TW200815753A - Competitive enzyme linked immunosorbent assay (C-ELISA) for the detection of a flavivirus specific antibody - Google Patents

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200815753 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種用以偵測人及/或動物對黃病毒 (flavivirus)或其同等物（equivalent)之方法。本發明係特別 有關於一種快速且簡易之標的（動物或人）生物樣品分析， 決定標的是否已事先暴露至黃病毒科分屬（member)或其同 等物。本發明更提供黃病毒之血清型暴露至血清分析，並 且提供醫學診斷套組及對黃病毒分屬感染或其同等物之不 ® 同血清研究發展。本發明對於偵測黃病毒之二級感染 (secondary infection)、定義感染前（previous infection)之血 清型（serotyping)、血清流行病學（sero-epidemiology)及疫苗 (vaccine)發展十分重要。 【先前技術】 黃病毒科（flavivirus family)包含多數可對人體致病之 病毒，且通常係經由蚊（mosquitoes)與兹（ticks)而傳播 φ (transmitted)。黃病毒屬（flavivirus genus)包含多數病毒包 括黃熱病毒（yellow fever virus，YF)、登革熱（dengue fever virus)、西尼羅河病毒（West Nile，WN)及曰本腦炎（Japanese encephalitis，JE)，且其導致相應之疾病。 登革熱係世界上最常見且分佈最廣之節肢動物媒介黃 病毒感染（arthropod-borne flavivirus infection)，世界上有 25億人面臨居住於登革熱疾病流行區域之危害，並且每年 有超過120萬人發生登革熱感染之情形（2005年4月世界 衛生組織/熱帶疾病研究與培訓特別專案（WHO/TDR)。在 6 200815753 黃病毒屬中有四種不同之病毒血清型（virus serotypes)，每 一種都能產生不同範圍之病症（signs)及症狀（symptoms)， 並且四jk清型中之一種之初級感染（primary infection)可授 予此類型之持續免疫性（lasting immunity)。但仍有可能發 生不同血清型之二級感染。 雖然登革熱盛行於多數熱帶及次熱帶國家，但主要仍 發生在缺乏健康照護基礎架構或經濟能力之發展中國家， 且無法有效診斷登革熱之發生。在新加坡，兩傳染媒介 ⑩ （vector)之不穩定分佈（uneven distribution)導致族群内登 革熱不穩定之傳播（transmission)(2001年Ooi等人發表於 L⑽cei第357卷第9257期第685至686頁，名稱為「Dengue seroepidemiology in Singapore」)〇藉由血清檢驗，可決定 登革熱發生之可能性。上述發現將有助於對傳染媒介控制 計晝（vector control programs)之傳播至新區域作更動與潤 飾。然而，目前僅完成上述四血清流行病學之檢驗。由於 馨實驗室之測試成本高或缺乏所需試劑，使得多數檢驗無法 延續。 一般而言，血液凝集抑制試驗（hemagglutination inhibition，HAI)係通常用以偵測抗登革熱之抗體。然而， 上述方法需要小鼠大腦來源之抗原（mouse brain-derived antigens)，但是由於其難以在上述細胞中生長因而並非十 分有效。另一常用方法係為補體固定（complement fixation)，但需要短周期（short-lived)之抗體。越來越多的 實驗室恢復使用商業用酵素連結免疫吸附分析法套組 7 200815753 (commercial ELIS A kits)。然而，上述測試並非登革熱特異 性抗體，而是與相同區域中黃病毒共同循環傳播 (co-circulating)之其他分屬，例如曰本腦炎（japanese encephalitis，JE)、西尼羅河病毒（West Nile，WN)、C 型 肝炎（Hepatitis C)、黃熱病毒（yellow fever virus，YF)、墨 萊溪谷腦炎（Murray Valley encephalitis)等，交互反應。 六商業用免疫系統用以偵測血清中登革熱病毒特異性 免疫球蛋白M(IgM)及免疫球蛋白G(IgG)抗體，其效能之 ® 敏感度已大幅提昇（2000年Groen等人發表於C7/« Dfagn LM /mrnw/ii?/第7卷第6期第867至871頁，名稱為 「Evaluation of six immunoassays for detection of dengue virus-specific immunoglobulin M and G antibodies」）。登革 熱病毒特異性分析之敏感度，免疫球蛋白M(IgM)約為71 至100%之範圍及免疫球蛋白G(IgG)約為52至100%之範 圍。較佳的，免疫球蛋白M(IgM)約為86至96%之範圍及 φ 免疫球蛋白G(IgG)約為81至100%之範圍。上述測試之總 測試時間約為7至480分。此外，除了膠體金免疫色層分 析試驗（PanBio rapid immunochromatographic test，PanBio RIT)之外，所有測試均需實驗室設備，並且登革熱免疫球 蛋白分析法之敏感度與特異性非常低（分別為75%與52 %)。然而，在上述研究之測試中並未能偵測登革熱特異性 病毒，而是與其他黃病毒交互反應。由於感染急性反應期 (acute phase)(發熱（febrile))僅存在登革熱特異性免疫球蛋 白G(IgG)即表示二級登革熱感染，因此目前早期二級感染 8 200815753 偵測較為困難（2004年ScMlling等人所提出）。 根據血清流行病學研究顯示，二級感染係為經由抗體 依賴增強（antibody dependent syndrome enhancement，ADE) 之出 j&l 性登革熱（dengue hemorrhagic fever，DHF)與登革熱 休克症候群（dengue shock syndrome)之重要危害因子（1973 年Halstead等人及1988年Halstead S. Β·所提出）。對於血 清流行病與病理學研究，初級病毒感染與二級病毒感染間 之變異係十分重要，用以決定過去與目前所感染之登革熱 ⑩血清型。 最廣泛使用之登隔熱診斷技術係為待測樣品 ^ (suspected samples)之血清分析。然而，基於下列數個理由 之考量，上述技術較為複雜：（1)由於缺乏交互保護中和抗 體（cross-protective neutralization antibody)，病患可能有四 登革熱病毒血清型之多重與連續感染；（2)由於原始抗體 (per-existing)與原始抗原（antigenic sin)之存在，多重與連 φ 續黃病毒感染使得變異性診斷更為困難（刺激多數B細胞 株對初級黃病毒感染反應，以在每次連續黃病毒感染中合 成較目前感染病毒親和力為高之初級感染病毒之早期抗 體）；（3)免疫球蛋白G(IgG)抗體對同質（homologous)與異質 (heterologous)黃病毒抗原具有高度交互反應性；及（4)由於 免疫球蛋白G(IgG)長期（long persistence)存在，因此過去、 最近及目前登革熱病毒感染之血清診斷係為困難10個 月’如套膜蛋白/膜特異性捕捉免疫球蛋白G之酵素連結免 疫吸附分析法（Envelope protein/Membrane specific capture 9 200815753

IgG ELISA，E/M specific capture IgG ELISA)所測量，或長 生命週期，如E/M抗原被覆直接免疫球蛋白G之酵素連結 免疫吸附分析法（E/M antigen-coated indrect IgG ELIS A)所 測量）（1996 年 Gubler D.J.發表於 Dengue Bull.第 20 卷第 20_23 頁，名稱為 r Serologic diagnosis of dengue/dengue haemorrhagic fever」，及 1989 年 Innis 等人發表於 Am· J. Trop· Med· Hyg·第 40 卷第 418 至 427 頁，名稱為「An enzyme -linked immunosorbent assay to characterize dengue infections where dengue and Japanese encephalitis co-circulate」）o 因此，藉由金清學而診斷之病毒性感染（viral infection) 中，登革熱病毒感染係最具挑戰性。然而，複雜病毒性抗 原與抗體反應分析之最大進步係藉由登革熱病毒感染之血 清診斷與血清流行病研究中針對不同結構與非結構 (non-structural，NS)蛋白質之各式方法所達成。 血液凝集抑制試驗（hemagglutination inhibition，HAI) 係通常用以偵測初級與二級感染登革熱感染之變異。由於 上述測試先天上之缺點，使得此測試方法較不普遍（1989 年Innis等人所提出，及2003年Shu等人於Clin. Diagn· Lab· Immunol.第 10 卷第 622-630 頁，名稱為「Comparison of capture immunoglobulin M (IgM) and IgG enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and nonstnxctural protein NS1 serotype-specific IgG ELISA for differentiation of primary and secondary dengue virus infections」）。相反的， 200815753 由於高敏感度與特異性，捕捉免疫球蛋白Μ與G之酵素 連結免疫吸附分析法（caPture IgM and !gG ELISAs)成為偵 測初級與二級感染變異最有利之分析方法（1989及1997年 Innis等人所提出）。然而，對於血清流行病研究中之登革 熱感染血清型，由於登革熱血清型抗體間之交互中和抗體 (cross-neutralizing)，因此捕捉免疫球蛋白Μ之酵素連結 免疫吸附分析法（capture IgM ELIS Α)與免疫球蛋白G之！| 素連結免疫吸附分析法（IgG ELIS A)均非最有效之方法。 馨 病毒中和測試（virus neutralization test，VNT)係為現 今基本標準技術（gold standard technique)，可用以區別登 革熱與其他黃病毒（2002年世界衛生組織（WHO)手冊，名 稱為「Dengue and dengue haemorrhagic fever」，相關網址 為 http://www.who.int/inf-fs/en/factl 17>htmn。上述病毒中 和測試（VNT)亦可用以鑑別登革熱血清型（1-4血清型）。提 高血清抗體以對抗中和所有登革熱金清型之病毒，及利_ φ 可中和異質病毒之高劑量中和同質病毒之其他黃病毒 (1994年Makino等人所提出）。然而，在感染早期所產生 之抗登革熱抗體（IgM)會同時提高中和抗所有登革熱灰$ 型至相同程度，因此此時期之二級感染無法由病毒中和_ 驗（VNT)所測定。另一方面，病毒中和試驗（VNT)具有下^ 缺點： 1. 需要經驗豐富的實驗室與訓練過的研究員。 2. 測試所需之時間超過一星期。 3·由於登革熱交互反應之抗體，少於六個月之登革熱 11 200815753 感染病患血清，無法鑑別其血清型。 4. 難以债測多重登革熱血清型。 5. 10 %的金清在細胞培育上具有毒性反應（toxic effect) 〇 1989年Innis等人提出，利用決定登革熱病毒免疫球 蛋白M(IgM)抗體比例至登革熱病毒免疫球蛋白G(IgG)抗 體單位，作為初級與二級感染之初級建議分類（first proposed classification)。根據上述顯示，初級登革熱病毒 • 感染病患急性反應期之血清具有較高之免疫球蛋白 M/G(IgM/IgG)比例，反之二級登革熱病毒感染病患具有較 低之免疫球蛋白M/G(IgM/IgG)比例。上述方法有助於登革 熱病患免疫狀態之分析。2003年Shu等人提出將上述方法 變動與簡化以鑑別初級與二級登革熱病毒感染，並且係利 用直接讀取免疫球蛋白M/G(IgM/IgG)比例（>1.2表示初級 感染，或<1.2表示二級感染），而不須經由標準控制之使用 0 而計算抗體單位。 2002年Ludoffs等人指出利用重組抗原（recombinant antigens)鑑別登革熱血清型1至4感染之血清變異 (serological differentiation)。免疫墨點試片法（immunoblot strips)利用標示（dotted)表現於大腸桿菌（五coz7) 之登革熱病毒血清型1至4之B區域（domains)，以從41 初級與二級感染病患之成對（paired)血清樣品中偵測登革 熱血清型特異抗體。然而，雖仍有異質血清型之交互反應， 但是上述結果顯示有93.94%特異性，因此血清型並非適 12 200815753 用於利用此方法鑑別二級感染。 登革熱病毒所面臨之問題與其他黃病毒相同，均為共 用抗原特性（antigenic characteristics)，因而難以準確診 斷。因此目前急需一種快速、可行及簡單之測試，可鑑別 黃病毒血清型間任何感染時期之黃病毒特異性抗體與其他 黃病毒抗體。血清型偵測方法在臨床診斷上扮演重要角 色，用以在血清監測研究（sero-surveillance studies)與疫苗 評估（vaccine diseases)上鑑別黃病毒感染與其他類似黃病 毒之感染性疾病。上述技術有助於將二級感染之早期偵測 導向較佳案例管理、減少致死案例（case fatality)及處理成 本。 【發明内容】 根據本發明之一觀點，本發明提供一種用以偵測標的 (subject)暴露至一黃病毒或其同等物之方法，上述方法包 含·將帶有抗黃病毒免疫球蛋白A捕捉組成物之黃病毒與 同$物之混合物之標的與生物樣品接觸；生物樣品及抗黃 病毋免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物與競爭黃病毒特異性 μ及錢爭黃病毒特錢減試劑之 生物樣品與黃病毒之抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組 成物中，蚊黃病毒特異性結合物所形成之複合物之存在。 八私t月係由於目1急需—種快速、低成本及直接有效 之刀 以決定目前或先前是否曾暴露至普病毒。本 發明特別利用一種競足K届毋不 ，性黃病毒特異性免疫試劑，以與寄 主體（host body)之結八私 "" °物（bonding partner)競爭黃病毒特異 13 200815753 或呈現於I + . 、病毒套膜蛋白之血清型之抗原決定區 (epitope)，^ ^ 、中包含抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成 物之奶口物，其包括其他代表黃病毒感染抗原之黃病毒顆 粒（particles)。 口此’輿其他一般與通常所使用之黃病毒免疫球蛋白 G(IgG)直接歲捕捉之酵素連結免疫吸附分析法（ELISA)相 較，本發日月Ss 項示極高特異性與敏感度，並且提供一平台專 ;疋義彳壬〜感染時期之抗黃病毒所產生之抗體（IgG)或 其相關免疫產物。 較佳的’上述黃病毒係選自由黃熱病毒（yellow fever virus，YF virus)、登革熱病毒（dengue fever virus)、日本腦 炎病毒（Japanese encephalitis virus，JE virus)、西尼羅河病 毒（West Nile virus，WN virus)、C 型肝炎(Hepatitis C virus)、墨萊溪谷腦炎病毒（Murray Valley encephalitis virus) 及聖路易斯腦炎病毒（St. Louis encephalitis)所組成之群組 之一。 