KR102238183B1

KR102238183B1 - 유전자 합성을 통해 설계된 뎅기열 바이러스의 유전형 복합 ｎｓ１ 재조합 항원 및 대조군 유행성 플라비바이러스 유전형 복합 ns1 재조합 항원 풀

Info

Publication number: KR102238183B1
Application number: KR1020190052424A
Authority: KR
Inventors: 이동건; 박철민; 조성연; 김원복; 오은지; 이혜영; 이윤석; 강경준
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2019-05-03
Publication date: 2021-04-12
Also published as: KR20190127601A

Abstract

본 발명은 유전자 합성을 통해 설계된 뎅기열 바이러스의 유전형 복합 NS1 재조합 항원 및 대조군 유행성 플라비바이러스 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 생물학적 시료 내 뎅기열 바이러스의 항체와 결합하여 뎅기열 바이러스의 감염을 진단할 수 있는 고감도의 유전자 합성을 통해 설계된 뎅기열 바이러스의 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀과 대조군 유행성 플라비바이러스 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀을 제공할 수 있다.

Description

유전자 합성을 통해 설계된 뎅기열 바이러스의 유전형 복합 ＮＳ１ 재조합 항원 및 대조군 유행성 플라비바이러스 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀{Recombinant pangenotype complex NS1 antigen pool of dengue virus and endemic flaviviruses designed by gene synthesis}

본 발명은 유전자 합성을 통해 설계된 뎅기열 바이러스의 유전형 복합 NS1 재조합 항원 및 대조군 유행성 플라비바이러스 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀에 관한 것이다.

뎅기열 바이러스(Dengue virus)는 플라비 바이러스(Flavivirus)속에 속하는 것으로, 모기에 의해서 전달되며 열대 또는 아열대 지역에서 발견되나, 최근, 도시와 인근 지역까지 전염이 확산되면서 국제적인 공공위생 우려의 대상이 되고 있다. 아데스 에집티(Aedes aegypti) 모기가 뎅기열 바이러스의 주된 전달자(carrier)이며, 암컷 모기가 사람을 물면서 전염이 시작된다. 4 내지 10일간의 배양기를 거치면 감염된 모기는 이 바이러스를 전 생애 기간 동안 전파를 할 수 있게 된다. 감염된 사람은 또한 주된 바이러스의 전달자가 되고, 바이러스를 증식하게 되며, 이후 감염 안 된 모기가 감염된 사람을 물면 바이러스를 제공하는 주체가 된다. 이미 뎅기열 바이러스에 감염된 환자는 처음 증상이 나타난 후 대략 4-5일, 최대 12일 후에 아데스 모기를 매개로 바이러스를 전파할 수 있게 된다. 뎅기열 바이러스의 감염에 의해서 뎅기열(dengue fever), 뎅기 출혈열(dengue hemorrhagic fever) 등이 발병한다.

뎅기열과 밀접하게 관련된 뎅기열 바이러스의 4가지의 혈청형(serotype)은 DENV-1, DENV-2, DENV-3 그리고 DENV-4로, 특정 타입의 바이러스에 감염 후 회복되면 생애 전 기간 동안 그 타입에 대해서 면역이 생기게 된다. 하지만, 다른 타입에 대한 면역은 일시적으로만 생기게 되어 다른 타입의 감염에 의해서 Severe dengue로 발전될 수가 있다. 뎅기열 바이러스는 단일 가닥으로 된 RNA 게놈(genome)을 가지고 있고, 바이러스 캡시드 단백질로 패키징되어 있고, 2가지의 당단백질 180개로 둘러싸여 있다. 바이러스 크기는 지름이 50nm이고, 대략 10.7 kb의 하나의 당단백질을 코딩하는 (+) 센스 RNA 게놈을 가지고 있다. 바이러스의 5'-말단은 3가지의 구조적 단백질들을 암호화하는데, 캡시드(capsid: C), 성숙한 비리온의 세포막 단백질을 형성하기 위해 호스트 단백질 분해효소인 퓨린에 의해서 분해되어 형성된 세포막 전구(precursor) 단백질(prM) 그리고 바이러스 입자의 외피(envelope)를 구성하는 envelope(E)이 그것들이다.

이러한 뎅기열 바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 대한민국 특허공개 제2009-0028704호에는 뎅기열 바이러스의 특이적인 면역원성 성분을 이용하여 검체에 포함된 IgA 형태의 항체를 검출함으로써 뎅기열 바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법이 개시되어 있고, 일본 특허공개 제2012-504955호에는 뎅기열 바이러스의 표면항원에 결합할 수 있는 재조합 항체를 포함하는 뎅기열 바이러스 진단용 키트가 개시되어 있으며, 미국 특허공개 제2013-0089543호에는 뎅기열 1형, 2형, 3형, 및 4형 바이러스에 각각 특이적인 단클론 항체를 이용하여 감염된 뎅기열 바이러스의 종류를 구별하기 위한 방법이 개시되어 있다.

상술한 뎅기열 바이러스 감염 여부를 확인하는 기술은 대체로 뎅기열 바이러스의 표면항원을 검출할 수 있는 항체를 이용하는데, 뎅기열 바이러스 NS1 항원에 대한 특이항체는 감염 후 생체 내에 지속적으로 존재하고 있어, NS1 항원은 백신 접종/치료 등에 중요한 혈청학적 진단에 중요 바이오마커로 인식되고 있다. 그러나, 상기 표면항원 전체를 이용할 경우, 3차원적 구조와 당화사슬 부분의 손상이 발생하여, 이러한 손상된 항원을 이용하여 제조된 항체는 정상적인 항원에 대한 민감성이 낮다는 문제점이 있다.

또한, 뎅기열 바이러스의 표면항원을 사용한 혈청학적 진단기술은 민감도에 비해 다른 플라비바이러스의 항원들과 면역적 교차반응성이 매우 높아, 특이도에 문제가 크다. 특히, 플라비바이러스중 뎅기열 바이러스와 같은 혈청학적 그룹으로 분류된 지카 바이러스(Zika virus)와는 면역적 교차반응성이 매우 높아, 혈청학적 진단에 개선이 요구되고 있다.

현재, 여러 뎅기열 바이러스 백신이 개발되어 임상시험을 거치고 있으나 기존에 감염 경력이 있었던 환자들에게서 심각한 부작용(eg. 백신 임상시험 중 원내 뎅기열 환자가 증가하였는데, 항체 의존적 증강(Antibody-dependent enhancement)에 의한 것으로 추정됨) 등이 보고되고 있다. 뎅기열 바이러스 감염 질환은 1차 감염보다는 2차 감염 시 오히려 감염 증세가 매우 악화되기도 하는데(뎅기 출혈열, dengue haemorrhagic fever), 이는 감염병력을 파악하는 것이 치료에 있어 중요한 쟁점이다.

