在该复合物则表明所述对象暴露于黄病毒或其等价物；以及
c)评估特定区域内暴露的相对风险。
可以使用计算机可读形式的软件来进行风险分析。因此，本发明还涉及计算机可读的程序和计算机，其包括适于分析对象或对象群对黄病毒或其等价物的暴露或者对象或对象群暴露于黄病毒或其等价物的风险。
附图说明
图1显示在捕获抗登革热IgA的聚苯乙烯板上对登革热裂解物抗原进行优化。图1(A)显示MAb-捕获ELISA与抗登革热IgA捕获ELISA的比较。(a)使用细胞上清液病毒抗原来检测登革热病毒(血清型-2)。将病毒以10倍(Log10)进行稀释，从106pfu/ml开始至在病毒稀释剂中102pfu/ml。(b)使用细胞裂解物抗原来检测登革热病毒(血清型-2)。在这两种情形中，抗登革热IgA捕获ELISA均比MAb捕获ELISA有更好的表现。
图2显示单克隆抗体针对登革热裂解物抗原之每种血清型的优化。确定最佳的MAb稀释度。(a)将两倍系列稀释的每种MAb(1:250至1:32000)与两倍稀释的登革热阳性血清和两种登革热阴性血清(一种对登革热间接IgG ELISA呈阴性，另一种对IgG ELISA和黄热病VNT呈阳性但对登革热VNT呈阴性)进行C-ELISA反应。选用1:2000的MAb稀释度。
图3显示，利用竞争性ELISA(C-ELISA)对登革热IgG阳性和阴性血清进行优化。确定C-ELISA所用血清的最佳稀释度。将两倍系列稀释的阴性、黄病毒交叉反应性(flavi-cross-reactive)和阳性对照血清与最佳稀释度(1:2000)的pan-den MAb进行C-ELISA反应。为了使所需血清的体积最小，选择表现略佳的1:20血清稀释度为优选稀释度。
图4显示使用经VNT验证的登革热阴性和阳性血清来确定C-ELISA的临界点(cut-off point)。建立C-ELISA的阴性临界点。(a)所有的登革热IgG阴性血清(n＝100)；(b)经VNT检测的登革热IgG阳性血清(n＝64)。(b)虚线代表区分阴性和阳性样品的30％抑制的临界点(平均值加3个标准偏差)。
图5显示3种登革热特异性IgG检测技术(阻断ELISA、同时和预孵育的竞争性ELISA)的比较评价。B-ELISA(阻断ELISA)与C-ELISA(同时以及预孵育加入MAb)的比较。每个数据点是4个值的平均数；中度阳性(Log2 100 TCID50，8)和阴性血清。同时加入测试血清和单克隆抗体(阳性1:40)比预孵育ELISA和阻断ELISA(1:160)的表现要差。
图6显示使用来自登革热确诊病例的10种血清样品(每种3份，分别在第1天、第4天和第20天收集)进行C-ELISA测定的结果。在来自10个登革热确诊的患者(通过PCR)第1天、第4天和第20天的3份样品中检测登革热特异性IgG的存在情况。第2次和第3次收集的样品中，抗登革热特异性IgG的水平与第1次收集的相比显著增加。
图7显示C-ELISA与VNT之间的相关性系数结果。抗登革热IgG特异性血清样品的线性回归表明C-ELISA与VNT之间具有高水平的相关性(r＝0.91)，并表明其与“黄金标准”技术相比具有高水平的特异性。
图8显示30分钟和15分钟一步C-ELISA之间的相关性系数。这两种测定的线性回归表明高水平的相关性(r＝0.9675)。
发明详述
一方面，本发明提供了一种用于检测对象对黄病毒或其等价物的暴露的方法，所述方法包括：
将来自所述对象的生物样品与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或等价物之黄病毒组分混合物进行接触；
用竞争性黄病毒特异性免疫试剂处理所述生物样品和抗黄病毒IgA捕获的组分；
在竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时，测定所述生物样品中的黄病毒特异性结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分之间所形成的复合物。
本发明源自对开发一种检测当前或先前暴露于黄病毒的快速、特异、低成本和直接的测定的需要。本方法采用抗黄病毒IgA来捕获黄病毒抗原(优选从细胞粗裂解物捕获)。所述裂解物源自经黄病毒感染的包含黄病毒组分(优选免疫原性成分)混合物的细胞。在竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时，筛选对象(包括动物如哺乳动物，特别是人)的生物样品中是否存在黄病毒特异性结合伴侣。优选的结合伴侣是源自对象的结合伴侣，例如但不仅限于免疫互作分子(immunointeractivemolecule)。优选地，所述免疫互作分子是抗体，特别是免疫球蛋白G(IgG)或免疫互作片段。此外，使用黄病毒特异性免疫试剂作为生物样品中黄病毒特异性结合伴侣的竞争剂来提高特异性。通过其与抗黄病毒IgA捕获的组分形成复合物的能力，对所述结合伴侣或竞争性黄病毒特异性免疫试剂的鉴定随后被用作当前或先前对象暴露于黄病毒或其等价物的证据。因此，本发明利用了抗黄病毒IgA捕获组分与C-ELISA的结合。
因而，与其它常规的和目前最常用的黄病毒IgG ELISA相比，本发明表现出更高的灵敏度和特异性，它提供了一个能够在感染的任意阶段鉴定针对黄病毒或其免疫学近亲所产生的抗体的平台。
在本发明的说明书和权利要求书中，词语“包含”及其变型(例如“包括”和“具有”)并不意在排除其他添加物、组分、整数(integer)或步骤。
黄病毒
本文的权利要求书和说明书中使用的术语“黄病毒”包括黄病毒科的黄病毒，其包含导致人类疾病且通常经节肢动物(如蚊和蜱)传播的黄病毒属。该病毒导致例如但不限于黄热病、登革热和日本脑炎的疾病。组成该属的黄病毒种在核苷酸和氨基酸序列水平上具有一定的序列保守性。黄病毒属中的病毒包括但不限于黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河和日本脑炎病毒。由于核苷酸和氨基酸水平上的相似性，这些病毒在抗原性、传播和致病中可能显示出相似性。
登革热病毒
本文的权利要求书和说明书中使用的术语“登革热病毒”是指与登革热感染有关的所有登革热血清型(Den-1、Den-2、Den-3和Den-4)。本发明可适用于在任意对象(包括人、非人动物和实验动物)中检测登革热病毒感染或暴露。然而，本发明优选人类对象。然而，本发明包括可以对登革热病毒或其等价物感染或免疫产生应答的任何对象。
登革热病毒被定义为一组人类RNA病毒，其由直径约为40-50nm的被膜颗粒组成。病毒基因组约为11kb(Stollar等，1966)。成熟的病毒粒子由包在等边(isometric)核壳体中的正义RNA基因组组成。所述基因组编码一个约11000个核苷酸的开放读码框，其编码3种结构蛋白(C-衣壳、M-膜和E-被膜)和7种非结构蛋白(NS1、NS2a和NS2b、NS3、NS4a和NS4b、NS5)。
登革热病毒通过经感染的雌性伊蚊(Aedes)(主要是埃及斑蚊(A.aegypti))叮咬而传播给人。这是一种小型、黑白两色、主要在室内活动(highly domesticated)的热带蚊子，它常将卵产于室内或附近的盛有水的人造容器中，如桶、花瓶及其它盛水容器。成年蚊很少在户外发现；它们通常栖息在室内黑暗的位置，不显眼，并喜欢在白天以人或动物为食，大多数叮咬发生在凌晨或傍晚(Gubler等，1992；Newton等，1992)。雌蚊在摄食时警惕性很高，即使宿主极其轻微的动作都会干扰其取食过程，随后其返回原先的宿主或另外的宿主继续取食。由于该蚊的这种行为，其常常在一次进食中在若干人身上取食，如果其被感染，则可将病毒传播给多人(Platt等，1997；Scott等，1997)。这种行为还用于解释流行病学所观察到的如下现象：登革热病主要在儿童中发病；而在某些地方(如新加坡)，由于采取了媒介物控制措施，这种情形可以发生改变(Ooi等，2001)。
在被经感染的雌蚊叮咬后，病毒开始了3至14天的内潜伏期(intrinsicincubation period)(平均4至7天)，之后患者可能经历急性发热并伴随其它非特异性迹象和症状。在病毒血症期期间(可为2～7天)，病毒在被感染人的血液中循环。如果未经感染的伊蚊取食病毒血症期间的宿主，这只蚊子在必经的10～12天外潜伏期后将会被感染，它随后能够将该病毒传播给其他未被感染的宿主。尽管研究表明猴可被感染并且可作为该病毒的来源，但是在该传播循环中人才是所述病毒的主要扩增宿主(Putnam等，1995；Gubler等，1976；WHO，情况说明书，2002)。
取决于所感染的病毒、宿主的年龄和免疫状况，登革热病毒感染导致人的多种疾病。它可以导致无症状疾病，或者从未分化的流感样疾病(病毒综合征(Viral syndrome))到登革热(DF)，到登革出血热(DHF)，以至严重并致命的登革休克综合征(DSS)(Nimmannitya，1993：WHO，1997)。
世界卫生组织已建立了登革出血热严重程度的分级标准。分为4个严重性等级，其中等级III和等级IV被认为是登革休克综合征(DSS)。
等级I：具有非特异性全身症状的发热，仅有的出血性表现是止血带试验呈阳性和/或容易发生瘀伤(bruising)。
等级II：除等级I中的表现外，皮肤自发性出血或其它出血。
