JP2023546048A - 改良された診断試験 - Google Patents

Abstract

本発明は、第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を含む、抗デング熱ウイルス抗体の検出のための免疫診断試験デバイスであって、第１のデング熱抗原は、配列番号１に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに第２のデング熱抗原は、配列番号２の配列を有するポリペプチドまたは配列番号２の配列と比べて少なくとも１かつ４以下のアミノ酸置換を有する配列を有するポリペプチドを含む、上記デバイスを提供する。

Description

本発明は、診断試験に関する。より詳細には、しかし排他的でなく、本発明は、デング熱の迅速な診断試験に関する。本発明は、以前のデング熱感染（ｐｒｉｏｒ ｄｅｎｇｕｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を識別するための迅速な診断試験にも関する。

デング熱は、マラリアの後の２番目に最も重要な感染性熱帯病であり、世界の人口のおよそ半分がその流行性伝播のリスクのある地域に住んでいる。デング熱の症例は毎年３億９０００万であると推定され、およそ９６００万人が、臨床的に明らかな疾患を有する。毎年、小児を含む推定５００，０００人が、入院を必要とする重症型のデング熱に罹患し、大流行の際、医療体制に多大な負担をかける。重症型のデング熱に罹患する人のおよそ２．５％が死亡するであろう（非特許文献１から入手可能）。

デング熱病は、抗原的には異なるが密接に関連する、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）属のデングウイルス血清型によって引き起こされる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。デングウイルスは、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。

デング熱病は、通常、デングウイルスに感染したネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）蚊の吸血の際のデングウイルスの注入によって感染する。４～１０日間の潜伏期間の後、病気は突然発症し、その後に以下の３つのフェーズが生じる：発熱（２～７日間）、重篤（２４～４８時間－重症合併症が生じる場合がある）、および回復（４８～７２時間）。重篤フェーズの間、生命に関わる合併症、例えば、出血、ショック状態、および急性臓器損傷など、が生じる場合がある。これらの予測不能な転帰を適切に管理することで、致死率を減少させることが可能である。デング熱の治癒は、７～１０日後に完了するが、通常、無力症が長引く。多くの場合、白血球および血小板の数の減少が観察される。

デング出血熱（ＤＨＦ）を含むデング熱病の重症型は、デングウイルス感染の潜在的な致死性の合併症である。ＤＨＦは、高熱とデング熱病の症状によって特徴づけられるが、極端な嗜眠および眠気を伴う。血管透過の増加および異常なホメオスタシスは、血液量の減少、低血圧、および重症の場合には、血液量減少性ショック状態、ならびに内出血を引き起こす場合がある。２つの要因が、ＤＨＦの発生－高レベルのウイルス血症を伴う急速なウイルス複製（疾患の重症度はウイルス血症のレベルに関連する；非特許文献６）および高レベルの炎症仲介物質の放出を伴う主要な炎症反応（非特許文献７；非特許文献８）において主要な役割を果たしていると考えられる。ＤＨＦの場合、死亡率は、治療なしでは１０％に達し得るが、治療の手段のあるほとんどのセンターでは＜１％である。デング熱病感染は、１００を超える熱帯諸国において風土病であり、ＤＨＦは、これらの国のうち６０か国において報告されている（非特許文献９）。

デング性ショック症候群（ＤＳＳ）は、ＤＨＦの一般的な進行であり、多くの場合、致死性である。ＤＳＳは、全身性脈管炎によって生じ、血管外への血漿漏出を引き起こす。ＤＳＳは、速く不十分な量の脈、低血圧、四肢冷感、および不穏状態によって特徴づけられる。

アジアでは、ＤＨＦおよびＤＳＳは、主に小児において観察され、ＤＨＦを患う人のおよそ９０％は１５歳未満である（非特許文献１０；非特許文献１１）。対照的に、カリブ海および中米での大流行では、主に大人が感染した（非特許文献１０）。デング熱が風土病である多くの国では、デング熱病の発生頻度は、より高い年齢層において増加した（非特許文献１２；非特許文献１３）。

デングウイルスの４つの血清型は、およそ６０～８０％の配列相同性を有する。１つのデング熱血清型による感染は、耐久性のある同種免疫が得られるが、異種免疫は限定的である（非特許文献１４）。したがって、デング熱の１つの血清型に感染した個体は、それに続いて、異なる血清型にも感染する場合がある。異なるデングウイルス血清型から生じる二次感染は、理論的に、重症型デング熱／ＤＨＦの発症の危険因子であり、と言うのも、重症型デング熱／ＤＨＦを示す患者の大部分が、以前に、デングウイルスの他の４つの血清型の少なくとも１つに晒されているためである。

これまで、デング熱病に対する特定の治療はない。デング熱病に対する治療は、対症的で、安静、解熱鎮痛剤による発熱および疼痛の制御、ならびに適切な飲酒である。ＤＨＦの治療は、液体喪失のバランス、凝固因子の置換、およびヘパリンの注入を必要とする。

デング熱予防対策、例えば、防蚊および蚊に刺されることからの身体保護など、は、有効性が限られ、実施が困難で、ならびに高価であるため、安全で有効なデング熱ワクチンは、予防のベストモードである。

Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒは、以前に、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）の商品名で市販されたデング熱ワクチンを開発した。このデング熱ワクチンのワクチン有効性（ＶＥ）は、とりわけ２～１６歳の対象において実証され（非特許文献１５および非特許文献１６）、ならびにより年齢の高い対象（１８～４５歳）においても抗体反応の中和に基づくブリッジング法の使用によって実証された（非特許文献１７）。

ただし、このデング熱ワクチンによって得られる結果の綿密な分析は、ワクチン接種の時点で既にデング熱血清陽性であった対象、すなわち、血清型に関係なく、以前にデングウイルスに感染したことのある対象、のデング熱病に対する保護において特に効果的であることを示している。しかしながら、初期デング熱血清陰性の対象、すなわち、以前にデングウイルスに感染したことがない対象に対しては、一次ワクチン接種後の中和抗体レベルは、デング熱血清陽性対象において生じる中和抗体反応より低い。

デング熱の血清状態の影響は、Ｓｒｉｄｈａｒら（非特許文献１８）によって詳細に調査され、それは、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）の安全性および有効性に対する以前のデング熱の血清状態（すなわち、ワクチン接種前）の効果と見なされた。Ｓｒｉｄｈａｒは、ワクチンの性能が、デング熱血清陽性対象、例えば、９～１６歳のワクチン接種者、において優れており、血清陰性対象における３９％と比較して、血清陽性対象における統計的に優位なＶＥは７６％であった。さらに、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）は、ワクチン接種前にデング熱血清陽性である対象において、少なくとも５年間、重症型デング熱および入院から保護することが見出されたが、デング熱血清陰性であったワクチン接種対象では、それらの転帰におけるより高いリスクの証拠があった。

デング熱感染を特定する試験が、当技術分野には存在する。しかしながら、そのような試験は、例えば、患者にデング熱の疑いのある症状を有する患者が来院する臨床環境において、急性デング熱を検出するために適合される。さらに、そのようなセロテスト（ｓｅｒｏｔｅｓｔ）は、適切な感度および／または特異度を欠いており、それは、偽陽性または擬陰性の結果につながる。

したがって、高い特異度および感度においてデング熱血清陽性である潜在的デング熱ワクチン対象、特に過去のある時期に以前のデング熱感染を有した（すなわち、急性デング熱感染を患っていない）デング熱血清陽性対象を識別することができるデング熱セロテストを開発することが必要とされている。識別されれば、そのような対象に、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）などのデング熱ワクチンを投与することができる。

本発明は、上記において言及したニーズに対処しようとするものである。

世界保健機構。Ｄｅｎｇｕｅ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ， Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ Ｎ°１１７、２０１５年５月に更新。ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ１１７／ｅｎ／ Ｇｕｂｌｅｒら， １９８８年， ｉｎ： Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｒｔｈｒｏｐｏｄ－ｂｏｒｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｍｏｎａｔｈ ＴＰＭ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ （ＦＬ）： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ： ２２３～６０頁 Ｋａｕｔｎｅｒら， １９９７年， Ｊ． ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ， １３１ ： ５１６～５２４頁 Ｒｉｇａｕ－Ｐｅｒｅｚら， １９９８年， Ｌａｎｃｅｔ， ３５２： ９７１～９７７頁 Ｖａｕｇｈｎら， １９９７年， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， １７６： ３２２～３０頁 Ｖａｕｇｈｎら， ２０００年， Ｊ． Ｉｎｆ． Ｄｉｓ．， １８１： ２～９頁 Ｒｏｔｈｍａｎ ａｎｄ Ｅｎｎｉｓ， １９９９年， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２５７： １～６頁 Ａｌａｎ Ｌ． Ｒｏｔｈｍａｎ． ２０１１年， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １１： ５３２～５４３頁 Ｇｕｂｌｅｒ， ２００２年， ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １０： １００～１０３頁 Ｍａｌａｖｉｇｅら， ２００４年， Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ． Ｊ．， ８０： ５８８～６０１頁 Ｍｅｕｌｅｎら， ２０００年， Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｉｎｔ． Ｈｅａｌｔｈ， ５：３２５～９頁 Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎら， ２０１２年， Ｌａｎｃｅｔ， ３８０， １５５９～１５６７頁 Ｍｅｓｓｉｎａら， ２０１４年， Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２２， １３８～１４６頁 Ｓａｂｉｎ， １９５２年， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ．， １： ３０～５０頁 Ｃａｐｅｄｉｎｇ ＭＲら， ２０１４年， Ｌａｎｃｅｔ； ３８４（９９５１）：１３５８～６５頁 Ｖｉｌｌａｒ Ｌら， ２０１５年， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．， ３７２（２）：１１３～２３頁 Ｇｉｌｂｅｒｔ ＰＢら， ２０１９年， Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ， １０１（１）：１６４～１７９頁 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ２０１８年， ｖｏｌ． ３７９： ３２７～３４０頁

本発明は、第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を含む、抗デングウイルス抗体の検出のための免疫診断試験デバイスであって、第１のデング熱抗原は、配列番号１に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに第２のデング熱抗原は、配列番号２の配列を有するポリペプチドまたは配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有するポリペプチドを含む、上記デバイスを提供する。

本発明は、ヒト対象のデング熱感染の診断における使用のための、または診断における補助としての使用のための、本明細書において説明される免疫診断試験デバイスも提供する。

本発明は、ヒト対象におけるデング熱感染を特定するための方法であって、
ａ．第１および第２のデング熱抗原は、本明細書において定義される通りであり、ならびに当該デング熱抗原は、検出可能な部分にコンジュゲートされる、第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を提供すること；
ｂ．デング熱抗原を対象から得られた生物学的試料と接触させることであって、当該生物学的試料は、潜在的に、当該抗原の少なくとも１つに結合することができる少なくとも１つの結合パートナーを含有すること；および
ｃ．試料が少なくとも１つの結合パートナーを含む場合、デング熱抗原検出可能部分コンジュゲートの少なくとも１つと少なくとも１つの結合パートナーとの間に形成される複合体の存在を検出することであって、存在が対象におけるデング熱ウイルス感染を示すこと、
を含む上記方法も提供する。

本発明は、デング熱血清陽性ヒト対象を識別する方法であって、（ｉ）当該対象から生物学的試料を得ること、および（ｉｉ）本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して試料を分析すること、の工程を含む、上記方法も提供する。

本発明は、ヒト対象において抗デング熱ＩｇＧ抗体を検出するインビトロ方法であって、（ｉ）当該対象から生物学的試料を得ること、および（ｉｉ）本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して当該試料を分析すること、の工程を含む、インビトロ方法も提供する。

本発明は、デング熱に対してヒト対象にワクチン接種する方法であって、（ｉ）当該対象から生物学的試料を得ること、（ｉｉ）当該対象がデング熱血清陽性であるか否かを特定するために、本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して当該試料を分析すること、および（ｉｉｉ）当該ヒト対象が工程（ｉｉ）によりデング熱血清陽性である場合、デング熱ワクチンを当該ヒト対象に投与すること、の工程を含む上記方法も提供する。

当然のことながら、本発明の一態様と関連して説明される特徴は、本発明の他の態様に組み入れてもよいことは理解されるであろう。例えば、本発明の方法は、本発明の試験デバイスに関して説明される特徴のいずれかを組み入れてもよく、その逆もまたしかりである。

ヒト対象から得られた試料のデング熱血清状態を高精度で特定するために使用される分類アルゴリズムを示す図である。 ＰＲＮＴアッセイにおける５０％および９０％ウイルス中和の計算を示す図である。ＰＲＮＴ_５０は、ウイルスインプットと比較しておよそ５０％の中和レベルの血清希釈による４点線形回帰を使用して計算される。ＰＲＮＴ_９０は、およそ９０％の中和レベルの血清希釈を使用して同じように計算される。 本発明の実施形態によるラテラルフロー型のデング熱診断試験（１）の概略図を示す図である。当該試験は、支持体（２）とその上に位置された試料パッド（３）、コンジュゲートパッド（４）、分析パッド（５）、および吸収パッド（６）を含む。当該試験は、さらに、試験ライン（７）、コントロールライン（８）、デング熱抗原コンジュゲート（９）、およびコントロールコンジュゲート（１０）を含む。 ユーザーに提示することができるそのままの、本発明の実施形態によるデング熱診断試験のイメージを示す図である。当該試験カセットは、試料適用ウェル（Ｓ）、緩衝液適用ウェル（Ｂ）、試験ライン（Ｔ）、およびコントロールライン（Ｃ）を含む。

定義
用語「免疫診断試験デバイス」は、本明細書において使用される場合、検出の主要手段として抗原と結合パートナーとの反応を利用する診断試験デバイスを意味する。結合パートナーは、抗原に特異的に結合することができる分子であり、ならびに、当該用語は、抗体またはその断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片など、を包含する。当該免疫診断試験デバイスは、本明細書において、「試験デバイス」または単に「デバイス」とも呼ばれる。