대한민국 특허공개 제2009-0028704호 일본 특허공개 제2012-504955호 미국 특허공개 제2013-0089543호

본 발명의 목적은 뎅기열 바이러스에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 유전자 합성을 통해 설계된 뎅기열 바이러스의 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀과 혈청면역학적 대조군으로 사용할 수 있는 유행성 플라비바이러스 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀을 이용한 뎅기열 바이러스 감염 진단 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NOS: 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항원 펩타이드; 및 SEQ ID NOS: 9 내지 14로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 교차면역원성 검사용 항원 대조군을 포함하는, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는 뎅기열 바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 생물학적 시료 내 뎅기열 바이러스의 항체와 결합하여 뎅기열 바이러스의 감염을 진단할 수 있는 고감도의 유전자 합성을 통해 설계된 뎅기열 바이러스의 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀과 혈청면역학적 대조군으로 사용할 수 있는 유행성 플라비바이러스 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 DENV type 1 NS1 유전자의 아미노산 서열(ST)의 계통 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 DENV type 1 NS1 유전자의 ST(113개)의 빈도 분포 분석(Genbank 등록 type 1 NS1 유전자 1,359개) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DENV type 2 NS1 유전자의 ST의 계통 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 DENV type 2 NS1 유전자의 ST(103개)의 빈도 분포 분석(Genbank 등록 type 2 NS1 유전자 1,150개) 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 DENV type 3 NS1 유전자의 ST의 계통 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 DENV type 3 NS1 유전자의 ST(68개)의 빈도 분포 분석(Genbank 등록 type 3 NS1 유전자 773개) 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 DENV type 4 NS1 유전자의 ST의 계통 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 DENV type 4 NS1 유전자의 ST(55개)의 빈도 분포 분석(Genbank 등록 type 4 NS1 유전자 202개) 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 NS1 유전자의 에피토프 분석 및 각 항원변이형의 에피토프와 빈도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 DENV type 1 NS1 항원 발현 벡터 설계 예시(subtype 4개)를 나타낸 것이다.
도 11은 DENV type 2 NS1 항원 발현 벡터 설계 예시(subtype 2개)를 나타낸 것이다.
도 12는 DENV type 3 & type 4 NS1 항원 발현 벡터 설계 예시를 나타낸 것이다.
도 13은 DENV type 1 NS1 subtype 1-4 유전자 재조합 항원 정제 후 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 DENV type 2, 3 & 4 NS1 유전자 재조합 항원 정제 후 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 DENV 재조합 항원의 웨스턴 블랏 결과(개발항원은 Native사 Flavivirus NS1 항원과 비교 검증)를 나타낸 것이다.
도 16은 일본뇌염 바이러스(JEV) NS1 항원 유전자 계통학적 분석 결과이다.
도 17은 WHO 일본뇌염 바이러스 감염 혈청을 통한 JEV 유전자 재조합 항원의 웨스턴 블랏 결과(개발항원은 Native사 Flavivirus NS1 항원과 비교 검증함)이다.
도 18은 웨스트나일 바이러스 NS1 항원 유전자 계통학적 분석 결과이다.
도 19는 황열 바이러스 NS1 항원 유전자 계통학적 분석 결과이다.
도 20은 지카 바이러스 NS1 항원 유전자 계통학적 분석 결과이다.
도 21은 Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)를 통한 뎅기열 바이러스 타입 별(DT1-4), 일본뇌염 바이러스(JEV YN(1형: SEQ ID NO: 9), JEV JA(3형: SEQ ID NO: 10), JEV XZ(5형: SEQ ID NO: 11)), 웨스트나일 바이러스(WNV: SEQ ID NO: 12), 황열 바이러스(YFV: SEQ ID NO: 13), 지카 바이러스(ZKV: SEQ ID NO: 14) NS1 유전자 재조합 항원들의 뎅기열 바이러스 NS1 항체에 대한 특이도 조사 결과이다.
도 22는 Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)를 통한 뎅기열 바이러스 타입 별(DT1-4), 일본뇌염 바이러스(JEV YN(1형: SEQ ID NO: 9), JEV JA(3형: SEQ ID NO: 10), JEV XZ(5형: SEQ ID NO: 11)), 웨스트나일 바이러스(WNV: SEQ ID NO: 12), 황열 바이러스(YFV: SEQ ID NO: 13), 지카 바이러스(ZKV: SEQ ID NO: 14) NS1 유전자 재조합 항원들의 지카 바이러스 NS1 항체에 대한 특이도 조사 결과이다.
도 23은 DENV type 1 NS1 항원의 피치아 효모 발현용 벡터 설계 예시를 나타낸 것이다.
도 24는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 최적화 유전자 후보물질 분석을 도시한 것이다.

본 발명자들은 보다 높은 민감도를 갖고 뎅기열 바이러스의 항체를 진단하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 사람 혈액 내에서 뎅기열 바이러스의 항체를 진단하기 위해서는 우수한 뎅기열 바이러스 항원이 중요함을 확인하였다. 따라서, 감염 시 생체 내에서 플라비바이러스 NS1 항원에 대한 항체가 지속적으로 유지되는 특성을 활용하였고, 뎅기열 바이러스의 진단 특이도를 개선하기 위해, 비교적 넓게 분포하고 뎅기열 바이러스와 교차면역원성을 가진 유행성 플라비바이러스 항원(일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 황열 바이러스, 지카 바이러스)을 활용하여 뎅기열 바이러스 기존 진단의 교차면역원성을 비교 검증하여 특이도 높였다.

따라서, 본 발명은 SEQ ID NOS: 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항원 펩타이드; 및 SEQ ID NOS: 9 내지 14로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 교차면역원성 검사용 항원 대조군을 포함하는, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 뎅기열 바이러스에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 유전자 합성을 통해 설계된 뎅기열 바이러스의 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀과 혈청면역학적 대조군으로 사용할 수 있는 유행성 플라비바이러스 유전형 복합 NS1 재조합 항원 풀을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 항원 펩타이드는 뎅기열 바이러스에 특이적인 항체 검출용 항원으로서, 뎅기열 바이러스의 뎅기열 1형 내지 4형 바이러스 중 어느 하나의 비구조 단백질 1(nonstructural protein 1: NS1, 1056 bp/352 aa)에서 다수의 유전자 변이를 포함하는 서열로 항-뎅기 IgM 또는 IgG와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 상기 뎅기열 1형 내지 4형 바이러스 중 어느 하나의 NS1 항원에 대한 특이항체는 감염 후 생체 내에 지속적으로 존재하고 있어, NS1 항원은 백신 접종/치료 등에 중요한 혈청학적 진단에 중요 바이오마커로 인식된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 항원 펩타이드는 다음과 같이 제조되었다.

우선, GenBank에 등록된 뎅기열 바이러스의 NS1 유전자의 서열 변이를 분석한 결과, 뎅기열 바이러스 Type 1의 NS1 유전자는 1,359개, Type 2는 1,150개, Type 3는 773개, Type 4는 202개가 등록되어 있고, 각 등록된 유전형에서 중복된 유전형 등을 고려해 아미노산 서열 타입(Sequence type(ST))를 각각 추출하였다. 이 중 type 1의 특이 ST는 총 113개 ST로 추출되어, 계통 분석을 통해 주요 유전형(pangenotype)을 분석한 결과, A그룹(808/1,359)와 B그룹(222/1,359) ST에서 가장 많은 빈도를 나타낸 유전형이 모여 있었다. 뎅기열 바이러스 type 2의 경우, 총 103개 ST로 추출되어 계통 분석 결과, 하나의 클레이드(clade)에서 1,150개 유전형중 1,097개가 집중되어 분포된 그룹이었다. 뎅기열 바이러스 type 3의 경우, 총 68개 ST로 추출되어 계통 분석 결과, 유연관계가 높은 유전변이형이 빈도수가 매우 높았다. 뎅기열 바이러스 type 4의 경우, 총 55개 ST로 추출되어 계통 분석 결과, 유연관계가 높은 유전변이형이 빈도수가 비교적 높았다.