等级III：表现为快速微弱的脉搏、脉压狭窄(narrowing of pulse pressure)或低血压的循环衰竭，并出现皮肤冰冷、湿粘以及多动不安(restlessness)。
等级IV：深度休克(profound shock)，并检测不到血压或脉搏(WHO，1997)。
典型的登革热在年龄稍大的儿童、青少年和成人中更为常见，他们较少为无症状的(Sharp等，1995)。发作时突然发热，并伴有高烧、头痛、失能性肌痛(incapacitating myalgia)和关节痛、恶心呕吐以及斑疹或斑丘疹(Waterman，1989)。发热通常持续5～7天，有时会跟随有双峰式病程(biphasic course)(鞍背状)(Nimmannitya，1993)。
尽管登革出血热也发生在成人中并且其主要与继发登革热感染有关，它主要是发生在15岁以下儿童中的疾病(Sumarmo等，1983；WHO)。登革出血热的关键阶段是体温变为正常时的退热期。在该时期决定疾病严重程度的主要因素是由增加的血管渗透性所致的血浆渗出(plasmaleakage)、稳态异常以及其它常见出血现象(如瘀点、紫癜性损伤和瘀斑)。这些症状加上止血带试验呈阳性有助于登革出血热的确诊(Gubler DJ.，1998)。
登革休克综合征是登革出血热的末期阶段，其表现为血浆渗出引起的低血容量性休克(WHO，1997)。登革休克综合征有4种警示性迹象：持续腹痛、持续呕吐、多动不安或嗜睡，以及突然由发热转变为低体温并伴有出汗和虚脱。有经验的医护人员的早期鉴定和适当治疗可以降低登革休克综合征的致死率至0.2％，但一旦发生休克，死亡率会超过40％(Nimmannitya，1994；Rigau-Perez JG等，1998)。
E蛋白是暴露于该病毒表面上最大的且仅有的结构蛋白，它是参与免疫反应(如受体结合、血凝(haemmagglutination)和中和)的主要蛋白。被所述血清型之一感染的人对该血清型产生终生免疫，但对其它血清型仅产生暂时性保护。
核质粒(nucleoplasmid)依次被含有被膜的脂质和膜蛋白包围。除被膜和衣壳蛋白外，登革热病毒还包含7种非结构蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。
日本脑炎病毒
日本脑炎是一种由经感染的蚊传播给人的疾病。它是蚊媒病毒疾病之一，其会影响中枢神经系统并导致严重的并发症甚至死亡。
日本脑炎由日本脑炎病毒(一种虫媒病毒)引起。虫媒病毒是多种由某些无脊椎动物(节肢动物)传播的病毒，所述无脊椎动物最常见为吸血昆虫。与大多数虫媒病毒一样，日本脑炎由经感染的蚊(库蚊属物种)传播。
被感染者有轻微症状或无任何症状。在那些发生更严重疾病的人中，日本脑炎开始通常表现为流感样疾病，并伴有发热、寒战、疲倦、头痛、恶心和呕吐。在早期还会发生意识错乱和躁动。该疾病可发展为严重的脑部感染(脑炎)，并可以在30％的病例中致死。在存活者中，另外30％的患者表现出永久性神经后遗症。
本发明还涉及导致病毒性脑炎的其它黄病毒。它们具有类似的疾病模式(disease picture)，其包括：
圣路易脑炎和墨累山谷脑炎
由蜱传播的俄罗斯地方性脑炎。
另外3种脑炎病毒属于甲病毒属(Alphavirus genus)，它们也通过蚊叮咬进行传播。它们是西方马脑炎、东方马脑炎和委内瑞拉马脑炎，或分别称为WEE、EEE和VEE。这些疾病均发生在北美洲和南美洲。已有了对抗EEE和WEE的疫苗。
与日本脑炎一样，这些病毒常常仅产生类似于轻微流感的一般性轻微症状。
以前诊断这种疾病是通过IgM捕获ELISA来检测血清和CSF(脑脊液)中的抗体，但是该方法的特异性较低且时程较长。已得到一种疫苗，然而除非在感染后数小时内施用，否则抗病毒抗体通常效率很低，因此治疗主要是辅助性的。日本脑炎病毒不在人与人之间传播。感染日本脑炎病毒会获得终生免疫。
等价物
本文涉及黄病毒时使用的术语“等价物”意在包括可以引发与黄病毒或黄病毒的结构或非结构蛋白可引发的应答同样或类似之应答的相似分子。例如，黄病毒在感染的各个阶段所表达的各种抗原或者各种病毒颗粒或片段可以导致与完整病毒类似的效果。所述应答可以是免疫应答(非临床应答)，或者是感染性应答(临床应答)或由疫苗接种所致。
暴露
对象可以曾经暴露于黄病毒，但无需表现出可见的感染症状。本方法检测可导致感染(临床或亚临床或非临床)的暴露，或者可以指示未表现出任何症状的先前暴露。
本发明适用于检测针对黄病毒或其等价物的暴露。暴露可以是当前或先前对黄病毒或其等价物的暴露。优选地，所述暴露足以引发体内的免疫反应或应答，从而诱导对黄病毒或其等价物产生应答的结合伴侣。对象一经暴露，本发明的方法即应用于上述的任何暴露阶段。优选地，本方法用于检测那些不具有明显的黄病毒感染迹象和症状的暴露。优选地，本方法检测对象在以下任意黄病毒感染阶段对黄病毒或其等价物的暴露：在继发感染的急性期早期，或者在原发感染或疫苗接种的康复期晚期。该暴露并不总表现出黄病毒感染或者明显的迹象或症状，但它会引起应答从而产生结合伴侣。优选地，所述应答为免疫应答。
免疫应答
“免疫应答”是指脊椎动物的免疫系统产生的选择性应答，其中针对被机体识别为外源物的病原体和抗原产生特异性抗体或抗体片段和/或细胞毒性细胞。
结合伴侣
因此，本文使用的“结合伴侣”是指针对外源黄病毒或其等价物而产生的任何分子或细胞。优选地，其为免疫互作分子。更优选地，所述结合伴侣是抗体或其免疫活性片段、或者细胞毒性细胞。所述结合伴侣包括可与黄病毒抗原或其等价物相互作用并与黄病毒特异性免疫试剂(如黄病毒特异性单克隆抗体)竞争的免疫互作分子。
优选的结合伴侣为免疫互作分子，其优选指包含抗原结合部分或其衍生物的任何分子。优选地，所述免疫互作分子是在黄病毒感染或暴露的对象中体液反应期间针对黄病毒蛋白任意部分的抗体。
更优选地，所述结合伴侣是对象中产生的针对黄病毒或相关病毒组分的抗体。然而，也可以使用被靶向抗体的结合伴侣。这样的结合伴侣的实例是抗独特型抗体或者特异性针对并区别于目标抗体的抗体，所述目标抗体特异性针对黄病毒成员或相关病毒组分。
在黄病毒感染的康复期早期，抗体(优选源自先前黄病毒感染的IgG)是继发或原发黄病毒感染的表征之一。可通过其与黄病毒成员的组分所形成的复合物来检测该抗体。缺乏竞争性黄病毒或成员特异性免疫试剂的附着表明在黄病毒成员特异性IgG与黄病毒特异性或成员特异性的表位的抗原之间形成该免疫复合物。
本文使用的“抗独特型抗体”是指与另一抗体的特异性抗原结合位点结合的抗体，所述另一抗体由对源自黄病毒属的成员或其免疫学近亲的组分的暴露产生应答而产生。
本文使用的术语“抗体”包括完整的抗体以及包含其功能性部分的抗体片段。术语“抗体”包括由轻链可变区和/或重链可变区的充足(sufficient)部分组成的任何单特异性或双特异性的化合物，从而与完整抗体对其具有结合特异性的表位结合。所述片段可包括至少一条重链或轻链免疫球蛋白多肽的可变区，并包括但不仅限于Fab片段、F(ab’)2片段和Fv片段。
优选地，所述结合伴侣为抗体。更优选地，其为黄病毒IgG分子或免疫互作部分。最优选地，黄病毒为登革热病毒或日本脑炎病毒。
生物样品中含有的细胞毒性细胞也可以作为结合伴侣。该细胞可以直接与黄病毒或者感染黄病毒或其等价物的细胞的细胞裂解物之任意成分相互作用。
生物样品
本发明的方法通过使用获取自曾可能暴露于黄病毒之对象的生物样品来检测对黄病毒或其等价物的暴露。所述生物样品可以是来自机体的可包含结合伴侣的任何样品。这样的生物样品可选自血液、唾液、脊髓液(cordfluid)、B细胞、T细胞、血浆、血清、尿液和羊水等。优选地，所述生物样品为血清、血浆或唾液。最优选地，生物样品为血清或唾液。
生物样品还优选获取自怀疑暴露于黄病毒的对象。生物样品还可以在使用前被修饰，例如稀释、纯化各级分、离心等。
因此，生物样品可以指制备从完整生物体或其一部分组织、细胞或部分组分制备的匀浆、裂解物或提取物或者其级分或部分。
应注意的是，生物样品还可以不包含能够与黄病毒或其等价物相互作用的结合伴侣。这种情形发生在对象未曾暴露于黄病毒或其等价物时。由于在缺乏结合伴侣时不会形成复合物，因此“检测生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成复合物的存在情况”可能得不出结果。在这种情形中唯一可形成的复合物包含竞争性黄病毒特异性免疫试剂(如经设计与生物样品中的结合伴侣竞争的单克隆抗体)。
提及置于与黄病毒或其免疫学近亲的裂解物组分(优选免疫原性组分)接触的生物样品时，应理解为提及促进该生物样品中一种或多种免疫互作分子与黄病毒或其免疫学近亲的组分之间相互作用的任何方法。所述相互作用应为免疫互作分子与黄病毒或其免疫学近亲的特定免疫原性组分之间可以发生的偶联、结合或其它相互作用。
生物样品与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或其等价物的病毒组分混合物接触。
抗黄病毒IgA捕获的组分
抗黄病毒IgA用于捕获黄病毒或成员特异性组分。优选地，所述组分是与黄病毒特异性结合伴侣和竞争性黄病毒特异性免疫试剂反应的免疫组分。抗黄病毒IgA可通过本领域技术人员已知的用于制备针对抗原之抗体的任何方法而获得。优选地，IgA由抗人IgA来捕获。