用語「デング熱病」は、本明細書において使用される場合、デングウイルスによる感染後に個体によって示される全ての重症度の臨床症状を意味する。本明細書において使用される場合、デング熱病なる用語は、より軽度のデング熱病の症状発症、例えば、デング熱発熱など、ならびにより重度のデング熱病の症状発症、例えば、重症型デング熱または本明細書において定義されるデング出血熱（ＤＨＦ）など、の両方を包含する。１９７５年以来、臨床デング熱は、世界保健機構ガイドライン（１９９７年に更新）に従って、（ｉ）デング熱発熱または（ｉｉ）デング出血熱として分類された（世界保健機構． Ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ： Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ２ｎｄ Ｅｄ． Ｇｅｎｅｖａ： ＷＨＯ， １９９７； ＩＳＢＮ ９２ ４ １５４５００ ３）。２００９年に、ＷＨＯは、（ｉ）危険な徴候の有る、もしくは無いデング熱、または（ｉｉ）重症型デング熱、として臨床デング熱を分類する新しいガイドラインを発行した。両方の分類は、Ｓｒｉｋｉａｔｋａｃｈｏｒｎら， Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． （２０１１） ５３（６）：５６３の図１および２に示される。１９９７年以前のＷＨＯ分類に従って、デング熱発熱は、以下：（ｉ）頭痛、関節痛、後眼窩痛、発疹、筋肉痛、出血症状、および白血球減少症から選択される少なくとも２つの症状を伴う発熱の存在；それと一緒の（ｉｉ）裏付けとなる血清学または他の確認されたデング熱症例と同じ場所および時期での発生、によって診断される。ＤＨＦへの進行は、発熱、出血症状、栓球減少、および血漿漏出の証拠の全てが観測される場合に確定される。２００９年のＷＨＯ分類に従って、デング熱の診断は、以下の存在：（ｉ）発熱ならびに、嘔気、嘔吐、発疹、うずく痛みおよび疼痛、陽性駆血帯試験から選択される少なくとも２つの臨床症状、あるいは、腹痛および圧痛、持続性嘔吐、臨床液体貯留、粘膜出血、嗜眠または不穏状態、肝腫大＞２ｃｍ、あるいは血小板数の急速な減少を伴うヘマトクリットの増加から選択されるいずれかの警告徴候；それと一緒の（ｉｉ）裏付けとなる血清学または他の確認されたデング熱症例と同じ場所および時期での発生、を必要とする。２００９年のＷＨＯ分類に従って、重症型デング熱は、以下のさらなる事象：（ｉ）ショック状態または呼吸困難（液体貯留）を引き起こす重症血漿漏出；（ｉｉ）臨床医によって評価される大量出血；または（ｉｉｉ）重症臓器病変（すなわち、肝臓：ＡＳＴ、ＡＬＴ≧１０００；ＣＮＳ：意識障害あるいは心臓または他の臓器の障害）、のいずれかの観察を伴うデング熱の診断として定義される。

用語「デング出血熱」または「ＤＨＦ」は、本明細書において使用される場合、１９９７年のＷＨＯの定義に一致し、以下の症状－１）臨床徴候：（ａ）発熱：急性発症、高熱（≧３８℃）、および連続して２～７日間続く；（ｂ）以下の出血症状のいずれか：陽性駆血帯試験、点状出血、紫斑、皮下溢血、衂血、歯茎からの出血、ならびに吐血および／または血便；２）検査所見：（ａ）栓球減少（血小板数≦１００×１０９／Ｌ）；（ｂ）血液濃縮によって示される血漿漏出（２０％以上のヘマトクリットの増加）または胸膜滲出（胸のＸ線検査において見られる）ならびに／あるいは腹水ならびに／あるいは低アルブミン血症（ヒプアルブミネミア（ｈｙｐａｌｂｕｍｉｎａｅｍｉａ））、を意味する。最初の２つの臨床基準（すなわち、発熱および出血症状）、ならびに栓球減少および血漿漏出の徴候は、ＤＨＦの臨床診断を確立するのに十分である。胸膜滲出（胸のＸ線検査において見られる）および／または低アルブミン血症（ヒプアルブミネミア（ｈｙｐａｌｂｕｍｉｎａｅｍｉａ））は、血漿漏出を支持する証拠を提供する。ＤＨＦは、本明細書において使用される場合、その重症度に基づいてさらに定義される。したがって、ＤＨＦは、グレードＩ、グレードＩＩ、グレードＩＩＩ、またはグレードＩＶとして定義される（世界保健機構． Ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ： Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ２ｎｄ Ｅｄ． Ｇｅｎｅｖａ： ＷＨＯ， １９９７； ＩＳＢＮ ９２ ４ １５４５００ ３）。グレードＩは、非特異的全身症状を伴う発熱として定義され；出血症状のみが、陽性駆血帯試験である。グレードＩＩは、グレードＩ患者の症状発生に加えて、通常は皮膚出血または他の出血の形態の、突発性出血として定義される。グレードＩＩＩは、寒冷皮膚および不穏状態の存在を伴う、速く弱い脈と狭い脈圧（２０ｍｍＨｇ以下）または低血圧により明らかにされる循環不全として定義される。グレードＩＶは、検知できない血圧および脈の深いショック状態と定義される。

用語「ウイルス学的に確認されたデング熱」は、本明細書において使用される場合、デングウイルスによって誘導されたことが、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ）によって、および／またはデング熱非構造的１（ＮＳ１）タンパク質酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって確認される急性熱性発作（すなわち、少なくとも連続する２日間において温度≧３８℃）を意味する。ＲＴ－ＰＣＲ法において、ＲＮＡが、市販のキットを使用して、潜在的Ｔａｑポリメラーゼ阻害因子または干渉因子を除去するために血清から抽出される。次いで、デング熱スクリーニングＲＴ－ＰＣＲ反応が、デングウイルスの間で保存される遺伝子配列由来のプライマーを用いて行われる。結果は、既知の濃度のウイルス性ゲノム核酸配列を含有する標準との比較によって、ｌｏｇ１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬの濃度として示される。感染後デング熱ウイルス血症の血清型識別は、Ｓｉｍｐｌｅｘａ（ＴＭ） デング熱ＲＴ－ＰＣＲアッセイ（Ｆｏｃｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． ＣＡ、ＵＳＡ）によって試料を試験することによって特定される。簡潔に説明すると、ＲＮＡが、市販のキットを使用して、潜在的ポリメラーゼ阻害因子または干渉因子を破棄するために血清から抽出される。次いで、デング熱配列由来の血清型特異的プライマーを組み入れたＳｉｍｐｌｅｘａ（ＴＭ）アッセイが実施される。結果は、定性的に示され、各デング熱血清型に対して、検出されたまたは検出されなかった、として報告される。血清型識別のために、Ｓｉｍｐｌｅｘａ（商標）アッセイが、全てのデング熱スクリーニングＲＴ－ＰＣＲ陽性試料またはデング熱ＮＳ１ Ａｇ ＥＬＩＳＡ陽性試料に対して使用される。ＮＳ１ ＥＬＩＳＡは、市販のキット（Ｐｌａｔｅｌｉａ（ＴＭ） デング熱ＮＳ１ Ａｇ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ－ｌａ－Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、フランス）を使用して実施される。製造元の指示に従って行われる。デング熱ＮＳ１ Ａｇ試験は、血清中のＮＳ１ Ａｇの検出を可能にする一段階サンドイッチＥＬＩＳＡベースのアッセイである。試験は、捕捉および摘発のためにマウスモノクローナルＡｂｓ（ＭＡｂｓ）を使用する。試料およびコントロールは、ＭＡｂでコーティングされたマイクロプレートウェル内において、当該コンジュゲートを用いて、直接および同時にインキュベートされる。試料中にＮＳ１ Ａｇが存在する場合、免疫－複合体ＭＡｂ－ＮＳ１－ＭＡｂ／ペルオキシダーゼが形成されるであろう。免疫－複合体の存在は、顕色反応を起こす色原性溶液の添加によって示される。室温でのインキュベーションの３０分後に、酸性溶液の添加によって、酵素反応は停止される。４５０／６２０ｎｍにおいて分光高度計セットによって得られる光学密度（ＯＤ）読取り値は、試料中に存在するＮＳ１ Ａｇの量に比例する。個々の試料中のＮＳ１ Ａｇの存在は、試料のＯＤ読取り値をカットオフコントロール血清のＯＤと比較することによって特定される。＜０．５、≧０．５から＜１．０、および≧１の試料比率は、それぞれ、陰性結果、疑わしい結果、陽性結果を示す。

用語「重症型デング熱」または「重症型デング熱病」は、本明細書において使用される場合、以下のように定義される重症型デング熱を意味する。デング熱発熱の場合、以下の基準のいずれかひとつの出現が重症型デング熱の診断をもたらす：（ｉ）ショック状態（小児または若者における脈圧≦２０ｍｍＨｇ、あるいは頻拍、弱脈、および不十分な灌流を伴う低血圧［≦９０ｍｍＨｇ］）；（ｉｉ）輸血を必要とする出血；（ｉｉｉ）脳症、すなわち、意識不明または不十分な意識状態または単純な発熱痙攣に起因しない痙攣または局在性神経兆候。不十分な意識状態または意識不明は、グラスゴー昏睡指数（ＧＣＳ）スコア：（ｉｖ）肝機能障害（ＡＳＴ＞１０００Ｕ／Ｌまたはプロトロンビン時間［ＰＴ］国際標準化比［ＩＮＲ］＞１．５）；（ｖ）腎臓機能障害（血清クレアチニン≧１．５ｍｇ／ｄＬ）あるいは、（ｖｉ）胸部Ｘ線（ＣＸＲ）、心エコー法、心電図（ＥＣＧ）、または利用可能であれば心筋酵素、によって裏付けされる心筋炎、心膜炎、または心臓麻痺（臨床心臓麻痺）、によって裏付けられなければならない。

用語「デング熱ウイルス」および「デングウイルス」は、相互互換的に使用される。それらは、フラビウイルス科ファミリーのフラビウイルス属に属するポジティブ一本鎖ＲＮＡウイルスを意味する。およそ６０～８０％の配列相同性を有するデングウイルスの４つの異なる血清型（血清型１、２、３および４）が存在する。ゲノムの構成は、以下のエレメント：５’非コード領域（ＮＣＲ）、構造タンパク質をコードする領域（キャプシド（Ｃ）、プレ膜（ｐｒＭ）、およびエンベロープ（Ｅ））および非構造タンパク質をコードする領域（ＮＳ１－ＮＳ２Ａ－ＮＳ２Ｂ－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５）および３’ＮＣＲ、を含む。デング熱ウイルスゲノムは、翻訳後プロセシングを受けて個々のタンパク質を生成する単一のポリタンパク質へ翻訳される、介在されていないコード領域をコードする。

本明細書において使用される場合、「デング熱免疫」または「デング熱血清陽性」対象は、（以前に）デングウイルスに感染しているかまたはデング熱ワクチンによって免疫されている対象を意味する。したがって、当該対象から採取された試料（例えば、血清試料）は、好適なデング熱ＩｇＧセロテスト、例えば、本発明の免疫診断試験デバイス、において陽性の結果を生じるであろう。本明細書において説明される抗デング熱ＮＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡは、デング熱血清陽性対象を識別するためにも使用することができ、特に、以前に（自然に）デングウイルスによって感染している対象と、以前にＮＳ１タンパク質をコードする核酸がデング熱起源ではないキメラデングウイルス、例えば、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標） （Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ、フランス）、によって免疫されている対象とを識別するために使用することができる。ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）におけるＮＳ１タンパク質をコードする核酸は、黄熱由来であり、結果として、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）は、デング熱ＮＳ１を発現しない。したがって、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）で免疫された対象は、抗デング熱ＮＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡにおいて陰性の結果を生じるであろう。本明細書において説明されるデング熱ＰＲＮＴ_５０は、デング熱血清陽性対象を識別するためにも使用できるが、ＰＲＮＴは、前のデング熱の自然感染とＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）によるデング熱ワクチン接種とを区別することができない。異なるデング熱ＩｇＧのセロテストの使用は、デング熱血清陽性対象を識別するために併用することができる。好ましくは、本明細書において言及されるような、デング熱血清陽性である対象は、デング熱の自然感染により、デング熱血清陽性である。

本明細書において使用される場合、「デング熱血清陰性」（または「デング熱ナイーブ」または「デング熱非免疫」）対象は、（以前に）デングウイルスによって感染しておらず、デング熱ワクチンによって免疫もされていない対象を意味する。したがって、当該対象から採取された試料（例えば、血清試料）は、好適なデング熱ＩｇＧセロテスト、例えば、本発明の免疫診断試験デバイス、において陰性の結果を生じるであろう。

本明細書において使用される場合、「マルチタイプデング熱免疫」または「マルチタイプデング熱血清陽性」対象は、その対象から得られた血清試料がデング熱ＰＲＮＴ_９０において少なくとも２つの血清型に対して陽性の結果（抗体価＞１０）を生じるような対象として定義される。

本明細書において使用される場合、「モノタイプデング熱免疫」または「モノタイプデング熱血清陽性」は、血清試料がデング熱ＰＲＮＴ_９０において１つの血清型のみに対して陽性の結果（抗体価＞１０）を生じるような対象として定義される。

詳細な説明
本発明は、抗デングウイルス抗体の検出のための改良された免疫診断試験デバイスを対象とする。特に、本発明は、２つのデング熱抗原、すなわち、血清型１のデング熱抗原および血清型２のデング熱抗原、を含む本発明による免疫診断試験デバイスが、デング熱血清陽性対象、特に、過去のある時期に以前のデング熱感染を有した（すなわち、急性デング熱感染を患っていない）デング熱血清陽性対象、を、高い特異度および感度において識別することができるという驚くべき観察に基づいている。デング熱ワクチンは、ベースラインデング熱血清陽性である（例えば、以前のデング熱感染を有した）ワクチンレシピエントにおいてより安全でより効果的であり得るため、本発明の試験デバイスの目的の１つは、デング熱ワクチンを投与するデング熱血清陽性対象を信頼性高く識別することである。これは、本明細書において、「試験およびワクチン接種」または「スクリーニングおよびワクチン接種」戦略と呼ばれ得る。