DENV의 T 세포 및 B 세포 에피토프에 대해 미국 NIH Immune Epitope Database and Analysis Resource에서 검색한 결과, 알려진 DENV Type 1의 에피토프는 360개, type 2는 274개, type 3는 330개, type 4는 49개가 DB에 보고되어 있고, 이중 NS1 항원의 에피토프는 총 8개로 분석되었고, 이에 따라 각 ST를 재분류하면 총 55개의 변이형을 찾을 수 있었다.

유전자 변이형 및 유연관계 그리고 항원 에피토프 변이형 및 빈도 분포를 분석하여 최종적으로 다음과 같이 DENV type 1에서 subtype 4개, type 2 subtype 2개, type 3 & 4에서 각각 1개를 유전형(pangenotype)으로 최종 추출하였다:

- DENV type 1: TM242(KU666943: SEQ ID NO: 1), BID-V1971(FJ410284: SEQ ID NO: 2), TM99(KU666941: SEQ ID NO: 3), BID-V1975(FJ461339: SEQ ID NO: 4)

- DENV type 2: Gainesville(AOE23003: SEQ ID NO: 5), SJRP(AKQ00027: SEQ ID NO: 6)

- DENV type 3: V3615(AMH87207: SEQ ID NO: 7)

- DENV type 4: V2490(ACQ44390: SEQ ID NO: 8)

상기에서 추출한 뎅기열 바이러스 유전형에 대한 NS1 유전자 염기서열(SEQ ID NOS: 15-22)을 기반으로 대장균에서 발현할 수 있도록 코돈 최적화를 실시하고, 대장균 발현 벡터로 설계하고, 대장균 Lemo21 세포에서 각각 형질전환시킨 후 각각의 재조합 항원을 생산하였다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 뎅기열 바이러스 유전형에 대한 NS1 유전자 염기서열(SEQ ID NOS: 27-30)을 기반으로 피치아 효모에 각각 형질전환시킨 후 각각의 재조합 항원을 생산하였다.

분리 정제된 재조합 항원에 대해 기존 Native사 항원과 항체를 통해 면역원성을 비교 검증한 결과, 총 8종의 뎅기열 바이러스 NS1 재조합 항원은 다른 플라비바이러스(일본뇌염, 웨스트나일, 황열, 지카 바이러스 NS1 항원)와 비교하여 NS1 단일항체에 특이적으로 반응하였다.

또한, 본 발명의 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물에서 교차면역원성 검사용 항원 대조군으로 사용하는 펩타이드는 유행성 플라비바이러스의 NS1 항원 펩타이드로, 이들 항원 대조군은 뎅기열 바이러스 NS1 재조합 항원 외에도 다른 플라비바이러스 종간의 교차반응이 미비하여 뎅기열 바이러스 감염 진단의 대조군으로 사용되는 것을 특징으로 한다.

상기 교차면역원성 검사용 항원 대조군은 구체적으로 다음과 같다.

일본뇌염 바이러스 NS1 항원 펩타이드: SEQ ID NOS: 9 내지 11

웨스트 나일 바이러스 NS1 항원 펩타이드: SEQ ID NO: 12

황열 바이러스 NS1 항원 펩타이드: SEQ ID NO: 13

지카 바이러스 NS1 항원 펩타이드: SEQ ID NO: 14

상기 대조군 항원은 각 바이러스의 NS1 유전자 염기서열(SEQ ID NOS: 23-26)을 기반으로 대장균에서 발현할 수 있도록 코돈 최적화를 실시하고, 대장균 발현 벡터로 설계하고, 대장균 Lemo21 세포에서 각각 형질전환시킨 후 각각의 재조합 항원을 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 각 바이러스의 NS1 유전자 염기서열(SEQ ID NOS: 31-34)을 기반으로 피치아 효모에 각각 형질전환시킨 후 각각의 재조합 항원을 생산할 수 있다.

본 발명의 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물에 있어서, 뎅기열 바이러스 감염 진단은 항원 펩타이드, 교차면역원성 검사용 항원 대조군 및 생물학적 시료, 예컨대, 전혈, 혈장, 혈청 또는 혈액 간의 항원-항체 복합체 형성량을 측정하고, 상기 생물학적 시료가 뎅기열 바이러스에 특이적인 항체를 함유하는 경우 항원-항체 복합체 형성량의 증가를 통해 뎅기열 바이러스 감염을 진단하는 것을 특징으로 한다.

즉, 항원 펩타이드는 생물학적 시료 내 뎅기열 바이러스 특이 항체와 결합하여 항원-항체 복합체를 생성하므로 항원-항체 복합체의 생성 정도를 확인하여 뎅기열 바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있다. 상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨의 시그널의 크기를 통해 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 검출 방법은 예컨대, 웨스턴 블랏(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는 뎅기열 바이러스 감염 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 환자 시료 내 뎅기열 바이러스에 대한 항체를 측정할 수 있는 항원 펩타이드 뿐만 아니라 항원-항체 복합체 형성량을 측정하는데 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항원-항체 복합체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 구체적인 일례로, 상기 뎅기열 바이러스 감염 진단용 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 뎅기열 바이러스에 대한 항체에 특이적인 본 발명의 항원 펩타이드 및 교차면역원성 검사용 항원 대조군을 포함한다. 그 외 ELISA 키트는 항원-항체 복합체 형성량을 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 이 외에도, 상기 키트는 웨스턴 블랏, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석, 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 뎅기열 바이러스 감염을 진단할 수 있으며, 이에 맞추어 환자를 적절히 치료할 수 있다.

본 발명의 키트로부터 감염을 진단할 수 있는 뎅기열 바이러스는 뎅기열 1형 내지 4형 바이러스 중 어느 하나일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 뎅기열 바이러스 type (1-4)별 유전 변이형 분석 및 pangenotype 추출

뎅기열 바이러스 유형별로 비구조 단백질 1(nonstructural protein 1: NS1, 1056bp/352aa)의 아미노산 서열 변이를 분석하였다. Position-specific iterated(psi) BLAST 검색을 통해 뎅기열 바이러스 NS1 유전자와 비슷한 플라비바이러스(Flavivirus)의 NS1 유전자는 약 5,000개가 검색되었다. 뎅기열 바이러스(DENV) type 1 NS1 유전자를 기준으로 type 1 NS1 유전자변이형(아미노산 서열)은 100%-94%에서 상동성을 보였고 DENV type 3은 80%-76%, DENV type 2는 74%-70%, DENV type 4는 70%-67%의 상동성을 보였다. 다른 플라비바이러스의 NS1 유전자의 상동성은 DENV type 1 NS1 유전자에 대해 54% 이하의 상동성을 나타냈다. 이 데이터를 바탕으로 분석된 뎅기열 바이러스 Type 1의 NS1 유전자는 1,359개, Type 2는 1,150개, Type 3는 773개, Type 4는 202개가 Genbank에 등록되어 있었다. 각 등록된 유전형에서 중복된 유전형 등을 고려해 아미노산 서열의 Sequence type(ST)를 각각 추출하였다.