本发明特别地使用抗黄病毒IgA捕获的组分，而非IgG或IgM捕获的组分，后两者常导致测试灵敏度的降低。目前已发现，使用IgA来捕获黄病毒组分可以提高血清学测试的灵敏度。IgA可以捕获黄病毒成分，并且更特异地与新近感染和暴露的结合伴侣反应。
当对象暴露于黄病毒时，机体的免疫系统产生反应以首先清除病毒。这引起通常出现在对黄病毒或其等价物所展示的多种抗原的免疫应答中的一连串事件。因此，本发明所提供的组分代表了对黄病毒暴露的任何阶段，并可以是包含特异性针对所有黄病毒或某种血清型的表位的抗原或抗原一部分。所述组分可以源自包括黄病毒本身的任何来源。但是，优选地，所述组分源自感染黄病毒的细胞。其可以源自感染黄病毒的细胞培养物或者组织或生物样品。最优选地，所述组分源自感染黄病毒的细胞培养物，并从中获得了细胞裂解物。
在本发明中，细胞裂解物优选包含黄病毒免疫原混合物，其包括病毒颗粒以及结构和非结构病毒蛋白。这些免疫原性组分通过抗黄病毒IgA来捕获。优选地，黄病毒免疫原是裂解物的免疫原性组分，其能够引发针对生物样品中的黄病毒特异性结合伴侣以及与竞争性黄病毒特异性免疫试剂的免疫反应。裂解物提供病毒组分，优选可以由任意发育阶段的黄病毒所提供的免疫原性组分。
本发明的裂解物可以从已被特定黄病毒或其等价物的特定成员感染的任何细胞来源获得。优选地，所述细胞在与黄病毒或其等价物的体内培养中被感染。
任何类型的细胞都可以被感染。优选地，所述细胞类型能够被感染并培养黄病毒。但是，优选地，根据本发明的方法感染那些能够产生高滴度黄病毒的细胞，所述细胞包括但不仅限于常用的传代细胞系(例如Vero细胞(Vero-PM细胞株)、CV-1细胞，LLC-MK2，C6/36和AP-61细胞)、原代细胞系(如恒河猴胎肺细胞(FRhL-2)、BSC-1细胞和MRC-5细胞)或人二倍体成纤维细胞。本发明还涉及细胞类型的组合。使用黄病毒或等价物感染C6/36或AP-61细胞。最优选的细胞类型为C6/36。
可以将细胞培养任意长的阶段，优选允许黄病毒进入并感染细胞的阶段。更优选地，将细胞培养至细胞培养物中的致细胞病变效应(cytopathiceffect)明显，从而指示细胞中病毒活跃的感染。
这时，可以利用本领域技术人员已知的任何方法来裂解细胞。优选地，可使用低渗缓冲液(包含去垢剂如Triton X 100)，只要该裂解缓冲液不会影响黄病毒或其等价物的免疫原，并优选使活病毒颗粒失活。
应理解的是，裂解物包含病毒免疫原性组分的混合物，其包括结构和非结构的黄病毒抗原以及完整的黄病毒颗粒。对于登革热病毒来说，这些可选自DEN1、2、3或4等。本发明试图通过生物样品中响应于对黄病毒或等价物的暴露而产生的结合伴侣的混合物来鉴定抗原的混合物。
优选地，黄病毒为登革热病毒或日本脑炎病毒。
更优选地，黄病毒或登革热特异性免疫原性组分是黄病毒或登革热病毒的结构或非结构蛋白。更优选地，所述结构蛋白选自可被抗黄病毒IgA所捕获的C-衣壳、M-膜和E-被膜蛋白等。更优选地，针对登革热的非结构蛋白选自NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5等。
可以以任何方式对裂解物进行加工。优选地，将裂解物净化以去除细胞核和细胞碎片以及完整的黄病毒颗粒。可以将裂解物分装并储存于-70℃至-80℃备用。
对于登革热病毒来说，先前的方法使用特定的登革热抗原DEN1、2、3和4(出现在登革热病毒感染细胞的上清液中)来检测指示登革热病毒感染的抗体。但是，本发明不单独使用这些抗原，而使用在黄病毒暴露期针对其产生抗体的黄病毒分子/免疫原的混合物(出现于黄病毒感染的细胞中，其可包含黄病毒颗粒和其它免疫组分，优选结构和非结构蛋白)。
竞争性黄病毒特异性免疫试剂
使用免疫试剂(优选抗体或单克隆抗体)与生物样品中的结合伴侣进行竞争。所述免疫试剂也与黄病毒特异性组分有反应性。优选任何特异性针对黄病毒(或更优选黄病毒表位)的免疫试剂。通常，免疫试剂特异性针对黄病毒被膜部分上的表位。最优选地，竞争性黄病毒特异性免疫试剂特异性针对抗黄病毒IgA捕获的组分。
由于免疫试剂与黄病毒特异性结合试剂竞争，因此还优选免疫试剂与黄病毒特异性结合试剂竞争至少一个或者相同的表位。因此，优选地，免疫试剂特异性针对抗黄病毒IgA捕获组分的表位。IgA捕获组分与高度特异性免疫试剂的组合会增强该测试对黄病毒属成员的特异性。
竞争性黄病毒特异性免疫试剂的特异性水平可以增强该测试的特异性。优选地，竞争性黄病毒特异性免疫试剂是抗体(如多克隆抗体或单克隆抗体)。更优选地，它是特异性针对黄病毒之表位的单克隆抗体，尤其是针对抗黄病毒IgA捕获的组分的单克隆抗体。
已知了产生抗体的抗原，便可以鉴定组分的抗原。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备针对黄病毒的抗体或单克隆抗体。
复合物形成
组分与生物样品接触，从而在组分与生物样品中存在的结合伴侣之间可以形成复合物。优选地，黄病毒颗粒的免疫原(包括但不仅限于由具有特异性针对黄病毒之表位的抗黄病毒IgA所捕获的结构和非结构蛋白)将与结合伴侣或竞争性黄病毒特异性免疫试剂形成复合物。优选地，特异性结合伴侣是生物样品中的抗体或其片段。这些只在对象已对黄病毒暴露/免疫后才出现。
优选地，复合物将在抗体(优选特异性针对黄病毒属成员或其等价物的IgG)与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分之间形成。
结合伴侣也可以是细胞毒性细胞，例如来自生物样品的与黄病毒免疫原反应的细胞毒性T细胞。
如果组分上的相同表位仍是游离的，则竞争性黄病毒或成员特异性免疫试剂也会与该组分形成复合物。如果结合伴侣和免疫试剂特异性针对同一表位，则会出现竞争，其表明存在结合伴侣以及先前曾暴露于黄病毒。
本发明的优选方法依赖于使用生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣来检测竞争性黄病毒或成员特异性免疫试剂。竞争性免疫试剂以及黄病毒或成员特异性结合伴侣竞争细胞裂解物中由抗黄病毒IgA捕获的黄病毒抗原组分，所述细胞裂解物源自经黄病毒或其等价物感染的细胞。复合物可以包含与源自黄病毒或其等价物的一个或多个组分结合的一个或多个结合伴侣。
在使得复合物稳定形成并抑制竞争性免疫试剂(如特异性针对黄病毒或该属任意特定成员的单克隆抗体)结合的条件下，将生物样品与源自黄病毒或其等价物的组分接触足够长的时间。
一经结合，便可加入竞争性黄病毒特异性免疫试剂。因此，优选包括预孵育的步骤，其使得结合试剂和组分在加入免疫试剂前形成复合物。但是，这些成分也可以同时加入。
本发明优选使用黄病毒特异性的或任意特定成员特异性的抗体来与结合伴侣竞争，所述结合伴侣如来自宿主机体的抗黄病毒特异性IgG或任意特定成员特异性IgG，其特异性针对黄病毒或该属中任意特定成员，或者特异性针对其血清型的源自细胞裂解物(包括包含黄病毒颗粒等指示黄病毒感染之抗原的黄病毒免疫原性组分混合物)的黄病毒被膜蛋白上的表位。
本发明的方法和试剂盒试图检测形成指示黄病毒感染之复合物的组分和结合伴侣。这些组分和结合伴侣在黄病毒感染期间产生。
另一方面，可将生物样品施加在固体支持物(例如但不仅限于包被有抗黄病毒IgA的硝酸纤维素膜或聚苯乙烯板)上。固体支持物还可以包含由抗人IgA捕获的并且源自施加在其上的黄病毒或其等价物的组分。然后，在使复合物在特异性针对黄病毒或该属任何成员的竞争性免疫试剂存在时稳定形成的条件下，将源自黄病毒或其等价物的组分与生物样品接触足够长的时间。复合物一经形成，便加入检测系统以有助于检测复合物中免疫试剂的特异性结合。
测定复合物的存在
可基于本领域技术人员已知的任何简便的方法来检测抗黄病毒IgA捕获的源自黄病毒的病毒组分和黄病毒特异性结合伴侣(如免疫互作分子或黄病毒特异性免疫试剂)的复合物。
可以预期的是，用于检测形成复合物并指示生物样品中黄病毒感染的抗黄病毒IgA捕获的组分、结合伴侣和黄病毒特异性免疫试剂(如单克隆抗体)的方法包括但不仅限于：免疫测定，例如免疫印迹、免疫细胞化学、免疫组织化学或抗体亲和层析、Western印迹分析或者这些方法或其它本领域已知技术的变型或组合。
在一个优选的实施方案中，所述检测方法涉及另一种检测试剂如与酶缀合的特异性抗体和抗抗体，或者仅使用直接结合报道基团(如酶)的免疫原性试剂。合适的酶是辣根过氧化物酶(HRP)，其允许检测竞争组分形成的复合物。为了提高特异性，可使用单克隆抗体。
本发明包括使用黄病毒或黄病毒成员特异性的带有报道基团的免疫试剂。使用上述试剂提高了可实现测试的速度。它减少了鉴定复合物形成所需的步骤数。合适的报道基团是酶，例如辣根过氧化物酶。可以使用本领域技术人员熟知的其它合适的报道基团。
可以使用包含报道基团并特异性结合所述组分/结合伴侣复合物的检测试剂来检测细胞裂解物的组分与结合伴侣所形成的复合物。这样的检测试剂包括例如源自其它动物种类的黄病毒特异性或成员特异性抗体，或者特异性与结合伴侣结合的其它试剂，如抗免疫球蛋白(即抗体)、G蛋白、A蛋白或凝集素。或者，可使用竞争性测定，其中能够与源自黄病毒成员的抗原结合的检测试剂用报道基团进行标记，并使之与细胞裂解物的固定组分连同生物样品中的结合伴侣结合。生物样品中的结合伴侣抑制经标记的黄病毒或黄病毒成员特异性检测试剂与固定组分结合的程度表明生物样品中结合伴侣与固定组分的反应性。