試験の特異度および感度における一般化された増加は明らかに有利であるが、その一方で、本発明の試験デバイスは、以下の特定の利点を提供する。特に、本発明の試験デバイスは、他の関連するフラビウイルスに対する交差反応性の不在またはレベルの低下を示す（すなわち、偽陽性の減少または不在）。この改良は、特に有利であり、と言うのも、試験およびワクチン接種の戦略の一部として、デング熱診断試験を使用して得られる偽陽性の結果（すなわち、実際にはデング熱血清陰性である対象をデング熱血清陽性として識別すること）は、真にデング熱血清陰性である対象にデング熱ワクチンを受けさせることにつながるからである。そのような対象は、重症型デング熱を経験するリスクの増加に苦しみ得る。本発明の試験デバイスは、モノタイプ免疫対象の検出の改善も有する。本発明の試験デバイスは、かなり以前に、例えば、１年以上前または５年以上前、例えば、１～３年前、１～５年前、または１～１０年前に生じた以前のデング熱感染の検出の改善も有する。

本発明は、抗デングウイルス抗体の検出のための免疫診断試験デバイスに関連する。本発明の実施形態において、試験デバイスは、本明細書において定義される少なくとも１つのデング熱抗原、例えば、本明細書において定義される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのデング熱抗原を含む。本発明の実施形態において、試験デバイスは、本明細書において定義される２つ以上；３つ以上；または４つ以上のデング熱抗原を含む。本発明の実施形態において、試験デバイスは、本明細書において定義される２つのデング熱抗原、すなわち、第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を含む。本発明の実施形態において、試験デバイスは、本明細書において定義されるデング熱血清型１抗原およびデング熱血清型２抗原を含む。本発明の実施形態において、試験デバイスは、本明細書において定義される４つのデング熱抗原、すなわち、第１のデング熱抗原、第２のデング熱抗原、第３のデング熱抗原、および第４のデング熱抗原を含む。本発明の実施形態において、試験デバイスは、本明細書において定義されるデング熱血清型１抗原、デング熱血清型２抗原、デング熱血清型３抗原、およびデング熱血清型４抗原を含む。

第一態様において、本発明は、第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を含む抗デングウイルス抗体の検出のための免疫診断試験デバイスであって、第１のデング熱抗原は、配列番号１に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに第２のデング熱抗原は、配列番号２の配列を有するポリペプチドまたは配列番号２の配列と比べて１つ以上かつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する置換ポリペプチドを含む、上記デバイスを提供する。

この態様のある実施形態において、上記デバイスは、さらに、第３のデング熱抗原または第４のデング熱抗原を含み、この場合、第３のデング熱抗原は、配列番号３に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに第４のデング熱抗原は、配列番号４に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含む。

この態様のある実施形態において、上記デバイスは、さらに、第３のデング熱抗原および第４のデング熱抗原を含み、この場合、第３のデング熱抗原は、配列番号３に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに第４のデング熱抗原は、配列番号４に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含む。

この態様のある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、同様の生化学的特性を有する異なるアミノ酸残基による、タンパク質配列における１つのアミノ酸残基の置換である。典型的には、保存的置換は、結果として得られるポリペプチドの活性に対して最小限の影響しか有さないかまたは影響を有さない。例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む抗原は、通常、非変異タンパク質の構造および機能を保持する。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および／または第４の抗原は、デングウイルスのエンベロープタンパク質である。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および／または第４の抗原は、デングウイルスの単量体エンベロープタンパク質である。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および／または第４の抗原は、変性されていないデングウイルスのエンベロープタンパク質である。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および／または第４の抗原は、変性されていない単量体デングウイルスエンベロープタンパク質である。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および／または第４の抗原は、デングウイルスの組換えエンベロープタンパク質である。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および／または第４の抗原は、デングウイルスの組換え単量体エンベロープタンパク質である。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および／または第４の抗原は、変性されていないデングウイルスの組換えエンベロープタンパク質である。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および／または第４の抗原は、変性されていないデングウイルスの組換え単量体エンベロープタンパク質である。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原は、ショウジョウバエシュナイダー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）２（Ｓ２）細胞において産生される、すなわち、発現される。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原は、ウイルス溶解物に由来しなかった。

この態様のある実施形態において、第１、第２、第３、および第４のデング熱抗原は、ショウジョウバエシュナイダー２（Ｓ２）細胞において産生される、すなわち、発現される。

この態様のある実施形態において、上記デング熱抗原の少なくとも１つは、抗デングウイルス抗体に結合することができる少なくとも１つのエピトープを含む。この態様のある実施形態において、デング熱抗原の両方または４つ全てのデング熱抗原は、抗デングウイルス抗体に結合することができる少なくとも１つのエピトープを含む。

この態様のある実施形態において、抗デングウイルス抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、上記デング熱抗原の少なくとも１つにおける少なくとも１つのエピトープに結合することができるＩｇＧ抗体である。

この態様のある実施形態において、試験デバイスは、本発明の実施形態のそれぞれにおいて本明細書において定義されるデング熱抗原の組み合わせ以外の他のデング熱抗原を含まない。例えば、試験デバイスは、追加のデング熱エンベロープ抗原を含まず、または、例えば、試験デバイスは、デング熱ＮＳ１抗原を含まず、または、例えば、試験デバイスは、追加デング熱エンベロープ抗原もデング熱ＮＳ１抗原もどちらも含まない。

この態様のある実施形態において、試験デバイスは、抗デング熱ＩｇＧ抗体のみを検出することができ、すなわち、試験デバイスは、抗ＩｇＭ抗体を検出することができない。

この態様のある実施形態において、第１の抗原のポリペプチドは、配列番号１の７５位および７６位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第２の抗原の置換ポリペプチドは、配列番号２の７５位および７６位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３の抗原のポリペプチドは、配列番号３の７６位および７７位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４の抗原のポリペプチドは、配列番号４の７５位および７６位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１の抗原のポリペプチドは、配列番号１の７５位および７６位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まず、ならびに、第２の抗原の置換ポリペプチドは、配列番号２の７５位および７６位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１の抗原のポリペプチドは、配列番号１の７５位および７６位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まず；第２の抗原の置換ポリペプチドは、配列番号２の７５位および７６位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まず；第３の抗原のポリペプチドは、配列番号３の７６位および７７位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まず；ならびに第４の抗原のポリペプチドは、配列番号４の７５位および７６位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この説明および特許請求の範囲の全体を通して、識別された配列に対するポリペプチドの配列同一性は、当該識別された配列の全長全体に対して測定される。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、この場合、場合により、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９２％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９４％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９６％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９８％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９９％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するか、または配列番号１の配列と比べて１つ以上かつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するか、または配列番号１の配列と比べて１以上かつ３以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するか、または配列番号１の配列と比べて１つ以上かつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するか、または配列番号１の配列と比べて１つのアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９２％配列同一性を有し、この場合、場合により、当該ポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９４％配列同一性を有し、この場合、場合により、当該ポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９６％配列同一性を有し、この場合、場合により、当該ポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９８％配列同一性を有し、この場合、場合により、当該ポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９９％配列同一性を有し、この場合、場合により、当該ポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するか、または配列番号１の配列と比べて１つ以上かつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、ならびに、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するか、または配列番号１の配列と比べて１つ以上かつ３つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、ならびに、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するか、または配列番号１の配列と比べて１つ以上かつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、ならびに、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するか、または配列番号１の配列と比べて１つのアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、配列番号１に対するアミノ酸置換は、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置においてではない。

この態様のある実施形態において、第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の配列を有する。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該配列は、配列番号２の５位、５２位、１１９位、１２５位、および２０２位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ３つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該配列は、配列番号２の５位、５２位、１１９位、１２５位、および２０２位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該配列は、配列番号２の５位、５２位、１１９位、１２５位、および２０２位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて１つのアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該配列は、配列番号２の５位、５２位、１１９位、１２５位、および２０２位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ３つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて１つのアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、配列番号２に対するアミノ酸置換は、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置においてではなく、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号２の５位、５２位、９７位、１０９位、１１９位、１２５位および２０２位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ３つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号２の５位、５２位、９７位、１０９位、１１９位、１２５位および２０２位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号２の５位、５２位、９７位、１０９位、１１９位、１２５位および２０２位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号２の配列を有するか；または配列番号２の配列と比べて１つのアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、配列番号２に対するアミノ酸置換は、配列番号２の５位、５２位、９７位、１０９位、１１９位、１２５位、および２０２位に対応するポリペプチドの位置においてではない。

この態様のある実施形態において、第２のデング熱抗原は、配列番号２の配列を有するポリペプチドを含む。

この態様のある実施形態において、抗デングウイルス抗体の検出のための免疫診断試験デバイスは、第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を含み、この場合、第１のデング熱抗原は、配列番号１に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに第２のデング熱抗原は、配列番号２の配列を有するポリペプチドまたは配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する置換されたポリペプチドを含み、ならびに第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有し、ならびに第２のデング熱抗原の置換ポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原は、配列番号３に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに、場合により、配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９２％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９４％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９６％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９８％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９９％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３の配列を有するか；または配列番号３の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３の配列を有するか；または配列番号３の配列と比べて少なくとも１つかつ３つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３の配列を有するか；または配列番号３の配列と比べて少なくとも１つかつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原は、配列番号３の配列を有するポリペプチドまたは配列番号３の配列と比べて１つのアミノ酸置換を有する配列を有するポリペプチドを含む。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９２％配列同一性を有し、ならびに配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９４％配列同一性を有し、ならびに配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９６％配列同一性を有し、ならびに配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９８％配列同一性を有し、ならびに配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９９％配列同一性を有し、ならびに配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３の配列を有するか；または配列番号３の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３の配列を有するか；または配列番号３の配列と比べて少なくとも１つかつ３つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３の配列を有するか；または配列番号３の配列と比べて少なくとも１つかつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号３の配列を有するか；または配列番号３の配列と比べて１つの置換を有する配列を有し、この場合、配列番号３に対するアミノ酸置換は、配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置においてではない。

この態様のある実施形態において、第３のデング熱抗原は、配列番号３の配列を有するポリペプチドを含む。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、場合により、配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９２％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９４％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９６％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９８％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９９％配列同一性を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４の配列または配列番号４の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４の配列を有するか；または配列番号４の配列と比べて少なくとも１つかつ３つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４の配列を有するか；または配列番号４の配列と比べて少なくとも１つかつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４の配列を有するか；または配列番号４の配列と比べて１つのアミノ酸置換を有する配列を有する。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９２％配列同一性を有し、ならびに配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９４％配列同一性を有し、ならびに配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９６％配列同一性を有し、ならびに配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９８％配列同一性を有し、ならびに配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９９％配列同一性を有し、ならびに配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４の配列を有するか；または配列番号４の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４の配列を有するか；または配列番号４の配列と比べて少なくとも１つかつ３つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４の配列を有するか；または配列番号４の配列と比べて少なくとも１つかつ２つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有し、この場合、当該置換されたポリペプチドは、配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号４の配列を有するか；または配列番号４の配列と比べて１つの置換を有する配列を有し、この場合、配列番号４に対するアミノ酸置換は、配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置においてではない。

この態様のある実施形態において、第４のデング熱抗原は、配列番号４の配列を有するポリペプチドを含む。

この態様のある実施形態において、抗デングウイルス抗体の検出のための免疫診断試験デバイスは、本明細書において定義される第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を含み、ならびに当該デバイスは、さらに、第３のデング熱抗原および第４のデング熱抗原を含み、この場合、第３のデング熱抗原は、配列番号３に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号３の９８位から１１０位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有し、ならびに第４のデング熱抗原は、配列番号４に対して少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、当該ポリペプチドは、配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチド内の位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する。

この態様の一実施形態において、当該免疫診断試験デバイスは、支持体、試料パッド、コンジュゲートパッド、分析パッド、吸収パッド、少なくとも１つの検出ライン、および少なくとも１つの品質コントロールラインを含む。この実施形態において、コンジュゲートパッドは、上記デング熱抗原を含み得、ならびに当該抗原のそれぞれは、検出可能な部分にコンジュゲートされる。当該検出可能な部分は、例えば、金コロイドであり得る。この実施形態において、少なくとも１つの捕捉部分が、検出ラインに固定される。当該捕捉部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または異なるモノクローナル抗体の混合物であり得、あるいは当該捕捉部分は、ヒトＩｇＧ抗体に対する特異性を有する任意の他の関連する結合パートナーであってもよい。この態様のある実施形態において、当該捕捉部分は、抗体、例えば、抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体である。この態様の別の実施形態において、コンジュゲートパッドは、品質コントロールラインに固定することができるコントロールコンジュゲートを含み得る。この実施形態において、コントロールコンジュゲートは、検出可能な部分、例えば、金コロイド、および相補的結合パートナーに結合することができる結合パートナーを含み、この場合、相補的結合パートナーは、品質コントロールラインに固定される。結合パートナーは、例えば、トリＩｇＹ抗体であり、ならびに品質コントロールラインに固定される相補的結合パートナーは、例えば、抗トリＩｇＹ抗体、例えば、ヤギ抗トリＩｇＹ抗体など、である。

別の態様において、本発明は、対象におけるデング熱感染の診断における使用のための、または診断における補助としての使用のための、本明細書において説明される免疫診断試験デバイスを提供する。

この態様の一実施形態において、対象はヒトである。したがって、この実施例において、本発明は、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒト、におけるデング熱感染の診断における使用のための、本明細書において説明される免疫診断試験デバイスを提供する。この態様の一実施形態において、ヒト対象は、デング熱風土病地域、例えば、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である地域、に存する。この態様の別の実施形態において、ヒト対象は、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が１０％から９０％の間、例えば１０％から８０％の間、１０％から７０％の間、１０％から６０％の間、１０％から５０％の間、２０％から８０％の間、２０％から７０％の間、２０％から６０％の間、または２０％から５０％の間である地域、に存する。地域集団に対するデング熱血清陽性の比率は、全体としての集団に対して、または特定の年齢グループ、例えば、６歳、９歳、１２歳、１５歳、１７歳、１９歳、または２１歳、に対して示される。

