CN101479606A - 用于检测黄病毒特异性抗体的抗原捕获抗登革热IgA ELISA（ACA-ELISA） - Google Patents

用于检测黄病毒特异性抗体的抗原捕获抗登革热IgA ELISA（ACA-ELISA） Download PDF

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Abstract

抗原捕获IgA酶联免疫吸附测定(antigen capture IgA Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ACA－ELISA)已被开发用于检测抗黄病毒IgA。该测定使用由单克隆抗体捕获的黄病毒裂解物抗原，优选登革病毒裂解物抗原。优选使用缀合有报告基团(例如辣根过氧化物酶(HRP))的兔抗IgA来检测测试血清中的所捕获抗黄病毒IgA。发现该测定比抗人IgA捕获ELISA(AAC－ELISA)灵敏至少8倍。发现基于血清或唾液的ACA－ELISA与“黄金标准”抗登革热IgM检测技术相比更加灵敏和快速，并且可用作感染早期确诊登革热的诊断工具。

Description

用于检测黄病毒特异性抗体的抗原捕获抗登革热IgA ELISA(ACA-ELISA)
技术领域
本发明涉及对人或动物近期暴露于黄病毒或其等价物的检测技术。更特别地，本发明涉及对取自受试者(动物或人)的生物样品的快速简便的分析，以确定该受试者是否已明确地暴露于黄病毒或其等价物。本发明还提供了医学诊断试剂盒以及通过检测由黄病毒或其等价物感染产生的黄病毒特异性抗体(IgA)而进行的血清评价。更优选地，本发明涉及登革病毒。
背景技术
黄病毒科(Flaviviridae)包括许多导致人类疾病并通常经蚊或蜱传播的病毒。黄病毒属(Flavivirus genus)包括多种病毒，其包括各自导致相应疾病的黄热病毒(YF)、登革热(DF)病毒、西尼罗河(WN)病毒和日本脑炎(JE)病毒。
登革热是世界范围内影响热带及亚热带地区(主要在市区和市郊区域)的主要病毒疾病之一。登革热及其更严重的形式登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)是重要的公共卫生问题。
登革病毒是有被膜的正链RNA病毒。基因组RNA长约11kb并包含三个结构蛋白基因(其编码核衣壳或核心蛋白(C)、膜相关蛋白(M)、被膜蛋白(E))以及七个非结构(NS)蛋白基因。登革病毒以及其它黄病毒的基因顺序是5’-C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。其具有四种不同的血清型——血清型1至4。感染会诱导针对同源血清型的终生保护性免疫，但对另外三种血清型的继发感染只有部分的和暂时性的保护。然而，已普遍认识到，由于依赖抗体的增强作用(antibody-dependent enhancement)所致，由多种登革病毒血清型引起的继发感染或者再次或多重感染是DHF和DSS的主要风险因素。已推测对于DHF发病很重要的另一些因素包括：病毒毒力、宿主遗传背景、T细胞活化、病毒载量和自身抗体。由于试图在登革热流行国家消灭埃及斑蚊(Aedes aegypti)(登革病毒的最有效蚊媒)的尝试未获成功，因此只有在开发出有效疫苗之后才有可能控制登革热。目前，尚无有效的登革疫苗获得批准。
实验室诊断登革病毒感染可以通过检测特定病毒、病毒抗原、基因组序列和/或抗体来进行。目前，大多数实验室使用的用于诊断登革病毒感染的三种基本方法是：病毒分离和表征，通过核酸扩增技术测定来检测基因组序列以及检测登革病毒特异性抗体。在疾病发作之后，所述病毒存在于血清或血浆、循环中的血细胞以及所选组织(特别是免疫系统中的组织)中大约2至7天(大致对应于发热期)。
在登革病毒感染的患者中可观察到两种模式的血清学应答：初次和再次抗体应答，这取决于受感染个体的免疫状况。初次抗体应答见于对登革病毒或黄病毒其它成员缺乏免疫力的个体中。再次抗体应答见于曾被登革病毒或黄病毒感染的个体中。对于急性期和恢复期的血清来说，基于捕获免疫球蛋白M(IgM)和IgG酶联免疫吸附测定(ELISA)的抗体血清学检测已成为检测和鉴别原发和继发登革病毒感染的新标准。这是很重要的，因为用于检测和鉴别原发、继发或多重登革病毒感染的灵敏且可靠的测定对于流行病学、病理学、临床和免疫学研究的数据分析来说是十分关键的。
由于针对继发感染患者之测定的低灵敏度，借助血清学检测急性期血清样品中的抗原进展缓慢，这是因为这些患者具有之前存在的病毒-IgG抗体免疫复合物。然而，使用针对被膜膜(E/M)抗原(denKEY试剂盒；Globio Co.，Beverly，Mass.)和NS1抗原的ELISA和点印迹测定的近期研究表明，在原发登革病毒感染患者和疾病发作后多至9天的继发登革病毒感染患者的急性期血清中均可以检测到免疫复合物形式的高浓度E/M和NS1抗原。Koraka等(2003)最近报道了通过点印迹免疫测定在急性登革病毒感染的患者中检测到与免疫复合物解离的NS1抗原，并得出结论：与用RT-PCR和denKEY试剂盒所得到的数目相比，在来自原发和继发登革病毒感染患者的非解离和解离的血清和血浆样品中通过点印迹免疫测定对NS1抗原进行检测得到的登革热抗原阳性患者的数目最多。
血清学诊断登革病毒感染相当复杂，原因包括：(i)由于缺乏交叉保护的中和抗体，患者可能具有四种登革病毒血清型的多重和相继感染；(ii)在两种或更多种黄病毒共同流行的地区，由于存在原有抗体和最初抗原原罪性影响(antigenic sin)(许多对首次黄病毒感染产生应答的B细胞克隆在之后的每一次黄病毒感染中受到再次刺激而合成早期抗体，这些抗体与首次感染病毒的亲和力较之与当次感染病毒的亲和力更高)，因此多重和相继黄病毒感染使鉴别诊断难于进行；(iii)IgG抗体对同源和异源的黄病毒抗原具有高度的交叉反应性；以及(iv)在许多登革热继发感染患者中，由于IgG抗体长期存在(≥10个月，如通过E/M特异性捕获IgGELISA(E/M-specific capture IgG ELISA)测量的；或终生，如通过E/M抗原包被间接IgG ELISA测量的)，难于对过去、近期和当前的登革病毒感染进行血清学诊断。因此，在可通过血清学进行诊断的病毒感染中，登革病毒感染是最具挑战性的。
已描述了几种用于血清学检测登革病毒特异性抗体的方法，其包括血凝抑制(HI)试验、中和试验、间接免疫荧光抗体试验、ELISA、补体结合、点印迹、Western印迹和快速免疫色谱试验。其中，捕获IgM和/或IgG ELISA、抗原包被间接IgM和/或IgG ELISA以及HI试验是常规诊断登革病毒感染最常用的血清学技术。传统上，由于HI试验具有简易性、灵敏性和可重复性，将其用于检测和鉴别原发和继发登革病毒感染。当患者血清中HI试验效价高于或等于1:2560时，其被归为具有继发登革病毒感染；当HI试验效价低于1:2560时，其被归为具有原发登革病毒感染。由于HI试验存在固有缺陷，目前已不常用并且逐渐被E/M特异性捕获IgM和IgG ELISA所取代。
市售有许多使用免疫色谱原理的快速测试试剂盒。这些试剂盒中的大多数可在5至30分钟内同时检测出人全血、血清或血浆中针对登革病毒的IgM和IgG抗体。这些试剂盒中的某些声称可以鉴别原发和继发登革病毒感染，然而这不总是可靠的。结果显示，这些试剂盒通常具有较高的IgG检测灵敏度而具有较低的IgM检测灵敏度，以及与E/M特异性捕获IgM和IgG ELISA相比不同的特异性。尽管快速测试试剂盒具有操作简便和快速提供结果的优点，但是它们应最多作为医院临床上的筛选试验。
一些研究人员报道了登革病毒特异性IgA和IgE抗体应答。Talarmin等(1998)报道了使用IgA和IgM特异性捕获ELISA在诊断登革病毒感染中的用途。结果显示IgM(2至3个月)比IgA(约40天)似乎更加快速和持久。他们得出结论：捕获IgA ELISA是可与捕获IgM ELISA一起实施的简单方法，其可帮助解释DF的血清学特征。最近，Balmaseda等(2003)报道了对血清和唾液中特异性IgM和IgA抗体的检测。他们得出结论：与唾液相比，血清中的登革病毒特异性IgA由于其高水平的表现因而更有潜力作为诊断靶标。
本发明提供了用于检测针对黄病毒感染的IgA的有效且灵敏的检测方法，其克服了现有技术中的某些问题。
发明概述
一方面，本发明提供了用于检测受试者中特异性针对黄病毒或其等价物的IgA的方法，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物进行接触；以及
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；以及
用抗IgA抗体表征所述复合物中的结合伴侣。
该方法仅鉴定所述生物样品中的IgA。
另一方面，本发明提供了检测受试者对黄病毒或其等价物的暴露的方法，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物进行接触；以及