在一个优选的实施方案中，所述检测试剂是能够与生物样品中的结合伴侣结合的抗体或二抗或其抗原结合片段。可以通过本领域普遍技术人员已知的多种技术之任意一种或几种来制备抗体(例如，参见Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。通常，可以利用细胞培养技术(包括单克隆抗体的产生)或通过将抗体基因转染进合适的细菌或哺乳动物细胞宿主(以产生重组抗体)来产生抗体。
可以将与标记缀合的二抗加入复合物以促进检测。可以使用多种提供可检测信号的标记。所述标记可选自色原、酶、催化剂、荧光团或直接可见的标记。对于直接可见标记来说，可以使用胶体金属或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物或胶乳颗粒。许多适用于用作标记的酶已公开于美国专利No.4366241、4843000和4849338中。本发明中合适的酶标记包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，优选辣根过氧化物酶。酶标记可单独使用或与溶液中的另一种酶联合使用。在本发明中，与辣根过氧化物酶连接的二抗优选地实现对免疫原与竞争性黄病毒或黄病毒成员特异性免疫试剂(如特异性针对黄病毒或该属任意成员的单克隆抗体)所形成复合物的检测，所述辣根过氧化物酶随后与其底物OPD或DAB反应并产生可察觉的颜色改变。
抗黄病毒IgA捕获组分的展示
在一个优选的实施方案中，本文公开的方法涉及使用源自感染黄病毒或该属黄病毒成员之细胞的细胞裂解物或者抗黄病毒IgA捕获的组分(在本文中可与“组分”或“细胞裂解物的组分”互换使用)，其固定在固体支持物(如聚苯乙烯或硝酸纤维素膜)上，生物样品中存在的结合伴侣可与之结合。
因此，另一方面，本发明提供了用于检测对象对黄病毒或其等价物的暴露的方法中的固体支持物，所述方法包括：
将来自所述对象的生物样品与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或其等价物组分混合物进行接触；
用竞争性黄病毒特异性免疫试剂处理所述生物样品和抗黄病毒IgA捕获的组分；
在竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时，测定所述生物样品中存在的黄病毒或黄病毒成员特异性结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成的复合物的存在情况；
所述支持物包含固定在该支持物上的抗黄病毒IgA捕获组分。
固体支持物可以是本领域普通技术人员已知的任何材料，结合伴侣或细胞裂解物组分可与其连接。例如，固体支持物可以是微量滴定板中的的测试孔或者硝酸纤维素膜或其它合适的膜。或者，支持物可以是珠子或盘，例如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。支持物还可以是磁性颗粒或光纤传感器，例如在美国专利No.5,359,681中公开的。
可用本领域技术人员已知的技术将结合伴侣或细胞裂解物组分固定在固体支持物上，这已详细描述于专利文献和科学文献中。在本发明中，术语“固定”既指免疫-吸附或非共价结合(如吸附)，也指共价结合(其可以是抗原或核苷酸与支持物上的功能性基团直接连接，或者可以通过交联剂进行连接)。优选使用包被在微量滴定板的孔中的抗体进行的免疫吸附或者简单地吸附在膜上这样的固定方式。在这些情形中，可以通过将结合伴侣或细胞裂解物组分在合适的缓冲液中接触来实现吸附，其中固体支持物预先用抗体包被适当长的时间。接触时间随温度而变化，通常为约1小时以及过夜。
也可以通过如下方式实现结合伴侣、抗黄病毒IgA捕获组分或者黄病毒或成员特异性免疫试剂与固体支持物的免疫附着：首先使支持物与双功能试剂反应，所述双功能试剂将与所包被抗体和结合伴侣或组分的免疫原性组分(如非特异性表位)反应。例如，可以通过免疫学方法使用抗抗体将结合伴侣、抗黄病毒IgA捕获组分或黄病毒特异性免疫试剂连接至具有合适抗体包被的支持物上。
本方法的概述
以下是对本方法的概述，仅举例说明了某些优选的实施例，而本发明不应限于本概述，也不限于登革热病毒。登革热病毒仅是为举例说明本发明中的黄病毒而优选的黄病毒。
本测定可以按照两步三明治测定法来进行。该测定可以首先将生物样品中的登革热特异性结合伴侣与本文所述的细胞裂解物组分进行接触，所述结合伴侣已固定在固体支持物(其可以是微量滴定板的孔)上，从而使组分与固定的结合伴侣结合。然后，将未结合的样品从固定的复合物除去，加入检测试剂(优选能够与结合伴侣或组分结合的含有报道基团的二抗)。然后使用适于该特异性报道基团的方法来检测仍结合在固体支持物上的检测试剂的量。
更优选地，结合伴侣或细胞裂解物组分一经固定在上述支持物上，通常要将该支持物上的其余结合位点封闭。本领域普通技术人员已知的任何合适的封闭剂例如含有Triton X 100或Tween 20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)的牛血清白蛋白或脱脂乳(skin milk)。然后将固定的结合伴侣或组分分别与细胞裂解物组分或结合伴侣进行孵育，从而使结合伴侣与组分之间形成复合物。也可以在孵育前用适当的稀释缓冲液(如含有登革热抗体阴性人血清和Triton X 100或Tween 20的磷酸缓冲盐溶液(PBS))对组分或结合伴侣进行稀释。通常，合适的接触时间(即孵育时间)是使细胞裂解物组分与固定的结合伴侣充分结合的时间，优选30分钟，反之亦然，然后将竞争性免疫试剂(如登革热病毒抗体，更优选单克隆抗体)加入该竞争性测定的混合物中并再反应30分钟。所述竞争性免疫试剂可以包含与其直接结合的报道基团。优选地，在结合与未结合的结合伴侣或细胞裂解物组分之间达到平衡时，所述接触时间足以使所结合的登革热抗原上靶表位的结合水平达到至少95％。本领域普通技术人员会了解，达到平衡所必需的时间可以通过测定在一段时间后的结合水平来容易地确定。室温下，约30～60分钟的孵育时间通常就足够了。
然后，可以通过用合适的缓冲液(如含有0.05％ Tween 20TM或Tween 80的PBS)洗涤固体支持物来除去未结合的组分。然后可以将能够结合细胞裂解物组分或结合伴侣并包含报道基团的检测试剂加至固体支持物上。随后将检测试剂与固定的结合伴侣-组分复合物孵育一段足以检测结合的组分或结合伴侣的时间。可以通过测定一段时间后的结合水平来确定适当的时间长短。然后将未结合的检测试剂去除，使用报道基团来检测结合的检测试剂。检测报告基团的方法依赖于报告基团的特性。
或者，可以将报道基团直接结合在免疫试剂上。然后便可以直接检测报道基团。对于放射性基团来说，闪烁计数或放射自显影方法通常是适用的。光谱方法可用于检测染料、发光基团、显色酶(chromogenic enzyme)和荧光基团。显色酶包括但不仅限于过氧化物酶和碱性磷酸酶。荧光基团包括但不仅限于异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)、罗丹明、德克萨斯红和藻红蛋白。生物素可以使用偶联有不同报道基团(通常为放射性或荧光基团，或者酶)的抗生物素蛋白来检测。酶报道基团通常可通过加入底物(通常保持特定长短的时间)、随后对反应产物进行层析或其它的分析来检测。底物可选自如下试剂：4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphtol，4CN)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)、氨乙基咔唑(aminoethyl carbazole，AEC)、2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2，2’azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)、邻苯二胺(ophenylenediamine(OPD))或四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)。
更理想地，还可以将多于一个报道基团偶联至检测试剂。在一个实施方案中，多个报道基团被偶联至一个检测试剂分子上。在另一实施方案中，可以将多于一种类型的报道基团偶联至一种检测试剂。不考虑特定的实施方案，可利用多种方式来制备带有多于一种报道基团的检测试剂。例如，多于一种的报道基团可直接与检测试剂偶联，或者可以使用提供多个连接位点的接头。
在一个相关的实施方案中，本文所述的方法可以在聚苯乙烯板中或者以流过(flow-through)或条带测试(strip test)的方式进行，其中生物样品的结合伴侣或组分通过抗登革热抗体固定或者在膜(如硝酸纤维素膜)上。例如，在流过测试中，当样品通过膜时，组分能够与固定的结合伴侣结合。或者，当样品通过膜时，生物样品中的结合伴侣能够与固定的细胞裂解物组分结合。然后，当含有检测试剂的溶液流过膜时，另一种经标记的检测试剂与结合伴侣-组分复合物结合。随后可以如上所述对结合的检测试剂进行检测。