根據本發明之另一觀點，本發明提供一種用以偵測標 的暴露至黃病毒或其同等物之套組，上述套組包含：黃病 毒之抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物；競爭性黃病 毒特異性免疫試劑；以及至少一偵測試劑，用以在競爭性 黃病毒特異性免疫試劑中，偵測生物樣品與黃病毒之抗黃 病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物中結合物所形成之複 合物。 本發明亦提供適用於本發明方法之上述套組中之個別 200815753 組成物，其包含固態支撐物（solid supports)，例如固定抗 黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物之微孔盤（microtitre plate)及頌酸纖維膜（nitrocellulose membranes) 〇 本發明更提供一種於定義位置（例如地理區域 (geographic area)、住宅區（11〇118丨叩681&16)、運輸裝置或醫 學處理中心或機構）内，評估一或多標的暴露至黃病毒或其 同等物之相關風險（relative risk)，包含：a)由定義位置内 之代表性群體中選擇樣品；以及b)評估樣品群體對黃病毒 ® 或其同等物個別分群之暴露證據之方法，上述方法包含： 1)將生物樣品與黃病毒或其同等物之組成物來源反應，以 形成生物樣品内上述組成物與其標的來源連結物間之複合 物；2)決定複合物之存在，其中上述複合物之存在代表標 的暴露至黃病毒或其同等物；以及c)評估定義位置内暴露 之相關風險。 風險分析利用電腦可讀取形式之軟體處理。因此，本 φ 發明更可提供一種電腦可讀取程式及電腦，包含適用於分 析標的或標的群體之暴露、或標的或標的群體暴露至黃病 毒或其同等物風險。 另一方面，本案申請人亦提供相關參考文獻一併作為 參考，如下·· 1988年Gubler等人發表於〇/Me International Symposium on Yellow Fever and Dengue % 291 至 322 頁，名稱為「Laboratory diagnosis of dengue and dengue hemorrthagic fever」； 2002 年 Gubler 發表於 A Mz’croMo/ 第 10 卷第 2 期，名稱為「Epidemic dengue/dengue 15 200815753 hemorrhagic fever as a public health，social and economic problem in the 21st century」；1993 年 Simmons 等人發表於 Southeast Asian J Trop Med Public Health % 2A 卷％ A 熟赛 742 至 746 頁，名稱為「A rapid membrane based immunobinding assay for the detection of dengue virus in tissue culture」；2000 年 Wu 等人發表於 C//« /mmwwo/ 第 7 卷第 1 期，名稱為「Comparison of two rapid

diagnostic assays for detection of immunoglobim M antibodies to dengue virus」；2001 年 Nawa 等人發表於 J Virol Methods第92卷第1頁第65至70頁，名稱為 「Development of dengue IgM-capture enzyme-linked immunosorbent assay with higher sensitivity using monoclonal diction antibody」；及 1974 年 Hasted 發表於 dm J TVo/7 Med办畧第23卷第5期第974至982頁，名稱為 「Etiologies of the experimental dengues of Siler and

Simmons」0 【實施方式】 根據本發明之一觀點，本發明提供一種用以偵測標的 (subject)暴露至黃病毒或其同等物之方法，上述方法包 含：將帶有抗黃病毒免疫球蛋白A捕捉組成物之黃病毒與 同等物之混合物之標的與生物樣品接觸；生物樣品及抗黃 病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物與競爭黃病毒特異性 免疫試劑進行反應；以及在競爭黃病毒特異性免疫試劑之 生物樣品與黃病毒之抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組 16 200815753 成物中，決定黃病毒特異性結合物所形成之複合物之存在。 本發明係由於目前急需一種快速、特異性、低成本及 直接有效之分析方法，以決定目前或先前是否曾暴露至黃 病毒。本發明利用抗黃病毒免疫球蛋白A(anti-flavivirus IgA)較佳的從粗細胞溶解物（crU(Je cell lysate)中捕捉黃病 毒抗原。上述黃病毒感染之細胞來源溶解物包含黃病毒組 成物之混合物，較佳的係為免疫性組成物（immunogenic components)。上述標的包含動物，如哺乳類動物，特別是 • 人類，篩選在競爭性特異性免疫試劑中生物樣品之黃病毒 特異性連結物（binding partners)之存在。上述較佳連結物係 標的來源連結物（subject-derived binding partners)，包含但 不限定於免疫反應分子（immuninteractive molecules)。較佳 的，免疫反應分子係特別是免疫球蛋白G(IgG)或免疫反應 片段（fragment)之抗體。再者，利用黃病毒特異性免疫試劑 作為生物樣品中黃病毒特異性連結物之競爭者 ⑩ （competitor) ’以増進其特異性（specificity)。上述連結物或 競爭性黃病毒特異性免疫試劑之區分（identification)係利 用標的目前或先前暴露至黃病毒或其同等物，而與抗黃病 毒免疫球蛋白A(lgA)捕捉組成物形成一複合物（complex) 之證據。因此，本發明結合抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA) 捕捉組成物與競爭性酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA)。 因此’與其他一般與通常所使用之黃病毒免疫球蛋白 G(IgG)之酵素連結免疫吸附分析法（ELIS A)相較，本發明顯 示極高敏感度與特異性，並且提供一平台專用於定義任一 17 200815753 感染時期之抗黃病毒所產生之抗體（IgG)或其相關免疫產 物0 在本發明之敘述及說明書申請專利範圍中，所使用之 名詞「包含（comprise)」及此名詞之變化用法，例如「包含 (comprising)」與「包含（comprises)」並非用以排除其他 附加物（additives)、組成物（components)、整體（integers)或 步驟。 黃病毒（Flaviviruses) ® 在說明書與申請專利範圍中所使用之名詞「黃病毒 (flaviviruses)」或「黃病毒（flaviviruse)」，包含黃病毒之黃 病毒科（Flaviviridae family)，包括對人體致病之黃病毒屬 (Flavivirus genus)，並且通常藉由節肢動物例如蚊 (mosquitoes)與蝨（ticks)所傳播。上述病毒會導致黃熱病 (yellow fever)、登革熱（dengue fever)及曰本腦炎（JE)疾 病。黃病毒之分類係由屬（genus)所組成，且表示在核酸與 ⑩胺基酸序列層級（level)上保有特定序列。黃病毒屬所包含 之病毒包含但不限定於黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅河 病毒及日本腦炎病毒。由於核酸與胺基酸層級之相似性 (similarities)，上述病毒可表現抗原性（antigenicity)、傳播 與疾病上之相似性。 登革熱病毒（Dengue Virus) 在說明書與申請專利範圍中所使用之名詞「登革熱病 毒（dengue virus)」係指與登革熱感染有關之所有登革熱血 清型（登革熱第一型（Den-Ι)、登革熱第二型（Den-2)、登革 18 200815753 熱弟二型（Den-3)與登革熱第四型（Den_4))。本發明係適用 於债測登革熱病毒感染或暴露於任何標的，包含人類、非 人類之動物及實驗室動物。根據本發明較佳之標的為人 類。然而’本發明包含可回應（reSp〇n(J)登革熱病毒或其同 等物感染或免疫反應之任何標的。 登革熱病毋係定義為核糖核酸（rib〇nucleic acid，RNA) 人類病毒之群組’且其包含大約40-50 nm直徑之套膜顆粒 (enveloped particles)。病毒基因型（genome)係約略為 11 _ kb(1966年St〇Uar等人發表於如第47卷 弟 ό 期弟 709-720 頁’名稱為 r a model of the transmission of dengue fever with an evaluation of the impact of ultra-low volume (ULV) insecticide application on dengue epidemics」）。成熟之病毒粒子（virion)包含異構核殼體 (isometric nucleocapsid)所包覆（encl〇sed)之正股核糖核酸 基因型（positive sense RNA genome)。基因型將大約 11000 φ 核酸之單一開放讀碼區（open reading frame)編碼 (encodes) ’且可解碼為三結構（structure)蛋白質（C-殼體 (capsid)、M_膜（membrane)及 E-套膜（envelope))及七非結構 (non，structural)蛋白質（NS1、NS2a 與 NS2b、NS3、NS4a 與 NS4b、NS5) 〇 登革熱病毒係經由雌性黑斑蚊（Aedes mosquitoes)叮 咬所傳染，通常是埃及斑紋〇4· mosquito)。上述蚊 類係為體型小、黑與白相間、高居家型熱帶蚊（highly domesticated tropical mosquito)，且其將卵產；ίΡΜ主家中與 P付 19 200815753 近盛裝水之人造容器，例如水桶、花瓶及其他盛水容器。 成蚊很少出現於室外；通常出現於陰暗的室内，在白天趁 不注意時叮咬人體或動物，通常最具叮咬能力時係在清晨 與傍晚（1992年Gubler等人及1992年Newton等人所提 出）。雌蚊係為神經性給食者（nervous feeders)，藉由在寄 主身上進行輕微叮咬之過程而散佈，而回到相同或不同寄 主身上以繼續進食。由於上述行為，蚊子通常在單一血液 進食中叮咬多數人，並且會將病毒傳染給多數人（1997年 _ Platt等人發表於第57卷第2期第119 至 125 頁，名稱為「Impact of dengue virus infection on feeding behavior of Aedes aegypti」，及 1997 年 Scott 等人 發表於4m / 第57卷第2期第235至239頁， 名稱為「A fitness advantage for Aedes aegypti and the viruses it transmits when females feed only on human blood」）。上述行為用以解釋流行病發現登革熱主要發生 着於特定地區，例如新加坡，之孩童，根據傳染媒介控制量 測（vector control measures)之適應（adaptation)將改變上述 結果（如前述2001年Ooi等人所提出）。 在感染性雌蚊叮咬後，病毒經過3至14天（平均4至 7天）之内發性培育期（intrinsic incubation period)之後，並 且人會開始經歷急性發熱伴隨其他非特定性病狀與症狀。 在病毒感染期（viraemic period)(大約2至17天之間），病毒 在被感染的動物血液中循環。如在病毒感染期間被未感染 斑紋叮咬，此斑紋在大約10至12天之絕對外發性培育期 200815753 後變為具有感染性，並且能將病毒傳播至其他未被感染之 寄主。在上述的傳播循環中，雖然研究中指出猴子可能被 感染及作為一病毒來源，但是人體仍為主要廣泛散佈 (amplifying)之寄主（1995 年 Putnam 等人、1976 年 Gubler 等人及2002年世界衛生組織研究資料表（WHO fact sheet) 所提出）。 根據感染病毒、寄主年齡與免疫系統條件，登革熱病 毒感染會對人體致病。上述將導致無症狀之病症 (asymptomatic illness)或與流行性感冒症狀類似病症（病毒 性症狀）之登革熱（DF)、出血性登革熱（dengue hemorrhagic fever，DHF)及嚴重（severe)且致命（fatal)之休克型登革熱症 候群（dengue shock syndrome，DSS) 〇 世界衛生組織已設立登革熱之層級標準。登革熱分為 四層級，並且第三層級（grade皿）與第四層級（grade IV)為休 克型登革熱症候群(DSS)(1993年Nimmannitya所提出，及 1997 年世界衛生組織（WHO)之 Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment，preventation and control，2nd ed. World Health Oragization, Geneva，Switzerland) o 第一級（grade I ):具有非特定全身發熱之症狀 (constitutional symptoms)，且此出血性症狀（hemorrhagic manifestation)係為陽性止血帶試驗（positive tourniquet test) 及或容易挫傷。 第二級（grade Π ):除了第一級之症狀，自發性出血 (spontaneous bleeding)會以皮膚或其他出血之形式。 21 200815753 第三級（grade ΠΙ):具有快速而微弱脈搏之循環衰竭 (circulatory failure)，限制血壓或因冷而產生之低企壓、皮 膚冰冷及心神不寧。 第四級（grade IV):無法偵測到血壓或脈搏而發生休克 (上述1997年世界衛生組織（WHO)所提出）。 典型的登革熱係常見於較年長孩童、青少年與成人， 且其並非無症狀（asymptomatic)(1995年Sharp等人所提 出）。上述發熱係突發性（abrupt)高熱、頭痛、肌肉無力酸 痛與關節痛（incapacitating myalgias and arthralgias)、口惡心 11 區吐（nausea vomiting)及療狀或丘療般塊狀紅療（macular or maculopapular rash)(1989 年 Waterman 所提出）。發熱通 常持續5至7天，且伴隨雙相歷程（biphasic course)(鞍脊現 象（Saddle back appearance))(1993 年 Nimmannitya 所提出）。 雖然出血性登革熱（dengue hemorrhagic fever，DHF) 會生生於成人，但其主要仍為小於15歲較年幼孩童之疾 病，且係有關登革熱二級感染（1983年Sumarmo等人及世 界衛生組織（WHO)所提出）。出血性登革熱(DHF)之關鍵期 (critical stage)係在於當溫度變為正常而退熱 (defervescence)之時。由於血管滲透性增加與非正常生理 十亙定（homeostasis)及其他常見出金現象，例如點狀出血 (petechiae)、紫斑（purpuric lesions)及斑狀出血 (ecchymoses)，出血性登革熱（DHF)病症之主要決定因素係 在於血漿滲漏（plasma leakage)。