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；
表征所述复合物中的结合伴侣；以及
将所述结合伴侣与对黄病毒的暴露相关联。
本发明源自对开发一种检测当前或不久前暴露于黄病毒的快速、低成本和直接测定的需求。本发明优选使用抗体从细胞裂解物中免疫纯化黄病毒特异性免疫原性组分，其随后捕获来自生物样品(如黄病毒感染患者的血清或唾液)的鉴定为抗登革热IgA的结合伴侣。
因此，通过提供能够在黄病毒感染早期特异性鉴定针对黄病毒或其免疫学近亲所产生的抗体(IgA)的平台，本发明显示出比其它常规的和目前最常用的登革热捕获IgM ELISA更好的特异性和灵敏性。最优选地，该方法鉴定登革病毒感染。
另一方面，本发明提供了用于检测受试者对黄病毒或其等价物的暴露之方法的固体支持物，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物或其等价物进行接触；
测定该生物样品中存在的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；以及任选地
表征所述复合物中的结合伴侣从而将所述结合伴侣与对黄病毒的暴露相关联；
所述支持物包含固定于其上的黄病毒特异性免疫原性组分。
在一个优选的实施方案中，可将生物样品应用到预先用所添加的源自黄病毒的黄病毒抗原或其等价物进行包被和捕获的聚苯乙烯板。优选地，所述抗原或免疫原性组分来源于细胞裂解物。然后可以使用含有报告基团并且特异性结合所述组分/结合伴侣(更具体为IgA结合伴侣)复合物的检测试剂来检测黄病毒细胞裂解物的免疫原性组分与所述结合伴侣所形成的复合物。
又一方面，本发明提供了用于检测受试者中特异性针对黄病毒或其等价物的IgA或者检测对黄病毒的暴露的试剂盒，其包含：
包含黄病毒特异性免疫原性组分或其等价物的固体支持物；或
包含附着于另一支持物的黄病毒特异性免疫原性组分或其等价物的固体支持物；
至少一种缀合有报告基团的检测试剂，其用于检测生物样品中与黄病毒特异性免疫原性组分形成复合物的结合伴侣；以及任选地
使用所述试剂盒以进一步鉴定所述复合物中之结合伴侣的说明书。
本发明还提供了用于本发明方法的试剂盒中的各个组分。
本发明还提供了一种评估限定区域(例如地理区域、住宅区域、运输工具或医学治疗或评估中心)内一个或多个受试者暴露于黄病毒或其等价物的相对风险的方法，其包括：
从限定区域内的代表性群体中获得样品；以及
通过包括以下步骤的方法来评估样品群体中各成员暴露于黄病毒或其等价物的证据：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物进行接触；以及
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况，其中所述复合物的存在指示该受试者暴露于黄病毒或其等价物；以及
通过表征所述复合物中的结合伴侣来评估限定区域内暴露的相对风险。
可使用计算机可读形式的软件来进行风险分析。因此，本发明还涉及适于分析受试者或受试者群暴露于黄病毒或其等价物或者受试者或受试者群暴露于黄病毒或其等价物之风险的计算机可读程序以及包含其的计算机。
附图说明
图1显示使用由泛-登革热单克隆抗体包被的聚苯乙烯板对登革热裂解物抗原进行优化。
图2显示使用确诊为登革热的成对血清对ACA-ELISA进行优化。
图3显示使用经确认的登革热阴性和阳性血清样品来确定ACA-ELISA的临界点。
图4显示两种抗登革热IgA ELISA技术(ACA和AAC)的灵敏度比较结果。
图5显示使用两种抗登革热IgA ELISA技术对确诊为登革热的血清样品中由非登革热特异性IgA所导致的抑制进行比较研究。
图6显示使用两种ELISA技术所产生抗登革热IgA的动力学，及其与使用确诊为登革热的血清样品时之抗登革热IgM的比较。
图7显示对基于唾液的ACA ELISA的优化。
图8显示ACA-ELISA所检测的唾液中抗登革热IgA产生的动力学。
图9显示使用确诊为登革热的唾液样品对ACA-ELISA(唾液和血清)与登革热IgM ELISA(pan-bio)的表现进行比较。
发明详述
第一方面，本发明提供了用于检测受试者中特异性针对黄病毒或其等价物的IgA的方法，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物进行接触；以及
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；以及
用抗IgA抗体表征所述复合物中的结合伴侣。
该方法特别地用于鉴定生物样品中IgA形式的结合伴侣。可使用经黄病毒特异性IgA分离得到的免疫原性组分来进一步改进该方法。因此，所述免疫原性组分可以是黄病毒IgA特异性免疫原性组分。引入IgA特异性免疫原性组分将会吸引生物样品中特异性针对该黄病毒的IgA。
另一方面，本发明提供了用于检测受试者对登革病毒或其等价物的暴露的方法，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物进行接触；
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；
表征所述复合物中的结合伴侣；以及
将所述结合伴侣与对黄病毒的暴露相关联。
本发明提供了一种新的抗登革热IgA检测技术(ACA-ELISA)，其优选靶向唾液以作为血液的替代品。相比于IgG和IgM(分别为1.4mg/100mg和0.2mg/100ml)，唾液中含有高水平的IgA(19.9mg/100ml)。就检测抗黄病毒IgA来说，该技术检测唾液具有比检测血清更好的表现，并可用作初级保健系统中当基于分子的黄病毒诊断不可用时的早期黄病毒诊断之一。
本发明源自对开发一种检测当前或不久前暴露于黄病毒的快速、低成本和直接测定的需求。根据本发明，对受试者(包括动物例如哺乳动物，特别是人)筛选针对黄病毒或其等价物的结合伴侣(优选IgA)的存在情况。优选的结合伴侣是来源于受试者的结合伴侣，例如但不仅限于免疫互作分子(immunointeractive molecule)。免疫互作最强的分子是抗体，特别是免疫球蛋白A(IgA)。然后，将这些结合伴侣的鉴定用作该受试者当前或不久前暴露于黄病毒或其等价物的证据。
本发明特别地使用了抗体(优选单克隆抗体)来捕获包含黄病毒免疫原性组分混合物的抗原(优选来自黄病毒感染之细胞的裂解物)，所述黄病毒免疫原性组分包括黄病毒颗粒以及指示黄病毒感染的其它抗原。在本发明中，所述细胞裂解物优选包含含有病毒颗粒以及结构和非结构病毒蛋白的黄病毒免疫原混合物。优选地，所述黄病毒免疫原是能够引发与生物样品中结合伴侣之免疫反应的裂解物免疫原性组分。
因此，与其它常规的和目前最常用的抗体捕获IgA(AAC-ELISA)相比，本发明通过提供在感染早期可鉴定针对黄病毒或其等价物所产生的抗体的平台从而显示出更高的灵敏度和特异性。
因此，本发明提供了一种优选使用感染黄病毒之细胞裂解物的新的特异、快速且经济的检测方法，所述裂解物包含黄病毒组分的混合物(优选上述裂解物的免疫原性组分)，其使得特异性检测黄病毒结合伴侣(优选可能存在于测试血清或唾液中的IgA)。该测试十分快速，优选在室温(RT)下90分钟内提供结果。除了是用于检测特异性抗体的简便技术之外，本发明的一个主要优点是：优选使用黄病毒特异性单克隆抗体从粗制细胞裂解物中纯化黄病毒抗原以及从唾液中检测抗黄病毒IgA。另外，由于最大程度暴露人血清或唾液中存在的抗登革热IgA，因此本发明具有高的测试灵敏度。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变化形式(如“包含”和“含有”)的使用不意在排除其它添加物、组分、整数或步骤。
黄病毒
本文的权利要求书和说明书中使用的术语“黄病毒”包括黄病毒科的黄病毒，其包含导致人类疾病且通常经节肢动物(如蚊和蜱)传播的黄病毒属。该病毒导致例如但不限于黄热病(YF)、登革热(DF)和日本脑炎(JE)的疾病。组成该属的黄病毒种在核苷酸和氨基酸序列水平上具有一定的序列保守性。黄病毒属中的病毒包括但不限于黄热病(YF)病毒、登革病毒、西尼罗河(WN)病毒和日本脑炎(JE)病毒。由于核苷酸和氨基酸水平上的相似性，这些病毒在抗原性、传播和致病中可显示出相似性。最优选地，本发明的黄病毒是登革病毒。
登革病毒
本文的权利要求书和说明书中使用的术语“登革病毒”是指与登革热感染有关的所有登革热血清型(Den-1、Den-2、Den-3和Den-4)。优选地，本发明可适用于在任何受试者(包括人、非人动物和实验动物)中检测登革病毒感染或暴露。但是，本发明优选人类受试者。然而，本发明包括可以对登革病毒或其等价物的感染或免疫产生应答的任何受试者。