この態様の一実施形態において、デング熱感染は、以前のデング熱感染である。以前のデング熱感染は、過去に生じた感染として本明細書において定義され、すなわち、それは急性デング熱感染ではない。対象における急性デング熱感染は、対象における発熱の存在ならびに対象から採取された試料中のデングウイルスおよび／またはデング熱ＮＳ１タンパク質および／またはデングウイルスＲＮＡの存在によって特徴づけられる。この態様の一実施形態において、以前のデング熱感染は、デング熱感染の診断における本発明のある実施形態の免疫診断試験デバイスの使用の少なくとも２８日前に、対象、例えば、ヒト対象、において生じた。別の実施形態において、以前のデング熱感染は、デング熱感染の診断における本発明のある実施形態の免疫診断試験デバイスの使用の少なくとも３か月前、少なくとも６か月前、または少なくとも１年前、例えば、１年～３年前、１年～５年前、または１年～１０年前に、対象、例えば、ヒト対象、において生じた。この態様の一実施形態において、対象における以前のデング熱感染は、対象から採取された試料中の抗デング熱ＩｇＧ抗体の存在ならびにデングウイルスおよび／またはデング熱ＮＳ１タンパク質および／またはデングウイルスＲＮＡの不在によって特徴づけられる。

別の態様において、本発明は、対象におけるデング熱感染を特定または検出する方法であって、
ａ．第１および第２のデング熱抗原は、本明細書において定義される通りであり、ならびに当該デング熱抗原は、検出可能な部分にコンジュゲートされる、第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を提供する工程；
ｂ．デング熱抗原を、潜在的に、当該抗原の少なくとも１つに結合することができる少なくとも１つの結合パートナーを含有する、対象から得られた生物学的試料と接触させる工程；および
ｃ．当該試料が当該少なくとも１つの結合パートナーを含む場合、存在が対象におけるデング熱ウイルス感染を示す、デング熱抗原検出可能部分コンジュゲートの少なくとも１つと少なくとも１つの結合パートナーとの間に形成される複合体の存在を検出する工程、
含む方法を提供する。

この態様の一実施形態において、対象は、ヒト、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトである。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、デング熱風土病地域、例えば、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である地域、に住んでいる。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が１０％から９０％の間、例えば１０％から８０％の間、１０％から７０％の間、１０％から６０％の間、１０％から５０％の間、２０％から８０％の間、２０％から７０％の間、２０％から６０％の間、または２０％から５０％の間である地域に住んでいる。地域集団に対するデング熱血清陽性の比率は、全体としての集団に対して、または特定の年齢グループ、例えば、６歳、９歳、１２歳、１５歳、１７歳、１９歳、または２１歳、に対して示される。

この態様の一実施形態において、工程（ａ）は、さらに、第３のデング熱抗原および第４のデング熱抗原を提供する工程を含み、この場合、第３および第４のデング熱抗原は、本明細書において定義される通りであり、ならびに当該デング熱抗原は、検出可能な部分にコンジュゲートされる。

この態様の一実施形態において、当該方法は、インビトロ法である。

この態様の一実施形態において、少なくとも１つの結合パートナーは、デングウイルスに対する抗体である。この態様の別の実施形態において、少なくとも１つの結合パートナーは、デングウイルスに対するＩｇＧ抗体である。

この態様の一実施形態において、検出可能な部分は、金コロイドである。

この態様の一実施形態において、生物学的試料は、唾液、全血（静脈血または毛細血管血（指先穿刺血）のどちらか）、血漿、血清、および尿からなる群から選択される。

この態様の一実施形態において、生物学的試料は、全血（静脈血または毛細血管血（指先穿刺血）のどちらか）、血漿、および血清からなる群から選択される。

この態様の一実施形態において、試料は、全血（静脈血または毛細血管血（指先穿刺血）のどちらか）である。

この態様の一実施形態において、試料は、毛細血管全血である。

この態様の一実施形態において、デング熱感染は、以前のデング熱感染である。以前のデング熱感染は、過去に生じた感染として本明細書において定義され、すなわち、急性デング熱感染ではない。対象における急性デング熱感染は、対象における発熱の存在ならびに対象から採取された試料中のデングウイルスおよび／またはデング熱ＮＳ１タンパク質の存在によって特徴づけられる。一実施形態において、以前のデング熱感染は、生物学的試料を対象から得る少なくとも２８日前に、対象、例えば、ヒト対象、において生じていた。別の実施形態では、以前のデング熱感染は、生物学的試料を対象から得る少なくとも３か月前、少なくとも６か月前、または少なくとも１年前、例えば、１年～３年前、１年～５年前、または１年～１０年前に、対象、例えば、ヒト対象、において生じていた。この態様の一実施形態において、対象における以前のデング熱感染は、対象から採取された試料中における抗デング熱ＩｇＧ抗体の存在ならびにデングウイルスおよび／またはデング熱ＮＳ１タンパク質の不在によって特徴づけられる。

この態様の一実施形態において、デング熱抗原検出可能部分コンジュゲートの少なくとも１つと少なくとも１つの結合パートナーとの間に形成される複合体の存在を検出する工程は、複合体を少なくとも１つの結合パートナーにハイブリダイズすることができる分子と接触させる工程を含む。

この態様の一実施形態において、少なくとも１つの結合パートナーにハイブリダイズすることができる分子は、ヒト抗体に対して特異性を有する抗体である。

この態様の一実施形態において、ヒト抗体に対して特異性を有する抗体は、ヒトＩｇＧ抗体に対して特異的である。

別の態様において、本発明は、デング熱血清陽性対象を識別する方法であって、（ｉ）当該対象から生物学的試料を得る工程、および（ｉｉ）本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して当該試料を分析する工程、を含む上記方法を提供する。

この態様の一実施形態において、対象は、ヒト、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒト、である。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、デング熱風土病地域、例えば、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である地域、に住んでいる。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が１０％から９０％の間、例えば１０％から８０％の間、１０％から７０％の間、１０％から６０％の間、１０％から５０％の間、２０％から８０％の間、２０％から７０％の間、２０％から６０％の間、または２０％から５０％の間である地域に住んでいる。地域集団に対するデング熱血清陽性の比率は、全体としての集団に対して、または特定の年齢グループ、例えば、６歳、９歳、１２歳、１５歳、１７歳、１９歳、または２１歳、に対して示される。この態様の別の実施形態において、対象は、モノタイプデング熱血清陽性対象、例えば、ヒトモノタイプデング熱血清陽性対象である。この態様の別の実施形態において、対象は、マルチタイプデング熱血清陽性対象、例えば、ヒトマルチタイプデング熱血清陽性対象である。

別の態様において、本発明は、デング熱血清陰性対象を識別する方法であって、（ｉ）当該対象から生物学的試料を得る工程、および（ｉｉ）本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して当該試料を分析する工程、を含む上記方法を提供する。

この態様の一実施形態において、対象はヒトである。

別の態様において、本発明は、抗デング熱抗体を検出する方法であって、（ｉ）当該対象から生物学的試料を得る工程、および（ｉｉ）本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して当該試料を分析する工程、を含む上記方法を提供する。

この態様の一実施形態において、当該方法は、インビトロ法である。

この態様の一実施形態において、当該方法は、例えば、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒト、における抗デング熱ＩｇＧ抗体を検出する方法である。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、デング熱風土病地域、例えば、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である地域、に住んでいる。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が１０％から９０％の間、例えば１０％から８０％の間、１０％から７０％の間、１０％から６０％の間、１０％から５０％の間、２０％から８０％の間、２０％から７０％の間、２０％から６０％の間、または２０％から５０％の間である地域に住んでいる。地域集団に対するデング熱血清陽性の比率は、全体としての集団に対して、または特定の年齢グループ、例えば、６歳、９歳、１２歳、１５歳、１７歳、１９歳、または２１歳、に対して示される。

この態様の一実施形態において、当該方法は、ヒト対象において抗デング熱ＩｇＧ抗体を検出するインビトロ方法であって、（ｉ）当該対象から生物学的試料を得る工程、および（ｉｉ）本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して当該試料を分析する工程、を含む上記方法である。

この態様の一実施形態において、生物学的試料は、唾液、全血（静脈血または毛細血管血（指先穿刺血）のどちらか）、血漿、血清、および尿からなる群から選択される。

この態様の一実施形態において、生物学的試料は、全血（静脈血または毛細血管血（指先穿刺血）のどちらか）、血漿、または血清からなる群から選択される。

この態様の一実施形態において、試料は、全血（静脈血または毛細血管血（指先穿刺血）のどちらか）である。

この態様の一実施形態において、試料は、毛細血管全血である。

この態様の一実施形態において、ＩｇＧ抗体は、抗デング熱エンベロープタンパク質抗体である。この態様の特定の実施形態において、ＩｇＧ抗体は、配列番号１～４からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチド配列に対して特異的である。

別の態様において、本発明は、デング熱に対して対象にワクチン接種する方法であって、（ｉ）当該対象から生物学的試料を得る工程、（ｉｉ）当該対象がデング熱血清陽性であるか否かを特定するために、本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して当該試料を分析する工程、および（ｉｉｉ）当該対象が工程（ｉｉ）の分析によりデング熱血清陽性である場合、デング熱ワクチンを当該対象に投与する工程、を含む上記方法を提供する。さらに、この態様において、本発明は、デング熱に対して対象にワクチン接種する方法における使用のための、本明細書において定義される免疫診断試験デバイスであって、上記方法は、以下の工程：（ｉ）当該対象から生物学的試料を得る工程、（ｉｉ）当該対象がデング熱血清陽性であるか否かを特定するために、本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して当該試料を分析する工程、および（ｉｉｉ）当該対象が工程の分析（ｉｉ）に従ってデング熱血清陽性である場合、デング熱ワクチンを当該対象に投与する工程、を含む、上記デバイスも提供する。さらに、この態様において、本発明は、デング熱に対して対象にワクチン接種する方法であって、当該対象は、本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して、以前にデング熱血清陽性であったことが示され、ならびにデング熱ワクチンを当該対象に投与する工程を含む上記方法も提供する。さらに、この態様において、本発明は、デング熱に対して対象にワクチン接種する方法における使用のためのデング熱ワクチンであって、当該対象は、本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して、以前にデング熱血清陽性であったことが示される、上記ワクチンも提供する。

この態様（すなわち、先行のパラグラフにおいて言及されるようなワクチン接種の工程を含む、本発明の態様）の一実施形態において、対象は、ヒト、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒト、である。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、デング熱風土病地域、例えば、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である地域、に住んでいる。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が１０％から９０％の間、例えば１０％から８０％の間、１０％から７０％の間、１０％から６０％の間、１０％から５０％の間、２０％から８０％の間、２０％から７０％の間、２０％から６０％の間、または２０％から５０％の間である地域に住んでいる。地域集団に対するデング熱血清陽性の比率は、全体としての集団に対して、または特定の年齢グループ、例えば、６歳、９歳、１２歳、１５歳、１７歳、１９歳、または２１歳、に対して示される。この態様の別の実施形態において、対象は、以前にデング熱ワクチンを受けていないヒトである。したがって、対象から得られる生物学的試料が工程（ｉｉ）の分析によりデング熱血清陽性である場合、デング熱血清反応陽性は、自然感染の結果であろう。この態様の別の実施形態において、ワクチンは、血清型１～４のそれぞれのデング熱抗原を含む四価ワクチンである。この態様の別の実施形態において、血清型１～４のデング熱抗原のそれぞれは、弱毒化生（非キメラ）デングウイルスおよび弱毒化生キメラデングウイルスからなる群から独立して選択される。この態様の別の実施形態において、血清型１～４のデング熱抗原のそれぞれは、弱毒化生キメラ黄熱－デングウイルス、例えば、ワクチンＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ、リヨン、フランス）である。この態様の別の実施形態において、血清型１、３、および４のデング熱抗原のそれぞれは、弱毒化生キメラデングウイルス（詳細には、キメラデング－デングウイルス）であり、ならびに血清型２のデング熱抗原は、弱毒化生非キメラデングウイルス、例えば、ワクチンＴＡＫ－００３（Ｔａｋｅｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、東京、日本）であり、Ｂｉｓｗａｌら， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ （２０２０）， ｖｏｌ． ３９５， ｉｓｓｕｅ １０２３４， ｐ． １４２３～１４３３ （ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３０４１４－１）を参照されたい。この態様の別の実施形態において、血清型１、３、および４のデング熱抗原のそれぞれは、弱毒化生非キメラデングウイルス、であり、ならびに血清型２のデング熱抗原は、弱毒化生キメラデングウイルスであり、詳細にはキメラデング－デングウイルス、例えば、ワクチンＴＶ００３（Ｂｕｔａｎｔａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ブラジル）であり、Ｋａｌｌａｓら， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （２０２０）， ｖｏｌ． ２０（７）， ｐ． ８３９～８５０ （ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ１４７３－３０９９（２０）３００２３－２）を参照されたい。この態様の別の実施形態において、本発明は、デング熱に対して対象にワクチン接種する方法における使用のためのデング熱ワクチンであって、対象は、本明細書において定義される免疫診断試験デバイスを使用して、以前にデング熱血清陽性であったことが示され、ならびに当該デング熱ワクチンは、（ｉ）血清型１～４のデング熱抗原のそれぞれが弱毒化生キメラ黄熱－デングウイルス（例えば、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標））である、血清型１～４のそれぞれのデング熱抗原を含む四価ワクチン；（ｉｉ）血清型１、３、および４のデング熱抗原のそれぞれは、弱毒化生キメラデングウイルス（例えば、キメラデング－デングウイルス）であり、ならびに血清型２のデング熱抗原は、弱毒化生非キメラデングウイルス（例えば、ＴＡＫ－００３）である、血清型１～４のそれぞれのデング熱抗原を含む四価ワクチン；および（ｉｉｉ）血清型１、３、および４のデング熱抗原のそれぞれは、弱毒化生非キメラデングウイルスであり、ならびに血清型２のデング熱抗原は、弱毒化生キメラデングウイルス（例えば、キメラデング－デングウイルス）、例えば、ワクチンＴＶ００３である、血清型１～４のそれぞれのデング熱抗原を含む四価ワクチン、からなる群から選択される、上記ワクチンを提供する。デング熱に対してワクチン接種された対象は、好ましくは、ヒト、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒト、である。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、デング熱風土病地域、例えば、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である地域、に住んでいる。この態様の別の実施形態において、ヒト対象、例えば、少なくとも６歳または少なくとも９歳の、例えば、６～６０歳または９～４５歳のヒトは、地域集団におけるデング熱血清陽性の比率が１０％から９０％の間、例えば１０％から８０％の間、１０％から７０％の間、１０％から６０％の間、１０％から５０％の間、２０％から８０％の間、２０％から７０％の間、２０％から６０％の間、または２０％から５０％の間である地域に住んでいる。地域集団に対するデング熱血清陽性の比率は、全体としての集団に対して、または特定の年齢グループ、例えば、６歳、９歳、１２歳、１５歳、１７歳、１９歳、または２１歳、に対して示される。