上述症狀加上陽性止企帶 試驗（positive tourniquet test)，將有助於準確診斷出血性登 22 200815753 革熱（DHF)(1998 年 Gubler，D. J·發表於 C7z.n MzcroMo/及ev· 第11卷第3期第480至496頁，名稱為「Dengue and dengue hemorrthagic fever」）。 由於血漿滲漏，休克型登革熱症候群（DSS)係為出血性 登革熱（DHF)之末期，且表現失血性休克（hypovolaemic shock)之症狀（1997年世界衛生組織（WHO)所提出）。休克 型登革熱症候群（DSS)具有四個警告訊息：持續腹痛 (sustained abdominal pain)、持續呕吐（persistent vomiting)、心神不寧（restlessness)或嗜睡（lethargy)及突然 由高熱（fever)轉變為低溫（hypothermia)且冒汗（sweating) 與虛脫（prostration)。有經驗的醫療人員提供早期識別 (recognition)與合適治療可降低休克型登革熱症候群（DSS) 之致死率（fatality rate)至0.2%，但因休克而造成死亡之比 例（mortality rate)超過 40% (1994 年 Nimmannitya 及 1998 年Rigau-Perez JG等人所提出）。 套膜蛋白（E protein)係為最大且僅暴露於病毒表面之 結構蛋白質，且為免疫反應中，例如受體連結（receptor binding)、凝集（haemmagglutination)與中和（neutralization) 反應，最重要之蛋白質。人體感染其中一血清型可提供長 時間對此血清型免疫，但僅對其他血清型具有暫時性保護 作用。 核殼體係為包含套膜與膜蛋白之脂質所圍繞。除了套 膜與殼體蛋白質，登革熱病毒具有七非結構蛋白質NS1、 NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 及 NS5 ° 23 200815753 日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus) 日本腦炎係由已感染之蚊所傳播之疾病。日本腦炎係 為蚊媒傳播性病毒疾病（mosquito-borne virus)群族中之 一，且會影響中央神經系統及導致嚴重併發症（severe complications)，甚至死亡。曰本腦炎係由節歧動物傳染病 毒（arbovirus)之日本腦炎病毒所引起。節肢動物傳染病毒 係由特定無脊椎動物（節肢動物（arthropods))所傳播，通 常是吸血昆蟲（blood sucking insects)。與大部分節肢動物 ⑩傳染病毒類似，曰本腦炎係由已感染之蚊（家蚊（culex Spp)) 所傳播。 上述感染會產生和緩症狀（mild symptoms)或完全沒有 症狀。上述被感染之寄主中會產生嚴重疾病，日本腦炎剛 開始通常與流行性感冒類似之症狀，例如發燒、發冷、疲 倦、頭痛、噁心與嘔吐。早期症狀也可能會產生煩躁 (confusion)與不安（agitation)。上述症狀可能進展為嚴重腦 φ 部（腦炎）感染，且可能有30%之致死率。而在倖存者 (survivors)中，另有30%病患會有永久性神經異常 (permanent neurological sequelae) 〇 本發明亦包含其他導致病毒性腦炎黃病毒。上述病毒 具有相似的疾病情況，並且包含： •聖路易斯腦炎及墨萊溪谷腦炎（St· Louis and Murray Valley encephalitis) •蘇俄春夏腦炎（Russian Spring Summer encephalitis)，且由兹（ticks)所傳播。 24 200815753 上述三種其他腦炎係屬於A族節足動物媒介病毒屬 (Alphavirus genus)，且亦由蚊叮咬所傳播。上述腦炎為西 部、東部與委内瑞拉馬腦炎病毒（Western，Eastern, Venezuelan equine encephalitis virus)腦炎或分別稱為 WEE、EEE及VEE。上述腦炎均發生於北美或南美。亦有 抗EEE與WEE之疫苗。 與曰本腦炎相似，上述病毒通常只產生一般和緩症 狀，類似與流行性感冒之症狀。上述疾病之診斷通常利用 免疫球蛋白M(IgM)捕捉酵素連結免疫吸附分析法（ELISA) 债測血清與腦脊鑛液（cerebrospinal Huid，CSF)中抗體，但 其特異性不佳且費時。雖然有疫苗但其對抗病毒通常是無 效的，除非能夠在被感染數小時内執行注射，因此治療 (treatment)係為主要方式。曰本腦炎病毒並非經由人類之 間互相傳染。日本腦炎病毒之感染通常授予長時間之免疫 性（immunity) 〇 同等物(Equivalents) 在說明書與申請專利範圍中所使用之名詞「同等物 (equivalents)」，係指包含可引起黃病毒或可引起黃病毒之 結構或非結構蛋白之相同或類似反應之相似分子。例如， 在各感染時期由黃病毒所表現之各式抗原，或可導致所有 病毒類似反應之各式病毒粒子或片段。上述反應可為免疫 反應（非臨床反應）或感染性反應（臨床反應）或因接種疫苗 (vaccination)而弓| 起。 暴露（Exposure) 25 200815753 上述標的已暴露至頁病毒’但尚未表現感染之病毒症 狀。本發明之方法偵測可導致感染（臨床或亞臨床 (sub-clinical)或非臨床）之暴露，或可指出先前無症狀之暴 露。 本發明係用以偵測暴露至黃病毒或其同等物。暴露可 能是當下或先前暴露至黃病毒及其同等物。較佳的，上述 暴露足以引起免疫反應或體内反應(respond)，使得引導連 結物（binding partner)反應黃病毒或其同等物。只要標的暴 ⑩露，本發明之方法將可應用於上述之任何暴露時期。較佳 的，上述方法係用以偵測明顯黃病毒感染但無病症與症狀 之暴露。較佳的，上述方法偵測標的在早期急性期之二級 感染之黃病毒感染任何時期之暴露，或晚期恢復期之初級 感染或接種疫苗之暴露至黃病毒或其同等物。上述暴露可 能不會引起黃病毒感染或明顯病症或症狀，但會引起一反 應（respond)使引導連結物。較佳的，上述反應係為免疫反 ⑩應。 ^ M (immune response or immunologic response) 免疫反應 r immune response」 或「immunologic response」係指脊椎動物免疫系統之選擇性反應，並且產 生特殊抗體或抗體及/或毒性細胞（cytotoxic cell)片段對抗 被人體視為入侵之病原菌與抗體。 結合物（binding partner) 因此，在此所使用之名詞「連結物（binding partner)」 係被產生，以對抗外來黃病毒或其同等物之任何分子或細 26 200815753 胞。較佳的，可為免疫反應分子（immunGinteractive ㈣的是，上述連結物係為抗體或其免疫性主 ，，ctlve fragment)或毒性細胞。上述連結物包含可金 :病毋抗原或同等物反應之免疫反應分子病 毒特異性免疫試劑，例如黃病切異性單株抗體，競= 李乂佳之連結物係為免疫反應分子，且 =其r生物:任何分子。較佳的，免疫反應=

產味：：：對抗汽病毒感染或暴露之標的中體液反應所 產生之頁病毒蛋白質之任何部份。

7的疋’連結物係為標的對黃病毒或相義毒組成 斤產生之抗體。然而，亦用於標的抗體之連結物。上述 連結物之實施例係為抗遺傳型抗體（anti_idi〇⑽C an^b〇dles) ’或對抗與標的黃病毒分屬或相關病毒組成物 之特異性抗體。 在黃病毒感染之早期恢復期，從先前黃病毒感染中所 #何生之免疫球蛋自G(IgG)之抗體係m初級黃病毒 感染之指標之-。可利用_抗體與黃病毒分屬組成物所 形成^複合物。在黃病毒特異性或膜特異性之抗原連处 區’黃病毒特異性免疫球蛋白G(igG)與抗原所形成之免疫 $合物表示缺乏競爭性黃財或分屬特異性免疫試劑之附 著。 .在此所使用之名詞「抗遺傳型抗體（anti-idiotypic anhboches)」，係為連結至任何陰暴露至黃病毒屬或其免疫 相關物之分屬所產生任何抗體之特殊抗原$結位置之^ 27 200815753 在此所使用之名詞「抗體（antibody or antibodies)」， 包含所有抗體與包含其功能性部份之抗體片段。名詞「抗 體（antibody)」包含具有輕鏈可變區（light chain variable region)及/或重鏈可變區（heavy chain variable region)之有 效部份之任何單特異性（monospecific)或雙特異性 (bispecific)複合物，以有效連結至具有連結特異性抗體之 抗原連結區（epitope)。上述片段包含至少一重或輕鏈免疫 ® 球蛋白多胜肽之可變區，且包含但不限定於，抗原連結片 段（Fab)、F(ab，）2、可變片段（Fv)。 上述連結物較佳的係為一抗體。特別是，上述連結物 可為黃病毒免疫球蛋白分子或免疫反應部份。較佳的，黃 病毒係為登革熱或曰本腦炎病毒。 生物樣品中所包含之毒性細胞亦可作為連結物。上述 細胞可直接與黃病毒或任何黃病毒或其同等物所感染之細 鲁胞溶解物組成物進行反應。 生物樣品（Biological sample) 本發明之方法係利用由可能暴露至黃病毒之標的所得 之生物樣品，以偵測暴露至黃病毒或其同等物。上述生物 樣品可為體内包含連結物之任何樣品。上述生物樣品係選 自由血液、唾液（saliva)、脊髓液（cord fluid)、B細胞、T 細胞、血漿、血清、尿液（urine)及羊膜液（amni〇tic fluid) 所組成之群組之一。較佳的，生物樣品係為血清、血漿或 唾液。生物樣品最佳地係為血清或唾液。 28 200815753 上述生物樣品較佳的亦由可能暴露至黃病毒之標的中 所得。生物樣品也可事先經過前處理（modified)，例如稀釋 (dilution)、各式成分（斤&〇1;1〇113)之純>[匕（卩1114行〇31^〇11)、离隹心 (centrifugation)與其相似之方式。因此，上述生物樣品可 為均質物（homogenate)、細胞溶解物或由生物體或其組 織、細胞、組成物部份（component parts)、部份（fractions) 或其部份（portion)之標的萃取物。 應可理解生物樣品亦可為缺乏與黃病毒或其同等物反 應之連結物。當標的已暴露至黃病毒或其同等物時，會發 生上述情形。因此，當缺乏連結物的情形下無法形成複合 物時，「決定在生物樣品中存在之黃病毒特異性連結物與抗 黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物間所形成之複合物 之存在」結果為零（zero result)。上述在實施例中所形成之 複合物包含競爭型黃病毒特異性免疫試劑，例如與生物樣 品中與連結物競爭之單株抗體。 生物樣品與細胞溶解物組成物互相接觸時，應該理解 黃病毒之免疫組成物或其免疫相關物較佳的係作為參考指 標，有助於生物樣品中之一或多免疫反應分子與黃病毒之 組成物或其免疫相關物之交互反應。上述交互反應可為， 例如耦合、連結、或其他免疫反應分子與黃病毒特異性免 疫組成物或其免疫同等物間之關聯。 生物樣品係與抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)所捕捉之 黃病毒病毒組成物或其同等物之混合物互相接觸。

抗黃病毒免疫球蛋白A捕捉組成物（anti-flavivirus IgA 29 200815753 captured components) 抗黃病毒免疫球蛋白A (anti-flavivirus IgA)係用以捕 捉黃病毒或膜特異性組成物（membrane specific components)。較佳的，上述組成物係為免疫組成物，且與 黃病毒特異性連結物與競爭型黃病毒特異性免疫試劑有 關。抗黃病毒免疫球蛋白A (anti-flavivirus IgA)可利用已 知之製造抗原之抗體方式製備。較佳的，免疫球蛋白A (IgA) 係由人體抗免疫球蛋白A (anti-human IgA)所捕捉。 本發明特別使用抗黃病毒免疫球蛋白A捕捉組成物 (anti-flavivirus IgA captured components)係作為對抗試驗 中失去敏感度之免疫球蛋白G(IgG)或M(IgM)。目前已得 知利用免疫球蛋白A(IgA)捕捉黃病毒組成物可增進jk清 試驗之敏感度。免疫球蛋白A(IgA)捕捉黃病毒組成物由最 近之感染與暴露中’與更多具有特異性之連結物進行反應。 當標的暴露至黃病毒時，體内免疫系統開始反應以移 φ 除病毒。上述反應引起連鎖免疫反應，以反應黃病毒或其 同等物所表現之多血症（plethora)抗原。因此，本發明所提 供之組成物代表暴露至黃病毒之任何時期，且可為抗原或 包含具有所有黃病毒或血清型特異性之抗原連結區之抗原 部份。上述組成物可從包含黃病毒本身之任何來源所衍 生。然而’上述組成物係由感染黃病毒之細胞所衍生。亦 可由黃病毒所感染之細胞培育、組織或生物樣品所衍生。 較佳的’上述組成物係由細胞溶解物中黃病毒感染之細胞 溶解物之細胞培育所衍生。 30 200815753 在本發明中，細胞溶解物較佳的包含黃病毒免疫廣 (immunogens)之混合物，上述黃病毒免疫原包含病毒粒子 (virus particles)及結構與非結構病毒蛋白質。上述免疫％ 合物係由抗黃病毒免疫球蛋白A (anti· flavivirus IgA)所捕 捉。較佳的，黃病毒免疫抗原係為細胞溶解物之免疫組戍 物，且可與引起生物樣品中黃病毒特異性連結物，及競爭 型黃病毒特異性免疫試劑之免疫反應。上述細胞溶解物提 供病毒組成物，較佳的為黃病毒之任何生長時期所產生之 免疫組成物。 本發明之細胞溶解物可為黃病毒之特異性膜或其同等 物所感染之任何細胞來源。較佳的，上述細胞係為黃病毒 或其同等物之體内培育（M v/vo)所感染。 任何形式之細胞均可被感染。較佳的，上述細胞形式 係為黃病毒可感染與培育之細胞。然而，較佳的根據本發 明之方法感染上述可產生高量（high titres)黃病毒之細胞， 包含但不限定於，通常使用之持續性細胞株（continuous cell lines)(例如，Vero 細胞株（Vero Cell Lines(Vero-PM strain))、CV-1 細胞、LLC-MK2、C6/36 及 AP-61 細胞）， 初級細胞株（primary cell lines)，例如致命之Rhesus lung (FRhL-2)細胞、BSC-1細胞與MRC-5細胞、或人類雙倍纖 維母細胞（human diploid fibroblasts)。細胞種類之組合係為 本發明所預設（envisaged)。C6/36或AP-61細胞係由黃病 毒與同等物所感染。較佳的，上述細胞形式為C6/36細胞。 細胞可培育至任何時期，較佳的係培育至黃病毒可建 31 200815753 立（establish)與感染細胞之時期。較佳的，上述細胞係培育 直至細胞培育中出現細胞病變作用（cytopathic effect)，因 而細胞中之病毒可主動感染。 在此觀點下，上述細胞係由已知之方式所溶解。較佳 的，利用包含清潔劑，例如包含Trition X 100，之低滲透 壓緩衝液（hypotonic buffer)，以提供不影響黃病毒或其同 等物之免疫原之溶解緩衝液，但不會活化（inactivates)活病 毒粒子。 應當理解上述細胞溶解物包含具有結構與非結構黃病 毒抗原，例如所有黃病毒的病毒粒子，之病毒免疫組成物 之混合物。上述登革熱病毒可選自由登革熱第一型 (DEN-1)、登革熱第二型（DEN-2)、登革熱第三型（DEN-3) 及登革熱第四型（DEN-4)所組成之群組之一。本發明利用 生物樣品中所產生回應暴露至黃病毒或同等物之連結物混 合物以定義抗原混合物。 較佳的’上述黃病毒係為登革熱病毒或日本腦炎病毒 (JE virus) 〇 較佳的’黃病毒或登革熱特異性組成物係為黃病毒或 登革熱病毒之結構或非結構蛋白質。結構蛋白質較佳的係 選自由C·殼體（capsid)、]y[•膜（membrane)及E·套膜 (envelope)蛋白質所組成之群組之一，並且可為抗黃病毒免 疫球蛋白A(IgA)所捕捉。非結構蛋白質較佳的係選自由 NS-1、NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b 及 NS-5 所組 成之群組之一。 