登革病毒被定义为一组人类RNA病毒，其包含直径约为40-50nm的被膜颗粒。该病毒的基因组约为11kb(Stollar等，1966)。成熟的病毒体包含包在等边(isometric)核衣壳中的正义RNA基因组。该基因组编码一个约11000个核苷酸的开放读码框，其编码3种结构蛋白(C-衣壳、M-膜和E-被膜)和7种非结构蛋白(NS1、NS2a和NS2b、NS3、NS4a和NS4b、NS5)。
登革病毒通过经感染的雌性伊蚊(Aedes)(主要是埃及斑蚊(A.aegypti))叮咬而传播给人。这是一种小型、黑白两色、主要在室内活动(highly domesticated)的热带蚊子，它常将卵产于室内或附近的可盛有水的人造容器中，如桶、花瓶及其它盛水容器。成年蚊很少在户外发现；它们通常栖息在室内黑暗的位置，不显眼，并喜欢在白天以人或动物为食，大多数叮咬发生在凌晨或傍晚(Gubler等，1992；Newton等，1992)。雌蚊在摄食时警惕性很高，即使宿主极其轻微的动作都会干扰其取食过程，随后其返回原先的宿主或另外的宿主继续取食。由于该蚊的这种行为，其常常在一次进食中在若干人身上取食，如果其被感染，则可将病毒传播给多人(Platt等，1997；Scott等，1997)。这种行为还用于解释流行病学所观察到的如下现象：登革热病主要在儿童中发病；而在某些地方(如新加坡)，由于采取了媒介物控制措施，这种情形可以发生改变(Ooi等，2001)。
在被经感染的雌蚊叮咬后，病毒进入3至14天的内潜伏期(intrinsicincubation period)(平均4至7天)，之后患者可经历急性发热并伴随其它非特异性迹象和症状。在该病毒血症期期间(可为2～7天)，病毒在被感染人的血液中循环。如果未经感染的伊蚊取食病毒血症期间的宿主，这只蚊子在必经的10～12天外潜伏期后将会被感染，它随后能够将该病毒传播给其他未被感染的宿主。尽管研究表明猴子可被感染并且可能作为该病毒的扩增主体，但是在该传播循环中人才是该病毒的主要扩增宿主(Putnam等，1995；Gubler等，1976；WHO，情况说明书，2002)。
取决于所感染的病毒、宿主的年龄和免疫状况，登革病毒感染导致人的多种疾病。它可以导致无症状疾病，或者从未分化的流感样疾病(病毒综合征(Viral syndrome))到登革热(DF)，到登革出血热(DHF)，以至严重并致命的登革休克综合征(DSS)(Nimmannitya，1993：WHO，1997)。
世界卫生组织已建立了登革出血热严重程度的分级标准。分为4个严重性等级，其中等级III和等级IV被认为是登革休克综合征(DSS)。
等级I：具有非特异性全身症状的发热，仅有的出血性表现是止血带试验呈阳性和/或容易发生瘀伤(bruising)。
等级II：除等级I中的表现外，皮肤自发性出血或其它出血。
等级III：表现为快速微弱的脉搏、脉压变窄(narrowing of pulse pressure)或低血压的循环衰竭，并出现皮肤冰冷、湿粘以及多动不安(restlessness)。
等级IV：深度休克(profound shock)，并检测不到血压或脉搏(WHO，1997)。
典型的登革热在年龄稍大的儿童、青少年和成人中更为常见，他们较少为无症状的(Sharp等，1995)。发作时突然发热，并伴有高烧、头痛、失能性肌痛(incapacitating myalgia)和关节痛、恶心呕吐以及斑疹或斑丘疹(Waterman，1989)。发热通常持续5～7天，有时会跟随有双峰式病程(biphasic course)(鞍背状)(Nimmannitya，1993)。
尽管登革出血热也发生在成人中并且其主要与继发登革热感染有关，它主要是发生在15岁以下儿童中的疾病(Sumarmo等，1983；WHO)。登革出血热的关键阶段是体温变为正常时的退热期。在该时期决定疾病严重程度的主要因素是由增加的血管渗透性所致的血浆渗出(plasmaleakage)、稳态异常以及其它常见出血现象(如瘀点、紫癜性损伤和瘀斑)。这些症状加上止血带试验呈阳性有助于登革出血热的准确诊断(GublerDJ.，1998)。
登革休克综合征是登革出血热的末期阶段，其表现为血浆渗出引起的低血容量性休克(WHO，1997)。登革休克综合征有4种征兆：持续腹痛、持续呕吐、多动不安或嗜睡，以及突然由发热转变为低体温并伴有出汗和虚脱。有经验的医护人员的早期鉴定和适当治疗可以降低登革休克综合征的致死率至0.2％，但一旦发生休克，死亡率会超过40％(Nimmannitya，1994；Rigau-Perez JG等，1998)。
E蛋白是暴露于该病毒表面上最大的且仅有的结构蛋白，它是参与免疫反应(如受体结合、血凝(haemmagglutination)和中和)的主要蛋白。被所述血清型之一感染的人对该血清型产生终生免疫，但对其它血清型仅产生暂时性保护。
核质粒(nucleoplasmid)依次被含有脂质的被膜和膜蛋白包围。除被膜和衣壳蛋白外，登革病毒还包含7种非结构蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。
等价物
本文涉及黄病毒时使用的术语“等价物”意在包括可以引发与黄病毒或黄病毒的结构或非结构蛋白可引发的应答同样或类似之应答的相似分子。例如，黄病毒在感染的各个阶段所表达的各种抗原或者各种病毒颗粒或片段可以导致与完整病毒类似的效果。所述应答可以是免疫应答(非临床应答)，或者是感染性应答(临床应答)或由疫苗接种所致。
暴露
本发明适用于检测针对黄病毒或其等价物的暴露。暴露可以是当前或先前对黄病毒或其等价物的暴露。优选地，所述暴露足以引发体内的免疫反应或应答，从而诱导对黄病毒或其等价物产生应答的结合伴侣。受试者一经暴露，本发明的方法即可以应用于上述的任何暴露阶段。优选地，本方法用于检测那些不具有明显的黄病毒感染迹象和症状的暴露。优选地，本方法在以下任意黄病毒感染阶段检测受试者对黄病毒或其等价物的暴露：在继发感染的急性期早期，或者在原发感染或疫苗接种的恢复期晚期。该暴露并不总表现出黄病毒感染或者明显的迹象或症状，但它会引起应答从而诱导产生结合伴侣。优选地，所述应答为免疫应答。
受试者可以曾经暴露于黄病毒，但无需表现出可见的感染症状。本方法检测可导致感染的暴露或者可以指示未表现出任何症状的先前暴露。
免疫应答
“免疫应答”是指脊椎动物的免疫系统产生的选择性应答，其中针对被机体识别为外源物的入侵病原体和抗原产生特异性抗体或抗体片段和/或细胞毒性细胞。
结合伴侣
结合伴侣是针对外源登革病毒或其等价物而产生的任何分子或细胞。优选地，所述结合伴侣是抗体或其免疫学活性片段，或细胞毒性细胞。所述结合伴侣包括可以与黄病毒抗原或等价物相互作用的免疫互作分子并优选IgA分子。
如本文所示，优选的结合伴侣是免疫互作分子，其优选指包含抗原结合部分或其衍生物的任何分子。优选地，所述免疫互作分子是在黄病毒感染或暴露的受试者之体液应答期间产生的针对黄病毒蛋白任意部分的抗体。
如本文所示，优选的结合伴侣是受试者产生的针对黄病毒或相关病毒组分的抗体。然而，也可使用被靶向抗体的结合伴侣。这样的结合伴侣的实例是抗独特型抗体或者特异性针对并区别于目标抗体的抗体，所述目标抗体特异性针对黄病毒或相关病毒组分。
本文使用的“抗独特型抗体”是指与另一抗体的特异性抗原结合位点结合的抗体，所述另一抗体是由对源自黄病毒或其免疫学近亲的组分的暴露产生应答而产生的。
本文使用的术语“抗体”包括完整的抗体以及包含其功能性部分的抗体片段。术语“抗体”包括含有轻链可变区和/或重链可变区充足部分的任何单特异性或双特异性的化合物，从而与完整抗体对其具有结合特异性的表位结合。所述片段可包括至少一条重链或轻链免疫球蛋白多肽的可变区，并包括但不仅限于Fab片段、F(ab’)2片段和Fv片段。
优选地，所述结合伴侣是抗体。更优选地，其为黄病毒IgA分子或登革热IgA分子。
生物样品
本发明的方法通过使用获取自曾可能暴露于所述病毒之受试者的生物样品来检测对黄病毒或其等价物的暴露。所述生物样品可以是来自机体的可包含结合伴侣的任何样品。这样的生物样品可选自血液、唾液、脊髓液(cord fluid)、B细胞、T细胞、血浆、血清、尿液和羊水等。优选地，所述生物样品为血清或血浆。最优选地，所述生物样品为血清或唾液。
所述生物样品还优选获取自疑似暴露于黄病毒的受试者。生物样品还可以在使用前进行修饰，例如稀释、纯化各级分、离心等。因此，生物样品可以指从完整生物体或其一部分组织、细胞或部分组分制备的匀浆物、裂解物或提取物，或其级分或部分。
应注意的是，生物样品还可以不包含能够与黄病毒或其等价物相互作用的结合伴侣。这种情形发生在受试者未曾暴露于黄病毒或其等价物时。由于在缺乏结合伴侣时不会形成复合物，因此“检测生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间所形成的复合物的存在情况”可能得到零结果。可以使用黄病毒特异性免疫试剂(如设计为竞争生物样品中结合伴侣的单克隆抗体)作为对照。