在条带测试中，将细胞裂解物组分所结合的膜的一端浸在含有生物样品的溶液中。生物样品中的结合伴侣沿着膜迁移，其穿过含有检测试剂的区域到达固定组分区域。在固定的结合伴侣-组分复合物区域的检测试剂浓度表明生物样品中结合试剂的存在。通常，该位点的检测试剂浓度形成一种图案，例如可见并可读取的线。没有这样的图案指示阴性结果。通常，当生物样品包含的结合试剂水平足以形成三明治测定(以上述形式)中的阳性信号时，膜上或聚苯乙烯板上所固定的结合伴侣的量会产生可见的可分辨图案。通常可以用很少量的生物样品进行这些测试。
在简化的条带测试或试纸条测试(dipstick test)中，可以将细胞裂解物组分固定在膜(如硝酸纤维素膜)上。然后，可以将膜条带与生物样品反应从而在组分和生物样品中的结合伴侣之间形成复合物。随后使用检测试剂(如单克隆抗体)利用上述任意方法来检测复合物。试纸条测试可以迅速指示先前的暴露，而无需使用大量生物样品。
本文使用的“结合”是指两个单独分子的非共价结合或免疫键合，从而形成复合物。结合的能力可通过例如测定复合物形成的结合常数来评估。结合常数是将复合物的浓度除以组分的浓度的乘积得到的值。通常，在本发明中，当复合物形成的结合常数超过约103L/mol时，认为两个化合物“结合”。可使用本领域公知的方法来测定结合常数。
本发明的方法和试剂盒所涉及的固体支持物包括利用免疫吸附可固定结合伴侣、源自黄病毒或该组任意特定成员或其等价物的组分、或者竞争性黄病毒特异性免疫试剂的表面。所述表面的实例包括但不限于：聚苯乙烯或具有滤纸载体的膜(包括硝酸纤维素膜、聚四氟乙烯滤膜、醋酸纤维素滤膜和硝酸纤维素滤膜)。最优选地，所述膜为聚苯乙烯和硝酸纤维素膜。
或者，本发明的诊断方法可使用生物微芯片而采用自动分析方法。例如，可组成诊断试剂盒，其使用包被有细胞裂解物组分的载玻片进行免疫印迹。如本文所述，该诊断试剂盒可包含生物学微芯片(细胞裂解物组分固定在其表面上)、合适的缓冲液、包含可检测水平的结合试剂的标准样品以及二级检测试剂(secondary detection reagent)。
本发明的方法和试剂盒可检测人或动物对黄病毒或该家族任意特定成员或其等价物的在急性感染期或康复期的特定暴露。本文使用的“急性感染”是指病毒已感染宿主并且活跃复制和/或导致感染相关症状(如发热、皮疹(rush)、关节痛和/或腹痛)的一段时期。“康复期”是指黄病毒不再增殖或维持在宿主血液中、并且已产生结合伴侣(例如但不仅限于抗体)的黄病毒感染周期阶段。使用本发明的方法和试剂盒，可以在感染的患者或先前感染的患者中在产生结合伴侣后的任何时间检测暴露。
试剂盒
另一方面，本发明提供了用于检测对象对黄病毒或该家族任意成员或其等价物的暴露的试剂盒，所述的试剂盒包含：
来自黄病毒的抗黄病毒IgA捕获组分；
竞争性黄病毒特异性免疫试剂；以及
至少一种检测试剂，其用于检测在竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时所述生物样品中的结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成的复合物。
任选地，如对实施该方法有必要的话，则所述试剂盒还包括另外的部分，如洗涤缓冲液、孵育容器、封闭缓冲液和说明书。
因此，本发明提供了用于检测对象暴露于黄病毒或该家族任意成员或其等价物的试剂盒。该试剂盒可以采用使生物样品中的结合伴侣与抗登革热IgA捕获的黄病毒组分相互作用、并进一步与竞争性黄病毒特异性免疫试剂进行竞争的任何方便的形式。生物样品中存在黄病毒特异性或黄病毒特异性结合伴侣的结果表明先前曾暴露于黄病毒。优选地，该试剂盒包含如本文所述的固体支持物，其适于接受或包含抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或其等价物组分。所述试剂盒还可以包括试剂、能够提供可检测信号的报道分子以及可选的使用说明书。该试剂盒可以采用组合的形式，其中单独的组分可以分别购买。
所述试剂盒可以是包括一个或多个成员的组合试剂盒，其中至少一个成员是包含抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或等价物或细胞裂解物(其包含源自黄病毒或其等价物的免疫组分)的黄病毒组分的固体支持物。
在一个可选的实施方案中，固体支持物包含一系列针对来自一个或多个对象的一种或多种黄病毒或其等价物的一种或多种组分的结合伴侣。
本发明还提供本发明的方法中使用的试剂盒的单独组分。本发明提供了固体支持物，其包括用于检测暴露于黄病毒的抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分。在一个实施方案中，本发明提供了聚苯乙烯96孔板或硝酸纤维素膜来附着病毒抗原，或者用作固定的抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分，或作为斑点印迹，或者用作包含黄病毒或其等价物组分的试纸条。优选地，所述板或膜包含选自以下的组分：源自黄病毒的黄病毒结构和非结构蛋白、黄病毒颗粒及其片段、糖蛋白、脂质和碳水化合物或其任意混合物等。
固体支持物还可以是细胞裂解物组分固定于其上的微量滴定板、载玻片或生物微芯片。然后，可将这些固体支持物与生物样品接触以检测黄病毒暴露。优选地，使用来自经黄病毒感染的细胞裂解物的抗黄病毒IgA，利用聚苯乙烯微量滴定板通过免疫-纯化来附着黄病毒抗原。
在硝酸纤维素膜的情形中，第二支持物可以是固定器，其固定固体支持物以改善固体支持物(其包含固定的黄病毒组分)的操作。例如，硝酸纤维素膜可以靠小棒(stick)支持，从而使该膜能够被浸入生物样品(如血清)中。这作为试剂盒的组分是有用的，因为可以同时检测少量生物样品。
评估感染的相对风险
另一方面，本发明还提供了一种评估特定区域(例如地理区域、居住区、交通工具或用于医学治疗或评价的中心)内一个或多个对象暴露于黄病毒或该家族任意成员或其等价物的相对风险的方法，其包括：
a)从特定区域内的代表性群体中获取样品；
b)通过包括以下步骤的方法来评估样品群体中各成员对黄病毒或该家族任意成员或其等价物的暴露：
i)将来自对象的生物样品与抗黄病毒IgA捕获的源自黄病毒或其等价物的组分进行接触，从而在所述组分与所述生物样品中的黄病毒特异性结合伴侣之间形成复合物；
ii)测定在存在竞争性黄病毒特异性免疫试剂时在生物样品中黄病毒特异性结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成的复合物，其中存在所述复合物即表明对象暴露于黄病毒或该家族任意成员或其等价物；以及
iii)评估特定区域内暴露的相对风险。
可以使用计算机可读形式的软件进行风险分析。因此，本发明还涉及计算机可读的程序和计算机，其包括适于分析对象或对象群对黄病毒或其等价物的暴露或者对象或对象群暴露于黄病毒或其等价物的风险。
本发明的方法或技术允许对由黄病毒或该家族任意成员或其等价物导致的感染发作进行流行病学研究或血清监视。这些研究提供了多方面增进黄病毒疾病领域的研究的有价值信息。例如，流行病学研究有助于鉴定感染指标。这些信息使得能够鉴定导致病毒爆发的病毒来源的特定区域。
此外，本发明的技术/方法允许快速鉴定或分离感染有黄病毒或其等价物的对象，而无需主要的实验室设备甚至可以在野外条件下进行。这些信息有助于鉴定需要医学治疗的对象以及确定需要进一步调查或进行疾病控制的区域，例如确定其孳生地及其控制方法。另外，本发明的技术允许监测已感染的患者以确定抗黄病毒特异性IgG的存在。IgG效价的降低或者其出现在感染早期指示继发感染，并因此有助于监测随后的黄病毒感染期(如登革出血热(DHF)或登革休克综合症(DSS))。
另外，本发明的技术提供了一种用于鉴定感染有黄病毒属任意特定成员以及所参与血清型之对象的方法，其允许快速检测进一步感染的风险、指出感染的区域以及疾病控制策略。
本文对专利文献或其它作为现有技术给出的事项的参考并非承认该文献或事项是已知的或者其包含的信息是任意权利要求的优先权日时公知常识的一部分。
本发明中使用的方法实例将进行更充分地描述。但应理解的是，以下的描述仅为示例性的，而不应以任何方式作为对上述发明的概括性的限制。
实施例
实施例1—用于检测登革热特异性IgG的C-ELISA
1.材料与方法
1.1 制备用于C-ELISA的病毒裂解物抗原：按照Cardosa等，2002所述的方法，针对登革热病毒的所有4种血清型来制备登革热病毒抗原裂解物。简言之，将登革热病毒(5m.o.i.)培养在C6/36细胞中，取决于致细胞病变效应的发生以及病毒的血清型，在含有2％胎牛血清的病毒维持培养基中孵育4～5天。将培养基倒出，用PBS洗涤包含感染细胞的培养瓶4次，用含有1％ trix100的1ml低渗缓冲液处理1小时，最后以14000rpm离心10分钟。收集上清液用于通过间接ELISA针对登革热群体特异性和血清型特异性的单克隆抗体进行检测，并以500μl分装至eppendorf管中，储存于-70℃备用。
1.2 单克隆抗体：从两个不同的来源(Abeam，Oxford，UK和Immunology Consultants Limited，USA)获得全登革热特异性单克隆抗体(MAb)，并且两种单克隆抗体都得到了CDC，Atlanta，USA(美国疾病预防控制中心)的验证。登革热血清型特异性单克隆抗体(den-1、den-2、den-3和den-4)从ICL，USA获得。所有单克隆抗体针对新加坡分离株的4种血清型的反应性也通过间接ELISA和斑点印迹免疫测定来评估。