32 200815753 上述溶解物可利用任何方式來處理。溶解物較佳的定 義為將核與細胞片段(cellular debris)及全部黃病毒粒子移 除。溶解物可被完全作用（aliquoted)，且儲存於-70°C至-80 °C以供使用。 對於登革熱病毒，習之技術係利用特異性登革熱抗原 之登革熱第一、二、三及四型（DEN-1、2、3及4)(存在於 感染登革熱細胞之懸浮液（supernatant))，以偵測代表登革 熱病毒感染之抗體。然而，本發明並未單獨使用上述抗原， ® 但是利用黃病毒分子/免疫原（存在於感染黃病毒之細胞， 且包含黃病毒粒子與其他免疫組成物，較佳的為結構與非 結構蛋白質）之混合物對抗因黃病毒暴露所產生之抗體。 競爭性黃病毒特異性免疫試劑（Competing Flavivirus specific immunological agent) 免疫試劑，較佳的為抗體或單株抗體，用以與生物樣 品中之連結物競爭。免疫試劑亦與黃病毒特異性組成物進 φ 行反應。任何免疫試劑係對黃病毒或黃病毒之抗原連結區 (epitope)具有特異性。一般而言，免疫試劑係對黃病毒之 病毒套膜部份上之抗原連結區（epitope)具有特異性。較佳 的，競爭性黃病毒免疫試劑係對抗黃病毒免疫球蛋白A捕 捉組成物（anti_flavivirus IgA captured component)具有特異 性。 由於免疫試劑與黃病毒特異性連結試劑競爭，因此免 疫試劑與黃病毒特異性連結試劑競爭至少一或相同的抗原 連結區。因此，免疫試劑較佳的係對抗黃病毒免疫球蛋白 33 200815753 A 捕捉組成物（anti-flavivirus IgA captured component)具有 特異性。免疫球蛋白A捕捉組成物（IgA capture(j component) 與焉特異性免疫試劑之結合將有助於對黃病毒屬膜之試驗 具有特異性。 矛J α爭型黃病毒特異性免疫試劑特異性之層級 (degree) ^力㈣驗中之特異性。冑爭型黃病毒特異性免疫 試劑較佳的传 ’τ、馬一抗體，例如多株抗體（p〇lyCl〇nal antibody)或單株 认此廿十主 几體（m〇noclonal antibody)。單株抗體較佳 的對頁病毒之抗馬$ ^ I$人 專連結區具有特異性，更佳的對抗黃病毒 免疫球蛋白A 4 用提組成物（anti-flavivirus IgA captured component)具有特異性。 由於已知括搭 L/ . _ 眾之抗體增加，便可定義（identified)組成 物之抗原。 亦可使用. 触^七+ 何省知之製備黃病毒之病毒抗體或單株抗 體之方法。 複合物形成（C〇mplQ) ,f t成物係與生物樣品接觸，使於生物樣品中形成 組成物與連結物夕> Λ Λ 包含但不限^ 物。黃病毒粒子之免疫原，較佳的 病毒免疫球蛋白二具有黃病毒特異性抗原連結區之抗黃 α ^ ^ ^ ^ AdgA)所捕捉之結構與非結構蛋白質，並 且與連、、、口物或競奉 ^田m ^ 于坦更病毒特異性免疫試劑形成複合物。 特吳性運結物你i H ^廿— 馬生物樣品中之抗體或其片段。當標的已 暴露至頁病毒/對龙 J汽病毒致免（immunized)時，上述情況才 會發生。 34 200815753 上述複合物較佳的係與抗體間形成，免疫球蛋白 G(IgG)較佳的對黃病毒屬膜或其同等物、及抗黃病毒免疫 球蛋白A(IgA)捕捉黃病毒病毒組成物具有特異性。 連結物亦可為毒性細胞，例如生物樣品中可與黃病毒 免疫原反應之毒殺型T細胞（cytotoxic T-cell)。 如果組成物上相同之抗原連結區未被佔用（free)時，競 爭型黃病毒或膜特異性免疫試劑亦形成與組成物競爭之複 合物。連結物與免疫試劑對相同抗原連結區具有特異性， ® 因此當競爭開始係表示連結物存在且已暴露至黃病毒。 本發明之方法係在生物樣品中偵測競爭型黃病毒或具 _ 有黃病毒特異性連結物之膜特異性免疫試劑。競爭型免疫 試劑與黃病毒或膜特異性連結物競爭黃病毒感染細胞所衍 生之細胞溶解物中黃病毒抗原組成物、或利用抗黃病毒免 疫球蛋白A(IgA)已捕捉之其同等物。上述複合物包含一或 多連結物連結由黃病毒或其同等物所衍生之一或多組成 • 物。 生物樣品係與黃病毒或其同等物所衍生之組成物接觸 足夠的時間與條件，使複合物穩定形成且抑制競爭性免疫 試劑，例如黃病毒特異性或任何屬之膜特異性之單株抗 體，之附著（attachment)。 當附著時，加入競爭性黃病毒特異性免疫試劑。因此， 較佳的執行一預培育步驟（pre-incubation step)，在加入免 疫試劑之前，連結物與組成物形成一複合物。然而，亦同 時加入上述組成物。 35 200815753 本發明較佳的係利用黃病毒特異性或任何特定膜特異 性抗體，以與連結物，例如抗黃病毒特異性或寄主體内任 何特殊膜特異性免疫球蛋白，競爭一抗原連結區，並且上 述抗原連結區對黃病毒或屬之任何特殊膜、或由細胞溶解 物所衍生黃病毒之套膜蛋白所表現之血清型具有特異性， 其中包含具有代表黃病毒感染之其他抗原間之黃病毒粒子 之黃病毒免疫組成物混合物。 本發明之方法與套組係用以偵測組合物與連結物所 ® 形成之複合物，且代表黃病毒感染。在黃病毒感染之時程 (course)中產生上述組成物與連結物。 依據本發明之另一觀點，上述生物樣品可應用至一固 態支撐物（solid supports)，例如但不限定於，确酸纖維膜 (nitrocellulose membranes)或塗佈（coated)抗黃病毒免疫球 蛋白A(IgA)之聚苯乙烯板（polystyrene plate)。固態支撐物 亦具有人類抗免疫球蛋白A(IgA)所捕捉及黃病毒所衍生 φ 或應用至其同等物之組成物。從黃病毒或其相動所衍生之 組成物係與生物樣品接觸足夠的時間與條件，使複合物在 黃病毒特異性之競爭性免疫試劑或任何屬存在下穩定形 成。當複合物形成時，加入偵測系統將有助於偵測複合物 中免疫試劑之特異性連結。 決定複合物之存在 可利用一般習知方法或熟知該項技術者所已知之方 法，偵測上述黃病毒衍生之抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA) 捕捉黃病毒之病毒成分與黃病毒特異性連結物，例如免疫 36 200815753 反應分子或黃病毒特異性免疫試劑，之間所形成之複合物。 應可理解，偵測抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉成 分、連結物與黃病毒特異性免疫試劑，例如由複合物所產 生之單株抗體且表示生物樣品中黃病毒感染之有效方法， 包含但不限定於免疫試驗分析法（immunological assays)， 例如免疫轉潰法（immunoblotting)、免疫細胞化學法 (immimocytochemistry)、免疫組織化學法 (immunohistochemistry)、抗體親和力色層分析法 • (antibody-affinity chromatography)、西方轉印分析法 (western blot analysis)、或習知技術中上述或其他技術之變 更（variations)或結合。 在一較佳實施例中，上述偵測方法更使用偵測試劑 (detection agent)，例如特異性抗體與抗酵素連結之抗體， 或利用免疫試劑直接與受體群（receptor group)，例如酵 素，連結。適合的酵素為可與競爭性組成物形成複合物之 φ 馬辣根過氧化物（horse radish peroxide，HRP)。為了增加 特異性，亦可使用單株抗體。 本發明包含使用黃病毒或具有受體群之黃病毒膜特異 性免疫試劑。上述使用可增進試驗速度。亦可減少所需步 驟，以定義複合物之形成。適合的受體群係為酵素，例如 馬辣根過氧化物（HRP)。亦可使用其他習知技術所已知之 適合的受體群。 由細胞溶解物之組成物與連結物所形成之複合物可利 用包含受體群之偵測試劑偵測，並且特異性連結組成物/ 37 200815753 連結物之複合物。上述之偵測試劑可包含，例如黃病毒特 異性或由其他種類動物所衍生之膜特異性抗體、或其他對 連結物具有特異性之試劑，例如抗免疫球蛋白（如抗體）、 蛋白質G、蛋白質A或凝集素（lectin)。亦可選擇性使用競 爭性試驗，其中偵測試劑可連結由黃病毒膜所衍生之抗 原，並且係利用受體群作為標示，使細胞溶解物之固定組 成物（immobilized component)與生物樣品之連結物結合。 生物樣品中連結物之範圍（extent)抑制已標示之黃病毒或 胃黃病毒膜特異性偵測試劑連結至固定成分，代表生物樣品 之連結物與固定組成物連結之反應性（reactivity)。 、 在一較佳實施例中，偵測試劑係為抗體或二級抗體或 其抗原連結片段，可與生物樣品之連結物連結。上述抗體 可利用熟知該項技術者所已知之方法來製備（參考如1988 年 Cold Spring Harbor Laboratory 由 Harlow 與 Lane 所提出 之 r Antibody: A Laboratory Manual一般而言，為了 φ 產生重組抗體（recombinant antibodies)，可利用細胞培育技 術產生上述抗體，包含產生單株抗體，或藉由抗體屬感染 適合的細菌或哺乳類細胞寄主。 二級抗體可連結添加至複合物之標示（label)，以利於 偵測。上述標示之範圍提供一種可使用之偵測訊號。上述 標示可選自由色原體（chromogen)、酵素、催化劑 (catalyst)、螢光基（flurorophore)及直接可見之標示（direct visual lable)所組成之群組之一。在直接可見之標示中，可 由膠狀（colloidal)金屬或非金屬粒子、染劑粒子（dye 38 200815753 particle)、酵素或受質（substrate)、有機聚合物（organic polymer)或凝膠粒子（latex particle)。在美國專利第 4,366,241、4,843,000及4,849,338號中，已揭露多數適合 做為標示之酵素。在本發明中適合的酵素包含鹼性磷酸酶 (alkaline phosphates)、馬辣根過氧化酶（horseradish peroxidase)，較佳的為馬辣根過氧化酶。酵素標示可於溶 液中單獨使用，或與二級酵素一起使用。在本發明中，二 級抗體附著至馬辣根過氧化酶，與其受質鄰苯二胺（OPD) 胃或二胺基聯苯胺（DAB)進行反應，且產生可直接觀察而偵 測之顏色變化，以達到偵測由免疫原與競爭性黃病毒或黃 _ 病毒膜特異性免疫試劑，例如黃病毒或其任何屬特異性之 單株抗體，所形成之複合物。 抗黃病毒免疫球蛋白A捕捉組成物之製備（anti-flavivirus IgA captured component) 在一較佳實施例中，所述之方法係有關使用由黃病 0^ 毒、黃病毒屬之分屬或抗貫病毒免疫球蛋白A捕捉成分 (anti讓flavivirus IgA captured components)(在]J：匕戶斤使用之 「組成物（components)」或「細胞溶解物之組成物 (components of the cell lysate)」，可互相交替使用）所感染 細胞衍生之細胞溶解物，固定於一固態支撐物，例如聚苯 乙烯或硝酸纖維膜，以與生物樣品中之連結物連結。 根據本發明之另一觀點，本發明提供一種固態支撐 物，適用於上述偵測標的暴露至黃病毒或其同等物之方 法，上述方法包含：將標的之生物樣品與黃病毒或同等物 39 200815753 之抗黃病毒免疫球蛋白A捕捉成分之混合物接觸；提供生 物樣品與抗黃病毒免疫球蛋白A捕捉成分至競爭性黃病毒 特異性免疫試劑；決定生物樣品中黃病毒特異性連結物與 競爭性黃病毒特異性免疫試劑中抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉成分之間所形成之複合物之存在；上述支撐 物包含固定於上述支撐物之抗黃病毒免疫球蛋 白A(IgA)捕捉成分。 上述支撐物可為熟知該項技術者所已知之任何材料， 可附著至連結物或細胞溶解物之組成物。例如，固態支撐 物可為微孔盤（microtitre plate)中之試驗孔（test well)、石肖酸 纖維膜（nitro cellulose)或其他適合之膜。上述支撐物可選擇 性為微珠（bead)、圓盤（disc)，例如玻璃、纖維玻璃 (fiberglass)、凝膠（latex)或塑膠材料，例如聚苯乙烯 (polystyrene)或聚氣乙稀（polyvinylchoride)。支撐物亦可為 例如美國專利第5,359,681號所揭露之磁性物質或光纖感 測器（fiber optic sensor) 〇 連結物或細胞溶解物之組成物利用熟知該項技術者所 熟知且詳細敘述於專利與科學文獻之方法，固定於固態支 撐物之上。在本發明之内容中，名詞「固定（immobilization)」 係指免疫吸收（immuno-absorption)或非共價連結 (non-covalent association)，例如吸附（adsorption) ’ 及共價 附著（covalent attachment)(可為抗原或核酸與支樓物之官 能基（functional groups)間之直接連結（Hnkage) ’或利用父 互連結試劑（cross-linking agent)之連結）。固定 200815753 (immobilization)係利用將抗體塗佈（coated)微孔盤之孑L (well)或簡易吸收至膜之免疫吸收（immuno-absorption)。在 上述實施例之合適緩衝液中，利用預先塗佈抗體充足時間 量之支撐物，接觸連結物或細胞溶解物之組成物而達到吸 附（adsorption)。上述接觸時間可隨溫度而變動，通常約為 1小時或隔夜(over night)。 連結物、抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉成分或黃病 毒或模特異性免疫試劑之免疫附著先利用具有與已塗佈抗 * 體反應之雙功能性試劑之支撐物與連結物或組成物之免疫 組成物，例如非特異性抗原連結區，進行反應。例如，連 結物、抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉成分或黃病毒特異 性試劑可免疫性地（immunologically)附著至具有利用抗-抗體（anti-antibody)塗佈之適合抗體之支撐物。 詳細程序說明 本發明中之敘述係僅用以說明本發明之較佳實施例， φ 但不限定於下述及登革熱病毒。登革熱病毒係僅為用以說 明本發明之黃病毒之一較佳實施例。 上述試驗可利用二步驟三明治分析法（two-step sandwich assay)來進行。上述試驗可先利用將已固定至固 態支撐物（可為微孔盤之孔）之生物樣品中之登革熱特異性 連結物與細胞溶解霧之組成物互相接觸，使組成物可固定 至連結物。未連結之樣品可從已固定之複合物中移除，且 加入一偵測試劑（二級抗體較佳的可連結至連結物或包含 受體群之組成物）。利用適合的特異性受體群之方法，決定 41 200815753 上述偵測試劑維持連結至固態支撐物之數量。 當連結物或細胞溶解物之組成物如前述固定至固態支 撐物上時’阻斷（bioeking)支樓物上殘留（reniaining)之連結 位置。可利用任何熟知該項技術所已知之適合阻斷試劑 (blocking agent)，例如牛血清白蛋白（bovine serum albumin) 或具有Trition X 100或Tween 20TM之護膚乳液（skin milk)(St· Louis，Μο·之 Sigma Chemical Co·所生產）。固定 之連結物或組成物分別與細胞溶解物之組成物或連結物進 ’ 行培育（incubation)，使連結物與組成物間形成複合物。連 結物與組成物亦可利用合適之稀釋緩衝液稀釋，例如具登 . 革熱抗體陰性人類血清之構酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS)，及培育（incubation)前之 Trition X 100或Tween 20。一般而言，適合的接觸時間（例如培育時 間（incubation time))較佳的係為30分，且可使細胞溶解物 之組成物連結至已固定之連結物，或競爭型免疫試劑，例 • 如登革熱抗體，較佳的加入單株抗體至上述混合物之競爭 試驗，再繼續反應30分。