提及与组分(优选免疫原性组分或其免疫学近亲)接触的生物样品时，应理解为提及促进该生物样品中一种或多种免疫互作分子与组分(优选来源于经黄病毒或其等价物感染之细胞的裂解物的组分)之间相互作用的任何方法。所述相互作用应为免疫互作分子与来源于经黄病毒或其等价物感染之细胞的裂解物的特异性免疫原性组分之间可以发生的偶联、结合或其它相互作用。
所述生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物(优选来源于经黄病毒或其等价物感染的细胞之裂解物)相接触。所述裂解物提供了病毒免疫原性组分，其可以由任何发育阶段的黄病毒提供。在黄病毒感染的恢复期早期，来自先前登革热感染的抗体(优选IgA)是继发或原发黄病毒感染的指示之一，这可以通过其与黄病毒特异性免疫原性组分(优选所述裂解物的免疫学组分)之间形成复合物来检测。
细胞裂解物
优选通过使用黄病毒特异性单克隆抗体的免疫纯化来纯化本发明中使用的裂解物。重要的是，所述裂解物是来源于已被黄病毒或其等价物感染之细胞的组分混合物。所述裂解物是黄病毒特异性免疫原性组分的优选来源。然而，这些组分可通过其它方法得到。由于裂解物可提供病毒产生的最早抗原(其可引发IgA应答)，因此细胞裂解物开始是最方便的。
当受试者暴露于黄病毒时，机体发生反应以除去该病毒。这导致通常表现为对黄病毒或其等价物呈递的多种抗原的免疫应答中的一系列事件。
本发明的裂解物可以获得自已感染黄病毒或其等价物之细胞的任何来源。优选地，所述细胞是在体内培养中被黄病毒或其等价物感染的细胞。
任何类型的细胞都可以被感染。优选地，所述细胞类型能够感染并培养黄病毒。但是，优选地，根据本发明的方法感染那些能够产生高滴度黄病毒的细胞，所述细胞包括但不仅限于常用的传代细胞系(例如Vero细胞(Vero-PM细胞株)、CV-1细胞，LLC-MK2，C6/36和AP-61细胞)、原代细胞系(如恒河猴胎肺细胞(FRhL-2)、BSC-1细胞和MRC-5细胞)或人二倍体成纤维细胞。本发明还涉及细胞类型的组合。使用黄病毒或其等价物感染C6/36或AP-61细胞。最优选的细胞类型为C6/36。
可以将细胞培养任意长的阶段，优选允许黄病毒进入并感染细胞的阶段。更优选地，将细胞培养至细胞培养物中的致细胞病变效应(cytopathiceffect)明显时，其指示细胞中病毒活跃的感染。
这时，可以利用本领域技术人员已知的任何方法来裂解细胞。通常，可使用低渗缓冲液(包含去垢剂如Triton X)，只要该裂解缓冲液不会影响黄病毒或其等价物的免疫原但可使活病毒颗粒失活即可。
应理解的是，所述裂解物包含病毒免疫原性组分的混合物，其包括结构和非结构的病毒抗原以及完整的黄病毒颗粒。对于登革病毒来说，这些可选自DEN1、2、3或4等。本发明试图通过提供生物样品中响应于对黄病毒或其等价物的暴露而产生的结合伴侣混合物来提供抗原混合物。
优选地，所述黄病毒是登革病毒。
更优选地，所述黄病毒或登革热特异性免疫原性组分是黄病毒或登革病毒的结构或非结构蛋白。更优选地，所述结构蛋白选自可被抗黄病毒IgA所捕获的C-衣壳、M-膜和E-被膜蛋白等。更优选地，登革病毒的非结构蛋白选自NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5等。
可以采用任何方式对裂解物进行处理。优选地，将裂解物净化以去除细胞核、细胞碎片和完整的黄病毒颗粒。可以将裂解物分装并储存于-80℃备用。
对于登革病毒来说，先前的方法使用特异性的登革热抗原DEN1、2、3和4(存在于登革病毒感染细胞的上清中)来检测指示登革病毒感染的抗体。然而，本发明不仅使用这些抗原，还使用在黄病毒暴露期针对其产生抗体的黄病毒分子/免疫原的混合物(存在于黄病毒感染的细胞中，其可包含黄病毒颗粒和其它免疫学组分，优选结构和非结构蛋白)。
所述黄病毒特异性免疫原性组分优选来自裂解物，所述生物样品进行接触从而所述裂解物的病毒免疫原性组分可以与所述生物样品中含有的结合伴侣形成复合物。优选地，所述黄病毒颗粒的免疫原包括但不限于抗登革热IgA捕获的结构和非结构蛋白，所述免疫原与结合伴侣将形成复合物。优选地，所述特异性结合伴侣是来源于生物样品的抗体或其片段。它们只有在受试者已暴露于登革病毒或被其免疫时才会存在。
复合物形成
在抗体(优选针对登革病毒或其等价物的IgA)与黄病毒特异性或反应性免疫原性组分之间会形成复合物。
本发明的方法和试剂盒试图检测组分和结合伴侣，其形成复合物并指示黄病毒感染。这些组分和结合伴侣在黄病毒感染过程中产生。
所述复合物可包含与来源于黄病毒或其等价物的一种或多种组分结合的一种或多种结合伴侣。但是，并非所有都是黄病毒特异性IgA。另一些分子例如IgG和IgM也可结合。
在使得复合物稳定形成或抑制竞争性免疫试剂(如特异性单克隆抗体)结合的条件下，将所述生物样品与来源于黄病毒或其等价物的组分接触足够长的时间。
将所述黄病毒特异性免疫原性组分与所述生物样品接触，从而使得所述组分与所述生物样品中的结合伴侣之间可以形成复合物。优选地，包含但不仅限于结构和非结构蛋白(优选通过具有黄病毒特异性表位的抗黄病毒IgA捕获)的所述黄病毒颗粒的免疫原会与结合伴侣或竞争性黄病毒特异性免疫试剂(例如特异性IgA)形成复合物。优选地，所述特异性结合伴侣是所述生物样品中存在的抗体或其片段。它们只有当受试者已暴露于黄病毒或被其免疫时才会存在。
优选地，抗体(优选特异性针对黄病毒属成员或其等价物的IgA)与抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分之间会形成复合物。于是，这指示样品中存在黄病毒特异性IgA，并因此指示最近或之前的暴露。
如果所述组分上仍保留同样表位的话，竞争性黄病毒或成员特异性的免疫试剂也会与所述组分形成复合物。当所述结合伴侣与所述免疫试剂特异性针对同一表位时会形成竞争，这指示所述结合伴侣的存在以及先前曾暴露于黄病毒。
本发明的优选方法依赖于检测所述生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣(优选IgA)，所述结合伴侣特异性针对来源于黄病毒或其等价物感染的细胞之细胞裂解物中存在的黄病毒抗原组分，该组分是使用抗黄病毒IgA捕获的。所述复合物可包含与源自黄病毒或其等价物的一种或多种组分结合的一种或多种结合伴侣。但是，在本发明中，鉴定出与所述复合物结合的IgA指示先前的暴露。
一经结合，可加入竞争性黄病毒特异性免疫试剂。因此，优选包括预孵育的步骤，其使得结合试剂与黄病毒特异性免疫原性组分在免疫试剂加入前形成复合物。但是，这些组分也可以同时加入。
检测黄病毒特异性IgA的支持物
因此，另一方面，本发明提供了用于检测受试者对黄病毒或其等价物之暴露的方法的固体支持物，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物或其等价物进行接触；
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；以及任选地
表征所述复合物中的结合伴侣从而将所述结合伴侣与对黄病毒的暴露相关联；
所述支持物包含固定于其上的黄病毒特异性免疫原性组分。
所述固体支持物可以是本领域普通技术人员已知的并且结合伴侣或黄病毒特异性免疫原性组分可与之结合的任何材料。例如，该固体支持物可以是微量滴定板中的测试孔或者硝酸纤维素膜或其它合适的膜。或者，所述支持物可以是珠或盘，例如玻璃、玻璃纤维、胶乳或塑胶材料(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。该支持物还可以是磁性颗粒或光纤传感器，例如在美国专利No.5,359,681中公开的那些。
可用本领域技术人员已知的技术将所述结合伴侣或黄病毒特异性免疫原性组分固定在固体支持物上，这已详细描述于专利文献和科学文献中。在本发明中，术语“固定”既指免疫吸附或非共价结合(如吸附)，也指共价结合(其可以是抗原或核苷酸与支持物上的功能性基团直接连接，或者可以通过交联剂进行连接)。优选使用吸附至微量滴定板的孔或吸附至膜的固定方式。在这些情形中，可以通过将结合伴侣或细胞裂解物组分与固体支持物在合适的缓冲液中接触适当长的时间来实现吸附。接触时间随温度而变化，通常约为1小时和过夜。
通常还可以通过首先将所述支持物与双功能试剂反应来实现结合伴侣或黄病毒特异性免疫原性组分与固体支持物的共价结合，所述双功能试剂与支持物以及结合伴侣或细胞裂解物组分的官能团(羟基或氨基)均发生反应。例如，可以使用苯醌或者通过所述支持物上醛基与所述组分的胺基和活化氢缩合将所述结合伴侣或组分共价连接至具有适当聚合物包被的支持物(参见，例如Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook，1991，A12-A13)。
检测、表征和鉴定所述复合物的结合伴侣
然后，在使得复合物稳定形成的条件下，将源自黄病毒或其等价物的黄病毒特异性免疫原性组分与所述生物样品接触足够长的时间。复合物一经形成，即加入检测系统以检测所述复合物中结合伴侣与所述黄病毒特异性免疫原性组分的特异性结合。