이 중 type 1의 특이 ST는 총 113개 ST(Genbank 등록 유전형1,359개)로 추출되어, 계통 분석을 통해 주요 유전형(pangenotype)을 분석하였다.

113개의 ST 분석 결과에서 A그룹(808/1,359)와 B그룹(222/1,359) ST에서 가장 많은 빈도를 나타낸 유전형이 모인 그룹이었다(도 1).

DENV type 1 NS1 유전자의 각 ST의 유전자 빈도 분석은 도 2에 도시하였다.

DENV type 2의 특이 ST는 총 103개 ST(Genbank 등록 유전형1,150개)로 추출되어 계통 분석을 통해 주요 유전형을 분석하였다.

103개의 ST 분석 결과에서 하나의 클레이드(clade)에서 Genebank에 등록된 1,150개 유전형 중 1,097개가 집중되어 분포된 그룹이었다(도 3 및 도 4 참조).

DENV type 3의 특이 ST는 총 68개 ST(Genbank 등록 유전형770개)로 추출되어, 계통 분석을 통해 주요 유전형을 분석하였다.

ST와 빈도수 분석 결과에서 유연관계가 높은 유전변이형이 빈도수가 매우 높았다(도 5 및 6 참조, ST134, ST136, ST146).

가장 최근에 보고되고 있는 DENV type 4의 특이 ST는 총 55개 ST(Genbank 등록 유전형 20개)로 추출되어, 계통 분석을 통해 주요 유전형을 분석하였다.

ST와 빈도수 분석 결과에서 유연관계가 높은 유전변이형이 빈도수가 비교적 높았다(도 7 및 8 참조, ST317, ST326, ST336).

<실시예 2> 뎅기열 바이러스 NS1 항원 에피토프 분석 및 유전형(pangenotype) 추출

DENV의 T 세포 및 B 세포 에피토프는 미국 NIH Immune Epitope Database and Analysis Resource에서 검색하였다. 알려진 DENV Type 1의 에피토프는 360개, type 2는 274개, type 3은 330개, type 4는 49개가 db에 보고되어 있었다. 이중 NS1 항원의 에피토프는 도 9와 같이 총 8개로 분석되었는데, 이에 따라 각 ST를 재분류하면 총 55개 변이형을 찾을 수 있었다(표 1 참조).

유전자 변이형 및 유연관계 그리고 항원 epitope 변이형 및 빈도 분포를 분석하여 최종 DENV type 1에서 subtype 4개, type 2 subtype 2개, type 3 & 4에서 각각 1개를 유전형으로 최종 추출하였다.

- DENV type 3: V3615(AMH87207: SEQ ID NO: 7)

- DENV type 4: V2490(ACQ44390: SEQ ID NO: 8)

<실시예 3> 뎅기열 바이러스(DENV) NS1 유전자 재조합 항원 개발

위와 같이 추출한 DENV 유전형에 대한 NS1 유전자 염기서열을 기반으로 E. coli에서 발현할 수 있도록 코돈 최적화를 실시하였다(SEQ ID NOS: 15-22). 최적화 후 E. coli 발현 벡터(pBT7 발현 벡터)로 설계하였다(도 10 내지 도 12 참조).

설계된 바와 같이 클로닝후 E. coli Lemo21 세포에 각각 형질전환 후 각각 재조합 항원을 생산하였다. Ni-NTA affinity column chromatography로 6X histidine tag 재조합 항원을 각각 정제하였다. 이로써 DENV NS1 유전자 재조항 항원 총 8종(type 1 4종, type 2 2종, type 3 1종, type 4 1종)을 대장균 시스템에서 성공적으로 발현시켰다.

항원은 SDS detergent로 녹여 정제하였고, 이는 다시 100mM 이미다졸로 용출하여 각각 추출하였다.

발현 확인된 배양액의 대장균체를 원심분리 후 모은 후 anionic detergent가 포함된 lysis buffer(8 mM Na₂HPO₄, 286 mM NaCl, 1.4 mM KH₂PO₄, 2.6 mM KCl, 1% SDS, pH 7.4)로 부유시켜 초음파 분쇄를 진행하였고, 고속원심분리후 용해된 항원이 포함된 상청액을 모았다. 상청액은 equilibration buffer(8 mM Na₂HPO₄, 286 mM NaCl, 1.4 mM KH₂PO₄, 2.6 mM KCl, 0.1% Sarkosyl, pH 7.4)로 평형화된 Ni-NTA resin column에 적용하여 100mM 이미다졸이 포함된 버퍼로 용출하여 항원을 정제하였다. 4%-12% SDS PAGE 전기영동을 통해 각 뎅기열 바이러스 NS1 항원의 정제 전 항원 발현 정도, Ni-NTA 크래마토그래피 분리 정제도 등을 확인하였다(도 13 및 도 14 참조).

<실시예 4> 항원의 면역원성 측정

각 항원은 웨스턴 블랏을 통하여 기존 Native사 항원과 항체(아래 참조)를 통하여 면역원성을 비교 검증하였다:

- Mouse anti Dengue virus NS1 antibody (AbDENVNS1-DA034, The Native Antigen Company Ltd., Oxford, UK)

- Dengue Virus NS1 protein serotypes 1-4(type 1, 2, 3, 4 pack, DENVX4-NS1, The Native Antigen Company Ltd.)

- Flavivirus NS1 protein pack(JEV NS1, TBEV NS1, WNV NS1, YFV NS1 포함, FLAVX4-NS1, The Native Antigen Company Ltd.)

도 15에 나타난 바와 같이, 총 8종의 개발 DENV NS1 재조합 항원은 다른 Flavivirus(일본뇌염, 황열, 웨스트나일, 지카 바이러스 NS1 항원)과 비교하여 NS1 단일항체에 특이적으로 반응하였다.

<실시예 5> 뎅기열 바이러스 항원의 인간 T 세포 면역 매개 반응 에피토프(MHC II 형) 분석

표 2는 뎅기열 바이러스 타입 별 특이 NS1 펩타이드의 인간 T 세포 면역 매개 반응 에피토프(MHC II형)를 분석하여 타입 별 특이 펩타이드 에피토프를 분석하였다. 이를 위해, IEDB (http://www.iedb.org)의 consensus tool 프로그램을 이용하여 사람 HLA I & II 형의 DR, DP, DQ를 포함하는 대표적인 27개의 allele에 대한 MHC binding 분석을 진행하였다. 또한 Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 프로그램을 이용하여 항원성을 동시에 평가하였다. 각 형별 항원별로 각각 MHC II binding은 약 9,100개의 에피토프, MHC I binding은 약 1,800개 에피토프의 특성을 분석하였다. 표 2에 도시된 데이터는 1.0 이하 백분위 랭크(consensus tool에 의해 순위화 됨)에서 필터링하여 추출하였다. 볼드체는 DENV 혈청형 중 동일한 코어 펩타이드를 나타낸다. a는 NS1 아미노산 서열 번호, b는 이 영역에서 예측된 펩타이드 중 백분위 랭크의 평균값, c는 이 영역에서 예측된 펩타이드 중 SMM-정렬 방법에 의한 IC₅₀의 평균값, d의 데이터는 조합 펩타이드 라이브러리에 의해 예측되었고, SMM-정렬 및 NN- 정렬 방법, e는 각 ST의 각 아미노산 서열에 대한 상동성의 평균으로서 계산된 값을 나타낸다.