競爭型免疫試劑具有直接連接之 受體群。較佳的，接觸時間足以達到連結已附著登革熱抗 原之標的抗原連結區至少約95%之連結與未連接連結物 或細胞溶解物組成物之平衡（equilibrium)。熟知該項技術 者應可理解，必需達到經過一段時間連結發生程度（level) 之試驗而決定。在室溫，培育時間大約需30至60分。 利用適合緩衝液，例如包含0.05% Tween 20】或Tween 80之磷酸鹽緩衝液（PBS)，清洗以移除未連結之組成物。 42 200815753 债測試劑可連結至細胞溶解物之組成物或連結物及包含一 受體群，再加至上述固態支撐物。偵測試劑係利用與已固 定連結物組成複合物培育充足的時間。適合的時間通常由 經過一段時間連結發生程度之試驗而決定。將未連結之偵 測試劑移除，並且利用受體群偵測已連結之偵測試劑。上 述用以偵測受體群之方法係依據受體群之本質（nature)。 受體群選擇性可直接連結至免疫試劑。因此受體群可 立即被彳貞測。對於輻射性群（radioactive groups)，通常利用 ® 閃爍計數器（scintillation counting)或自動放射攝影方法 (autoradiographic method)。分光光度法（spectroscopic method)通常利用偵測染劑（detect dye)、冷光基 (luminescent groups)、呈色酵素（chromogenic enzyme)與螢 光基（fluorescent groups)。呈色酵素包含，但不限定於，過 氧化酶（peroxidase)及驗性鱗酸酶（alkaline phosphatase)。螢 光基包含，但不限定於，異硫氰酸鹽螢光素（fluorescein φ isothiocyanate(FITC))、四曱基異硫氰酸羅達明 (tetramethylrhodamine isothiocyanate(TRITC))、羅達明 (rhodamine)、Texas Red 及藻紅蛋白（phycoerythrin)。生物 素（biotin)可利用耦合至不同受體群（通常是輻射或螢光基 或酵素）之抗生物素蛋白（avidin)而偵測。酵素受體群通常 利用分光光度或其他分析反應產物之後，加入受質（通常反 應特定之時間）而偵測。上述受質係可選自由 4-chloro-l-napthol(4CN)、二胺基聯苯胺 (diaminobenzidine(DAB))、aminoethyl carbazole(ACE)、 43 200815753 2,2’ azino-bis (3 _ethylbenzothiazoline_6-sulfonic acid)(ABTS)、鄰苯二胺（ophenylenediamine(OPD))及四曱 基聯苯胺（tetramethyl benzidine(TMB))所組成之群組之一。 亦可將超過一受體群耦合至偵測試劑。在一實施例 中，多數受體群係耦合至一偵測試劑分子。在另一實施例 中，超過一受體群可耦合至一偵測試劑。如不考慮特殊實 施例，超過一受體群之偵測試劑可利用各式方法製備。例 如，超過一受體群可直接辆合至偵測試劑或可提供附著 _ (attachment)至多數位置（multiple sites)之連接者（linkers)。 在一相關之實施例中，所述之方法可利用聚苯乙烯板 或流道（flow-through)或試片試驗（strip test)之形式來進 行，其中生物樣品之連結物或組成物係利用抗登革熱抗體 固定或固定於膜，例如硝酸纖維膜，之上。舉例而言，在 流道（flow-through)試驗中，當樣品通過膜時，組成物可連 結至已固定之連結物。當樣品通過膜時，生物樣品中之連 φ 結物可選擇性連結至細胞溶解物已固定之組成物。當包含 偵測試劑之溶液通過膜時，二級且已標示之偵測試劑可連 接至連結物-組成物之複合物。利用上述方法偵測已連結之 偵測試劑。 試片試驗（strip test)之形式中，膜之一端係連結至細胞 溶解物之組成物，而另一端係浸潰於包含生物樣品之溶液 中。生物樣品中之連結物係沿膜通過包含偵測試劑之區 域，且到達已固定組成物之區域。在已固定之連結物-組成 物之複合物區域之偵測試劑濃度係代表生物樣品中連結物 44 200815753 之存在。在此位置之彳貞測試劑濃度產生一圖案（pattern)， 例如可目視（visually)讀取之線條（line)。未出現上述圖案表 示陰性結果（negative result)。一般而言，當生物樣品包含 足以於三明治試驗中產生陽性結果（positive result)之連結 試劑之程度時，選擇連結物固定至膜或聚苯乙烯板之數 量，以產生可目視辨認（discernible pattern)之圖案。通常可 利用非常微量之生物樣品來進行上述試驗。 在試片試驗或浸潰片試驗(dipstick test)之簡單形式 (version)中，細胞溶解物之組成物可固定至膜，例如硝酸 纖維膜。膜之試片可放置（subjected)至生物樣品中以形成 組成物與生物樣品中連結物間之複合物。可利用上述任何 方法中所述之偵測試劑，例如單株抗體，偵測上述複合物。 上述浸潰片試驗可提供先前暴露之快速標示，而無須大量 生物樣品。 在此所使用之「連結（binding)」係指非共價連結 (non-covalent association)或兩分離（separate)分子，例如複 合物，間免疫連結之形成。舉例而言，上述連結能力之評 估係取決於複合物形成之連結常數（binding constant)。當 複合物之濃度除以組合物濃度之乘積，可得到連結常數。 通常，在本發明之文中，當複合物形成之連結常數超過1 〇3 L/mol時，二組成物係「連結（binding)」。亦可利用已知方 法決定連結常數。 本發明之方法與套組中所述固態支撐物包含連結物、 黃病毒或任何群組之特定分屬或其同等物所衍生之組成 45 200815753 物、或可利用免疫吸收法固定之競爭型黃病毒特異性免疫 試劑之任何表面。上述表面之實施例包含，但不限定於， 聚苯乙浠或膜包含破酸纖維膜、聚四氟乙浠濾膜 (polyterafluorethylene membrane filters)、纖維酷酸濾膜 (cellulose acetate membrane filters)及具有濾膜載體（filter carriers)之硝酸纖維濾膜（cellulose nitrate membrane filters)。較佳的，上述膜可為聚苯乙烯與硝酸纖維膜。 本發明之診斷方法可選擇性採用利用生物微晶片之自 ® 動分析法。例如，建構診斷套組，以利用塗佈細胞溶解物 之組成物之玻璃載玻片進行免疫點墨法 (immunoblotting)。上述診斷套組包含生物微晶片配置至已 固定之細胞溶解物組成物之表面、適合之緩衝液、標準化 樣品包含可偵測程度之連結試劑及二級偵測試劑。 本發明之方法與套組可在急性感染期（acute infection) 或恢復期（convalescent phase)，偵測人類或動物對黃病毒 φ 或科之任何特異性分屬或其同等物之暴露。在此所述之「急 性感染期」係指當病毒感染寄主之時期，且可主動複製及/ 或導致感染相關之病症，例如發燒（fever)、發療（rash)、關 節痛（joint pain)及/或腹痛（abdominal pain)。在此所述之 「恢復期」係指當黃病毒不再複製或存留於寄主血液之黃 病毒感染時期，且具有已發生之連結物，例如，但不限定 於，抗體。利用本發明之方法與套組，可在感染病患或由 病患本身先前感染所衍生之病患產生連結物後，偵測任何 時期之暴露。 46 200815753 套組（Kits) 根據本發明之另一觀點，本發明提供一種用以偵測一 標的暴露至黃病毒或其同等物之套組，上述套組包含：黃 病毒之抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物；競爭性黃 病毒特異性免疫試劑；以及至少一偵測試劑，用以偵測生 物樣品中連結物與該競爭性黃病毒特異性免疫試劑中抗黃 病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物之間所形成之複合物。 上述套組可選擇性包含附加部份，例如清洗之緩衝液 _ (washing buffer)、培育容器（incubation containers)、阻斷 緩衝液（blocking buffers)及執行上述方法所必須之操作指 令（instructions) 〇 因此，本發明提供一種用以偵測標的暴露至黃病毒或 科之任何分屬或其相等物之套組。上述套組可為任何已知 之方式，可使生物樣品中連結物與抗登革熱免疫球蛋白 A(IgA)捕捉黃病毒之病毒組成物進行反應，並且與競爭型 0 黃病毒特異性免疫試劑競爭。上述結果係為先前暴露至黃 病毒之標示（indication)，代表黃病毒特異性或生物樣品中 黃病毒特異性連結物之存在。較佳的，上述套組包含如上 述用以接收（receive)之固態支撐物，或包含黃病毒之抗黃 病毒免疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物或其同等物。上述套組 亦包含試劑、可提供偵測訊號之受體分子及可使用之選擇 式操作指令。上述套組可為組合形式(modular form)，其中 個別組成物均可分開購買。 套組可為包含一或多組件（member)之組合式套組，其 47 200815753 中至少一組件為固態支撐物，且包含黃病毒之抗黃病毒免 疫球蛋白A(IgA)捕捉組成物或其同等物，或細胞溶解物包 含由黃病毒或其同等物所衍生之免疫組成物。 在一選擇性實施例中，固態支撐物包含一種由一或多 標的中之一或多黃病毒或其同等物之連結物試驗。 本發明亦提供本發明方法中所使用套組之個別組成 物。本發明提供包含黃病毒之抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA) 捕捉組成物之固態支撐物，用以偵測黃病毒之暴露。在一 * 實施例中，本發明提供聚苯乙烯之96孔盤或硝酸纖維膜以 附著病毒抗原，或用以作為已固定之抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉黃病毒之病毒組成物，或作為墨點（dot blot)或 作為試片（dip stick)，其中包含黃病毒或其同等物之組成 物。較佳的，上述盤或膜包含組成物，該組成物係為黃病 毒結構與非結構蛋白質、黃病毒粒子及其片段及該黃病 毒所衍生之醣蛋白、脂質與破氫化合物所組成之 φ 群組之一。 上述固態支撐物亦可為微孔盤（microtitre plate)、玻璃 載玻片（glass slide)、生物微晶片（biological microchip)，其 中細胞溶解物之組成物係為已固定。上述固態支撐物可與 生物樣品進行反應（subjected)，以彳貞測黃病毒之暴露。較 佳的，聚苯乙稀之微孔盤係利用細胞溶解物所感染之黃病 毒中之抗黃病毒免疫球蛋白以附著經純化之黃病毒抗原。 在硝酸纖維膜之實施例中，第二支撐物為可支撐固態 支撐物之支架（holder)，以增進固態支撐物之操作 48 200815753 (manipulation)，其中具有已固定之黃病毒組成物。例如， 硝酸纖維膜可利用試片支撐，而使上述膜沉入（dipped into) 生物樣品，例如血清，之中。由於微量之生物樣品可同時 被測試，因此上述套組之組成物係為十分有用。 評估感染之相關風險（Assessing relative risk of infection) 根據本發明之另一觀點，於定義位置（例如地理區域 (geographical area)、住宅區（housing estate)、運輸裝置 (means of transports)或醫療處理或評估中心（center for • medical treatment or assessment))内評估一或多標的暴露至 黃病毒或其同等物之相關風險，上述方法包含：a)由定義 位置内之代表性群體中選擇樣品；以及b)評估樣品群體對 黃病毒或其同等物個別分群之暴露證據之方法，上述方法 包含· 1)將一生物樣品與黃病毒或其同等物之組成物來源 反應，以形成該生物樣品内組成物與其標的來源連結物間 之一複合物；2)決定複合物之存在，其中複合物之存在代 φ 表標的暴露至黃病毒或其同等物；以及3)評估定義位置内 暴露之該相關風險。 風險分析利用電腦可讀取形式之軟體處理。因此，本 發明更與電腦可讀取程式及電腦相關，包含適用於分析標 的或標的群體之暴露、或標的或標的群體暴露至黃病毒或 其同等物風險。 本發明之方法與技術可克服由黃病毒或科之任何分屬 或其同等物所引起感染爆發（outbreaks)之流行病學研究或 血清監控（sero-surveillance)。上述研究提供十分寶貴之資 49 200815753 訊，使黃病毒疾病區域對黃病毒有更進一步之多方研究。 例如，流行病學研究有助於感染指引（index)之識別 (identification)。上述資訊有助於從回應病毒先前爆發之病 毒來源之位置識別。 另一方面，本發明之技術/方法對於感染黃病毒或其同 等物之標的可快速識別或隔離，而不須實驗室或所屬技術 領域中之設備。上述資訊有助於識別需要醫療處理之標 的，並且需更進一步研究或疾病控制方法之定義位置，例 ® 如孳生地(breeding place)或其控制之識別。再者，本發明 之技術用以監控已感染病患，以決定抗黃病毒特異性免疫 球蛋白G(IgG)之存在。在感染早期免疫球蛋白G(IgG)量或 其存在之減緩（alleviation)可為二級感染之指標，因此有助 於黃病毒感染，例如出血性登革熱（DHF)或休克型登革熱 (DSS)，後續時期之監控。 再者，本發明之技術提供一種識別方法，用以識別感 φ 染黃病毒屬之任何特定分屬及相關血清型之標的，使可快 速偵測、更進一步感染之風險、指出感染位置及疾病控制 狀態（strategy)。 在本發明之專利文件或其他先前之參考文獻，並非承 認上述文件或文獻為本案前案，亦非任何申請專利範圍之 優先權日前之部份先前技術之資料。 本發明中所使用之方法之實施例將會完整說明。然 而，應當理解下列敘述係僅用以說明本發明，並非用以限 定本發明。 50 200815753 實施例 實施例一-偵測登革熱特異性免疫球蛋白G(IgG)之競爭型 酵素連結免疫吸附分析法（C-ELIS A) 1.材料與方法 1 · 1競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C_ELISA)之病毒溶解 物抗原（viral lysate antigens)之製備： 根據2002年Cardosa等人所述之方法，製備對抗登革 熱四A清型之溶解物登革熱病毒抗原。首先，根據細胞病 馨變反應（cytopathic effects)與病毒血清型之研究，登革熱病 毒（5 m.o.i·)係生長於C6/36細胞且在含有2%胎羊血清 (fetal calf serum)之病毒培育液培育4至5天。輕輕倒出 (decanted)上述培育液，並且利用磷酸鹽緩衝液（pbs)清洗 具有感染細胞之細胞培育瓶（flask)四次，以1毫升含1 % 之trix 100之低滲透壓緩衝液（hypotonic buffer)反應1小 時，最後以每分鐘14,000之轉速（rpm)離心1〇分鐘。收集 參上述之懸浮液（supernatant)，並且利用直接式酵素連結免疫 吸附分析法（direct ELIS A)測試對抗登革熱群特異性與血 清型特異性之單株抗體，以及分配500// 1於小試管中，且 在使用前儲存於-70°C。 1.2 單株抗體（monoclonal antibodies) ·· 利用兩種不同來源（Abeam，Oxford，UK and Immunology Consultants Limited，USA)得到 Pan 登隔熱特 異性單株抗體（MAbs)，並且利用美國亞特蘭大（Atlanta)疾 病管制預防中心（CDC)所驗證（certified)之兩單株抗體。由 51 200815753 美國ICL得到登革熱血清型特異性單株抗體（登革熱第一 型（DEN-1)、登革熱第二型（DEN-2)、登革熱第三型（DEN_3) 及登革熱第四型（DEN-4))。利用直接式酵素連結免疫吸附 分析法（direct ELIS A)與點墨免疫分析法（dot-blot immunoassay)評估所分離之抗新加坡四血清型之所有單株 抗體之反應性（reactivities)。 