可以基于任何方便的方法来检测源自黄病毒或其等价物的组分源自受试者的结合伴侣(例如免疫反应性分子)之间的复合物，所述方法是本领域技术人员已知的。
认为用于检测形成复合物并指示生物样品中黄病毒感染的组分和结合伴侣的方法包括但不仅限于：免疫测定，例如免疫印迹、免疫细胞化学、免疫组织化学或抗体亲和色谱、Western印迹分析或这些方法的变形或组合，或者本领域已知的另一些技术。
通常，可以通过本领域技术人员可用的任何方法在获得自受试者的生物样品中检测形成组合物并指示黄病毒感染的组分和结合伴侣。在一个优选的实施方案中，所述检测方法使用另外的检测试剂(例如缀合有酶的特异性MAb和抗MAb)，其允许检测所述复合物和结合伴侣。
在一个优选的实施方案中，本文所述方法包括使用源自感染了黄病毒或其等价物的细胞裂解物或者从其中纯化的组分(在本文中可互换地指“组分”或“细胞裂解物组分”)，其固定于生物样品的结合伴侣可吸附/结合于其上的固体支持物(例如聚苯乙烯或硝酸纤维素膜)上。然后可以使用包含报告基团并特异性结合所述组分/结合伴侣复合物的检测试剂来检测细胞裂解物组分与结合伴侣所形成的复合物。这样的检测试剂可包括例如抗体或特异性与结合伴侣结合的其它试剂，如抗免疫球蛋白(即抗体)、G蛋白、A蛋白或凝集素。或者，可使用竞争性测定，其中能够与源自黄病毒成员的抗原结合的检测试剂用报告基团进行标记，并使之与固定的细胞裂解物组分连同生物样品中的结合伴侣结合。生物样品中的结合伴侣抑制经标记的黄病毒检测试剂与固定组分结合的程度指示生物样品中结合伴侣与固定组分的反应性。
在一个优选的实施方案中，所述检测试剂是能够与生物样品中的结合伴侣结合的抗体或二抗或其抗原结合片段。可以通过本领域普遍技术人员已知的多种技术之任一种或几种来制备抗体(例如，参见Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。通常，可以利用细胞培养技术(包括产生单克隆抗体)或通过将抗体基因转染进合适的细菌或哺乳动物细胞宿主(以产生重组抗体)来产生抗体。
可以将缀合有标记的二抗加入复合物以利于检测。可以使用多种提供可检测信号的标记。所述标记可选自色原、酶、催化剂、荧光团和直接可见的标记。对于直接可见的标记来说，可以使用胶体金属或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物或胶乳颗粒。许多适于用作标记的酶已公开于美国专利No.4366241、4843000和4849338中。本发明中合适的酶标记包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，优选辣根过氧化物酶。酶标记可单独使用或与溶液中的另一种酶联合使用。在本发明中，优选使用与辣根过氧化物酶(其随后与其底物DAB反应并产生可察觉的颜色改变)连接的二抗来检测复合物。
优选地，所述抗体是抗IgA抗体，从而检测已与所述黄病毒特异性免疫原性组分结合的IgA结合伴侣。
所述方法概述
实施该测定可以通过首先将已固定在固体支持物(通常为微量滴定板的孔)上的生物样品中的结合伴侣与如本文所述的黄病毒特异性免疫原性组分进行接触，从而使所述组分与固定的结合伴侣(例如抗体)结合。或者，可以将所述黄病毒特异性免疫原性组分与固体支持物结合，从而使结合伴侣与固定的组分结合。然后，从固定的复合物除去未结合样品，加入检测试剂(优选能够结合所述结合伴侣或所述组分并含有报告基团的二抗)。然后使用适用于特定报告基团的方法来测定仍结合在固体支持物上的检测试剂的量。
更特别地，所述结合伴侣或黄病毒特异性免疫原性组分一经如上所述固定于所述支持物上，通常将所述支持物上剩余的结合位点封闭。可以使用任何本领域普通技术人员已知的合适封闭剂，例如血清白蛋白或含Triton X 100或吐温20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)的脱脂乳。还可以用合适的稀释缓冲液对所述组分或结合伴侣进行稀释，所述缓冲液如含有人血清的磷酸盐缓冲液(PBS)以及孵育前的Triton X 100或吐温20。通常，合适的接触时间(即孵育时间)优选30分钟，其足以使得黄病毒特异性免疫原性组分与固定的结合伴侣结合，反之亦然。优选地，所述接触时间足以实现：与所结合的黄病毒特异性免疫原性组分上的靶表位结合水平是结合和未结合的结合伴侣或黄病毒特异性免疫原性组分之间平衡时所达到水平的至少约95％。本领域普通技术人员会了解，可以通过测定一段时间内发生结合的水平来方便地确定达到平衡所需时间。在室温(RT)下，约30-60分钟的孵育时间通常足矣。
然后，可以通过用合适的缓冲液(例如含0.05％吐温20TM或吐温80的PBS)冲洗所述固体支持物来除去未结合的黄病毒特异性免疫原性组分或结合伴侣。然后可加入能够结合所述结合伴侣且含有报告基团的检测试剂。所述检测试剂通常是抗IgA抗体。优选的报告基团包括本文所述的基团。然后将所述检测剂与固定的结合伴侣-组分复合物一起孵育足够长的时间以检测所结合的组分或结合伴侣。通常可以通过测定在一段时间内发生结合的水平来确定合适的时间。然后除去未结合的检测试剂，并使用报告基团来检测结合的检测试剂。用于检测报告基团的方法取决于报告集团的性质。对于放射性基团来说，闪烁计数或放射自显影方法通常是适用的。光谱方法可用于检测染料、发光基团、显色酶(chromogenic enzyme)和荧光基团。显色酶包括但不仅限于过氧化物酶和碱性磷酸酶。荧光基团包括但不仅限于异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)、罗丹明、德克萨斯红和藻红蛋白。生物素可以使用偶联有不同报告基团(通常为放射性或荧光基团，或者酶)的抗生物素蛋白来检测。酶报告基团通常可通过加入底物(通常保持特定长短的时间)、随后对反应产物进行光谱分析或其它分析来检测。底物可选自如下试剂：4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphtol，4CN)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)、氨乙基咔唑(aminoethyl carbazole，AEC)、2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2，2’azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)、邻苯二胺(ophenylenediamine，OPD)和四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)。
优选地，还可以将多于一个报告基团偶联至检测试剂。在一个实施方案中，多个报告基团被偶联至一个检测试剂分子上。在另一实施方案中，可以将多于一种类型的报告基团偶联至一种检测试剂。不考虑特定的实施方案，可利用多种方式来制备带有多于一种报告基团的检测试剂。例如，多于一种的报告基团可直接与检测试剂偶联，或者可以使用提供多个连接位点的接头。
在一个相关的实施方案中，本文所述的方法可以以流过(flow-through)或条带测试(strip test)的方式进行，其中生物样品中的结合伴侣或黄病毒特异性免疫原性组分被固定在膜(如硝酸纤维素膜)上。例如，在流过测试中，当样品通过膜时，黄病毒特异性免疫原性组分能够与固定的结合伴侣结合。或者，当样品通过膜时，生物样品中的结合伴侣能够与固定的黄病毒特异性免疫原性组分结合。然后，当含有检测试剂的溶液流过膜时，另一种经标记的检测试剂与结合伴侣-组分复合物结合。随后可以如上所述对结合的检测试剂进行检测。
在条带测试中，将细胞裂解物组分所结合的膜的一端浸在含有生物样品的溶液中。该生物样品中的结合伴侣沿着膜迁移，其穿过含有检测试剂的区域到达固定组分区域。在固定的结合伴侣-组分复合物区域的检测试剂浓度指示生物样品中结合试剂的存在。通常，该位点的检测试剂浓度形成一种图案，例如可见并可读取的线。没有这样的图案指示阴性结果。通常，当生物样品包含的结合试剂水平足以形成三明治测定(以上述的形式)中的阳性信号时，膜上或聚苯乙烯板上所固定的结合伴侣的量会产生可见的可分辨图案。通常可以用很少量的生物样品进行这些测试。
在简化的条带测试或试纸条测试(dipstick test)中，可以将细胞裂解物组分固定在膜(如硝酸纤维素膜)上。然后，可以将膜条带与生物样品反应从而在组分和生物样品中的结合伴侣之间形成复合物。随后使用检测试剂(如抗体)利用上述任意方法来检测复合物。试纸条测试可以迅速指示先前的暴露，而无需使用大量生物样品。
本文使用的“结合”是指两个单独分子的非共价结合，从而形成复合物。结合的能力可通过例如测定复合物形成的结合常数来评估。结合常数是将复合物的浓度除以组分浓度的乘积得到的值。通常，在本发明中，当复合物形成的结合常数超过约103L/mol时，认为两个化合物“结合”。可使用本领域公知的方法来测定结合常数。