別の態様において、本発明は、さらに、本明細書において説明される免疫診断試験デバイスのいずれかを製造する方法を提供する。例えば、本発明は、支持体、試料適用ゾーン、本明細書において説明される少なくとも１つのコンジュゲートされたデング熱抗原を含む抗原コンジュゲートゾーン、固定された捕捉部分を含む分析ゾーン、および吸収ゾーンを含む免疫診断試験デバイスを製造する方法であって、以下の工程：（ｉ）支持体を提供する工程；（ｉｉ）捕捉ゾーン、吸収ゾーン、抗原コンジュゲートゾーン、および試料適用ゾーンを支持体に取り付け、結果として、上記免疫診断試験デバイスを形成する工程、を含む上記方法を提供する。この態様の一実施形態において、抗原コンジュゲートゾーンは、第１のコンジュゲートされたデング熱抗原および第２のコンジュゲートされたデング熱抗原を含み、当該第１および第２のデング熱抗原は、本明細書において説明される通りである。この態様の一実施形態において、抗原コンジュゲートゾーンは、第１のコンジュゲートされたデング熱抗原、第２のコンジュゲートされたデング熱抗原、第３のコンジュゲートされたデング熱抗原、および第４のコンジュゲートされたデング熱抗原を含み、この場合、当該第１、第２、第３、および第４のデング熱抗原は、本明細書において説明される通りである。この態様の一実施形態において、当該コンジュゲートされたデング熱抗原は、検出可能な部分、例えば、金コロイド、にコンジュゲートされる。この態様の一実施形態において、当該固定された捕捉部分は、モノクローナル抗体、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体である。この態様の一実施形態において、捕捉ゾーン、吸収ゾーン、抗原コンジュゲートゾーン、および試料適用ゾーンを支持体に取り付ける工程は、ラミネーションによって達成される。この態様の一実施形態において、当該方法は、さらに、コントロール捕捉部分、例えば、抗トリＩｇＹ抗体、を支持体に取り付ける工程、および本明細書において定義されるコントロールコンジュゲートを抗原ゾーンに含ませる工程を含む。この態様の一実施形態において、支持体は、ニトロセルロースである。

本発明の実施例は、デング熱に対して血清陽性または血清陰性である血清試料と他の関連するフラビウイルス、例えば、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、および黄熱ウイルス（ＹＦＶ）など、とを区別する本発明の免疫診断試験の能力の分析について説明する。本発明の免疫診断試験の特性を正しく調査するために、他の有効なフラビウイルスセロテストを使用して血清試料の実際のフラビウイルス状態を高い確実性において特定することが必要である。血清試料のフラビウイルスの状態を特定する方法は、以下のパラグラフにおいて説明される通りである。

血清試料がデング熱非デング熱風土病地域（例えば、米国、欧州本土など）に住む対象から採取されている場合、試料がデング熱血清陽性またはデング熱血清陰性のどちらであるかを特定するための好適なセロテストは、Ｔｉｍｉｒｙａｓｏｖａ， Ｔ．Ｍ．ら， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． （２０１３）， ｖｏｌ． ８８（５）， ９６２～９７０に記載されるデング熱プラーク減少中和試験（Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）（ＰＲＮＴ_５０）アッセイであろう。簡潔に説明すると、血清（以前に熱不活性化された）の２倍段階希釈が、必要に応じて血清型１、２、３、または４の各デングウイルスの一定のチャレンジ用量（ＰＦＵ／ｍＬとして表現される）と混合される。ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）デング熱ワクチンコンストラクトの親デングウイルス株が、チャレンジ株として使用される。これらの親株は以下の通りである－血清型１：株ＰＵＯ３５９（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， （２００１） ｖｏｌ． ７５（１６）： ７２９０～７３０４およびＧｅｎＢａｎｋ配列記録ＡＦ４２５６３０）；血清型２：株ＰＵＯ２１８（Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． （１９８８）， ｖｏｌ． ６９：１３９１～１３９８およびＧｅｎＢａｎｋ配列記録Ｄ００３４５）；血清型３：株ＰａＨ８８１／８８（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， （２００１） ｖｏｌ． ７５（１６）： ７２９０～７３０４およびＧｅｎＢａｎｋ配列記録ＡＦ３４９７５３）、および血清型４：株１２２８（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， （２００１） ｖｏｌ． ７５（１６）： ７２９０～７３０４およびＧｅｎＢａｎｋ配列記録ＪＮ０２２６０８）。次いで、当該混合物は、コンフルエントなＶｅｒｏ細胞単層（ＣＣｌ－８１細胞、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア、米国）から入手可能）を伴うマイクロプレートのウェルに播種される。吸着後、細胞単層が、数日間インキュベートされる。デングウイルス感染細胞の存在は、感染巣（すなわち、プラーク）の形成によって示され、その結果、血清試料中の中和抗体の存在に起因するウイルス感染性の減少（すなわち、プラークの数の減少）を検出することができる。報告される値（エンドポイント中和力価）は、ネガティブコントロールウェル（１００％のウイルス負荷を表す）における平均ウイルスプラーク数と比較した場合にデング熱チャレンジウイルスの≧５０％（プラーク数）が中和される、血清の最も高い希釈を表す。エンドポイント中和力価は、連続値として提示される。アッセイの定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、１０（１／ｄｉｌ）である。一般的に、力価が１０（１／ｄｉｌ）以上のときにセロコンバージョンが生じると考えられている。ＰＲＮＴ試験が実験室から別のものへとわずかに変わり得る場合、ＬＬＯＱもわずかに変わり得る。したがって、一般的に、力価が当該試験のＬＬＯＱと同等以上のときにセロコンバージョンが生じると考えられる。しかしながら、代替手段として、セロコンバージョンを決定するより高いカットオフ（すなわち、陽性結果）、例えば、２５（１／ｄｉｌ）、５０（１／ｄｉｌ）、７５（１／ｄｉｌ）、または１００（１／ｄｉｌ）が、ＰＲＮＴ_５０との関連において使用される。

血清試料が、デング熱風土病地域（例えば、ブラジル、コロンビア、タイ、フィリピンなど）に住む対象から採取される場合、したがって、当該試料が、他の関連フラビウイルスに対して特異的な抗体を含み得る場合、好ましくは、当該試料のデング熱血清状態は、３つのデング熱セロテスト、すなわち、ＰＲＮＴ_９０アッセイ、ＰＲＮＴ_５０アッセイ、および抗デング熱ＮＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、の使用を組み合わせる、図１Ａに示される分類アルゴリズムに従って特定される。ＰＲＮＴ_９０アッセイに対して、より高い９０％中和のカットオフ値を、５０％中和に対する試験において得られた元のプラーク数から再計算することができる（図１Ｂを参照されたい）。したがって、ＰＲＮＴ_５０は、ウイルスインプットと比較しておよそ５０％の中和レベルの血清希釈による４点線形回帰を使用して計算され、ならびに、ＰＲＮＴ_９０は、およそ９０％の中和レベルの血清希釈による４点線形回帰を使用して同じように計算される。デング熱風土病地域に住む対象からの血清試料を評価する際の図１Ａのアルゴリズムの値は、以下の通りである。上記において説明されるように、デング熱ＰＲＮＴは、ウイルス中和に基づく機能的アッセイである。ＰＲＮＴ_５０およびＰＲＮＴ_９０に対する陽性は、少なくとも１つのデング熱血清型に対して≧１０（１／希釈［ｄｉｌ］）の力価の試料に対して定義される。デング熱ＰＲＮＴ試験に関するＷＨＯガイドライン（世界保健機構－デングウイルスに対するヒト抗体のプラーク減少中和試験に対するガイドライン。ジュネーブ：ＷＨＯ／ＩＶＢ／０７．０７； ２００７）に従って、ＰＲＮＴアッセイは、フラビウイルスに対して最も血清学的にウイルス特異的な、ならびにデングウイルスに対して血清型特異的な試験である。ガイドラインでは、ＰＲＮＴ_９０は、風土病地域での前デング熱暴露の評価において、ＰＲＮＴ_５０より有用であると述べられており、と言うのも、それは、関連するフラビウイルスに対する交差反応性中和抗体のバックグラウンドを減少させ、結果として、高い特異度をもたらすからである。しかしながら、非常に高い特異性の試験は、特異性の低い試験よりも感度が低い可能性が高い。結果として、ＰＲＮＴ_９０アッセイにおいてデング熱陰性を試験するいくつかの試料は、本当にデング熱陽性であり得る（ＰＲＮＴ_９０偽陰性）。偽陰性のリスクを最小化するために、図１Ａに示される分類アルゴリズムは、同時に最小のデング熱偽陽性を維持しつつ、デング熱陽性としてのＰＲＮＴ_９０偽陰性を「レスキュー」する試みにおいて、追加のセロテスト（ＰＲＮＴ_５０および抗デング熱ＮＳ１ ＥＬＩＳＡ）からの情報を導入する。ＰＲＮＴに関して、フラビウイルスにおけるデングウイルス抗体中和においてある役割を果たすと考えられる原発性ウイルス成分は、エンベロープタンパク質であり、その一方で、プレ膜タンパク質は、限られた役割を果たす。対照的に、ＮＳ１は、ビリオンの構成成分ではないが、むしろ、急性感染の際に、感染した宿主細胞によって血液循環中へと分泌される。デング熱ＮＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡは、まさに有用であると見なされるが、それは、ＮＳ１タンパク質がフラビウイルスにおいて十分には保存されないためである。初期特性評価研究は、９ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）／ｍＬの閾値レベルが非常に高い感度（＞９５％、低い偽デング熱血清陰性）に関連し、ならびに、５０ＥＵ／ｍＬの閾値がデング熱血清陽性の個人の識別における非常に高い感度に関連することを示した。このことは、さらに、試料の大きいセットにおいても確認され、それは、≧５０ＥＵ／ｍＬのデング熱ＮＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡリードアウトの試料の＞９９％はＰＲＮＴ_９０陽性でもあることを明らかにした（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ ＥＪＭら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１８； ２５７：４８～５７）。ＰＲＮＴアッセイにおける主なウイルス標的は、デング熱ＮＳ１ ＩｇＧアッセイにおける標的とは異なるため、これらのアッセイは、図１Ａに示される分類アルゴリズムにつながる、前デング熱暴露の可能性についての補足情報を提供する。

デング熱抗ＮＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡは、Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ ＥＪＭら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１８； ２５７：４８～５７ （ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２０１８．０３．００７）に記載されるように実施した。簡潔に説明すると、等モル濃度のデング熱ＮＳ１抗原の４つ全ての血清型（Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、オックスフォードシャー、イギリス）を、ｐＨ９．６±０．１の炭酸／重炭酸緩衝液において４℃で一晩かけて、９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングした。コーティングしたプレートを、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ－Ｔ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、米国）によって洗浄し、１％（ｖ／ｖ）ヤギ正常血清（１％ ＧＮＳ；Ｇｉｂｃｏ、ゲイザースバーグ、米国）を補ったＰＢＳ－Ｔによって、２１℃で４５±５分かけてブロックした。プレートを再びＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで、１％ＧＮＳ中における２倍段階希釈したヒト試料および内部クオリティコントロールを加えて、３７℃で６０±５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、１％ＧＮＳ中におけるペルオキシダーゼ標識Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃｙ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、米国）によって３７℃で６０±５分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳｅｒａＣａｒｅ、ミルフォード、米国）によって２１℃で３０±２分間かけて顕色した。反応を１ＮのＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フェアローン、米国）によって停止させ、４５０ｎｍの光学密度（参照波長として６５０ｎｍ）を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアバージョン６．５．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベル、米国）と併せて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベル、米国）を使用して測定した。血清試料中の抗デング熱ＩｇＧの幾何平均濃度（ＧＭＣ）を、ＥＬＩＳＡ単位／ミリリットル（ＥＵ／ｍＬ）において報告された各試料の濃度を特定するために試料希釈に対して修正された、最低３つの値を使用してＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅにおいて構築した、４パラメーターロジスティック（４ＰＬ）モデルを使用して参照基準に関して特定した。

日本脳炎ウイルス中和抗体測定が、ＰＲＮＴによって評価される。試験される血清（前に熱不活性化された）の１０倍段階希釈が、一定のチャレンジ用量（ＰＦＵ／ｍＬとして表現される）のＪＥ北京株（遺伝子型ＩＩＩ）と混合される。当該混合物は、コンフルエントＬＬＣ－ＭＫ２細胞のプレートのウェルへ播種される。吸着後、細胞単層が重ねられ、数日間インキュベートされる。報告された値（エンドポイント中和力価）は、１００％のウイルス負荷を表すネガティブコントロールと比較して、ＪＥチャレンジウイルスの≧５０％が中和される、血清の最も高い希釈を表す。

黄熱中和抗体レベルが、ＰＲＮＴによって測定される。簡潔に説明すると、試験される血清（予め熱不活性化された）の連続２倍段階希釈物を、ＰＦＵ／ｍＬとして表現される一定濃度のＹＦワクチン株１７Ｄ（Ｔｈｅｉｌｅｒ Ｍ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｈ．Ｈ．， １９３７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， ６５． ７６７～７８６）と混合する。当該混合物は、デュブリケートにおいて、コンフルエントＶｅｒｏ細胞のプレートのウェルへ播種される。吸着後、細胞単層が重ねられ、数日間インキュベートされる。報告された値（エンドポイント中和力価）は、１００％のウイルス負荷を表すネガティブコントロールウェルと比較して、ＹＦチャレンジウイルスの≧５０％（プラーク数において）が中和される、血清の最も高い希釈を表す。