표 3은 뎅기열 바이러스 타입 별 특이 NS1 펩타이드의 인간 T 세포 면역매개 반응 에피토프(MHC I 형) 분석 결과로, 이 데이터는 0.6 이하 백분위 랭크에서 필터링에 의해 추출되었고, 볼드체는 펩타이드가 MHC 클래스 II 결합 코어 펩타이드와 공유됨을 나타낸다.

<실시예 6> 유행성 플라비바이러스(endemic flavivirus) NS1 항원 개발

면역적 교차반응성이 높다고 알려진 플라비바이러스의 NS1 항원들은 뎅기열 NS1 진단에 필요하다. 플라비바이러스 중 비교적 지역적으로 널리 분포하고 있는 플라비바이러스들(일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 황열 바이러스, 지카 바이러스)의 NS1 항원을 동시에 개발하여 뎅기열 NS1 항원 진단에 대조군으로 사용할 수 있다.

6-1. 일본뇌염 바이러스 유전자 재조합 NS1 항원 개발

일본뇌염 바이러스의 NS1(nonstructural protein 1) 항원은 불활성 백신(inactivated vaccine)에는 없는 성분으로 선천적 감염(natural infection) 진단에 사용되는 항원으로 여기에서는 뎅기열 바이러스 진단을 위한 대조군 항원으로 개발하였다. 유전적 변이성을 조사하기 위해 글로벌 유전은행(Genbank)에 등록된 293개의 유전자를 조사하였으며 59개의 특이 유전자 서열을 분석하고 펩타이드 항원 에피토프 분석을 진행하여 특이 에피토프를 도출하였다.

도 16은 일본뇌염 바이러스 NS1 항원 유전자 계통학적 분석 결과로, 그 중 주요 genotype(1, 3, 5)을 대표하는 3개의 항원을 선발하였고 유전자 합성을 진행하였다.

도 17은 WHO 일본뇌염 바이러스 감염 혈청을 통한 JEV 유전자 재조합 항원의 웨스턴 블랏 결과로, 개발 항원은 Native사 Flavivirus NS1 항원과 비교 검증하였다.

6-2. 웨스트나일 바이러스 유전자 재조합 NS1 항원 개발

웨스트나일 바이러스의 NS1 항원은 선천적 감염 진단에 사용되는 항원으로 뎅기열 바이러스 진단 시 대조군 항원으로 개발하였다. 유전적 변이성을 조사하기 위해 글로벌 유전은행(Genbank)에 등록된 2,039개의 유전자를 조사하였으며 119개의 특이 유전자 서열을 분석하고 펩타이드 항원 에피토프 분석을 진행하여 특이 항원 에피토프를 도출하였다.

6-3. 황열 바이러스(Yellow fever virus) 유전자 재조합 NS1 항원 개발

황열 바이러스의 NS1 항원은 선천적 감염 진단에 사용되는 항원으로 뎅기열 바이러스 진단 시 대조군 항원으로 개발하였다. 유전적 변이성을 조사하기 위해 글로벌 유전은행(Genbank)에 등록된 73개의 유전자를 조사하였으며 16개의 특이 유전자 서열을 분석하고 펩타이드 항원 에피토프 분석을 진행하여 특이 항원 에피토프를 도출하였다.

6-4. 지카 바이러스 유전자 재조합 NS1 항원 개발

지카 바이러스의 NS1항원은 선천적 감염 진단에 사용되는 항원으로 뎅기열 바이러스 진단 시 대조군 항원으로 개발하였다. 유전적 변이성을 조사하기 위해 글로벌 유전은행(Genbank)에 등록된 402개의 유전자를 조사하였으며 39개의 특이 유전자 서열을 분석하고 펩타이드 항원 에피토프 분석을 진행하여 특이 항원 에피토프를 도출하였다.

도 21은 플라비바이러스 대조군 항원의 뎅기열 NS1 유전자 재조합 항원과의 교차면역반응 결과를 나타낸 것이다.

도 22는 Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)를 통한 뎅기열 바이러스 타입 별(DT1-4), 일본뇌염 바이러스(JEV), 웨스트나일 바이러스(WNV), 황열 바이러스(YFV), 지카 바이러스(ZKV) NS1 유전자 재조합 항원들의 지카 바이러스 NS1 항체에 대한 특이도 조사결과를 나타낸 것이다.

면역교차반응을 조사하기 위한 ELISA 결과, 뎅기열 바이러스 유전자 재조합 항원외에 다른 플라비바이러스와의 교차반응이 미미하여 대조군 항원으로서, 플라비바이러스 감염 여부 진단에 효과적으로 사용될 것으로 판단된다.

대장균 발현을 위한 일본뇌염 바이러스(JEV), 웨스트나일 바이러스(WNV), 황열 바이러스(YFV), 지카 바이러스(ZKV) NS1 유전자 재조합 항원의 염기서열은 SEQ ID NOS: 23-26을 사용할 수 있다.