本发明的方法和试剂盒所涉及的膜包括可与结合伴侣、源自黄病毒或其等价物结合的膜。所述膜的实例包括但不限于：硝酸纤维素膜、聚四氟乙烯滤膜、醋酸纤维素滤膜和硝酸纤维素滤膜。最优选地，所述膜为硝酸纤维素膜。
或者，本发明的诊断方法可使用生物微芯片而采用自动分析方法。例如，可组成诊断试剂盒，其使用包被有细胞裂解物组分的载玻片进行免疫印迹。如本文所述，该诊断试剂盒可包含生物学微芯片(其表面上固定有黄病毒特异性免疫原性组分)、合适的缓冲液、包含可检测水平的结合试剂的标准样品以及二级检测试剂(secondary detection reagent)。
本发明的方法和试剂盒可检测人或动物对黄病毒或该家族任意特定成员或其等价物的在急性感染期或恢复期的特定暴露。本文使用的“急性感染”是指病毒已感染宿主并且活跃复制和/或导致感染相关症状(如发热、皮疹(rush)、关节痛和/或腹痛)的一段时期。“恢复期”是指黄病毒不再增殖或维持在宿主血液中、并且已产生结合伴侣(例如但不仅限于抗体)的黄病毒感染周期阶段。使用本发明的方法和试剂盒，可以在感染的患者或先前感染的患者中产生结合伴侣后的任何时间检测暴露。
试剂盒
另一方面，本发明提供了用于检测受试者中特异性针对黄病毒或其等价物的IgA或者用于检测黄病毒暴露的试剂盒，其包含：
包含黄病毒特异性免疫原性组分或其等价物的固体支持物；或
与第二支持物连接的包含黄病毒特异性免疫原性组分或其等价物的固体支持物；
至少一种缀合有报告基团的检测试剂，其用于检测生物样品中与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成复合物的结合伴侣；以及任选地
使用所述试剂盒进一步鉴定所述复合物之结合伴侣的说明书。
任选地，所述试剂盒还包括另外的部分，如实施该方法所需的清洗缓冲液，孵育容器，封闭缓冲液和说明书。
因此，本发明提供了用于检测受试者暴露于黄病毒或该家族任意成员或其等价物的试剂盒。该试剂盒可以采用使生物样品中的结合伴侣与抗登革热IgA捕获的黄病毒组分相互作用、并可进一步与竞争性黄病毒特异性免疫试剂进行竞争的任何方便的形式。生物样品中存在黄病毒特异性结合伴侣的结果表明先前曾暴露于黄病毒。优选地，该试剂盒包含如本文所述的固体支持物，其适于接受或包含抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或其等价物组分。所述试剂盒还可以包含试剂、能够提供可检测信号的报告分子以及可选的使用说明书。该试剂盒可以采用组合的形式，其中各组成部分可以分别购买。
所述试剂盒可以是包括一个或多个成员的组合试剂盒，其中至少一个成员是包含抗黄病毒IgA捕获的黄病毒或等价物或细胞裂解物(其包含源自黄病毒或其等价物的免疫原性组分)的黄病毒组分的固体支持物。
在一个可替代的实施方案中，所述固体支持物包含针对来自一个或多个受试者的一种或多种黄病毒或其等价物的一种或多种组分的结合伴侣之阵列。
本发明还提供本发明的方法中使用的试剂盒的单独组分。本发明提供了固体支持物，其包括用于检测黄病毒暴露的抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分。在一个实施方案中，本发明提供了聚苯乙烯96孔板或硝酸纤维素膜来附着病毒抗原，其或者用作固定的抗黄病毒IgA捕获的黄病毒组分，或作为点印迹，或者用作包含黄病毒或其等价物组分的试纸条。优选地，所述板或膜包含选自以下的组分：黄病毒结构和非结构蛋白、黄病毒颗粒及其片段、源自黄病毒的糖蛋白、脂质和碳水化合物或其任意混合物等。
所述固体支持物还可以是细胞裂解物组分固定于其上的微量滴定板、载玻片或生物微芯片。然后，可将这些固体支持物与生物样品接触以检测黄病毒暴露。优选地，使用来自经黄病毒感染的细胞裂解物的抗黄病毒IgA，利用聚苯乙烯微量滴定板通过免疫纯化来附着黄病毒抗原。
在硝酸纤维素膜的情形中，所述第二支持物可以是固定器，其固定固体支持物以改善固体支持物(其包含固定的黄病毒组分)的操作。例如，硝酸纤维素膜可以靠小棒(stick)夹持，从而使该膜能够浸入生物样品(如血清)中。这作为试剂盒的组分是有用的，因为可以同时检测少量的生物样品。
评估感染的相对风险
再一方面，本发明还提供了一种评估限定区域(例如地理区域、住宅区域、运输工具或医学治疗或评价中心)内一个或多个受试者暴露于黄病毒或其等价物的相对风险的方法，其包括：
从限定区域内的代表性群体中获得样品；以及
通过包括以下步骤的方法来评估样品群体中各成员暴露于黄病毒或其等价物的证据：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分进行接触；以及
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况，其中所述复合物的存在指示该受试者暴露于黄病毒或其等价物；以及
通过表征所述复合物中的结合伴侣来评估限定区域内暴露的相对风险。
可使用计算机可读形式的软件来进行风险分析。因此，本发明还涉及适于分析受试者或受试者群暴露于黄病毒或其等价物或者受试者或受试者群暴露于黄病毒或其等价物之风险的计算机可读程序以及包含其的计算机。
本发明的方法或技术允许对由黄病毒或该家族任意成员或其等价物导致的感染发作进行流行病学研究或血清监视。这些研究提供了多方面增进黄病毒疾病领域研究的有价值的信息。例如，流行病学研究有助于鉴定感染指标。这些信息使得能够鉴定导致病毒爆发的病毒来源的特定区域。
此外，本发明的技术/方法允许快速鉴定或分离感染有黄病毒或其等价物的受试者，而无需主要的实验室设备，甚至可以在野外条件下进行。这些信息有助于鉴定需要医学治疗的受试者以及确定需要进一步调查或进行疾病控制的区域，例如确定其孳生地及其控制方法。另外，本发明的技术允许监测已感染的患者以确定抗黄病毒特异性IgA的存在。IgA效价的降低或者其出现在感染早期可以指示继发感染，并因此有助于监测随后的黄病毒感染期(如登革出血热(DHF)或登革休克综合症(DSS))。
另外，本发明的技术提供了一种用于鉴定感染有黄病毒属任意特定成员以及所参与血清型之受试者的方法，其允许快速检测进一步感染的风险、指出感染的区域以及疾病控制策略。
本文对专利文献或其它作为现有技术给出的事项的参考并非承认该文献或事项是已知的或者其包含的信息是任意权利要求的优先权日时公知常识的一部分。
本发明中使用的方法实例将进行更充分地描述。但应理解的是，以下的描述仅为示例性的，而不应以任何方式作为对上述发明的概括性的限制。
实施例
实施例1：开发使用血清的抗登革热IgA(ACA-ELISA)
a)制备抗原：根据Cardosa等(2002)所述方法制备针对所有四种登革病毒血清型的裂解物登革病毒抗原。简言之，将登革热病毒(5m.o.i.)培养在C6/36细胞中，取决于致细胞病变效应的发生以及病毒的血清型，在含有2％胎牛血清的病毒维持培养基中孵育4～5天。将培养基倒出，用PBS冲洗包含感染细胞的培养瓶4次，用含有1％ trix100的1ml低渗缓冲液处理1小时，最后以14000rpm离心10分钟。收集上清，并以250μl分装至eppendorf管中，储存于-70℃备用。
b)血清样品：使用3组总共292个经登革PCR确认的血清样品作为阳性样品。使用182个登革PCR呈阴性的患者血清样品作为该研究的阴性样品。
c)血清学测定：使用IgM捕获ELISA商用试剂盒(Pan-bio，Australia)测量本研究所用样品中的抗登革热特异性IgM抗体。根据制造商所述步骤实施此测试。
使用IgG间接ELISA商用试剂盒(Pan-bio，Australia)检测本研究所用血清样品中的抗登革热特异性IgG抗体。根据制造商所述步骤实施此测试。
d)IgA捕获ELISA(AAC-ELISA)：使用Talarmin等(1998)和Balmaseda等(2003)所述的方法并进行微小改动。简言之，用100μl包被缓冲液(碳酸氢钠缓冲液，Sigma，USA)中1:500稀释的抗人IgA(Source)包被96孔聚苯乙烯板(maxi-absorb，NUNC)，在37℃孵育2小时或者4℃孵育过夜。用封闭缓冲液(含0.1％ triton X100的5％脱脂乳)在37℃封闭1小时，用清洗缓冲液(含0.05％吐温20的1×PBS)清洗4次。使用10对确诊为登革热的血清样品(抗登革热IgM和IgG)优化该测试。每个血清样品在稀释缓冲液(含0.1％ triton X100的5％脱脂乳)中进行1:100稀释，并将100μl稀释的血清样品加至每个孔中，在室温孵育1小时。每个板中保留1个阳性对照和3个阴性对照。在玻璃瓶中准备登革热裂解物抗原(1:100)以及缀合有HRP的泛登革热反应性单克隆抗体(1:1000)(ICL，USA)的混合物，并在室温下孵育1小时。将所述板如上所述清洗6次之后，向每个孔中加入100μl抗原和MAb混合物，室温下孵育1小时，然后再清洗6次。然后将100μl OPD(Sigma，UK)加至每个孔中，室温下孵育5-10分钟。然后用终止缓冲液(2.75％硫酸)终止反应，在ELISA读数器中492nm处读取所述板的读数。使用以下公式计算结果，即测试样品的OD值除以阴性样品的平均OD值，然后乘以5。