ジカ中和抗体が、Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ ＥＪＭら， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ．， １０１（３）， ２０１９， ｐｐ． ７０８～７１５ （ｄｏｉ：１０．４２６９／ａｊｔｍｈ．１９－０２７０）に記載されるようなマイクロ中和アッセイによって評価される。簡潔に説明すると、試験される血清（前に熱不活性化された）の連続２倍段階希釈物を、一定濃度のジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９ （ＶＲ－１８４３、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ［ＡＴＣＣ］、ロックビル、ＭＤ）と混合する。当該混合物は、デュブリケートにおいて、許容細胞を伴う９６ウェルマイクロプレートのウェルへ播種される。吸着後、細胞単層が、数日間インキュベートされる。血清試料中に存在する抗体による中和によるウイルス感染性の減少（ウイルス抗原産生）が、ＥＬＩＳＡによって検出される。洗浄および固定化の後、細胞におけるジカウイルス抗原産生は、ジカ特異的モノクローナル抗体（抗ｐａｎフラビウイルスｍＡｂ、Ｂｉｏｔｅｍ Ｉｎｃ．（Ａｐｐｒｉｅｕ、フランス）製のＨＢ１１２－４Ｇ２）、抗マウスＩｇコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のホースラディッシュ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ）、および発色基質（ＳｅｒａＣａｒｅ製のＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質系）による連続するインキュベーションによって検出される。結果として生じるＯＤが、マイクロプレートリーダーを使用して測定される。ウイルスコントロールウェルと比較した場合のジカウイルス感染性の低下は、陽性中和反応を構成し、それは、血清試料中の中和抗体の存在を示している。その一方で、細胞の感染は、血清試料中の中和抗体の不在を示している。

例えば、本明細書において開示される方法との関連において、本明細書において開示される免疫診断試験デバイスを使用する場合、コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の背後の原因病原体である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対しても対象が陽性でないことを確保するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して対象を試験することも、好ましくあり得る。例えば、両方ともＣＴＫ Ｂｉｏｔｅｃｈ （カリフォルニア、米国）によって製造されるオンサイト ＣＯＶＩＤ－１９ Ａｇ迅速試験またはＡｒｉｄｉａ ＣＯＶＩＤ－１９リアルタイムＰＣＲ試験など、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性を特定するための多くの試験が存在する。さらに、例えば、本明細書において開示される方法との関連において、本明細書において開示される免疫診断試験デバイスを使用する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２大流行の急性期との関連において当該試験を使用するのを避けることが好ましくあり得、例えば、本明細書において開示される免疫診断試験デバイスを使用する場合などには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が（活発に）循環していない地域および／または急性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が存在しない可能性の高い地域において、当該試験を使用することが好ましくあり得る。

２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、例えば、２つの配列を手作業でアラインメントすることによって特定することができる。あるいは、パーセント同一性は、より便利には、標準的アラインメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５： ４０３～４１０に記載されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４４～４５３のアルゴリズム；Ｍｅｙｅｒｓら （１９８８） Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ４： １ １ ～１７のアルゴリズム；またはＴａｔｕｓｏｖａら （１９９９） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １７４： ２４７～２５０など、によって特定される。そのようなアルゴリズムは、ヌクレオチドＢＬＡＳＴおよびタンパク質ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを参照されたい）。そのようなプログラムを利用する場合、デフォルトのパラメーターを使用することができる。例えば、ヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドＢＬＡＳＴに対して以下の設定を使用することができる：０．０５のｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；２８のｗｏｒｄ ｓｉｚｅ；０のｍａｘｉｍｕｍ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ；１、－２のｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｃｏｒｅｓ、およびｌｉｎｅａｒ ｇａｐ ｃｏｓｔｓ。アミノ酸配列の場合、タンパク質ＢＬＡＳＴに対して以下の設定を使用することができる：ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ０．０５；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ３；ｍａｘｉｍｕｍ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ ０の；ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ － ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １、ならびにｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ。

実施例１
免疫診断試験デバイスの構造、構成、および操作
本発明の免疫診断試験デバイスは、迅速診断試験（ＲＤＴ）としても知られるラテラルフロー型診断試験である。以下の実施例は、そのような試験の構造、構成、および操作の説明を提供する。

本発明のある実施形態によるラテラルフロー型デング熱診断試験の概略図は、図２Ａに示されている通りである。図２Ｂは、エンドユーザーに提示することができるような、本発明のある実施形態によるラテラルフロー型デング熱診断試験のダイアグラムを示している。図２Ａから分かるように、当該試験は、試料パッド、コンジュゲートパッド、分析パッド、および吸収パッドが上にラミネートされたニトロセルロース支持体を含む。

試料が適用される試料パッドは、グラスファイバーで作製されており、血球をろ別するが抗体は透過するように設計される。

分析パッドは、ヒトＩｇＧ抗体、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または異なるモノクローナル抗体の混合物、に対して特異的な固定された結合部分を含む試験ラインを含む。そのような抗体の例は、ＣＴＫ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（カリフォルニア、米国）によって製造されたマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体Ｂ００１５である。Ｂ００１５は、ヒトＩｇＧによってマウスを免疫することによって作製されており、プロテインＡクロマトグラフィーによって細胞培養物から精製された。そのアイソタイプはＩｇＧ１であり、それは、ヒトＩｇＧのＦｃ部分を認識する。試験ライン抗体Ｂ００１５の溶液を調製し、支持体上にコーティングした。分析パッドは、抗トリＩｇＹ抗体を含むコントロールラインも含む。そのような抗体の例は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ研究所Ｉｎｃ．（オレゴン、米国）によって製造されたヤギ抗トリＩｇＹ抗体ＧＧＨＬ－３０Ａである。ＧＧＨＬ－３０Ａは、高度に精製されたトリＩｇＹ ｈ＋Ｉによってヤギを免疫して、抗血清を収集し、免疫溶媒を含有するトリＩｇＹを使用して、抗体をイムノアフィニティー精製することによって作製されている。コントロールライン抗体の溶液を調製し、支持体の上にコーティングした。コンジュゲートパッドは、デング熱抗原コンジュゲートおよびコントロールコンジュゲートを含んだ。デング熱抗原コンジュゲートは、目的のデング熱抗原、この場合、ショウジョウバエＳ２細胞において発現される本明細書において説明されるデング熱抗原の１つ、にコンジュゲートしたコロイド状金粒子（ナノ粒子）を含む。金ナノ粒子の製造およびタンパク質へのコンジュゲーションは、Ｙｏｋｏｔａ Ｓ． （２０１０） Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ， ＩｇＧ， Ｆ（ａｂ’）２， ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ． Ｉｎ：Ｓｃｈｗａｒｔｚｂａｃｈ Ｓ．， Ｏｓａｆｕｎｅ Ｔ． （ｅｄｓ） Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）， ｖｏｌ ６５７． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－６０７６１－７８３－９＿８に記載される。目的のタンパク質への金ナノ粒子のコンジュゲーションは、例えば、クエン酸安定化金ナノ粒子の表面へのタンパク質の自発的吸着によって達成される。タンパク質とナノ粒子との間の物理的相互作用は、以下の３つの現象：（ｉ）負に帯電した金と正に帯電したタンパク質との間のイオン引力；（ｉｉ）金表面とタンパク質上の疎水性パッチとの間の疎水性引力、および（ｉｉｉ）結果として共有結合を形成する金の伝導電子とタンパク質の遊離チオール基との間の与格結合、に依存する。コントロールコンジュゲートは、トリＩｇＹ抗体にコンジュゲートしたコロイド状金粒子を含む。好適なコンジュゲートは、ＢＢＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｃｒｕｍｌｉｎ、イギリス）から入手可能なＣＯＮＴ．ＣＨＩＣＫ製品である。

好適なＱＣ検査の後、支持体ならびに、試料パッド、コンジュゲートパッド、分析パッド、および吸収パッドのラミネート層を、適切なサイズの細片に切断し、次いで、熱融着させた。

使用の際には、試験される対象から採取した試料から得られた体液（例えば、毛細血管全血）を、カセット（図２Ｂに示されるような）の試料ウェル（Ｓ）に適用した。約５μｌの試料を、試料パッドにロードした。ランニングバッファー（例えば、１％のＴｗｅｅｎ ２０を伴う１Ｘ ＰＢＳ）を、バッファー用ウェル（Ｂとしてマークされ、図２Ｂに示される）に加えた。これが、コンジュゲートパッドにおけるコンジュゲートの混合物（および試料中に存在する全ての抗体）を、支持体に沿って、試験ライン（図２ＢにおいてＴとしてマークされる）およびコントロールライン（図２ＢにおいてＣとしてマークされる）へと移動させる。図２Ｂの本発明の実施形態では、コンジュゲートパッド（図示されず）は、バッファーウェルと試料パッドとの間に位置されている。対照的に、図２Ａの本発明の実施形態において、コンジュゲートパッドは、分析パッドと試料パッドの間に位置されており（すなわち、コンジュゲートパッドは、分析パッドのより近くに存在する）、バッファーウェルは存在しない。どちらかの方向において、試料中に存在する全ての抗デング熱抗体（図２Ａにおいて緑色に示される）は、デング熱抗原を含むコンジュゲートに結合し、その後、結果として得られる免疫複合体は、細片に沿ってさらに移動し、試験ラインにおいて（抗デング熱抗体に結合する）抗ヒトＩｇＧ抗体によって捕捉され、その結果、サンドイッチを形成する。その結果、抗デング熱抗体が存在する場合、捕捉されたコロイド状金粒子が、試験ラインにおいてコンジュゲートし、その存在を、肉眼で視認することができる。試験が適切に行われたことを確認するために、コントロールコンジュゲートが使用される。そのようなコンジュゲートがコントロールラインまで移動した場合、それらは、抗トリＩｇＹ抗体によって捕捉され、やはり、肉眼によって視認することができる。したがって、試験ラインおよびコントロールラインの両方の出現は、陽性結果、すなわち、試料は抗デング熱抗体を含んでいることを示している。コントロールラインのみの出現は、陰性結果、すなわち、試料は検出可能なレベルの抗デング熱抗体を含んでいないことを示している。試験ラインもコントロールラインも現れない場合、または試験ラインは現れるがコントロールラインは現れない場合、これは、試験の失敗を示しており、したがって、再度、試験を行うべきである。

実施例２Ａ
ウイルス溶解物由来のデング熱血清型２（ＳＴ２）抗原を組換えＳＴ２エンベロープ抗原で置き換える効果
この研究は、市販のデング熱ＲＤＴにおいて抗原－金コロイドコンジュゲートのための基礎として使用されているウイルス溶解物由来のＳＴ２抗原を、ショウジョウバエＳ２細胞において発現される精製された組換えＳＴ２エンベロープ抗原で置き換える効果を比較するために実施した。ＲＤＴ特異度および感度における変化を、下記において定義されるように、定義され十分に特性評価された血清試料パネルに対して評価した。

２Ａ－１－ＲＤＴ選択
比較のための参照試験として、ＣＴＫ Ｂｉｏｔｅｃｈによって製造された既存の市販されているラテラルフロー型ＲＤＴ（供給元カタログ番号Ｒ００６１Ｃ）であるオンサイトデング熱ＩｇＧ／ＩｇＭ ３．０ Ｃｏｍｂｏ ＲＤＴを使用した。この試験は、２つのデング熱抗原、配列番号１に示される配列を有する組換えデング熱血清型１（ＳＴ１）エンベロープ抗原および配列番号５に示される配列を有するウイルス溶解物由来のＳＴ２抗原、を含んでおり；後者の抗原は、ＵＳ ＣＤＣから認可されたキメラデングウイルスから得られる。比較されるプロトタイプ試験「プロトタイプ１」は、唯一の変更が配列番号５の溶解物由来ＳＴ２抗原の、ショウジョウバエＳ２細胞において発現される配列番号２に示される配列を有する組換えＳＴ２エンベロープ抗原への置き換えである市販の参照ＲＤＴに基づいている。ＩｇＭからのいかなる交絡効果も避けるために、ＩｇＧ成分のみを両方の試験に対して評価した。

２Ａ－２－血清試料パネル特性評価
特異性血清試料パネルは、下記の表１に提示される、ＰＲＮＴ_５０アッセイ（Ｔｉｍｉｒｙａｓｏｖａ， Ｔ．Ｍ．ら， Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． （２０１３）， ｖｏｌ． ８８（５）， ９６２～９７０）および／またはデング熱ＮＳ１ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりデング熱血清陰性として評価された１３０の試料で構成された。ＪＥは、日本脳炎ウイルスを意味し、ＹＦは、黄熱ウイルスを意味する。好適なデング熱陽性および陰性ヒト血清試料は、様々な商業的供給源、例えば、Ａｃｃｅｓｓ Ｂｉｏ， Ｉｎｃ．（サマセット、ニュージャージー、米国）またはＡＢＯ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（サンディエゴ、カリフォルニア、米国）などから入手することができる。あるいは、血清試料の好適なパネルは、単純に、デング熱非デング熱風土病地域（例えば、米国、欧州本土など）に住む対象のグループおよびデング熱風土病地域（例えば、ブラジル、コロンビア、タイ、フィリピンなど）に住む対象のグループから血清試料を得ることによって作製することができる。そのような試料は、フラビウイルスＰＲＮＴおよび本明細書において説明されるデング熱ＮＳ１ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して表１に示される異なるグループへと分類することができる。

感度パネルは、下記の表２において提示される１２７のデング熱ＰＲＮＴ_５０陽性試料で構成された。全てのウイルス学的に確認されたデング熱（ＶＣＤ）試料に対して、血清型識別を行った。

２Ａ－３－結果および解説
特異度および感度に対する結果が、それぞれ、表３および表４に示される。

この研究は、既存のオンサイトデング熱ＩｇＧ／ＩｇＭ ＲＤＴにおけるウイルス溶解物由来ＳＴ２抗原を組換えデング熱ＳＴ２エンベロープ抗原で置き換えることは、既存の現状技術水準よりも試験性能を向上させるのに十分であることを実証している。経時においてＩｇＧのレベルが低下するほど以前の感染を検出するのがより困難なることが予想されるとすると、リモートＶＣＤに対する感度の向上は、特に際立っている。