<실시예 7> 피치아 효모 발현용 플라비바이러스 NS1 유전자 재조합 항원 설계

대장균뿐만 아니라 진핵생물에서 발현할 수 있는 대량 생산용 재조합 항원을 설계하였다. 각 설계된 NS1 항원은 뎅기열 바이러스 형별 4종, 일본뇌염 바이러스 대표 유전형 3종, 황열 바이러스 1종, 웨스트나일 바이러스 1종, 지카 바이러스 1종이다. 피치아 효모 발현용 유전자 설계는 multi-objective optimization platform (codon context (CC), host’s codon adaptation index (CAI), individual codon usage (ICU), repeat bases, stop codon 생성비율 등의 값을 동시에 평가 분석)인 Codon Optimization OnLine (COOL) 프로그램을 사용하였다. 각 형별로 각각 50개의 후보 유전자를 추출하였으며 Pichia pastoris의 codon context fitness 값 상위 10%를 대상으로 IC fitness, CAI(>0.9) 등을 고려하여 유전자 합성 염기서열을 설계하였다(MlyI, SwaI, FseI, KpnI 등 제한효소 제외). 이들 유전자는 Pichia pastoris AOE1 발현조절 유전자와 signal peptide(alpha factor와 결합하여 합성되도록 최적화로 설계하였다((SEQ ID NOS: 27-34, 도 23 참조). 도 24는 Pichia pastoris 최적화 유전자 후보물질 분석을 도시한 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Recombinant pangenotype complex NS1 antigen pool of dengue virus & endemic flaviviruses designed by gene synthesis <130> P19U11C0459 <150> KR 10-2018-0051678 <151> 2018-05-04 <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Dengue virus type 1 TM242 <400> 1 Asp Ser Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys Gly Arg Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr 20 25 30 Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Gly Lys 35 40 45 Ala Trp Glu Glu Gly Val Cys Gly Ile Arg Ser Ala Thr Arg Leu Glu 50 55 60 Asn Ile Met Trp Lys Gln Ile Ser Asn Glu Leu Asn His Ile Leu Leu 65 70 75 80 Glu Asn Asp Met Lys Phe Thr Val Val Val Gly Asp Ala Asn Gly Ile 85 90 95 Leu Thr Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln Pro Met Glu His Lys 100 105 110 Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys Ala Lys Ile Ile Gly Ala Asp Thr 115 120 125 Gln Asn Thr Thr Phe Ile Ile Asp Gly Pro Asp Thr Pro Glu Cys Pro 130 135 140 Asp Asp Gln Arg Ala Trp Asn Ile Trp Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe 145 150 155 160 Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Thr 165 170 175 Gln Met Cys Asp His Arg Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Ser Lys 180 185 190 Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu 195 200 205 Thr Trp Lys Leu Ala Arg Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Thr Cys Ile 210 215 220 Trp Pro Arg Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Ile Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Gly Pro Ile Ser Gln His Asn Tyr 245 250 255 Arg Pro Gly Tyr Phe Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Phe Asn Leu Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Asp 275 280 285 Glu His Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Lys Ile Ile His Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro 305 310 315 320 Leu Arg Phe Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Val Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Arg Ser Met Val Ser Ala 340 345 350 <210> 2 <211> 352 <212> PRT <213> Dengue virus type 1 V1971 <400> 2 Asp Ser Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys Gly Arg Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr 20 25 30 Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Gly Lys 35 40 45 Ala Trp Glu Glu Gly Val Cys Gly Ile Arg Ser Ala Thr Arg Leu Glu 50 55 60 Asn Ile Met Trp Lys Gln Ile Ser Asn Glu Leu Asn His Ile Leu Leu 65 70 75 80 Glu Asn Asp Met Lys Phe Thr Val Val Val Gly Asp Val Val Gly Ile 85 90 95 Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln Pro Met Glu His Lys 100 105 110 Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys Ala Lys Ile Ile Gly Ala Asp Val 115 120 125 Gln Asn Thr Thr Phe Ile Ile Asp Gly Pro Asn Thr Pro Glu Cys Pro 130 135 140 Asp Asp Gln Arg Ala Trp Asn Ile Trp Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe 145 150 155 160 Gly Ile Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Thr 165 170 175 Gln Ala Cys Asp His Arg Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Ser Lys 180 185 190 Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu 195 200 205 Thr Trp Lys Leu Ala Arg Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Thr Cys Ile 210 215 220 Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Val Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Gly Pro Ile Ser Gln His Asn Tyr 245 250 255 Arg Pro Gly Tyr Phe Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Phe Asp Leu Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Asp 275 280 285 Glu His Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Lys Ile Ile His Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro 305 310 315 320 Leu Arg Phe Lys Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Val Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Lys Ser Met Val Ser Ala 340 345 350 <210> 3 <211> 352 <212> PRT <213> Dengue virus type 1 TM99 <400> 3 Asp Ser Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys Gly Arg Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr 20 25 30 Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Gly Lys 35 40 45 Ala Trp Glu Glu Gly Val Cys Gly Ile Arg Ser Ala Thr Arg Leu Glu 50 55 60 Asn Ile Met Trp Lys Gln Ile Ser Asn Glu Leu Asn His Ile Leu Leu 65 70 75 80 Glu Asn Asp Met Lys Phe Thr Val Val Val Gly Asp Val Ala Gly Ile 85 90 95 Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln Pro Met Glu His Lys 100 105 110 Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys Ala Lys Ile Ile Gly Ala Asp Val 115 120 125 Gln Asn Thr Thr Phe Ile Ile Asp Gly Pro Asn Thr Pro Glu Cys Pro 130 135 140 Asp Asp Gln Arg Ala Trp Asn Ile Trp Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe 145 150 155 160 Gly Ile Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Thr 165 170 175 Gln Val Cys Asp His Arg Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Ser Lys 180 185 190 Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu 195 200 205 Thr Trp Lys Leu Ala Arg Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Thr Cys Ile 210 215 220 Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Ile Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Gly Pro Ile Ser Gln His Asn Tyr 245 250 255 Arg Pro Gly Tyr Phe Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Phe Asp Leu Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Asp 275 280 285 Glu His Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Lys Ile Ile His Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro 305 310 315 320 Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Val Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Lys Ser Met Val Ser Ala 340 345 350 <210> 4 <211> 352 <212> PRT <213> Dengue virus type 1 V1975 <400> 4 Asp Ser Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys Gly Arg Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr 20 25 30 Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Gly Lys 35 40 45 Ala Trp Glu Glu Gly Val Cys Gly Ile Arg Ser Ala Thr Arg Leu Glu 50 55 60 Asn Ile Met Trp Lys Gln Ile Ser Asn Glu Leu Asn His Ile Leu Leu 65 70 75 80 Glu Asn Asp Met Lys Leu Thr Val Val Val Gly Asp Val Ala Gly Ile 85 90 95 Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln Pro Met Glu Tyr Lys 100 105 110 Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys Ala Lys Ile Ile Gly Ala Asp Val 115 120 125 Gln Asn Thr Thr Phe Ile Ile Asp Gly Pro Asn Thr Pro Glu Cys Pro 130 135 140 Asp Asp Gln Arg Ala Trp Asn Ile