e)抗原捕获抗登革热IgA ELISA(ACA-ELISA)：以100μl/孔用包被缓冲液中1:1000稀释的抗小鼠IgG包被96孔板(Max-absorb，NUNC)，然后在4℃孵育过夜或37℃孵育1小时。用封闭缓冲液在37℃下封闭所述板1小时后，将100μl在PBS中1:1000稀释的泛-登革热MAb(ICL，USA)加至每个孔中，在37℃孵育1小时。清洗4次后，将1:100稀释的登革热裂解物抗原(1-4)加至每个孔中，在37℃再孵育1小时。然后用清洗缓冲液清洗所述板4次，将100μl在稀释缓冲液中1:100稀释的测试血清加至每个孔中。每个板上保留1个阳性和3个阴性血清对照。在室温孵育1小时后，再用清洗缓冲液清洗所述板6次，然后将100μl缀合有HRP的兔抗人IgA(1:4000)加入到每个孔，在室温下再孵育30分钟。孵育后，将所述板清洗6次，将100μl OPD(Sigma，USA)加入到每个孔，在室温孵育5分钟。使用硫酸(2.75％)终止进一步显色，在ELISA读数器中492nm处读取所述板的读数。使用以下公式计算结果，即测试样品的OD值除以阴性样品的平均OD值，然后乘以5。
f)ACA和AAC ELISA的分析灵敏度比较。通过使用强、中和弱的登革热IgA阳性血清样品来研究用于检测患者血清中抗登革热IgA的IgA捕获(AAC)和抗原捕获(ACA)酶测定的分析灵敏度。血清样品以1:5至1:640在来自登革热抗体(IgG、IgM和IgA)阴性的健康人血清中稀释或者在稀释缓冲液中稀释，并用作储存溶液。所述储存稀释液在稀释缓冲液中进一步以1:100稀释以用作工作溶液，如上所述实施所述测定(AAC和ACA ELISA)。通过如下公式计算由于稀释缓冲液的血清中登革热非特异性IgA所致的测定抑制：
抑制百分比(PI)＝100-(血清稀释液中OD值/稀释缓冲液中OD值)×100。
g)测定的标准化：棋盘式滴定(checkerboard titration)显示，100μl抗小鼠IgG、100μl泛登革热MAb(在PBS中1:1000，以1:100稀释的100μl裂解物抗原)对于96孔板测定来说是最佳的(图1)。通过针对抗人IgA的棋盘式滴定使用10个登革热阳性和6个登革热阴性抗体血清样品来确定ELISA中所用的血清样品最佳稀释度(1:100)(图2)。类似的，通过棋盘式滴定来确定用于ACA-ELISA的兔抗人IgA-HRP的最佳稀释度，其在1:4000时是最佳的。
使用12.5至1:800的样品系列稀释进行所述测定的血清稀释。在此测定中使用8个抗登革热IgA阳性和6个抗登革热IgA阴性血清样品。甚至在1:800稀释时，平均所有的阳性血清样品均为阳性，而阴性样品则没有呈阳性的(图3)。2个样品略高于临界值，该测定的血清稀释度固定在1:100(4倍于阴性样品稀释度)并在整个测定中使用。
使用以10-37天间隔收集的10对登革热PCR阳性急性和恢复期血清样品进行ACA-ELISA。以1:100检测血清，结果显示所有确诊为登革热的10个恢复期血清显示出高水平的抗登革热裂解物抗原之抗登革热IgA(图4)。
实施例3：两种IgA测定的分析灵敏度比较：
使用2种不同稀释剂中(例如登革热阴性血清和稀释缓冲液)的登革阳性IgA血清样品进一步分析两种抗登革热IgA测定(AAC-ELISA和ACA-ELISA)的灵敏度水平。图4显示，在AAC-ELISA中，当在阴性血清中稀释时具有高水平抗登革热IgA的血清之灵敏度相比于稀释缓冲液中低32倍，由于血清稀释剂中高水平非登革热特异性IgA造成的抑制为43.71％～79.79％(图4)。
另一方面，在ACA-ELISA中，两种稀释剂(阴性血清和稀释剂缓冲液)中的登革热特异性IgA的检测水平相同，血清稀释剂中存在的非登革热特异性IgA的抑制是可忽略的，为-11.08％～-61.76％(图4)。
实施例4：ACA-ELISA的灵敏度和特异性
使用在急性期和恢复期收集的296例确诊为登革热的以及182例登革热阴性的血清样品实施该实施例。在所述确诊为登革热的样品中，96例收集自发热发作的第1-3天，97例样品收集自第3-7天，而102例收集自发热发作的第10-37天。182例血清样品收集自登革热PCR呈阴性而在样品收集过程中发生发热的患者。ACA-和AAC-ELISA的灵敏度和特异性显示于表1和表2中。
表1.血清ACA-ELISA的灵敏度和特异性
Figure A200780022652D00331
表2.显示AAC-ELISA的灵敏度和特异性
实施例5：使用两种抗登革热IgA测定和IgM抗体捕获(MAC)-ELISA在确诊为登革热的血清样品中产生抗登革热IgA和IgM的动力学。
使用3组101例确诊为登革热的血清样品来研究IgA(AAC和ACA-ELISA)和IgM的动力学。总共292例样品收集自急性期和恢复期。分三次收集发热发作后的血清样品(第一组(1-3天)、第二组(3-7天)和第三组(10-37天))。在所述登革热阳性血清样品中，第一组(1-3天)中35.79％是抗登革热IgA阳性的，第二组(3-7天)中61.46％是阳性的，而第三组(10-37天)中85.15％血清样品是阳性的。
另一方面，在第一组中AAC-ELISA的检测水平是6.49％，第二组中是41.67％，第三组中是72.50％。相当地，在同样的疾病阶段中抗登革热IgM的存在情况如下：第一组中6.67％，第二组中66.67％，第三组中79.61％(图6)。当用于检测医院样品的抗登革热IgA时，实施ACA-ELISA观察到类似的水平(图7)。
新开发的ACA-ELISA显示出相比于ACC-ELISA更好的表现。这是由于在ACA-ELISA中消除了非登革特异性IgA的干扰，其在AAC-ELISA中抑制43.71％至79.79％，特别是在登革热疾病的早期。相比于MAC-ELISA，ACA-ELISA还检测到更多的登革热病例，其可能是由于在继发感染中缺少登革热IgM产生(Chanama等2004)，而发现92.1％的IgA与IgG相关。该研究提示ACA-ELISA可单独或者与MAC ELISA联合用于检测更多的登革热病例(在确诊为登革热的病例中为76.26％)。
实施例6：开发使用唾液的ACA-ELISA
a)抗原捕获抗登革热IgA ELISA(ACA-ELISA)：用100μl/孔在包被缓冲液中1:1000稀释的泛-登革热MAb包被96孔板(Max-absorb-NUNC)，然后在4℃孵育过夜或37℃孵育1小时。用封闭缓冲液在37℃下封闭所述板1小时后，将1:100稀释的登革热裂解物抗原加入到每个孔，在室温再孵育1小时。然后用清洗缓冲液清洗所述板4次，将100μl在稀释缓冲液中1:5稀释的测试唾液加入到每个孔。每个板上保留1个阳性和3个阴性血清对照。在室温孵育1小时后，再次用清洗缓冲液清洗所述板6次，然后将100μl缀合有HRP的兔抗人IgA(1:4000，Dakocytomation，Denmark)加入到每个孔，在室温下再孵育30分钟。孵育后，将所述板再清洗6次，将100μl OPD(Sigma，USA)加入到每个孔，在室温孵育5分钟。使用硫酸(2.75％)终止进一步显色，在ELISA读数器中492纳米处读取所述板的读数。使用以下公式计算结果，即测试样品的OD值除以阴性样品的平均OD值，然后乘以5。
b)测定的标准化：棋盘式滴定显示，100μl泛登革热MAb(包被缓冲液中1:4000，0.25ng/孔)和1:100稀释的100μl裂解物抗原对于96孔板中的抗原来说是最佳的。通过针对抗人IgA的棋盘式滴定使用来自5个确诊为登革热的病例(PCR)的唾液和来自健康供体的作为阴性对照的5个唾液样品来确定ELISA中所用的唾液样品最佳稀释度。类似的，通过棋盘式滴定来确定用于ACA-ELISA的兔抗人IgA-HRP以及用于AAC-ELISA的抗小鼠IgG的最佳稀释度，其分别是1:4000和1:3000。
在稀释缓冲液中1:1:25至1:640范围内测试从5-7天的登革热PCR阳性患者中收集5个唾液样品以及来自健康志愿者的5个样品。结果显示，来自5个确诊为登革热的患者之所有唾液样品显示高水平的针对登革热裂解物抗原的抗登革热IgA，其效价为1:160至1:640，而除了2个在稀释水平多至1:1:25时显示轻微反应之外，5个登革热阴性唾液样品即使在较低稀释度下(1:2.5)也不显示任何的反应(图6)。因此，对于ACA-ELISA，唾液稀释的临界点设在1:5(4倍)，并在整个研究中使用。