実施例２Ｂ
この研究は、デング熱ＮＳ１抗原（試験プロトタイプ「Ｆ」）を、コンジュゲートとして配列番号１に示される配列を有する組換えデング熱ＳＴ１エンベロープ抗原および配列番号２に示される配列を有する組換えデング熱ＳＴ２エンベロープ抗原を含む別の同一のプロトタイプＲＤＴ（「プロトタイプＢ」）に導入することの試験特異度および感度に対する効果を特定した。ＮＳ１抗原は、デング熱ＳＴ２ウイルスから得られ（ならびに配列番号６に示される配列を有し）、これを、総コンジュゲート量の３０％の最終比率においてプロトタイプＢベースに加えた。

特異度および感度を、上記の実施例２Ａと同じ試料パネルを使用して評価した。クロス反応性に対する任意の効果を試験するために、特異度パネルを、追加のデング熱血清陰性のフラビウイルス陽性試料によって増加させ；この場合、含まれる他のフラビウイルスは、日本脳炎（ＪＥ）ウイルス、黄熱（ＹＦ）ウイルス、西ナイル（ＷＮＶ）ウイルス、およびジカウイルスであった。感度パネルも、追加のデング熱モノタイプ免疫試料（ＳＴ１、２、３、および４）によって増加させた。デング熱モノタイプ免疫試料は、デング熱ＰＲＮＴ_９０アッセイにおいて１つの血清型のみに対して陽性の結果（抗体価＞１０）を生じるような試料を意味する。対照的に、デング熱マルチタイプ免疫試料は、デング熱ＰＲＮＴ_９０アッセイにおいて少なくとも２つの血清型に対して陽性の結果（抗体価＞１０）を生じるような試料を意味する。感度は、図１Ａのアルゴリズムによりデング熱血清陽性と評価された、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）ワクチン（それぞれ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ番号ＮＣＴ０１３７３２８１およびＮＣＴ０１３７４５１６）のＣＹＤ１４およびＣＹＤ１５臨床試験からの２００のベースライン試料のさらなるパネルに対して得点化も行った。

２Ｂ－１－結果および解説
特異度および感度に対する結果を、それぞれ、表６および表７に示す。

これらの結果は、ＮＳ１抗原の導入はより高いＲＤＴ感度を与えることができるが、それは、他のフラビウイルスとの交差反応性の増加のリスクもある程度伴うことを示している。これは、不都合として受け取られている。しかしながら、ある特定のフラビウイルスの分布は、ある特定の地理的地域に限定されるため（例えば、南米のＹＦウイルスおよび東南アジアのＪＥウイルス）、ＮＳ１抗原を組み入れる試験は、フラビウイルスの共流行があまり生じなさそうな地理的地域において利用することができ、結果として、交差反応性に関連する任意の問題を緩和する。このようにＮＳ１に基づく試験を利用することは、感度増加に関連する利点を利用することを可能にするであろう。

実施例３
本発明による５つの免疫診断試験デバイス（Ｂ１、Ｂ１Ａ、Ｂ１Ｂ、Ｂ１Ｃ、およびＩ１Ｃ）および１つの比較免疫診断試験デバイス（Ｉ１Ｄ）を、実施例１において説明された方法に類似する方法を使用して調製した。これらの免疫診断試験デバイスは、表８に示されるように、デバイス中に存在するデング熱抗原のみにおいてお互いに異なっていた。表８は、デバイス中に存在する総デング熱抗原に対する、Ｂ１、Ｂ１Ａ、Ｂ１Ｂ、Ｂ１Ｃ、Ｉ１Ｃ、およびＩ１Ｄにおけるそれぞれの特定のデング熱抗原の比率を示している。デング熱抗原の総濃度は、免疫診断試験デバイスの間で同じままであった。まとめると：Ｂ１は特定のデング熱抗原Ｅ１（配列番号１）およびＥ２（配列番号２）を含み；Ｂ１Ａは特定のデング熱抗原Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３（配列番号３）を含み；Ｂ１Ｂは特定のデング熱抗原Ｅ１、Ｅ２およびＥ４（配列番号４）を含み；Ｂ１Ｃは特定のデング熱抗原Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４を含み；Ｉ１Ｃは特定のデング熱抗原Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４、ならびに実施例２において言及され下記の表において「ＣＤＣ」として示されるオンサイトデング熱ＩｇＧ／ＩｇＭ ３．０ Ｃｏｍｂｏ ＲＤＴからのさらなるデング熱抗原（ウイルス溶解物由来ＳＴ２抗原（「ＣＤＣ」－配列番号５）を含み；ならびにＩ１Ｄは特定のデング熱抗原Ｅ１、Ｅ３、およびＥ４（すなわち、Ｅ２は含まない）、ならびにオンサイトデング熱ＩｇＧ／ＩｇＭ ３．０ Ｃｏｍｂｏ ＲＤＴからのウイルス溶解物由来ＳＴ２抗原（「ＣＤＣ」－配列番号５）を含む。

Ｂ１、Ｂ１Ａ、Ｂ１Ｂ、およびＢ１Ｃの交差反応性、感度（マルチタイプおよびモノタイプ）、および特異度を、実施例２Ｂにおいて説明されるのと同じ試料のパネルおよび方法を使用して試験した。この結果は、表９に示される。

以上のように、本発明による免疫診断試験デバイスにデング熱抗原Ｅ３および／またはＥ４を含ませることは、特異度および交差反応性に対して負の影響を及ぼすことなく、感度をさらに増加させる。さらに、ＣＤＣデング熱抗原をデング熱抗原Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４と一緒に含ませることは、交差反応性または特異度にいかなる改善ももたらさないが、感度は低下させる。特に、モノタイプ感度は低下する。同様の結果が、Ｅ２をＣＤＣで置き換えた場合にも見られる。

実施例４
下記の実施例において説明されるように、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）のＣＹＤ１４およびＣＹＤ１５フェーズＩＩＩ有効性試験からの血清試料の遡及的分析において、ラテラルフロー型ＲＤＴ（オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴ（ＣＴＫ Ｂｉｏｔｅｃｈ、サンディエゴ、米国、供給元カタログ番号Ｒ００６５Ｃ））を使用した。この実施例において、ＤＥＮＧＶＡＸＩＡ（登録商標）は、ＣＹＤ－ＴＤＶと呼ばれる。

方法
研究設計および参加者
フェーズＩＩＩランダム化プラセボ対照ＣＹＤ－ＴＤＶ試験ＣＹＤ１４およびＣＹＤ１５は、Ｃａｐｅｄｉｎｇ ＭＲら， ２０１４， Ｌａｎｃｅｔ；３８４（９９５１）：１３５８～６５およびＶｉｌｌａｒ Ｌら， ２０１５， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．， ３７２（２）：１１３～２３において説明される。ＣＹＤ１４（ＮＣＴ０１３７３２８１）を、アジア太平洋地域の５つの国（インドネシア、マレーシア、フィリピン、タイ、およびベトナム）における２～１４歳の小児において行った。ＣＹＤ１５（ＮＣＴ０１３７４５１６）を、ラテンアメリカの５つの国（ブラジル、コロンビア、ホンジュラス、メキシコ、およびプエルトリコ）における９～１６歳の小児において行った。３つの用量のＣＹＤ－ＴＤＶまたはプラセボを６か月間離して受けさせるために、小児をランダマイズした（２：１）。それぞれの研究において、参加者のランダムサブセット（ＣＹＤ１４から１９８３／１０２７５［約２０％］の参加者およびＣＹＤ１５から２０００／２０８６９［約１０％］の参加者）を、免疫原性分析のために選択した。このサブセットからの参加者は、登録時に血液試料を提供した（ワクチン接種前）。それらの試料を、オンサイトデング熱Ｄｅｎｇｕｅ ＩｇＧ ＲＤＴを使用してワクチン効果の転帰およびアッセイ性能を評価するために、この実施例において説明される研究において使用した。

イムノアッセイ
オンサイトデング熱 ＩｇＧ ＲＤＴ（ＣＴＫ Ｂｉｏｔｅｃｈ、サンディエゴ、米国、供給元カタログ番号Ｒ００６５Ｃ）は、特定のデング熱Ｅタンパク質Ｅ１（配列番号１のアミノ酸配列を含む）、Ｅ２（配列番号２のアミノ酸配列を含む）、Ｅ３（配列番号３のアミノ酸配列を含む）、およびＥ４（配列番号４のアミノ酸配列を含む）を含むＣＥマークされたラテラルフロー型イムノアッセイである。当該アッセイは、４つのデング熱血清型のそれぞれに対する抗デングウイルスＩｇＧ抗体を定性的に検出し、ヒト血清、全血、または血漿試料において以前のデング熱感染を識別する。このアッセイによる試料の試験を、製造元の指示に従って、Ｇｌｏｂａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （ＧＣＩ） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ、（スウィフトウォーター、ペンシルバニア）によって行った。試験人員を、研究治療グループ、参加者の以前のデング熱暴露、および参加者の任意のデング熱転帰に対して盲検化した。

有効性転帰
この実施例において説明される研究は、ＣＹＤ１４およびＣＹＤ１５の活動期（最長２５か月間まで）における症候性ＶＣＤ、ならびに研究期間全体（最長７２か月間まで）における入院ＶＣＤ（ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ＶＣＤ）および重症型デング熱に対して、ワクチン接種前試料がオンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴによる試験で陽性と出た参加者においてＣＹＤ－ＴＤＶワクチンの有効性を特定した。これらの転帰（症候性ＶＣＤ、入院ＶＣＤ、および重症型デング熱）に対する定義は、ＤｉａｚＧｒａｎａｄｏｓ ＣＡ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０２０ （ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ１４７３－３０９９（２０）３０６９５－２）において説明される通りである。

参照アルゴリズムによるデング熱血清状態
各試料のデング熱血清状態は、９０％カットオフ（ＰＲＮＴ_９０）、５０％カットオフ（ＰＲＮＴ_５０）、および本明細書において説明される抗非構造的タンパク質１（ＮＳ１）ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによるプラーク減少中和試験から前のリードアウトを使用して得た。次いで、下記の表１０に示されるアルゴリズムを使用して、試料を以下の６つのグループにカテゴライズした：デング熱血清陰性として試料を割り当てたグループ１～３、この場合、グループ１は、「真」のデング熱血清陰性に可能な限り近い参照である；デング熱陰性として参加者を割り当てたグループ４～６、この場合、グループ６は、「真」のデング熱血清陽性に最も近い。

アッセイ性能
オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴの感度および特異度を、表１０に示されるデング熱参照アルゴリズムによって分類した試料を使用して推定した。オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴによって血清陽性として正しく分類された試料の比率（試験陽性の数／真の陽性の合計）として、感度を計算した。オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴによって血清陰性として正しく分類された試料の比率（試験陰性の数／真の陰性の合計）として、特異度を計算した。陽性的中率を、イムノアッセイの「真」の血清陽性の数／全てのイムノアッセイの血清陽性として計算し、その一方で、陰性的中率を、イムノアッセイの「真」の血清陰性の数／全てのイムノアッセイの血清陰性として計算した。

さらに、オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴの感度を、免疫状態：１つのみのデング熱血清型に対して≧１０［１／ｄｉｌ］の中和抗体の力価を有するモノタイプ；または≧２つのデング熱血清型に対して≧１０［１／ｄｉｌ］の中和抗体の力価を有するマルチタイプ、によって参照グループ６からの、ＰＲＮＴ_９０陽性である試料において特定した。免疫状態による結果も、５つの市販のイムノアッセイ：ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ抗デングウイルスタイプ１～４ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ ＡＧ、リューベック、ドイツ）（ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ－ＥＬＩＳＡ）、Ｐａｎｂｉｏ（登録商標）デング熱ＩｇＧ間接的ＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ、シカゴ、米国）（Ｐａｎｂｉｏ－ＥＬＩＳＡ）、ＴＥＬＬ ＭＥ ＦＡＳＴ（商標） Ｄｅｎｇｕｅ ＩｇＧ／ＩｇＭ Ｃｏｍｂｏ試験デバイス（Ｂｉｏｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ、バンクーバー、カナダ）（ＴＥＬＬ ＭＥ ＦＡＳＴ－ＲＤＴ）、ＳＤ ＢＩＯＬＩＮＥデング熱ＩｇＧ／ＩｇＭ ＷＢ（Ａｂｂｏｔｔ、シカゴ、米国）（ＳＤ ＢＩＯＬＩＮＥ－ＲＤＴ）、およびオンサイトデングＩｇＧ／ＩｇＭ ３．０ Ｃｏｍｂｏ迅速試験ＣＥ（ＣＴＫ Ｂｉｏｔｅｃｈ、サンディエゴ、米国、供給元カタログ番号Ｒ００６１Ｃ）（ＯｎＳｉｔｅ－ＩｇＧ／ＩｇＭ ＲＤＴ）に対して提示される。

統計分析
ワクチンの有効性を、少なくとも１回の研究注射を受け、参考試験からの妥当な結果を有し、ＣＹＤ－ＴＤＶが血清陰性個人における使用のために意図されていないためにオンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴによる試験で陽性と出た、参加者に対するＣＹＤ１４およびＣＹＤ１５の免疫原性サブセットからの参加者において排他的に評価し；アッセイ性能を、全ての含まれる参加者において評価した。

症候的ＶＣＤ、入院ＶＣＤ、または重症型ＶＣＤの発生率を、１００人年あたりの症例の数において特定し、対応する９５％信頼区間（ＣＩ）を、正確二項検定（Ｃｌｏｐｐｅｒ－Ｐｅａｒｓｏｎ法）によって計算した。プールされたＣＹＤ１４およびＣＹＤ１５データからの有効性結果に対し、固定された効果としてワクチングループおよび研究を用いたＣｏｘ回帰モデルを使用した。ワクチンの有効性を、（１－ハザード比）＊１００として定義し、ならびに関連する９５％ＣＩを計算した。症候的ＶＣＤ、入院ＶＣＤ、または重症型ＶＣＤに対するワクチンの有効性を、年齢層（≧９歳、＜９歳、および≧６歳）および研究（ＣＹＤ１４またはＣＹＤ１５）によって、全てに対して計算した。