1.3 測試血清（test sera): 在此研究中使用全部之360個血清樣品。上述樣品係 ⑩來自不同臨床與醫院所接收利用聚合酶連鎖反應（PCR)或 病毒分離或血清試驗以診斷登革熱感染之樣品。樣品中登 一 革熱反應抗體（IgG)之存在係利用登革熱病毒免疫球蛋白 G(IgG)直接式酵素連結免疫吸附分析法（direct ELISA)(Pan_Bio, Australia and IVD Research Inc，Carlsbad, CA 92008, USA)之兩種方式來初步篩選，並且可利用連續 稀釋之點墨式輻射免疫分析法（dot-blot EIA)決定免疫球蛋 φ 白G(IgG)之程度（level)。在競爭型酵素連結免疫吸附分析 法（C-ELISA)試驗之前，所有樣品均保存於-80°C。 1.4直接式酵素連結免疫吸附分析法（direct ELIS A): 商業套組（Pan-Bio, Australia and IVD Research Inc， Carlsbad，C A 92008, US A)係用以作為篩選血清樣品中之 登革熱病毒反應免疫球蛋白抗體G(IgG)，並且根據製造商 所述之方法來進行試驗。利用直接式酵素連結免疫吸附分 析法（direct ELISA)，以評估單株抗體（MAbs)及決定競爭性 試驗中所使用之最適病毒抗原、單株抗體（MAbs)及血清稀 52 200815753 釋。在96孔最大-吸收聚苯乙浠盤（96 well maxi-sorb poly styrene plates)中進行直接式酵素連結免疫吸附分析法 (direct ELISA)。利用上述最大-吸收96孔平底微孔盤 (NUNC，Denmark)與100// 1體積之試劑以進行上述試驗。 酵素連結免疫吸附分析盤（ELIS A plate)係於每一孔中塗佈 100 μΐ之1··500稀釋比例之抗人類免疫球蛋白抗體A(IgA) 與pH值9·6之碳酸/重碳酸緩衝液（carbonate/bicarbonate buffer)(Fluka，Biochemika，Switzerland)，並且於 37。(3 下 培育1小時，或於4°C下培育隔夜（over night)。利用清洗 緩衝液（washing buffer)(含0.05% Tween 20之填酸鹽緩衝 液（PBS))清洗一次上述盤，於每一孔中加入1〇〇 μΐ之以預 定最佳稀釋（1:5000)之抗人類免疫球蛋白抗體A(IgA)與磷 酸鹽緩衝液（PBS)。於37°C下培育1小時後再清洗一次， 並且於每一孔中加入ΙΟΟμΙ之以預定稀釋（1:1 〇〇)之抗登革 熱溶解物抗原（Den-Ι至Den-4)與磷酸鹽緩衝液（PBS)，於 ⑩ 37°C下再培育1小時。在上述培育之後，將上述盤清洗四 次，且於競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELIS A)稀釋緩 衝液（含0.3%登革熱抗體陰性人體血清與0.1%Trition xlOO之磷酸鹽緩衝液（PBS))中加入從1:250至64,000連續 稀釋之單株抗體，於室溫下培育30分鐘。再清洗六次之 後，於每一孔中加入100 μΐ之1:3000稀釋之帶有馬辣根過 氧化酶之山羊抗小鼠免疫球蛋白G(goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase(HRP))與稀釋緩衝 液，於室溫下再培育30分鐘。在將序列稀釋之單株抗體塗 53 200815753 佈於盤之後，利用直接式酵素連結免疫吸附分析法（direct ELISA)決定帶有馬辣根過氧化酶之山羊抗小鼠免疫球蛋 白 G(goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase(HRP))之最佳稀釋。在培育之後，將盤清洗六 次，並且於每一孔中加入100 μΐ之鄰苯二胺 (ortho-phenylene-diamine(OPD)，Sigma，USA)，於室溫下 再培育5至10分鐘。再者，加入ΙΟΟμΙ之2M硫酸（H2S04) 反應5至10分鐘使呈色反應（colour development)停止，且 可於492 nm波長下讀取最佳密度（optimal density)。 1.5競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C_ELISA): 競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA)係取決於 阻斷（blocking)登革熱陽性血清中登革熱病毒相同抗原連 結區之單株抗體之連結。彳貞測競爭性（competition)作為單 獨使用單株抗體所讀取最佳密度之減少。酵素連結免疫吸 附刀析法（ELIS A)之訊號減少量與血清中登革熱病毒特異 _ 性免疫球蛋白G(IgG)之量成正比（proportional)。換言之， 上述試驗可利用下述三種方法來執行，同時將測試企清與 單株抗體加入抗原捕捉孔而導致競爭型酵素連結免疫吸附 分析法（C-ELIS A)，或在待測血清預培育半小時後加入單株 抗體，或在血清清洗六次之〗小時預培育後加入單株抗體 之阻斷型酵素連結免疫吸附分析法（bl〇cking ELISA或 B-ELIS A)。上述三種形式在研究中均經過測試。 在研究中使用新加坡所分離出之四種登革熱血清型。 研究中所使用之單株抗體係利用過去四年間（2002至2005 54 200815753 年）分離超過 100 分離樣品（isolates)(Den_l、Den_2、Den-3 及Den-4)所篩選，並且其反應性均相等。溶解物抗原之最 佳稀釋係取決於利用抗原捕捉技術預先利用抗登革熱免疫 球蛋白A(IgA)與1:100稀釋之溶解物抗原於孔中所捕捉之 棋盤式滴定法（checkerboard titration)，為試驗之最佳方法。 最大-吸收96孔平底微孔盤利用上述方法以捕捉抗 原，並且將上述盤清洗四次以用於競爭型及阻斷型酵素連 結免疫吸附分析法（C and B-ELISA)試驗。上述試驗中，於 每一孔加入45 μΐ之阻斷緩衝液（blocking buffer)(含0.3 % 登革熱抗體陰性人體血清與〇. 1 % Trition xlOO之罐酸鹽緩 衝液（PBS))，然後分別將5 μΐ之待測與控制血清加入每一 孔，並且根據試驗進行下列步驟··進行競爭型酵素連結免 疫吸附分析法（C-ELISA)，將50 μΐ之1:1000稀釋之特異性 單株抗體與阻斷緩衝液加入包含血清之孔中；競爭型酵素 連結免疫吸附分析法（C-ELIS Α)之預培育，在室溫血清培育 φ 30分鐘後加入特異性單株抗體，而阻斷型競爭型酵素連結 免疫吸附分析法（B-ELISA)係在室溫下培育1小時，清洗六 次，於每一孔中再加入特異性單株抗體。在上述培育之後 (同時培育60分鐘及30分鐘競爭塑酵素連結免疫吸附分析 法（C-ELISA)之預培育），將上述盤清洗六次，在於每一孔 中加入100 μΐ之1:3000稀釋之帶有山羊抗小鼠免疫球蛋白 G(IgG)之馬辣根過氧化酶（HRP)與阻斷緩衝液。上述試驗 之終止（rest)係如直接式酵素連結免疫吸附分析法（direct ELIS A)所述。在阻斷型競爭型酵素連結免疫吸附分析法 55 200815753 (B-ELIS A)之實施例中，待測血清加入之後，於室溫下培育 上述盤1小時，清洗六次，再於每一孔中加入100μΐ之 1:1000稀釋之單株抗體。上述終止步驟（rest steps)係類似 於競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELIS A)。 1 ·6最佳單株抗體與血清稀釋及試驗形式之建立 (establishment)： 利用二登革熱病毒-2中和陽性血清（1:640與1:160)、 恢復期登革熱血清（已經由聚合酶連鎖反應（PCR)確認）、二 ® 黃病毒中和陽性血清（1:1280與1:80)及二黃病毒陰性血清 (病毒中和試驗（VNT) = 1:1 〇)，開始建立試驗參數。首先， ^ 利用以阻斷緩衝液連續稀釋（1:250541:64000)所滴定 (titrated)之單株抗體加入抗體捕捉盤，並且進行直接式競 爭型酵素連結免疫吸附分析法（direct C-ELISA)(第一（A)與 二（B)圖）。然後，任意選擇二稀釋單株抗體，對應於滴定 曲線上平穩期（plateau)光度值（OD)之100及75至80%， φ 並且利用競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA)與阻 斷型酵素連結免疫吸附分析法（B-ELISA)之連續倍數稀釋 之血清進行試驗（第二a、二b與三圖）。所有的樣品均須重 複試驗（duplicate)。控制組包含利用無血清但包含單株抗 體（〇 %抑制）之孔及無血清且無單株抗體（100 %抑制）之 孑L，而未連結之組成物（missing compounds)將被阻斷緩衝 液所置換。 1·7競爭型及阻斷型酵素連結免疫吸附分析法（c and B-ELISA)結果與統計分析之定量（quantification): 56 200815753 抑制單株抗體連結至血清中套膜蛋白上特異性抗原連 結區係表示為抑制比例（percent inhibition(PI))，並且經由 下列公式之平均光度值（OD)所計算： pi = 100 OP test sam; UD average role

xlOO 計算登革熱陰性與陽性血清樣品之抑制比例的平均與 標準差，而建立陽性臨界值（positive cutoff)。利用病毒中 和試驗（VNT)作為金標準試驗（gold standard test)，以建立 競爭性酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA)之相關特異性 . 與敏感度。 2.結果 2· 1抗原與單株抗體（MAbs)之最佳稀釋（optimal dilutions): 基於競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA)之一 需求，可使用未純化及未離心之登革熱溶解物抗原，並且 φ 採用已由抗人類免疫球蛋白A所捕捉之抗登革熱免疫球蛋 白A(IgA)至最大-吸收酵素連結免疫吸附分析盤（maxi-sorb EUSA plate)。上述技術可從細胞溶解物中立即純化及濃縮 登革熱病毒抗原以表現捕捉抗原至登革熱特異性免疫球蛋 白G(IgG)(亦可從陽性血清或特異性單株抗體）。在利用登 革熱特異性單株抗體（亦可為複合物或血清型特異性）連結 (picked up)較單株抗原捕捉酵素連結免疫吸附分析法 (ELISA)更多抗原之試驗後，可達到抗登革熱免疫球蛋白 A(IgA)特異性捕捉抗原之純化。（第一 (A)與一（B)圖）。 57 200815753 2·2抗原、單株抗體（MAbs)與血清之最佳稀釋方式： 競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELIS A)之主要目 的在於區分登革熱特異性抗體與其他黃病毒科（family flavivirideae)之其他分屬。因此，亦利用其量測試驗之特 異性區分各式濃度之弱陽性（weak-positive)登革熱病毒jk 清（由病毒中和試驗所定義）與強陽性（strong-positive)黃病 毒血清（黃熱病病毒）。並且將特異性表示為弱陽性登革熱 病毒血清與強陽性黃熱病毒血清間抑制比例（PI)之平均差 ’ （mean difference)。第二a圖表示pan-登革熱特異性單株抗 體（英國Abeam之Pan-dengue MAb及美國ICL之 Pan-dengue MAb)之滴定曲線及更進一步之稀釋試驗。第二 b圖將差異表示為血清稀釋之功效（function)。在第二b圖 之結果中，選擇75至80%之飽和稀釋（1:1000)作為後續試 驗中單株抗體之最佳稀釋。在單株抗體之濃度，血清之最 佳稀釋為產生峰值（peak value)之稀釋。血清稀釋為1:10(第 φ 三圖）。值得注意的是，在相同稀釋血清下，二單株抗體之 平穩期（plateau)(第二a圖）。後續試驗中，多數試驗均可以 得到近似之結果，由於其成本低廉與容易取得，因此選擇 使用美國 ICL 之 Pan-dengue MAb。 2.3測試方式··競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA) 對阻斷型酵素連結免疫吸附分析法（B-ELISA)與培育期： 比較競爭型與阻斷型連結免疫吸附分析法（C-ELIS A) 之強、中（moderate)、弱及陰性登革熱血清（病毒中和試驗 (VNT)= 1:640、1:160、1:40 及<1:1〇)。上述比較亦可延伸 58 200815753 評估不同血清與單株抗體培育期之組合。可同時加入單株 抗體或血清，亦或是在所有培育時期（血清加單株抗 體）45、60、90、120分鐘之血清預培育後加入單株抗體。 第四圖清楚指出競爭型與阻斷型之形式產生近似的敏感度 與特異性。再者，利用血清之3 0分鐘預培育’且在加入較 同時加入單株抗體與血清更具最佳特異性與敏感度之單株 抗體後，再培育3 0分鐘。 2.4 陰性臨界值（Negative cutoff value): ® 利用100個利用免疫球蛋白Μ捕捉酵素連結免疫吸附 分析法與直接式登革熱免疫球蛋白G(澳洲與美國加州 Carisbad 之 IVD Research Inc·之 Pan-Bio)之登革熱抗體 (IgG及IgM)陰性血清樣品、64個登革熱陽性血清 (VNT>l:2〇)及25個登革熱免疫球蛋白G陽性反應但登革 熱病毒病毒中和試驗（VNT)陰性反應之血清，並且利用競 爭型與阻斷型酵素連結免疫吸附分析法（C and B-ELIS A) φ 建立臨界值（cutoff value)(第五圖）。結合二群體（第五a、 五b圖），臨界值可任意設定於平均值（9.9)加2倍標準差或 抑制（6.6)。黃病毒交互反應之血清樣品係單獨考量（第五 圖，提供相同臨界值為平均值加3倍標準差）。對於絕對陰 性之血清樣品，平均加上標準差可提供25%抑制之臨界 值。 2.5 病毒中和試驗（Virus Neutralization Test，VNT)與競爭 型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA)之比較·· 第六圖表不血清樣品之二組平均終點滴定（mean endpoint 59 200815753 titers)，由病毒中和試驗（VNT)與競爭型酵素連結免疫吸附 分析法（C-ELISA)所判疋。所有試驗結果之相關係數為 (n=64)。結合上述樣品，競爭型酵素連結免疫吸附分析法 (C-ELISA)之特異性與敏感性與病毒中和試驗（VNT)之關 聯如表格1所示。 表格1顯示偵測登革熱特異性抗體（IgG)之競爭型酵 素連結免疫吸附分析法（C-ELISA)與病毒中和試驗（virus Neutralization Test，VNT)之比較。 表格1 :病毒中和試驗（VNT) 競爭型酵素 陽性 陰性 總數 連結免疫吸 陽性 62 0 62 附分析法 陰性 2 --------- 100 102 (C-ELISA) 總數 64 100 164 敏感度= 62/64= 1x100= 96.88%，特異性=1〇〇/1〇〇 =1 〇〇%，陽性預測值= 62/62x100= 1〇〇%及陰性預測值= φ 100/102x100二 98%。 2.6競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C_ElisA)與登革熱二 級感染： 用以偵測登革熱二級感染之競爭型酵素連結免疫吸附 分析法（C-ELISA)之特異性與敏感性與二習知技術比較;抗 登革熱免疫球蛋白Μ與G之比例（IgM and IgG ratio) S1·2(二級感染）與<1·2(初級感染，如前述2003年Shu等 人所提出），及抗登革熱免疫球蛋白M(IgM)捕捉酵素連結 免疫吸附分析法（ELISA)，其係等於1:2560之HI單位（表 200815753 格3)。 表格2顯示偵測登革熱二級感染之競爭型酵素連結免 疫吸附分析法（C-ELISA)與一般習知技術（免疫球蛋白Μ與 G 之比例（IgM and IgG ratio))之比較。 