1.3 测试血清：本研究中使用了总共360个血清样品。这些样品来自不同的门诊和医院，其用于通过PCR或病毒分离或血清学测定来诊断登革热感染。使用两种登革热病毒IgG间接ELISA(Pan-Bio，Australia和IVD Research Inc，Carlsbad，CA 92008，USA)来初筛样品中的登革热反应性抗体(IgG)，随后使用斑点印迹EIA通过系列稀释来测定IgG的水平。所有的样品都保存在-80℃，直至用C-ELISA检测时。
1.4 间接ELISA：本研究中使用了3种间接ELISA。使用市售试剂盒(Pan-Bio，Australia和IVD Research Inc，Carlsbad，CA 92008，USA)来筛选血清样品中的登革热病毒反应性IgG抗体，并按照制造商所述的的步骤进行该测试。使用自制间接ELISA(in house indirect ELISA)来评估单克隆抗体并确定用于竞争性测定中最佳的病毒抗原、单克隆抗体和血清稀释度。间接ELISA在maxi-sorb聚苯乙烯96孔板上进行。在测定中使用maxi-sorb 96孔平底微量滴定板(NUNC，Denmark)和100μl试剂。ELISA板用每孔100μl的抗人IgA(用pH9.6的碳酸盐/重碳酸盐缓冲液(Fluka，Biochemika，Switzerland)以1:500稀释)包被，37℃孵育1小时或4℃过夜。用洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的PBS)洗涤该板1次，将预先确定在PBS最佳稀释度(1:5000)的100μl抗登革热IgA加至每个孔。将该板在37℃孵育1小时并再洗涤1次，将预先确定在PBS中稀释度(1:100)的100μl登革热裂解物抗原(Den-1至Den-4)加入每个孔，再于37℃孵育1小时。孵育后，将板洗涤4次，并以C-ELISA稀释缓冲液(含0.3％登革热抗体阴性人血清和0.1％ Triton X 100的PBS)中1:250至64,000的系列稀释度加入单克隆抗体，室温孵育30分钟。洗涤6次后，将100μl缀合有辣根过氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgG加入每个孔，所述IgG在稀释缓冲液中以1:3000进行稀释，再于室温孵育30分钟。带有HRP的羊抗鼠IgG的最佳稀释度1:3000是将板用系列稀释的单克隆抗体包被后通过直接ELISA确定的。孵育后，将板洗涤6次，并将100μl OPD(邻苯二胺，Sigma，USA)加入每个孔，室温孵育5～10分钟。5～10分钟后，通过加入100μl 2M H2SO4终止显色，并在492nm波长下读取光密度。
1.5 竞争性ELISA(C-ELISA)：C-ELISA依赖于在登革热阳性血清存在时阻断单克隆抗体与登革热病毒共有表位的结合。当单克隆抗体单独存在时，所检测的竞争为光密度读取的降低。ELISA信号的减少量与血清中登革热病毒特异性IgG的效价成比例。该测试通过3种方式进行，即同时向抗原捕获孔加入测试血清和单克隆抗体形成竞争性ELISA，或者在测试血清预孵育半小时后加入单克隆抗体，或者用血清预孵育1小时后洗涤6次再加入单克隆抗体(称作阻断ELISA或B-ELISA)。这3种形式在本研究中均进行了测试。
本研究中使用了在新加坡分离的4种登革热血清型。本研究中使用的单克隆抗体是用超过100个分离株(Den-1、Den-2、Den-3和Den-4)进行筛选的，所述分离株是在过去4年中(2002-2005)分离的并发现其与所有病毒株的反应等同。在先前用抗登革热IgA捕获的孔上，使用抗原捕获技术通过棋盘式滴定(checkerboard titration)来测定最佳的裂解物抗原稀释度，1:100稀释的裂解物抗原对本测定是最佳的。
采用上述方法，使用maxi-sorb 96孔平底微量滴定板来捕获抗原，洗涤4次，该板备用于进行C-ELISA和B-ELISA测定。在该测定中，将45μl封闭缓冲液(含0.3％登革热抗体阴性人血清和0.1％ Triton X100的PBS)加入每个孔中，然后将5μl待测血清和对照血清分别加入各孔中，并按照以下方法来使用：对于同时C-ELISA来说，将50μl用封闭缓冲液1:1000稀释的特异性单克隆抗体加入含有血清的孔中；对于预孵育C-ELISA来说，血清在室温孵育30分钟后加入特异性单克隆抗体；对于B-ELISA来说，将血清在室温孵育1小时，洗涤6次，并将特异性单克隆抗体加入每个孔中。孵育(对于同时C-ELISA来说为60分钟，对于预孵育C-ELISA来说为30分钟)后，洗涤板6次，并将用封闭缓冲液1:3000稀释的100μl HRP-缀合的羊抗鼠IgG加入每个孔中。其余的测定按照间接ELISA中所述的进行。在B-ELISA的情形中，在加入测试血清后，将板在室温孵育1小时，洗涤6次，然后在每孔中加入1:1000稀释的100μl单克隆抗体。其余步骤类似于C-ELISA。
1.6 建立最佳的单克隆抗体、血清稀释度和测试形式：为了最初建立测试参数，使用了两种登革热病毒-2中和阳性血清(1:640和1:160)、两种康复期的登革热血清(经PCR确认)、两种黄热病中和阳性血清(1:1280和1:80)以及两种黄病毒阴性血清(VNT＝1:10)。首先，通过将封闭缓冲液中的系列稀释物(1:250至1:64000)加入抗原捕获板并进行间接ELISA来测定单克隆抗体的效价(图1a和2b)。然后，对应于滴定曲线上平台期OD值的100％以及75％～80％，任意选择两种稀释度的单克隆抗体，针对系列倍数稀释的血清通过C-ELISA和B-ELISA进行测定(图2a、2b和3)。所有样品均测试两次。对照包括不含血清含单克隆抗体的孔(0％抑制)以及不含血清不含单克隆抗体的孔(100％抑制)，缺少的组分用封闭缓冲液替代。
1.7 C-ELISA和B-ELISA结果的定量和统计分析：在血清存在时单克隆抗体结合被膜蛋白上特异性表位的抑制表示为抑制百分数(percent inhibition，PI)，其使用下式由平均OD值进行计算：
Figure A200780017982D00371
计算登革热阴性和阳性血清样品的抑制百分数的平均值和标准偏差，并确定阳性临界值。通过使用作为黄金标准测试的VNT来评估C-ELISA的相对特异性和灵敏度。
2.结果
2.1 抗原和单克隆抗体的最佳稀释度：由于C-ELISA的要求之一是使用非纯化和非浓缩的登革热裂解物抗原的可能性，因此所采用的策略是使用预先由抗人IgA捕获于maxi-sorb ELISA板上的抗黄病毒IgA捕获物。该技术能够免疫纯化并浓缩来自细胞裂解物的黄病毒抗原，并能够呈现针对登革热特异性IgG(来自阳性血清或特异性单克隆抗体)的诱捕抗原(trapped antigen)。我们观察到，对抗登革热IgA特异性捕获的抗原进行纯化并随后使用登革热特异性单克隆抗体(复合物或血清型特异性的)进行检测，其比单克隆抗体捕获ELISA获得更多的抗原(图1a和1b)。
2.2 抗原、单克隆抗体和血清的最佳稀释度：C-ELISA的主要目的是区分登革热与黄病毒科其它成员的特异性抗体。因此，该测试的特异性通过其区分不同浓度下的弱阳性(由VNT所定义)登革热病毒血清和强阳性黄病毒血清(黄热病)的能力来测量。我们将特异性表示为弱阳性登革热血清和强阳性黄热病血清之间PI值的平均差别。图2a显示pan-登革热特异性单克隆抗体(Pan-登革热单克隆抗体—Abeam，UK和Pan-登革热单克隆抗体—ICL，USA)的滴定曲线以及继续进行测试的稀释度。图2b表示血清稀释度函数的差别。基于图2b的结果，我们采用75～80％的饱和稀释度(1:1000)作为随后测试中的单克隆抗体最佳稀释度。在该单克隆抗体浓度下，血清的最佳稀释度是得到峰值的稀释度。该血清稀释度为1:10(图3)。值得注意的是，所述两种单克隆抗体在同样的血清稀释度时到达平台期(图2a)。在随后的测试中，我们观察到它们在每个测试中均得到类似的结果，由于Pan-登革热单克隆抗体较廉价且有效，因此我们选用Pan-登革热单克隆抗体，ICL，USA。
2.3 测试形式——竞争性ELISA对B-ELISA以及孵育时间：我们通过强的、中等的、弱的和阴性的登革热血清(VNT＝1:640、1:160、1:40以及<1:10)对竞争性ELISA和阻断ELISA进行了比较。该比较还可包括评估不同组合的血清和单克隆抗体孵育时间以及最佳稀释度的血清。单克隆抗体或血清同时加入，或者单克隆抗体在血清预孵育之后加入(其总孵育时间(血清加单克隆抗体)为45、60、90和120分钟)。图4清楚地表明竞争性和阻断形式得到类似的灵敏度和特异性。另外，较之同时加入单克隆抗体和血清，用血清预孵育30分钟并在加入单克隆抗体后再孵育30分钟可获得最佳的特异性和灵敏度。
2.4 阴性临界值：通过使用100份对登革热抗体(IgG和IgM)呈阴性的血清样品(其使用IgM捕获ELISA和间接登革热IgG(Pan-Bio，Australia和IVD Research Inc，Carlsbad，CA 92008，USA)鉴定)、64份登革热阳性血清(VNT>1:20)以及25份登革热IgG反应性但对登革热病毒VNT呈阴性(<1:10)的样品，确定了C-ELISA和B-ELISA的临界值(图5)。对于两种结合的群体(图5a、5b)来说，临界值任意设立在平均值(9.9)加2个标准偏差或者抑制(6.6)。当单独考虑黄病毒交叉反应血清样品时(图5)，同样的临界值表示为平均值加3个标准偏差。对于绝对阴性的血清样品来说，平均值加标准偏差得到25％抑制的临界值。