年齢層（≧９歳、＜９歳、および≧６歳）およびデング熱免疫プロファイル（モノタイプまたはマルチタイプ）によって、総集団に対してアッセイ性能を計算した。感度、特異度、および予測値に対して、正確二項検定（Ｃｌｏｐｐｅｒ－Ｐｅａｒｓｏｎ法）を使用して９５％ＣＩを推定した。

結果
ＣＹＤ１４およびＣＹＤ１５免疫原性サブセットにおいて、２４９０／３８４０（６４．８％）の試料が、オンサイトデング熱ＩｇＧ試験陽性であった。ベースライン特性（年齢、性別、身長、体重、および民族性）は、オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴによる試験で陽性と出た参加者に対して、ワクチンとプラセボグループとの間で偏りはなかった（データは示さず）。オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴによる試験で陽性と出た参加者の大部分は、ＰＲＮＴ_９０陽性であり、参照グループ６に属した（以下の表１１を参照されたい）。

異なる年齢層でのオンサイトデング熱ＩｇＧ試験陽性参加者における、症候的ＶＣＤおよび入院デング熱に対するワクチンの有効性は、下記の表１２に示される通りである。

オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴの感度および特異度は、下記の表１３に示される通りである。

オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴは、研究集団全体（２～１６歳）に対して、非常に高い感度（９１．１％； ９５％ＣＩ８９．９、９２．１）および高い特異度（９２．８％； ９５％ＣＩ９１．２、９４．２）を示した。異なる年齢層において、感度および特異度の両方は、≧９歳および≧６歳の参加者において匹敵していた（それぞれ２つの年齢層において、感度： ９２．４％および９１．８％；特異度：９６．６％および９６．１％）。陽性および陰性予測値は、≧９歳および≧６歳の参加者において匹敵していた（それぞれ２つの年齢層において、陽性予測値：０．９８９および０．９８６、ならびに陰性予測値：０．７９０および０．７９６であった）。モノタイプ免疫プロファイルを有する参加者の場合、オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴによる感度は８２．９％であり、各デング熱血清型に対して、７５．２％から８７．５％まで及ぶ（表１４）を参照されたい）。これは、プラセボ－ＥＬＩＳＡによって観察される感度（８４．０％）に匹敵し、ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ－ＥＬＩＳＡ（７４．４％）より高く、ならびに３つの市販のＩｇＭ－Ａ／ＩｇＧ ＲＤＴｓ （１２．１～４４．６％の範囲）より実質的に高かった（表１４）。

説明
この実施例において、極めて重要なＣＹＤ－ＴＤＶ有効性研究から参加者のベースラインデング熱血清状態を遡及的に特定するために、新規のオンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴを使用した。アッセイによってベースラインデング熱血清陽性であると特定された２～１６歳の参加者において、ＣＹＤ－ＴＤＶのワクチン有効性は、症候的ＶＣＤに対して２年間（ワクチン有効性は８４．１％）、および入院ＶＣＤに対して６年間（ワクチン有効性は６９．２％）のロバストな保護を示した。これは、症候的ＶＣＤおよび入院ＶＣＤに対してそれぞれ８６．０％および７５．５％のワクチン有効性を有する≧６歳の参加者を含め、それぞれの年齢層に対して観察された。

高い試験特異度は、血清陰性の人に対するリスクを最小にすることを確実にするが、その一方で、高い感度は、適任の個人の最大数が恩恵を受けることを確実にするために重要である。ＣＹＤ－ＴＤＶのための示された年齢層である≧９歳において、オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴは、高い特異度（９７％）および高い感度（９２％）を示し、同様の結果は、≧６歳の年齢層においても観察された。

ワクチン接種前スクリーニング戦略のモデリングは、スクリーニングおよびワクチン接種戦略の潜在的恩恵を示し、ならびにそのような戦略はＲＤＴの感度を増加させることにより改良されることを示した。オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴは、１つのみのデング熱血清型による感染の証拠を有する場合に対して良好な感度（モノタイプ；８２．９％）を示し、マルチタイププロファイルを有する場合に対しては、高感度であった（９８．１％）。モノタイプデング熱に対する感度は、４つの血清型において偏りはなく、以前に評価されたデング熱ＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって見られたものに匹敵するかまたはより優れていた。しかしながら、ＥＬＩＳＡよりもより好都合で実践するのが容易なオンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴは、診療現場でのスクリーニングのさらなる利点を提供するであろう。オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴのモノタイプデング熱に対する感度は、現在の市販のＲＤＴより実質的に高かった。モノタイプデング熱は、１回の以前のデング熱感染を経験することの代わりとなるものであり、モノタイプ個人の識別は、重症型デング熱症例を減少させるために特に重要であり、と言うのも、これらの個人は、二次感染の際の重症型デング熱感染のリスクが増加するためである（Ｋａｔｚｅｌｎｉｃｋ ＬＣら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１７； ３５８（６３６５）： ９２９～３２）。

診療現場でのワクチン接種前スクリーニングのためのＲＤＴの選択は、使用の正確さおよび容易さを含むいくつかの要因に依存する。上記に示されているように、高い特異度および感度を提供するのに加えて、オンサイトデング熱ＩｇＧ ＲＤＴは、２５分以内に実施することができ（ＥＬＩＳＡとは異なる）、したがって、ワクチン接種時に、使いやすい試験を実施し易くすることができ（例えば、１回のクリニック訪問内において）、それによって、デング熱ワクチン接種の適合および取り込みを増加させることができる。

本発明について、特定の実施態様を参照しながら説明し、例示してきたが、当業者は、本発明が、本明細書において詳細に例示されていない多くの異なる変形に適していることを理解するであろう。単なる一例として、ある特定の可能な変形についても説明されるであろう。

先述の説明において、整数または要素が、既知の、明白な、または予見できる同等物を有すると言及される場合、そのような同等物は、あたかも個別に説明されたかのように、本明細書に組み入れられる。本発明の真の範囲を決定するために、特許請求の範囲が参照されるべきであり、任意のそのような同等物も包含されると解釈されるべきである。好ましい、有利である、簡便であるなどとして説明される本発明の整数または特徴は、随意であり、ならびに、独立請求項の範囲を限定しないことも、読み手によって理解されるであろう。その上、そのような随意の整数または特徴は、本発明のいくつかの実施形態において、可能な恩恵をもたらすが、望ましくない場合もあり、したがって、他の実施形態では、存在しない場合もある。

Claims (34)

1. 抗デング熱ウイルス抗体の検出のための免疫診断試験デバイスであって、第１のデング熱抗原および第２のデング熱抗原を含み、該第１のデング熱抗原は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに該第２のデング熱抗原は、配列番号２の配列を有するポリペプチドまたは配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有するポリペプチドを含む、免疫診断試験デバイス。
2. 配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する、前記第２のデング熱抗原の前記ポリペプチドは、配列番号２の５位、５２位、１１９位、１２５位、および２０２位に対応する該ポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まない、請求項１に記載の免疫診断試験デバイス。
3. 前記第１のデング熱抗原のポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応する該ポリペプチドの位置に、配列番号１に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、該ポリペプチドは、配列番号１の９７位から１０９位に対応する該ポリペプチド内の該位置に配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有し；ならびに配列番号２の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する、前記第２のデング熱抗原の前記ポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応する該ポリペプチドの位置に、配列番号２に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、該ポリペプチドは、配列番号２の９７位から１０９位に対応する該ポリペプチド内の該位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する、請求項１または請求項２に記載の免疫診断試験デバイス。
4. さらに、第３のデング熱抗原および第４のデング熱抗原を含み、該第３のデング熱抗原は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ならびに第４のデング熱抗原は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
5. 前記第３のデング熱抗原の前記ポリペプチドは、配列番号３の９８位から１１０位に対応する該ポリペプチドの位置に、配列番号３に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、該ポリペプチドは、配列番号３の９８位から１１０位に対応する該ポリペプチド内の該位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有し、ならびに前記第４のデング熱抗原の前記ポリペプチドは、配列番号４の９７位から１０９位に対応するポリペプチドの位置に、配列番号４に対するアミノ酸置換を含まず、すなわち、該ポリペプチドは、配列番号４の９７位から１０９位に対応する該ポリペプチド内の該位置に、配列ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫを有する、請求項４に記載の免疫診断試験デバイス。
6. 前記第１、第３、および第４のデング熱抗原の前記ポリペプチドは、それぞれ配列番号１、配列番号３、および配列番号４に対して少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項４または請求項５に記載の免疫診断試験デバイス。
7. 前記第１、第３、および第４のデング熱抗原の前記ポリペプチドは、それぞれ配列番号１、配列番号３、および配列番号４の配列を有し、または、該第１、第３、および第４のデング熱抗原の該ポリペプチドは、それぞれ配列番号１、配列番号３、および配列番号４の配列と比べて少なくとも１つかつ４つ以下のアミノ酸置換を有する配列を有する、請求項４～６のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
8. 前記第１、第２、第３、および第４の抗原の前記ポリペプチドは、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４の配列を有する、請求項４～７のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
9. 他のデング熱抗原を含まない、請求項１～８のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
10. 前記デング熱抗原の少なくとも１つは、前記抗デングウイルス抗体に結合することができる少なくとも１つのエピトープを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
11. 前記抗デングウイルス抗体はＩｇＧ抗体である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
12. 支持体、試料パッド、コンジュゲートパッド、分析パッド、吸収パッド、少なくとも１つの検出ライン、および少なくとも１つの品質コントロールラインを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
13. 前記コンジュゲートパッドは、前記デング熱抗原を含み、該デング熱抗原のそれぞれは、検出可能な部分にコンジュゲートされる、請求項１２に記載の免疫診断試験デバイス。
14. 前記検出可能な部分は、金コロイドである、請求項１３に記載の免疫診断試験デバイス。
15. 少なくとも１つの捕捉部分は、前記検出ラインに固定されている、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
16. 前記少なくとも１つの捕捉部分は、抗ヒトＩｇＧ抗体である、請求項１５に記載の免疫診断試験デバイス。
17. ヒト対象のデング熱感染の診断における使用のための、または診断における補助としての使用のための、請求項１～１６のいずれか１項に記載の免疫診断試験デバイス。
18. 前記デング熱感染は、以前のデング熱感染（ｐｒｉｏｒ ｄｅｎｇｕｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）である、請求項１７に記載の使用のための免疫診断試験デバイス。
19. ヒト対象におけるデング熱感染を特定するための方法であって、
    ａ．第１および第２デング熱抗原は、請求項１～３および６～８のいずれか１項において定義される通りであり、該デング熱抗原は、検出可能な部分にコンジュゲートされる、該第１のデング熱抗原および該第２のデング熱抗原を提供する工程；
    ｂ．該デング熱抗原を、潜在的に、前記抗原の少なくとも１つに結合することができる少なくとも１つの結合パートナーを含有する、対象から得られた生物学的試料と接触させる工程；および
    ｃ．該試料が該少なくとも１つの結合パートナーを含む場合、存在が対象におけるデング熱ウイルス感染を示す、デング熱抗原検出可能部分コンジュゲートの少なくとも１つと該少なくとも１つの結合パートナーとの間に形成される複合体の存在を検出する工程、
    含む方法。
20. 前記工程（ａ）は、第３のデング熱抗原および第４のデング熱抗原を提供する工程であって、該第３および第４デング熱抗原は、請求項４～８のいずれか１項において定義される通りであり、該デング熱抗原は、検出可能な部分にコンジュゲートされる、工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. インビトロ法である、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
22. 前記少なくとも１つの結合パートナーは、デングウイルスに対するＩｇＧ抗体である、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記検出可能な部分は、金コロイドである、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記生物学的試料は、唾液、全血、血漿、血清、および尿からなる群から選択される、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記生物学的試料は、全血、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記デング熱感染は、以前のデング熱感染である、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記デング熱抗原検出可能部分コンジュゲートの少なくとも１つと前記少なくとも１つの結合パートナーとの間に形成される複合体の存在を検出する前記工程は、前記複合体を、該少なくとも１つの結合パートナーに結合することができる分子と接触させる工程を含む、請求項１９～２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記少なくとも１つの結合パートナーに結合することができる前記分子は、ヒト抗体に対する抗体である、請求項２７に記載の方法。
29. ヒト抗体に対する前記抗体は、ヒトＩｇＧ抗体に対して特異的である、請求項２８に記載の方法。
30. デング熱血清陽性ヒト対象を識別する方法であって、（ｉ）該対象から生物学的試料を得る工程、および（ｉｉ）請求項１～１６のいずれか１項において権利請求される免疫診断試験デバイスを使用して試料を分析する工程、を含む方法。
31. ヒト対象において抗デング熱ＩｇＧ抗体を検出するインビトロ方法であって、（ｉ）該対象から生物学的試料を得る工程、および（ｉｉ）請求項１～１６のいずれか１項において権利請求される免疫診断試験デバイスを使用して試料を分析する工程、を含む方法。
32. デング熱に対してヒト対象にワクチン接種する方法であって、（ｉ）該対象から生物学的試料を得る工程、（ｉｉ）該対象がデング熱血清陽性であるか否かを特定するために、請求項１～１６のいずれか１項において権利請求される免疫診断試験デバイスを使用して試料を分析する工程、および（ｉｉｉ）該ヒト対象が工程（ｉｉ）の分析によりデング熱血清陽性である場合、デング熱ワクチンを該ヒト対象に投与する工程、を含む方法。
33. デング熱に対してヒト対象にワクチン接種する方法であって、前記ヒト対象は、請求項１～１６のいずれか１項において権利請求される免疫診断試験デバイスを使用して以前にデング熱血清陽性であることが示されており、および、デング熱ワクチンを該対象に投与する工程を含む、方法。
34. デング熱に対してヒト対象にワクチン接種する方法における使用のためのデング熱ワクチンであって、該ヒト対象は、請求項１～１６のいずれか１項において権利請求される免疫診断試験デバイスを使用して以前にデング熱血清陽性であることが示されている、デング熱ワクチン。

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