表格3顯示彳貞測登革熱二級感染之競爭型酵素連結免 疫吸附分析法（C-ELISA)與一般習知技術（登革熱捕捉免疫 球蛋白G之酵素連結免疫吸附分析法（dengue capture IgG ELISA))之比較。 表格2 :抗登革熱免疫球蛋白]^與0之比例 (anti-dengue IgM/IgG ratio)(S 1:2 與<1:2) 競爭型酵素 陽性 陰性 ----1 總數 連結免疫吸 陽性 64 8 ---_ 72 附分析法 陰性 51 31 82^ (C-ELISA) 總數 115 39 ^^ 154 敏感度= 72/115χ100= 62·60%，特異性= 31/39χι⑽ ⑩= 79.48%，陽性預測值（PPV)= 64/72x100 = 88.89%及陰性 預測值= 31/82x100= 37.80%。 表格3 :抗登革熱免疫球蛋白G之捕捉型酵素連結$ 疫吸附分析法（anti-dengue IgG capture ELIS A) —-—------ 競爭型酵素 陽性 陰性 連結免疫吸 陽性 54 18 附分析法 陰性 16 66 (C-ELISA) —-——___—- 總數 70 84 15^^ - 敏感度= 54/70xl00= 77·14%，特異性= 82/84xl〇0 61 200815753 97.62%，陽性預測值= 54/72x100= 75%及陰性預測值= 66/82x100= 80.49%。 2.7競爭型酵素連結免疫咗附分析法（C-ELISA)登革熱血清 型（serotyping): 上述試驗亦可利用登革熱血清型特異性單株抗體，登 革熱第一型（Den-Ι)、登革熱第二型（Den-2)、登革熱第三型 (Den-3)及登革熱第四型（Den-4)，以區別（differentiate)血清 樣品中登革熱病毒之血清型。已先利用Pan-登革熱單株抗 * 體偵測之81個登革熱特異性血清樣品，係再利用登革熱血 清型特異性單株抗體作測試。利用三種登革熱血清型特異 . 性單株抗體，登革熱第二型（Den-2)、登革熱第四型（Den-4) 及登革熱第一型（Den-1)，作測試。結果顯示於表格4，分 別表示80.25%之登革熱第二型（Den-2)陽性、49.38%之登 革熱第四型（Den-4)及32· 10%之登革熱第一型（Den_l)。20 %的血清對於三種登革熱血清型（Den-2、Den-4及Den_l) φ 呈陽性反應，38.46%的血清對於Den-2及Den-4抗體呈陽 性反應，10.77%的血清具有抗Den-2及Den-Ι之抗體，而 12,50%的血清對於Den-4及Den-4病毒呈陽性反應。由於 血清型特異性抗體對登革熱血清型第三型（Den_3)之反應 性較低，因此測試抗登革熱血清型第三型之血清樣品。 表格4:登革熱血清型 樣 Den- Den-1 Den-2 Den-4 Den-Ι + Den-1 + Den-1 Den-2 品 特異 特異 特異 特異 Den-2 + Den-2 + + 總 數 性 性 性 性 Den-4 Den-4 Den-4 62 200815753 88 81 26 65 46 13 20 18 25 90.05% 32.10% 8025% 49.38% 20% 3077% 27.69% 38.46% 2.8 15分與一步驟之競爭性酵素連結免疫吸附分析法（one step competitive ELISA): 此項試驗之進行大部分已陳述於實施方法2.3部份 中，下文將再陳述競爭型單株抗體連結馬辣根過氧化酶 (HRP)(美國ICL)，並且同時加入待測血清。全部培育期時 間從原本的90分鐘縮短為15分鐘，並且二步驟縮短為一 步驟。將15分一步驟試驗之結果與預培育之競爭型酵素連 結免疫吸附分析法（C-ELISA)及同時30分一步驟之競爭型 酵素連結免疫吸附分析法（C_ELISA)相較，發現有100%之 近似性（表格5)。 表格5 ··效能時間（performance times)之比較 樣品 總量 C-ELISA/90 分與2步驟 C-ELISA/30 分與1步驟 C-ELISA/15 分與1步驟 陽性 (Pan-bio IgG) 98% 80(81.63%) 83(84.69%) 81(82.65%) 陰性 (Pan-bio IgG) 29 1(3.45%) 3(10.35%) 1(3.45%) 2.9抗日本腦炎（JEV)之競爭性酵素連結免疫吸附分析法 (competitive ELISA) · 亦利用競爭型酵素連結免疫吸附分析試驗（C-ELISA) 之單株抗體對抗非登革熱黃病毒，例如利用病毒特異性單 株抗體（利用聖路易斯腦炎病毒（St· Louis encephalitis)交 63 200815753

互反應）對抗日本腦炎病毒（JEV)。利用2.3部份所述之步 驟製備盤，並且捕捉日本腦炎病毒抗原以取代登革熱病 毒。簡言之，利用曰本腦炎溶解物抗原（Nayakama strain)， 且由抗登革熱免疫球蛋白A(IgA)所捕捉。利用兔子產生抗 曰本腦炎抗體作為試驗之使用，並且利用此方法篩選83 人類血清樣品。在83樣品中，65樣品對黃病毒交互反應 之免疫球蛋白G (IgG)呈陽性反應，而其餘28血清對黃病 毒呈陰性反應。結果顯示，89·23 % (5 8/65)之黃病毒反應金 鲁清對日本腦炎之競爭型酵素連結免疫吸附分析試驗（JE C-ELISA)呈陽性反應，而89.29%(25/28)之黃病毒陰性樣 品並未與日本腦炎之競爭型酵素連結免疫吸附分析試驗 (JE C-ELISA)進行反應。然而，並非使用已確認為曰本腦 炎之血清樣品來強化上述方法之準確性（validation)。 3 ·討論 利用競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELIS A)之單 φ 株抗體提供一種快速、敏感及特異性偵測登革熱抗體之方 法。上述試驗較直接型酵素連結免疫吸附分析試驗（direct ELIS A)提供更多其他優點，可篩選不同黃病毒屬之血清。 與病毒中和試驗（VNT)相較，競爭型酵素連結免疫吸附分 析法（C-ELIS A)提供較高之敏感度（100%)與特異性（100 % )，並且同時將反應進行之時間（run time)從7天減少為 少於2小時。再者，與病毒中和試驗（VNT)不同的是，競 爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELIS A)較不受血清品質 (serum quality)(細胞毒性（Cyt〇toxicity)、污染 64 200815753 (contamination)、血球溶解（hem〇iyzed)或存在於脂肪（fat) 中）之影響’並且對黃病毒之其他分屬具有較低之交互反應 性。污染會以下述二方式影響血清學之結果，抗體降級 (degradation)及變化（aiteration)至阻礙(hin(iers)抗體連結 之pH值。實際上，以高度稀釋（1:20或更高）之血清作篩選 應為試驗無效（nullify)之第二因素。 由於單株抗體為高度純化且對抗原連結區具有較血清 抗體為高之親和性，因此利用阻斷型酵素連結免疫吸附分 ⑩析法（B-ELISA)與同時加入待測血清與單株抗體之3〇分鐘 預培育血清之競爭型酵素連結免疫吸附分析法 (C-ELIS A)。當同時加入上述待測血清與單株抗體時，只有 高親和性之血清抗體可以競爭形式競爭，早期初級反應 (early primary response)血清主要包含較低親和性之抗體 且呈因性反應，而推定二級反應（secondary-response)血清 具有高親和性，且顯示可與阻斷型酵素連結免疫吸附分析 φ 法（B-ELIS A)相較之敏感度程度。然而，利用已連結之特異 性登革熱單株抗體可排除此方法中之較低敏感度’並且可 得到近似之結果。上述經潤飾之方法不僅可增進試驗敏感 度，也可將需時90分鐘減少為15分鐘及二步驟減少為一 步驟。15分一步驟之競爭型酵素連結免疫吸附分析法 (C-ELISA)提供目前登革熱免疫球蛋白G(IgG)偵測技術之 重大突破，並且單一試驗（signal test)可用以在疾病早期區 別登革熱初級與二級感染，如同登革熱特異性血清監控 (sero-surveillence)對超過一黃病毒共同循環傳播 65 200815753 (co-circulating)十分重要。目前抗登革熱免疫球蛋白G(IgG) 試驗係用以偵測登革熱二級感染與血清監控。 競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA)之標準化 方法與微:量中和試驗（micro-neutralization assay)相較：(1) 目前病毒中和試驗（VNT)為超過一黃病毒之登革熱感染之 容易取得的確認性試驗（available confirmatory test);及（2) 中和性抗體可作為寄主免疫狀態之最佳預測物。競爭型酵 素連結免疫吸附分析試驗（C-ELISA)之結果與病毒中和試 * 驗（VNT)十分近似，並且二試驗結果之間具有非常高之正 相關性（r= 0.88)。 登革熱特異性抗體之偵測不僅對流行病學研究十分重 要，亦可利用偵測先前感染病患之登革熱特異性免疫球蛋 白G(IgG)來診斷二級感染。根據世界衛生組織（WHO)，只 有登革熱感染早期恢復期抗免疫球蛋白G(IgG)中>2560 ΗAI程度之血清被認定為一級感染（1982年世界衛生組織 φ 年度手冊（WHO Manual))。然而，由於延遲之债測程序並 無法提供適合的病患管理，上述登革熱二級感染偵測標準 (criterion)可能導致人類遭受嚴重的登革熱感染，如出血型 登革熱（DHF)。將本發明之方法與世界衛生組織（WHO)同 等之試驗（登革熱免疫球蛋白G(IgG)捕捉酵素連結免疫吸 附分析法（ELISA)，表格3)相較，可知競爭型酵素連結免 疫吸附分析法（C-ELISA)對登革熱免疫球餐白G(IgG)捕捉 酵素連結免疫吸附分析法（ELISA)具有77%之敏感度與 97.62%之特異性，並且有18登革熱案例雖具有登革熱免 66 200815753 疫球蛋白G(IgG)，但捕捉免疫球蛋白G(IgG)無法偵測’而 16登革熱案例對登革熱免疫球蛋白G(IgG)並無特異性，但 捕捉免疫球蛋白G(IgG)酵素連結免疫吸附分析法（ELIS A) 仍可偵測出。因此，登革熱高度交互反應之免疫球蛋白 G(IgG)並非表示登革熱二級感染，通常是因為具有超過一 黃病毒共同循環傳播（co-circulating)所造成。另一方面’ 登革熱早期低程度之登革熱特異性免疫球蛋白G(IgG)並 未排除為二級感染之案例。2003年Shu等人所述之其他利 ® 用免疫球蛋白Μ與G比例（IgM and IgG ratio)之方法（表格 2)，顯示74.67%之登革熱病患具有二級感染，並且與登革 熱捕捉免疫球蛋白G(IgG)與競爭型酵素連結免疫吸附分 析法（C-ELISA)相較之結果為十分良好。在此情況下，本發 明之競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELIS A)在登革熱 急性病症之病患血清中，利用登革熱特異性捕捉免疫球蛋 白G(IgG)(在低與高程度下）於15分鐘内偵測二級感染係 φ 為十分有效之工具。 利用登革熱溶解物抗原與登革熱特異性單株抗體說明 (demonstrated)競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA) 之步驟。亦可用以對抗其他黃病毒，並且日本腦炎之初步 結果係為本發明之實施例。 本發明以較佳實施例說明如上，然其並非用以限定本 發明所主張之專利權利範圍。其專利保護範圍當視後附之 申請專利範圍及其等同領域而定。凡熟悉此領域之技藝 者，在不脫離本專利精神或範圍内，所作之更動或潤飾， 67 200815753 包含但不限定於方法之步驟與順序，均屬於本發明所揭示 精神下所完成之等效改變或設計，且應包含在下述之申請 專利範圍内。 【圖式簡單說明】 藉由參考下列實施例之詳細敘述，將可以更快地了解 本發明之上述及其他優點，藉由下文中之描述以及附加圖 式，可以容易了解本發明之精神，並且說明書中相同的元 件標號代表相同的元件，其中： * 第一圖係顯示於抗登革熱免疫球蛋白A(IgA)捕捉聚 苯乙烯盤（polystyrene plate)之最佳化（optimization)登革熱 , 溶解物抗原之示意圖。第一（A)圖係顯示比較單株抗體捕捉 與抗登革熱免疫球蛋白A(IgA)捕捉酵素連結免疫吸附分 析法（C-ELISA)。（a)利用細胞懸浮病毒抗原偵測登革熱病 毒（血清型-2)。病毒係由106 pfu/ml至102 pfu/ml病毒稀釋 作十倍稀釋（Log1G)。（b)利用細胞溶解物抗原偵測登革熱病 φ 毒（血清型-2)。在上述二例子中，抗登革熱免疫球蛋白 A(IgA)捕捉酵素連結免疫吸附分析法（ELISA)顯示較單株 抗體捕捉酵素連結免疫吸附分析法（ELISA)為佳之效能。 第二圖係顯示最佳化之抗登革熱溶解物抗原之每一血 清型之單株抗體。決定單株抗體之最佳稀釋。（a)連續二倍 稀釋之每一單株抗體（1:250至1:32000)與競爭型酵素連結 免疫吸附分析法（C-ELISA)中二倍稀釋之登革熱陽性及二 登革熱陰性之血清（一為登革熱直接式免疫球蛋白G(IgG) 酵素連結免疫吸附分析法（ELISA)陽性反應，另一為免疫球 68 200815753 蛋白G(IgG)酵素連結免疫吸附分析法（ELISA)與黃熱病毒 中和試驗（VNT)陽性反應，且登革熱病毒中和試驗（VNT) 陰性反應)進行反應。單株抗體以1:2000稀釋。 第三圖係顯示利用競爭型酵素連結免疫吸附分析法 (C-ELIS A)之登革熱免疫球蛋白G(IgG)陽性與陰性血清之 最佳化。決定競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA) 血清之最佳稀釋。在競爭型酵素連結免疫吸附分析法 (C-ELISA)中，連續二倍稀釋之陰性、黃病毒交互反應及陽 * 性控制血清與最佳化之Pan-登革熱單株抗體（1:2000)之稀 釋進行反應。為了減少所需血清之體積，選擇1:20之血清 稀釋作為表現較佳效能之較佳稀釋。 第四圖係顯示利用病毒中和試驗（VNT)已確認為登革 熱之陰性與陽性血清決定競爭型酵素連結免疫吸附分析法 (C-ELISA)之臨界值（cutoff value)。建立競爭型酵素連結免 疫吸附分析法（C-ELISA)之陰性臨界值。（a)所有登革熱免 φ 疫球蛋白G(IgG)陰性血清（n=100); (b)利用病毒中和試驗 (VNT)所偵測之登革熱免疫球蛋白G(IgG)陽性血清（η = 64)。虛線代表30%抑制之臨界值（平均值加3標準差），用 以區分陰性與陽性樣品。 第五圖係顯示三登革熱特異性免疫球蛋白G(IgG)偵 測方法，阻斷型酵素連結免疫吸附分析法（blocking ELIS A)、同時及預培育之競爭型酵素連結免疫吸附分析法 (competitive ELISA)，之比較。比較阻斷型酵素連結免疫 吸附分析法（B-ELIS A)與競爭型酵素連結免疫吸附分析法 69 200815753 (C-ELISA)(同時與預培育加入單株抗體）。每—咨 貝料％位 四數值之平均，中陽性（Log〗1〇〇 TCIDw，8)與陰性1為 清。與預培育及阻斷型酵素連結免疫吸附分析法 血 (B-ELISA)(1:160)相較，同時加入待測血清與單株抗體（陽 性1:40)表現較低之效能（perf〇rmance)。 第六圖係顯示利用1〇三重（triplets)血清樣品（第1、4 及20天所收集）之競爭型酵素連結免疫吸附分析法 (C-ELISA)之結果。從第1、4及20天之已（經聚合酶連鎖 釀反應（PCR))確認為登革熱之丨〇病患之三重樣品中，偵測机 登革熱特異性免疫球蛋白G(IgG)。在第二次與三次收集中 ‘之抗登革熱特異性免疫球蛋白G(IgG)之程度與第〆次收 集相較，約略較為増加。 第七圖係顯示競爭型酵素連結免疫吸附分析表 (C-ELISA)與病毒中和試驗（vnt)間相關係數之詰果。机合 革熱捕捉免疫球蛋白G(IgG)特異性樣品之線性回歸（lineaT _ regression)顯示競爭型酵素連結免疫吸附分析法（C-ELISA) 與病毒中和試驗（VNT)間之高相關性（r= 0.91)，旅指出與 「金標準（gold standard)」方法相較之高度特異性。 第八圖係顯示30與15分一步驟之競爭型酵素連結免 疫吸附分析法（C-ELIS A)間之相關係數。二試驗之線性回歸 (linear regression)顯示高相關性（r=： 〇 9675)。 【主要元件符號說明】