2.5 VNT与C-ELISA的比较：图6显示通过VNT和C-ELISA测定的两组血清样品的平均滴定终点。测试结果之间的整体系数相关性为(n＝64)。通过结合所有的样品，C-ELISA相对于VNT的特异性和灵敏度的评估示于表1。
表1显示在检测登革热特异性抗体(IgG)中，C-ELISA与病毒中和测试(VNT)的比较。
表1：病毒中和测试(VNT)
Figure A200780017982D00391
灵敏度＝62/64＝1×100＝96.88％，灵敏度＝100/100＝1×100＝100％，阳性预测值＝62/62×100＝100，阴性预测值＝100/102×100＝98％。
2.6 C-ELISA和登革热继发感染：将C-ELISA检测登革热继发感染的灵敏度和特异性与两种常规技术进行比较：抗登革热IgM和IgG的比值(≤1.2(继发感染)，<1.2(原发感染，Shu等，2003))和抗登革热IgG捕获ELISA(其相当于≥1:2560HI单位)(表3)。
表2显示在检测登革热继发感染中C-ELISA与常规技术(IgM与IgG的比值)的比较。
表3显示在检测登革热继发感染中C-ELISA与常规技术(登革热捕获IgG ELISA)的比较。
表2：抗登革热IgM/IgG比值(≤1:2和<1:2)
Figure A200780017982D00392
灵敏度＝72/115×100＝62.60％，特异性＝31/39×100＝79.48％，阳性预测值(PPV)＝64/72×100＝88.89％以及阴性预测值＝31/82×100＝37.80％。
表3：抗登革热IgG捕获ELISA
Figure A200780017982D00401
灵敏度＝54/70×100＝77.14％，特异性＝82/84×100＝97.62％，阳性预测值＝54/72×100＝75％以及阴性预测值＝66/82×100＝80.49％。
2.7C-ELISA和登革热血清分型：该测试还用于区分血清样品中登革热病毒的血清型(Den-1、Den-2、Den-3和Den-4)，其使用登革热血清型特异性单克隆抗体。使用登革热血清型特异性单克隆抗体对81份预先经pan-登革热单克隆抗体检测的登革热特异性血清样品进行进一步地分析。使用了3种登革热血清型特异性单克隆抗体(登革热-2、Den-4和Den-1)。表4中的结果显示，分别地，80.25％对Den-2病毒呈阳性；49.38％对Den-4病毒呈阳性；32.10％对Den-1病毒呈阳性。20％的血清对所有3种登革热血清型(Den-2、Den-4和Den-1)均呈阳性，38.46％的样品对Den-2和Den-4呈阳性，10.77％的血清包含针对Den-2和Den-1的抗体，而12.50％的血清样品对Den-4和Den-1病毒呈阳性。由于血清型特异性单克隆抗体的低反应性所致，检测血清样品针对登革热血清型3的活性。
表4：登革热血清分型
 
总样品 登革热特异性的 Den-1特异性的 Den-2特异性的 Den-4特异性的 Den-1+Den2+Den-4 Den-1+Den-2 Den-1+Den-4 Den-2+Den-4 
88 81 26 65 46 13 20 18 25
90.05％ 32.10％ 80.25％ 49.38％ 20％ 30.77％ 27.69％ 38.46％
2.8 15分钟一步竞争性ELISA：除了竞争性单克隆抗体与HRP(ICL，USA)缀合并被同时加入测试血清以外，该测试按照2.3部分所述进行。总孵育时间从90分钟缩短至15分钟，并且两步变为一步。将15分钟一步测定的结果与预孵育C-ELISA和同时30分钟一步C-ELISA进行比较，发现它们100％相似(表5)。
表5：进行时间的比较
 
总样品 C-ELISA/90分钟，2步              C-ELISA/30分钟，1步  C-ELISA/15分钟，1步 
阳性(Pan-bio IgG) 98 80(81.63％) 83(84.69％) 81(82.65％)
阴性(Pan-bio IgG) 29 1(3.45％) 3(10.35％) 1(3.45％)
2.9 针对日本脑炎病毒的竞争性ELISA：还建立了针对非登革热黄病毒如日本脑炎病毒(JEV)的基于单克隆抗体的C-ELISA，其使用病毒特异性单克隆抗体(与圣路易脑炎病毒有交叉反应)。使用2.3部分所述的步骤来制备平板，捕获日本脑炎病毒抗原而取代登革热病毒。简言之，使用日本脑炎裂解物抗原(Nayakama株)，用抗登革热IgA进行捕获。在兔中产生抗日本脑炎抗体并用于本测定，使用所述技术对83份人血清样品进行筛选。在83份样品中，65份样品对黄病毒交叉反应IgG呈阳性，其余28份血清对黄病毒呈阴性。结果表明，89.23％(58/65)的黄病毒反应性血清对日本脑炎C-ELISA呈阳性，而89.29％(25/28)的黄病毒阴性样品不与日本脑炎C-ELISA反应。然而，还未使用确诊日本脑炎的血清样品对该技术进行验证。
3.讨论
已证实基于单克隆抗体的竞争性ELISA是一种检测登革热抗体的快速、灵敏且特异的方法。与间接ELISA相比，该测试还具有另外的优点，即允许筛选血清中黄病毒的不同成员。与VNT相比，C-ELISA具有高灵敏度(100％)和高特异性(100％)，同时将反应时间从7天缩短为少于2小时。此外，与VNT不同的是，C-ELISA较少受血清质量(细胞毒性、杂质、溶血或富含脂肪)的影响，并且与黄病毒其它成员的交叉反应水平也较低。杂质可以以两种方式影响血清学结果：降解抗体以及改变pH至阻碍抗体结合的水平。在实践中，筛选血清的相对较高的稀释度(1:20或以上)可抵消第二种因素。
B-ELISA和30分钟预孵育血清C-ELISA相对于同时加入测试血清和单克隆抗体的优越性可能由于单克隆抗体被高度纯化以及与血清抗体相比其对表位具有高亲和力。当同时加入两者时，只有高亲和力的血清抗体以竞争形式参与竞争，早期原发应答血清(其主要包含低亲和性抗体)的检测呈阴性，而继发应答血清(可能具有高亲和性)显示出与B-ELISA相当的灵敏度水平。然而，使用特异性针对登革热病毒的缀合单克隆抗体消除了本技术的低灵敏度，并得到了类似的结果。经改进的技术不仅提高了测试的灵敏度，还将总时间从90分钟减少至15分钟，两步变为一步。该15分钟一步C-ELISA是目前登革热IgG检测技术中的巨大突破，可以使用一项测试在疾病早期以及登革热特异性血清监视中区分登革热原发和继发感染，这在超过一种黄病毒共同流行的地区尤为重要。目前，使用两种抗登革热IgG测试来检测登革热继发感染以及血清监视。
基于以下两个原因，将C-ELISA标准化至微量中和测定：(i)VNT是目前唯一可用的登革热感染(其中存在多于一种的黄病毒)验证测试；以及(ii)中和抗体被认为是宿主免疫状况最佳预报器(predictor)。C-ELISA的结果与VNT的结果非常吻合，在这两种测试结果之间具有非常高的正相关系数(r＝0.88)。
检测登革热特异性抗体不仅对于流行病学研究非常重要，而且对于通过检测登革热特异性IgG(患者可以从先前感染获得)来诊断继发感染也很重要。根据WHO的规定，只有在登革热感染的康复期早期血清中包含>2560 HAI水平的抗登革热IgG才认定为继发感染(WHO手册-1982)。然而，由于其延迟的检测步骤，该登革热继发感染的检测标准可导致患者发生更严重形式的登革热感染(如登革出血热(DHF))，因此不适于对患者采取适当的措施。我们将我们的新技术与WHO对应的测试(登革热IgG捕获ELISA，表3)进行比较，发现C-ELISA较之登革热IgG捕获ELISA具有77％的灵敏度和97.62％的特异性，还观察到，在18个登革热病例中尽管存在登革热特异性IgG，却无法检测捕获IgG，而通过捕获IgG ELISA(其不特异性针对登革热IgG)检测出16个病例。因此，存在高水平的登革热交叉反应IgG并不意味着登革热继发感染，其是在多于一种黄病毒共同流行的地区的普遍现象。另一方面，在登革热疾病早期存在低水平的登革热特异性IgG也不排除登革热继发感染的情形。Shu等，2003描述的另一种使用IgM和IgG比值的技术(表2)显示，74.67％的登革热患者存在继发感染，与登革热捕获IgG和C-ELISA相比，该数值相当高。在这种情形下，我们发现我们发明的C-ELISA技术是检测继发感染的有力工具，其通过检测登革热急性发病期间的患者血清中登革热特异性IgG(低水平和高水平)在15分钟内完成。
由C-ELISA发展而来的这种实验方法使用登革热裂解物抗原和登革热特异性单克隆抗体进行示例说明。该方法也可用于针对其它黄病毒，对日本脑炎的初步结果例证了这点。
最后，应理解的是，在不背离本文所述的本发明之精神的前提下，可以进行多种另外的修正和/或改变。
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Claims (46)

1.一种用于检测对象对黄病毒或其等价物的暴露的方法，所述方法包括如下步骤：