使用收集自急性期和恢复期(1-3天、4-7天和10-37天)的184例登革热PCR确认的唾液样品进行ACA-ELISA。104例唾液样品收集自已发热但登革热PCR测试呈阴性的患者。收集自健康者的50例唾液样品在本研究中用作阴性样品。发现100μl泛-登革热MAb(包被缓冲液中1:4000，0.25ng/孔)和1:100稀释的100μl裂解物抗原对于96孔板中的抗原是最佳的。
实施例7：使用AAC-和ACA-ELISA检测抗登革热IgA
使用两种抗登革热IgA测定(AAC-ELISA和ACA-ELISA)测试来自106个确诊为登革热的患者之唾液和血清样品中抗登革热IgA的存在情况。结果显示，在ACA-ELISA中63.04％的唾液样品和48.08％的血清样品是登革热IgA阳性的，而在AAC-ELISA中32.40％的唾液样品和37.15％的血清样品是阳性的。
通过ACA-ELISA显示的在登革热疾病期间唾液中产生的抗登革热IgA的动力学显示出在感染早期出现登革热反应性IgA，在疾病(出现发热)的第二周内达到100％，在第五周之后逐渐消退(图10)。
在急性期和恢复期的3次血清收集(1-3天、4-7天和10-37天)期间，ACA-ELISA检测的登革热阳性病例水平分别为61.04％、70.83％和54.35％。相比于MAC-ELISA，在1-3天(图11)基于唾液的ACA-ELISA检出多出50％的登革热病例，这清楚地表明了此技术在使用非侵入性样品(例如唾液)早期检测登革热感染的有效性。
表3：2乘2表格显示基于唾液的ACA-ELISA对于在发热发作的第1-37天之间收集的184例唾液样品的灵敏度、特异性、阳性和阴性的预测值。
阳性预测值＝91.89％
阴性预测值＝79.57％
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最后应理解，在不脱离如本文所描述的本发明精神的前提下，可以做出多种其它修饰和/或改变。

Claims (37)

1.一种用于检测受试者中特异性针对黄病毒或其等价物的IgA的方法，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物进行接触；以及
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；以及
用抗IgA抗体来表征所述复合物中的结合伴侣。
2.一种检测受试者对黄病毒或其等价物的暴露的方法，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物进行接触；以及
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；
表征所述复合物中的结合伴侣；以及
将所述结合伴侣与对黄病毒的暴露相关联。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述黄病毒特异性免疫原性组分捕获自经黄病毒或其等价物感染的细胞之裂解物。
4.根据权利要求1的方法，其中所述黄病毒特异性免疫原性组分通过单克隆抗体进行捕获。
5.根据权利要求1的方法，其中所述黄病毒特异性免疫原性组分选自黄病毒结构和非结构蛋白、黄病毒颗粒及其片段、源自黄病毒的糖蛋白、脂质和碳水化合物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述结构蛋白选自被膜蛋白、Pr膜蛋白和核衣壳蛋白。
7.根据权利要求6的方法，其中所述结构蛋白是被膜蛋白。
8.根据权利要求1的方法，其中所述黄病毒特异性免疫原性组分选自登革病毒血清型免疫原性组分，其选自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4。
9.根据权利要求2的方法，其中所述方法检测对选自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4的登革病毒血清型的暴露。
10.根据权利要求5的方法，其中所述非结构蛋白选自NS-1、NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b和NS-5。
11.根据权利要求10的方法，其中所述非结构蛋白是NS-1。
12.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原性组分是针对黄病毒抗体之抗原结合位点的抗独特型抗体，所述黄病毒抗体响应于对源自黄病毒或其等价物的组分之暴露而产生。
13.根据权利要求1的方法，其中所述结合伴侣是黄病毒特异性抗体或其免疫学片段。
14.根据权利要求13的方法，其中所述结合伴侣是在黄病毒感染早期、恢复期表达的抗体或者源自先前感染的抗体。
15.根据权利要求1的方法，其中所述结合伴侣是IgA抗体。
16.根据权利要求1的方法，其中所述黄病毒选自黄热病毒、登革病毒和日本脑炎病毒。
17.根据权利要求16的方法，其中所述黄病毒是登革病毒。
18.根据权利要求13的方法，其中所述结合伴侣抗体是特异性针对选自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4的登革热血清型的IgA抗体。
19.根据权利要求1的方法，其中所述生物样品选自血液、唾液、脊髓液、B细胞、T细胞、血浆、血清、尿和羊水。
20.根据权利要求19的方法，其中所述生物样品是血清或唾液。
21.根据权利要求1的方法，其中使用抗IgA抗体来表征所述结合伴侣。
22.根据权利要求21的方法，其中所述抗IgA抗体结合有报告基团。
23.根据权利要求22的方法，其中所述报告基团是酶。
24.用于根据权利要求1之方法的固体支持物，所述方法包括：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物或其等价物进行接触；
测定该生物样品中存在的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况；以及任选地
表征所述复合物中的结合伴侣从而将所述结合伴侣与对黄病毒的暴露相关联；
所述支持物包含固定于其上的黄病毒特异性免疫原性组分。
25.根据权利要求24的固体支持物，其选自珠、盘、磁性颗粒或光纤传感器、微量滴定板、载玻片或生物微芯片或膜，所述膜包括硝酸纤维素膜、聚四氟乙烯滤膜、醋酸纤维素滤膜和带滤纸载体的硝酸纤维素滤膜。
26.一种用于检测受试者中特异性针对黄病毒或其等价物的IgA或者用于检测黄病毒暴露的试剂盒，其包含：
包含黄病毒特异性免疫原性组分或其等价物的固体支持物；或
与第二支持物连接的包含黄病毒特异性免疫原性组分或其等价物的固体支持物；
至少一种缀合有报告基团的检测试剂，其用于检测生物样品中与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成复合物的结合伴侣；以及任选地
使用所述试剂盒进一步鉴定所述复合物之结合伴侣的说明书。
27.根据权利要求26的试剂盒，其中所述黄病毒特异性免疫原性组分固定于固体支持物上。
28.根据权利要求26的试剂盒，其中所述黄病毒特异性免疫试剂通过单克隆抗体进行捕获。
29.根据权利要求28的试剂盒，其中所述黄病毒特异性免疫原性组分选自黄病毒结构和非结构蛋白、黄病毒颗粒及其片段、源自黄病毒的糖蛋白、脂质和碳水化合物。
30.根据权利要求29的试剂盒，其中所述结构蛋白选自被膜蛋白、Pr膜蛋白和核衣壳蛋白。
31.根据权利要求30的试剂盒，其中所述结构蛋白是被膜蛋白。
32.根据权利要求26的试剂盒，其中所述黄病毒选自黄热病毒、登革病毒和日本脑炎病毒。
33.根据权利要求32的试剂盒，其中所述黄病毒是登革病毒。
34.根据权利要求29的试剂盒，其中所述黄病毒特异性免疫原性组分选自登革病毒血清型免疫原性组分DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4。
35.根据权利要求29的试剂盒，其中所述非结构蛋白选自NS-1、NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b和NS-5。
36.根据权利要求35的试剂盒，其中所述非结构蛋白是NS-1。
37.一种评估限定区域(例如地理区域、住宅区域、运输工具或医学治疗或评估中心)内一个或多个受试者暴露于黄病毒或其等价物的相对风险的方法，其包括：
从限定区域内的代表性群体中获得样品；以及
通过包括以下步骤的方法来评估样品群体中各成员暴露于黄病毒或其等价物的证据：
将来自受试者的生物样品与黄病毒特异性免疫原性组分混合物进行接触；以及
测定该生物样品中的结合伴侣与黄病毒特异性免疫原性组分之间形成的复合物的存在情况，其中所述复合物的存在指示该受试者暴露于黄病毒或其等价物；以及
通过表征所述复合物中的结合伴侣来评估限定区域内暴露的相对风险。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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