Claims (1)

1. 200815753 十、申請專利範圍： 1. 一種用以偵測一標的暴露至一黃病毒或其同 等物之方法，該方法包含： 將帶有抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組成 物之黃病毒與同等物之一混合物之該標的與 一生物樣品接觸； 該生物樣品及該抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA) 捕捉組成物與一競爭黃病毒特異性免疫試劑 進行反應；以及 在該競爭黃病毒特異性免疫試劑之該生物樣 品與黃病毒之該抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA) 捕捉組成物中，決定一黃病毒特異性結合物所 形成之複合物之存在。 2. 如申請專利範圍第1項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該生物 樣品、該黃病毒之抗黃病毒免疫球蛋白A(IgA) 捕捉組成物係預培育，以在該競爭型黃病毒特 異性免疫試劑進行反應之前形成一複合物。 3. 如申請專利範圍第1項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中在決定 該複合物之存在之前，同時將該生物樣品、該 黃病毒之抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組 71 200815753 成物及該競爭性黃病毒特異性免疫試劑互相 接觸。 4. 如申請專利範圍第1至 3項中任一項之用以 偵測一標的暴露至一黃病毒或其同等物之方 法，其中該競爭性黃病毒特異性免疫試劑係為 一抗體，且與黃病毒之抗免疫球蛋白 A(IgA) 捕捉組成物之抗原連結區具有特異性。 5. 如申請專利範圍第1至 4項中任一項之用以 偵測一標的暴露至一黃病毒或其同等物之方 法，其中該競爭性黃病毒特異性免疫試劑係為 一單株抗體連結至一受體群。 6. 如申請專利範圍第 5項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該受體 群係為一酵素。 7. 如申請專利範圍第1至 6項中任一項之用以 偵測一標的暴露至一黃病毒或其同等物之方 法，其中該抗免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組成物 係由黃病毒感染細胞之溶解物中所捕捉。 8. 如申請專利範圍第1至 7項中任一項之用以 72 200815753 债測一標的暴露至一黃病毒或其同等物之方 法，其中該抗登革熱免疫球蛋白 A(IgA)捕捉 組成物係選自由黃病毒結構與非結構蛋白 質、黃病毒粒子與其片段及該黃病毒所衍生之 醣蛋白、脂質與碳氫化合物所組成之群組之 9·如申請專利範圍第 8項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該結構 蛋白質係選自由套膜蛋白、Pr膜蛋白及核鞘 蛋白所組成之群組之一。 10·如申請專利範圍第9項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該抗黃 病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組成物係為一抗 遺傳型抗體，且回應暴露至由黃病毒或其同等 物所衍生之免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組成物而 產生之黃病毒抗體之抗原連結位置。 11.如申請專利範圍第1至10項中任一項之用以 偵測一標的暴露至一黃病毒或其同等物之方 法，其中該連結物係為一黃病毒特異性抗體或 其免疫片段。 73 200815753 12. 如申請專利範圍第1 1項之用以偵測一標 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該 物係表現於黃病毒感染之早期、恢復期或 感染所衍生。 13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之 偵測一標的暴露至一黃病毒或其同等物 法，其中該黃病毒係選自由黃熱病毒、登 病毒及日本腦炎病毒所組成之群組之一。 14. 如申請專利範圍第13項之用以偵測一標 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該 毒係為登革熱病毒。 15·如申請專利範圍第1 3項之用以偵測一標 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該 毒係為曰本腦炎病毒。 16.如申請專利範圍第14項之用以偵測一標 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該 偵測暴露至之一登革熱病毒血清型，且該 熱病毒血清型係選自由登革熱第一型 (DEN-1)、登革熱第二型（DEN-2)、登革熱 型（DEN-3)及登革熱第四型（DEN-4)所組 的暴 連結 先前 用以 之方 革熱 的暴 黃病 的暴 黃病 的暴 方法 登革 第三 乞之 74 200815753 群組之 17. 如申請專利範圍第16項之用以偵測一標 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該 登革熱特異性免疫試劑係為一登革熱病 異性抗體，且該登革熱病毒特異性抗體對 熱病毒血清型第一型（DEN-1)、第 (DEN-2)、第三型（DEN-3)或第四型（DEN_ 相同抗原決定區具有特異性。 18. 如申請專利範圍第1 4或1 7項之用以偵測 的暴露至一黃病毒或其同等物之方法，其 非結構蛋白質係選自由N S -1、N S - 2 a、N S NS-3、NS-4a、NS-4b 及 NS-5 所組成之群 19. 如申請專利範圍第1 8項之用以偵測一標 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該 構蛋白質係為NS-1。 20. 如申請專利範圍第14項之用以偵測一標 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中該 物抗體係為一免疫球蛋白 G(IgG)抗體， 選自由登革熱第一型（DEN-1)、登革熱第 的暴 競爭 毒特 登革 二型 4)之 一標 中該 2b、 組之 的暴 非結 的暴 連結 且對 二型 75 200815753 (DEN-2)、登革熱第三型（DEN-3)或登革 型（DEN-4)所組成之群組之一之登革熱 具有特異性。 21.如申請專利範圍第1至20項中任一項 偵測一標的暴露至一黃病毒或其同等 法，其中該生物樣品係選自由血液、唾 聽液、B細胞、T細胞、jk漿、血清、 羊膜液所組成之群組之一。 22·如申請專利範圍第2 1項之用以偵測一 露至一黃病毒或其同等物之方法，其中 樣品係為血清或唾液。 23. —種用於如申請專利範圍第1至22項 項之彳貞測一標的暴露至一黃病毒或其 方法之黃病毒之抗黃病毒免疫球蛋白 捕捉化合物之混合物。 24. 如申請專利範圍第23項之用於如申請 圍第1至2 2項中任一項之偵測一標的 一黃病毒或其同等物方法之黃病毒之 毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉化合物之混 其中該抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)所 熱第四 血清型 之用以 物之方 液、脊 尿液及 標的暴 該生物 中任一 同等物 A(IgA) 專利範 暴露至 抗黃病 合物， 捕捉化 76 200815753 合物係由黃病毒所感染之細胞溶解物所捕捉。 25·如申請專利範圍第23或24項之用於如申請專 利範圍第1至22項中任一項之偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物方法之黃病毒之抗 黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉化合物之混合 物，其中該組成物係選自由黃病毒結構與非結 構蛋白質、黃病毒粒子與其片段及該黃病毒所 衍生之醣蛋白、脂質與碳氫化合物所組成之群 組之一 ° 26·如申請專利範圍第25項之用於如申請專利範 圍第1至22項中任一項之偵測一標的暴露至 一黃病毒或其同等物方法之黃病毒之抗黃病 毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉化合物之混合物， 其中該結構蛋白質係選自由套膜蛋白、Pr膜 蛋白及核鞘蛋白所組成之群組之一。 27·如申請專利範圍第23、24、25或26項之用於 如申請專利範圍第1至22項中任一項之偵測 一標的暴露至一黃病毒或其同等物方法之黃 病毒之抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉化合 物之混合物，其中該黃病毒係選自由黃熱病 毒、登革熱病毒及日本腦炎病毒所組成之群組 77 200815753 之 28.如申請專利範圍第27項之用於如申請專利範 圍第1至2 2項中任一項之偵測一標的暴露至 一黃病毒或其同等物之任一方法之黃病毒之 抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉化合物之混 合物，其中該黃病毒係為登革熱病毒。 馨 29·如申請專利範圍第27項之用於如申請專利範 圍第1至22項中任一項之偵測一標的暴露至 _ 一黃病毒或其同等物方法之黃病毒之抗黃病 毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉化合物之混合物， 其中該黃病毒係為曰本腦炎病毒。 30.如申請專利範圍第28項之用於如申請專利範 φ 圍第1至22項中任一項之偵測一標的暴露至 一黃病毒或其同等物方法之黃病毒之抗黃病 毒免疫球蛋白 A (I g A)捕捉化合物之混合物， 其中該登革熱病毒係選自由登革熱第一型 (DEN-1)、登革熱第二型（DEN-2)、登革熱第三 型（DEN-3)及登革熱第四型（DEN-4)所組成之 群組之一。 31·如申請專利範圍第28或30項之用於如申請專 78 200815753 利範圍第1至22項中任一項之偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物方法之黃病毒之抗 黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉化合物之混合 物，其中該非結構蛋白質係選自由 N S - 1、 NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b 及 NS-5 所組成之群組之一。 32. 如申請專利範圍第3 1項之用於如申請專利範 圍第1至2 2項中任一項之偵測一標的暴露至 一黃病毒或其同等物方法之黃病毒之抗黃病 毒免疫球蛋白 A (I g A)捕捉化合物之混合物， 其中該非結構蛋白質係為NS-1。 33. —種用以偵測一標的暴露至一黃病毒或其同 等物之套組，該套組包含： 黃病毒之抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組 成物； 一競爭性黃病毒特異性免疫試劑；以及 至少一偵測試劑，用以偵測一生物樣品中一連 結物與該競爭性黃病毒特異性免疫試劑中一 抗黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組成物之間 形成之一複合物。 34·如申請專利範圍第33項之用以偵測一標的暴 79 200815753 露至一黃病毒或其同等物之套組，其中該抗 病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組成物或該競 型特異性或膜特異性免疫試劑係固定於該 態支撐物之上。 35. 如申請專利範圍第33或34項之用以偵測一 的暴露至一黃病毒或其同等物之套組，其中 黃病毒特異性免疫試劑係為一單株抗體。 36. 如申請專利範圍第33項之用以偵測一標的 露至一黃病毒或其同等物之套組，其中該抗 革熱免疫球蛋白 A(IgA)捕捉組成物係選自 黃病毒病毒結構與非結構蛋白質、黃病毒粒 與其片段及該黃病毒所衍生之醣蛋白、脂質 石炭氳化合物所組成之群組之一。 37·如申請專利範圍第36項之用以偵測一標的 露至一黃病毒或其同等物之套組，其中該結 蛋白質係選自由套膜蛋白、Pr膜蛋白及核 蛋白所組成之群組之一。 38·如申請專利範圍第33至37項中任一項之用 偵測一標的暴露至一黃病毒或其同等物之 組，其中該黃病毒係選自由黃熱病毒、登革 黃 爭 固 該 暴 登 由 子 與 暴 構 鞘 以 套 敎 80 200815753 病毒及日本腦炎病毒所組成之群組之一。 39. 如申請專利範圍第3 8項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之套組，其中該黃病 毒係為登革熱病毒。 40. 如申請專利範圍第3 8項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之套組，其中該黃病 _ 毒係為曰本腦炎病毒。 41·如申請專利範圍第39項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之套組，其中該競爭 登革熱特異性免疫試劑係為一登革熱病毒特 異性抗體，且該登革熱病毒特異性抗體對登革 熱病毒血清型登革熱第一型（DEN-1)、登革熱 φ 第二型（DEN-2)、登革熱第三型（DEN-3)或登革 熱第四型（DEN-4)之相同抗原決定區具有特異 性。 42.如申請專利範圍第3 8或4 1項之用以偵測一標 的暴露至一黃病毒或其同等物之套組，其中該 非結構蛋白質係選自由NS-l、NS-2a、NS-2b、 N S 3、N S _ 4 a、N S - 4 b及N S _ 5所組成之群組之 81 200815753 43·如申請專利範圍第42項之用以偵測一標的暴 露至一黃病毒或其同等物之套組，其中該非結 構蛋白質係為N S -1。 44·一種固態支撐物，適用於偵測一標的暴露至黃 病毒或其同等物之方法，該方法包含： 將該標的之生物樣品與黃病毒或同等物之抗 黃病毒免疫球蛋白 A(IgA)捕捉成分之混合物 接觸； 提供該生物樣品與該抗黃病毒免疫球蛋白 a 捕捉成刀至'~競爭性育病毒特異性免疫試劑； 決定該生物樣品中黃病毒特異性連結物與該 競爭性黃病毒特異性免疫試劑中該抗黃病毒 免疫球蛋白 A(IgA)捕捉成分之間所形成之複 合物之存在； 該支撐物包含固定於該支撐之該抗黃病毒免 疫球蛋白A(IgA)捕捉成分。 45·如申請專利範圍第44項之固態支撐物，其中 該固態支撐物係選自由微珠（bead)、圓盤 (disc)、磁性粒子、光纖感測器、微孔盤、玻 璃載玻片（g 1 a s s s 1 i d e)、生物微晶片（b i ο 1 〇 g i c a 1 microchip)或膜包含硝酸纖維膜、聚四氟乙烯 濾、膜（polyterafluorethylene membrane 82 200815753 filters)、纖維醋酸濾膜（cellulose acetate membrane filters)及具有滤膜載體（filter carriers)之硝酸纖維滤膜（cellulose nitrate membrane filters)所組成之群組之一。 46.—種於一定義位置内評估一或多標的暴露至 黃病毒或其同等物之相關風險，該方法包含： a) 由該定義位置内之一代表性群體中選擇樣 品；以及 b) 評估一樣品群體對黃病毒或其同等物個別 分群之暴露證據之方法，上述方法包含： 1) 將一生物樣品與黃病毒或其同等物之組成 物來源反應，以形成該生物樣品内該組成物與 其標的來源連結物間之一複合物； 2) 決定該複合物之存在，其中該複合物之存在 代表該標的暴露至黃病毒或其同等物；以及 c) 評估該定義位置内暴露之該相關風險。 83