将来自所述对象的生物样品与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分混合物进行接触；
用竞争性黄病毒特异性免疫试剂处理所述生物样品和抗黄病毒IgA捕获的组分；以及
在所述竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在下，测定所述生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分之间所形成的复合物的存在情况。
2.根据权利要求1的方法，其中在用所述竞争性黄病毒特异性免疫试剂处理前，将所述生物样品和抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分预孵育以形成复合物。
3.根据权利要求1的方法，其中在测定复合物的存在前，将所述生物样品、抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分和竞争性黄病毒特异性免疫试剂同时进行接触。
4.根据权利要求1的方法，其中所述竞争性黄病毒特异性免疫试剂是特异性针对抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分之表位的抗体。
5.根据权利要求1的方法，其中所述竞争性黄病毒特异性免疫试剂是缀合有报道基团的单克隆抗体。
6.根据权利要求5的方法，其中所述报道基团是酶。
7.根据权利要求1的方法，其中所述抗黄病毒IgA捕获的组分捕获自经黄病毒感染之细胞的裂解物。
8.根据权利要求1的方法，其中所述抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分选自源自黄病毒的黄病毒结构和非结构蛋白、黄病毒颗粒及其片段、糖蛋白、脂质以及碳水化合物之中。
9.根据权利要求8的方法，其中所述结构蛋白选自被膜蛋白、Pr膜蛋白和核壳蛋白之中。
10.根据权利要求9的方法，其中所述抗黄病毒IgA捕获的组分是针对黄病毒抗体之抗原结合位点的抗独特型抗体，所述黄病毒抗体是响应于对源自黄病毒或其等价物的IgA捕获组分的暴露而产生的。
11.根据权利要求1的方法，其中所述结合伴侣是黄病毒特异性抗体或其免疫原性片段。
12.根据权利要求11的方法，其中所述结合伴侣是在黄病毒感染早期或康复期表达的抗体或源自先前感染的抗体。
13.根据权利要求1的方法，其中所述黄病毒选自黄热病病毒、登革热病毒和日本脑炎(JE)病毒之中。
14.根据权利要求13的方法，其中所述黄病毒是登革热病毒。
15.根据权利要求13的方法，其中所述黄病毒是日本脑炎病毒。
16.根据权利要求14的方法，其中该方法检测对选自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4之中的登革热病毒血清型的暴露。
17.根据权利要求16的方法，其中所述竞争性登革热特异性免疫试剂是特异性针对登革热病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4的共同表位的抗体。
18.根据权利要求14的方法，其中所述非结构蛋白选自NS-1、NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b和NS-5之中。
19.根据权利要求18的方法，其中所述非结构蛋白是NS-1。
20.根据权利要求14的方法，其中所述结合伴侣抗体是特异性针对选自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4之中的登革热血清型的IgG抗体。
21.根据权利要求1的方法，其中所述生物样品选自血液、唾液、脊髓液、B细胞、T细胞、血浆、血清、尿液和羊水之中。
22.根据权利要求21的方法，其中所述生物样品是血清或唾液。
23.用于权利要求1至22中任一项所述方法中的抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分混合物。
24.根据权利要求23的抗黄病毒IgA捕获之组分的混合物，其捕获自经黄病毒感染细胞的裂解物。
25.根据权利要求23的混合物，其包含选自如下的组分：源自黄病毒的黄病毒结构和非结构蛋白、黄病毒颗粒及其片段、糖蛋白、脂质和碳水化合物之中。
26.根据权利要求25的混合物，其中所述结构蛋白选自被膜蛋白、Pr膜蛋白和核壳蛋白之中。
27.根据权利要求23的混合物，其中所述黄病毒选自黄热病病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒之中。
28.根据权利要求27的混合物，其中所述黄病毒是登革热病毒。
29.根据权利要求27的混合物，其中所述黄病毒是日本脑炎病毒。
30.根据权利要求28的混合物，其中所述登革热病毒选自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4之中。
31.根据权利要求28的混合物，其中所述非结构蛋白选自NS-1、NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b和NS-5之中。
32.根据权利要求31的混合物，其中所述非结构蛋白是NS-1。
33.用于检测对象对黄病毒或其等价物的暴露的试剂盒，所述试剂盒包含：
来自黄病毒的抗黄病毒IgA捕获组分；
竞争性黄病毒特异性免疫试剂；以及
至少一种检测试剂，其用于检测在所述竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时所述生物样品中存在的结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成的复合物。
34.根据权利要求33的试剂盒，其中所述抗黄病毒IgA捕获的组分或者竞争性黄病毒特异性免疫试剂或成员特异性免疫试剂被固定在固体支持物上。
35.根据权利要求33的试剂盒，其中所述黄病毒特异性免疫试剂是单克隆抗体。
36.根据权利要求33的试剂盒，其中所述抗登革热IgA捕获的组分选自源自黄病毒的黄病毒结构和非结构蛋白、黄病毒颗粒及其片段、糖蛋白、脂质和碳水化合物之中。
37.根据权利要求36的试剂盒，其中所述结构蛋白选自被膜蛋白、Pr膜蛋白和核壳蛋白之中。
38.根据权利要求33的试剂盒，其中所述黄病毒选自黄热病病毒、登革热病毒和日本脑炎病毒。
39.根据权利要求38的试剂盒，其中所述黄病毒是登革热病毒。
40.根据权利要求38的试剂盒，其中所述黄病毒是日本脑炎病毒。
41.根据权利要求39的试剂盒，其中所述竞争性登革热特异性免疫试剂是特异性针对登革热病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4的共同表位的登革热特异性抗体。
42.根据权利要求38的试剂盒，其中所述非结构蛋白选自NS-1、NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b和NS-5之中。
43.根据权利要求42的试剂盒，其中所述非结构蛋白是NS-1。
44.用于检测对象对黄病毒或其等价物的暴露的方法中的固体支持物，所述方法包括：
将来自所述对象的生物样品与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或其等价物组分混合物进行接触；
用竞争性黄病毒特异性免疫试剂处理所述生物样品和抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分；
在所述竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时，测定生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成的复合物的存在情况；
所述支持物包含固定于该支持物上的抗黄病毒IgA捕获的组分。
45.根据权利要求44的固体支持物，其选自珠、盘、磁性颗粒或光纤传感器、微量滴定板、玻璃载玻片或生物微芯片或膜，所述膜包括硝酸纤维素膜以及具有滤纸载体的聚四氟乙烯滤膜、醋酸纤维素滤膜和硝酸纤维素滤膜。
46.一种评估特定区域内一个或多个对象暴露于黄病毒或其等价物的相对风险的方法，其包括：
a)从特定区域内的代表性群体中获取样品；
b)通过包括以下步骤的方法来评估样品群体中各成员对黄病毒或其等价物的暴露情况：
i)将来自对象的生物样品与源自黄病毒或其等价物的抗黄病毒IgA捕获组分进行接触，从而在所述组分与所述生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣之间形成复合物；
ii)在竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在时，测定所述生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣与抗黄病毒IgA捕获的组分之间所形成的复合物的存在情况，其中所述复合物的存在表明该对象暴露于黄病毒或其等价物；以及
c)评估特定区域内暴露的相对风险。
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