Trp Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe 145 150 155 160 Gly Ile Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Asp Ser His Thr 165 170 175 Gln Val Cys Asp His Arg Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Ser Lys 180 185 190 Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu 195 200 205 Thr Trp Lys Leu Ala Arg Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Thr Cys Ile 210 215 220 Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Ile Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Gly Pro Ile Ser Gln His Asn Tyr 245 250 255 Arg Pro Gly Tyr Phe Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Phe Asp Leu Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Asp 275 280 285 Glu His Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Lys Ile Ile His Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro 305 310 315 320 Leu Arg Phe Lys Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Val Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Lys Ser Met Val Ser Ala 340 345 350 <210> 5 <211> 352 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 SJRP-869 <400> 5 Asp Ser Gly Cys Ile Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr 20 25 30 Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys 35 40 45 Ala His Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu 50 55 60 Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile 85 90 95 Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser 115 120 125 His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro 130 135 140 Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe 145 150 155 160 Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp 165 170 175 Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg 180 185 190 Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp 195 200 205 Thr Trp Lys Met Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His 210 215 220 Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Val Ile Pro Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr 245 250 255 Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys 260 265 270 Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr 275 280 285 Glu Asp Cys Glu Lys Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser 290 295 300 Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro 305 310 315 320 Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 340 345 350 <210> 6 <211> 352 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 Gainesville <400> 6 Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr 20 25 30 Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys 35 40 45 Ala His Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu 50 55 60 Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asn Glu Ile Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile 85 90 95 Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser 115 120 125 His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro 130 135 140 Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe 145 150 155 160 Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp 165 170 175 Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg 180 185 190 Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp 195 200 205 Thr Trp Lys Met Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His 210 215 220 Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu 225 230 235 240 Met Ile Ile Pro Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr 245 250 255 Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys 260 265 270 Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr 275 280 285 Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser 290 295 300 Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro 305 310 315 320 Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg 325 330 335 Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 340 345 350 <210> 7 <211> 352 <212> PRT <213> Dengue virus type 3 V3615 <400> 7 Asp Met Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys Gly Lys Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr 20 25 30 Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg Leu Ala Thr Ala Ile Ala Gly 35 40 45 Ala Trp Glu Asn Gly Val Cys Gly Ile Arg Ser Thr Thr Arg Met Glu 50 55 60 Asn Leu Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asn Glu Leu Asn Tyr Ile Leu Trp 65 70 75 80 Glu Asn Asn Ile Lys Leu Thr Val Val Val Gly Asp Ile Ile Gly Val 85 90 95 Leu Glu Gln Gly Lys Arg Thr Leu Thr Pro Gln Pro Met Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Ile Val Thr Ala Glu Thr 115 120 125 Gln Asn Ser Ser Phe Ile Ile Asp Gly Pro Asn Thr Pro Glu Cys Pro 130 135 140 Ser Ala Ser Arg Ala Trp Asn Val Trp Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe 145 150 155 160 Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Val Tyr Thr 165 170 175 Gln Leu Cys Asp His Arg Leu Met Ser Ala Ala Val Lys Asp Glu Arg 180 185 190 Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Gln Lys Asn Gly 195 200 205 Ser Trp Lys Leu Glu Lys Ala Ser Leu Ile Glu Val Lys Thr Cys Thr 210 215 220 Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Asp 225 230 235 240 Met Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Ile Ser Gln His Asn His 245 250 255 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encephalitis virus JaOArS982 <400> 10 Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Thr Arg Lys Glu Met Arg Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Phe Val His Asn Asp Val Glu Ala Trp Val Asp Arg Tyr 20 25 30 Lys Tyr Leu Pro Glu Thr Pro Arg Ser Leu Ala Lys Ile Val His Lys 35 40 45 Ala His Lys Glu Gly Val Cys Gly Val Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu 50 55 60 His Gln Met Trp Glu Ala Val Arg Asp Glu Leu Asn Val Leu Leu Lys 65 70 75 80 Glu Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Val Val Asn Lys Pro Val Gly Arg 85 90 95 Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr Gln Glu Lys Phe Glu 100 105 110 Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Ile Leu Phe Ala Pro Glu Leu 115 120 125 Ala Asn Ser Thr Phe Val Val Asp Gly Pro Glu Thr Lys Glu Cys Pro 130 135 140 Asp Glu His Arg Ala Trp Asn Ser Met Gln Ile Glu Asp Phe Gly Phe 145 150 155 160 Gly Ile Thr Ser Thr Arg Val Trp Leu Lys Ile Arg Glu Glu Ser Thr 165 170 175 Asp Glu Cys Asp Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly His Val 180 185 190 Ala Val His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Arg Tyr Asn 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14 Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly 1 5 10 15 Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr 20 25 30 Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln 35 40 45 Ala Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu 50 55 60 Asn Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu 65 70 75 80 Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro 85 90 95 Met Trp Arg Ala Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro 100 105 110 His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys 115 120 125 Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro 130 135 140 Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe 145 150 155 160 Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser 165 170 175 Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu 180 185 190 Ala Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp 195 200 205 Thr Trp Arg Leu Lys 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agctgaacca tattttgtta 240 gagaatgata tgaaattcac agtggttgta ggagatgcca atggaatcct gacccaagga 300 aaaaagatga ttcgcccaca gcctatggaa cacaaatatt catggaaaag ctggggaaaa 360 gccaaaatca taggtgcaga tacgcagaat accacattta tcatcgacgg cccagatact 420 cctgaatgcc cggatgacca gcgcgcatgg aacatttggg aagttgaaga ttacggcttt 480 ggcgttttca cgaccaacat ttggctcaaa ttacgtgatt catataccca aatgtgcgat 540 catcggctga tgtccgcggc cattaaggac tctaaagcag tccatgctga catggggtac 600 tggatagaaa gtgaaaagaa tgagacctgg aagctagcta gagcctcttt tatagaagtg 660 aaaacatgca tctggccgcg ctcccacact ctgtggagca acggcgtcct ggaaagtgaa 720 atgatcattc ctaagatata tggtggtccc atatctcagc acaactaccg cccagggtat 780 tttacacaga cggcggggcc ttggcattta ggtaaattgg aactggattt taatctgtgt 840 gaaggcacca ccgttgttgt ggatgaacat tgcggaaatc gaggtccgag ccttcggact 900 acgacagtga caggaaaaat tattcatgag tggtgctgcc gttcctgtac cttgccgccc 960 ttacgcttcc gcggagagga cggatgttgg tatggcatgg agatccgtcc ggttaaagaa 1020 aaggaagaaa atctcgtaag gtcaatggtc tctgcg 1056 <210> 16 <211> 1056 <212> DNA <213> Dengue virus type 1 V1971 <400> 16 gatagtggtt gcgtaattaa ttggaaaggt agagaactca aatgtggcag tggcattttt 60 gtcaccaatg aagtgcatac ttggacggag caatataagt ttcaggcaga ctctccaaag 120 cgtctatcag ctgccattgg gaaggcatgg gaagagggtg tgtgtggaat tcgaagtgcg 180 actcgtctcg agaatatcat gtggaaacag atttcaaatg aactgaacca catattactt 240 gagaacgaca tgaaattcac agtggtcgta ggcgatgtag tgggcatttt ggctcaaggc 300 aaaaaaatga ttaggccaca gcccatggaa cataaatact cgtggaaaag ctggggaaaa 360 gcgaaaatca taggggccga tgtgcagaat acaactttca ttatcgatgg cccgaacacc 420 ccagaatgcc ctgacgatca acgcgcatgg aatatctggg aagttgagga ttatggcttc 480 ggtattttta ccacaaatat ctggctgaag ttgcgtgact cctacacgca ggcctgtgac 540 catcggctga tgtcagcagc gatcaaggac agcaaggctg ttcatgcgga tatgggctat 600 tggatagaaa gtgaaaagaa cgagacctgg aagctggcca gagcgagctt tatagaagtt 660 aagacttgca tttggcctaa atcccacact ctttggagca atggtgttct ggagtcggaa 720 atggtgattc caaagatcta tggaggcccg atttctcagc acaactaccg cccagggtat 780 ttcacgcaga ccgccgggcc gtggcacctg ggtaaattgg agctggattt tgatctgtgc 840 gagggtacga cagttgttgt ggatgaacat tgcggaaacc gggggccatc tcttcgcacc 900 accacagtta caggaaagat aattcatgaa tggtgttgtc gttcttgcac gctgccgccc 960 ttacgtttta aaggtgaaga tggttgttgg tatggtatgg aaatccgccc ggtcaaagaa 1020 aaagaagaga atttagtcaa atcaatggtc tccgca 1056 <210> 17 <211> 1056 <212> DNA <213> Dengue virus type 1 TM99 <400> 17 gattcaggct gtgtaatcaa ctggaaaggt cgcgaactca aatgcggttc ggggattttc 60 gtcactaatg aagtgcatac ttggacagag caatataaat ttcaggctga ttccccaaag 120 agattatcag cggccattgg gaaagcctgg gaggagggtg tgtgtggtat tcgtagcgca 180 actcgtctcg aaaacattat gtggaaacag ataagtaatg aactgaacca catcttactt 240 gaaaatgaca tgaaattcac tgtggttgta ggtgacgttg ctggcatctt ggctcagggc 300 aaaaagatga ttcgccctca acccatggaa cataagtatt cgtggaaaag ctggggcaaa 360 gcgaagatca tcggggccga tgtgcagaac accaccttta tcattgatgg cccgaatacc 420 ccagagtgcc ctgacgatca gagagcatgg aatatttggg aggtagagga ttacggtttt 480 ggaatcttta cgacgaatat atggctgaaa ttgcgtgatt cctacacaca agtgtgtgac 540 caccggctaa tgtcagctgc gattaaggac agcaaagcag ttcacgccga catggggtat 600 tggatcgaaa gtgaaaaaaa cgaaacctgg aagctggcac gcgcgtcttt tatagaagta 660 aaaacatgca tttggccgaa atcccatact ctgtggagca atggagttct ggaaagtgaa 720 atgattattc caaagattta tggaggccct atctctcagc ataattatcg cccgggatat 780 ttcacacaga ccgcaggccc gtggcacctg ggcaaacttg agttggattt tgatttatgc 840 gaggggacca cggttgttgt ggatgaacat tgtggcaacc gaggtccgtc tcttaggacg 900 acaaccgtca caggaaagat aattcatgaa tggtgttgcc ggtcttgtac gttacctccc 960 ctgcgttacc gtggagagga tggttgctgg tacggaatgg aaatccgccc ggtgaaagaa 1020 aaggaagaga atctggtcaa atcaatggtc agtgcc 1056 <210> 18 <211> 1056 <212> DNA <213> Dengue virus type 1 V1975 <400> 18 gattcaggct gcgtaattaa ctggaagggg agagaactca aatgcggtag tggcatcttt 60 gtcaccaatg aagttcatac gtggactgaa cagtataagt ttcaggcgga ttccccgaaa 120 cgtctgagcg cggccatcgg gaaggcatgg gaggaaggtg tgtgtggaat tcgctcagca 180 actcgtctgg aaaacatcat gtggaaacag ataagtaatg aactgaacca tattttactt 240 gaaaatgata tgaaacttac ggtagtggtg ggagatgttg ctggtatctt ggctcaggga 300 aaaaagatga ttcgaccaca gcccatggaa tacaaatact cgtggaagtc gtggggaaaa 360 gctaaaatca taggtgccga tgtgcagaat accaccttta ttatcgacgg ccctaacacc 420 ccagagtgcc ctgatgacca aagagcatgg aacatttggg aggttgagga ctatggtttt 480 ggcattttca cgacaaatat atggctgaaa ttgcgtgatt cccataccca ggtgtgcgat 540 catcgtctga tgtcagctgc catcaaagac agcaaagccg ttcacgcgga catgggttat 600 tggattgaaa gtgagaaaaa tgagacctgg aaactggcgc gcgcctcttt tatagaagta 660 aaaacatgta tttggccgaa atcccacact ttatggagca atggggttct ggaaagtgaa 720 atgattatcc cgaagatcta tggaggacca atctctcaac acaactaccg gccaggctat 780 ttcacacaaa ccgcagggcc gtggcaccta ggcaaattgg aactggactt tgatctgtgt 840 gagggtacga cagttgttgt ggatgagcat tgtggtaatc gcggcccgtc acttaggact 900 acaactgtca ccggtaagat tattcatgaa tggtgttgcc ggtcttgcac gctccctccc 960 ttacgtttca aaggcgaaga tgggtgttgg tatggtatgg agatccgccc tgtaaaggaa 1020 aaagaagaga atttagtcaa aagcatggtc tctgca 1056 <210> 19 <211> 1056 <212> DNA <213> Dengue virus type 2 SJRP-869 <400> 19 gatagtgggt 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cacagattga tgtccgctgc tatcaaggat tccaaggctg tccatgctga catgggatac 600 tggattgaat ccgaaaagaa cgaaacgtgg aagttggcca gagcttcttt tattgaggtc 660 aagacttgta tctggcctaa gtctcacact ctttggtcta acggtgtttt ggaatctgag 720 atgatcattc caaagattta cggtggtcca atttcccaac acaactacag accaggttac 780 ttcactcaaa ctgctggtcc atggcatttg ggtaaattgg aattggactt tgatttgtgt 840 gagggtacca ctgttgttgt ggatgaacac tgtggtaaca gaggtccatc tttgagaact 900 actaccgtta ctggtaagat tatccacgaa tggtgttgta gatcttgtac tttgccacca 960 ttgagataca gaggtgaaga cggttgttgg tacggtatgg aaattagacc tgttaaggag 1020 aaggaagaaa acttggttaa gtccatggtt tcagca 1056 <210> 28 <211> 1056 <212> DNA <213> Dengue virus type 2 <400> 28 gattccggtt gtattgtctc ctggaaaaac aaggagttga agtgtggttc tggaatcttt 60 attactgaca acgttcatac ctggaccgag caatacaagt tccaacccga atctccttcc 120 aagcttgctt ccgccatcca gaaggcccat gaagaaggta tttgtggaat tagatctgta 180 acccgcttgg agaacctgat gtggaaacaa attaccccag agttgaacca tattttgtct 240 gagaacgagg ttaagttgac tatcatgact ggtgacatta 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tcaaacctgg caaattgaga gagcttcttt gattgaggtt 660 aagacttgtt tgtggccaaa aactcacact ttgtggtcta acggtgtttt ggaatctcaa 720 atgttgattc caaagtccta cgctggtcca ttctctcaac acaactacag acaaggttac 780 gccactcaaa ctgttggtcc atggcacttg ggtaagttgg aaattgattt tggtgaatgt 840 ccaggtacta ctgttaccat tcaagaaaac tgtgatcaca gaggtccttc tttgagaact 900 actactgctt ccggtaagtt ggttactcaa tggtgttgta gatcttgtac tatgccacca 960 ttgagattct tgggtgagga tggttgttgg tacggtatgg aaattagacc attgtctgaa 1020 aaggaggaga acatggttaa gtctcaagtt actgct 1056 <210> 31 <211> 1056 <212> DNA <213> Japanese encephalitis virus <400> 31 gatactggtt gtgctattga tattactaga aaggagatga gatgtggatc tggtattttc 60 gttcataatg atgttgaggc ctgggtcgac agatacaagt acttgcctga gaccccaaga 120 tccttggcta aaattgtgca caaggcacat aaggagggtg tctgtggtgt aagatctgtt 180 acacgtctgg agcatcagat gtgggaagct gtcagagatg agttgaacgt tcttttgaaa 240 gagaacgctg ttgacctttc agtagttgtc aacaagccag ttggtagata cagaagtgct 300 ccaaagcgtt tgtctatgac ccaagaaaag tttgaaatgg gttggaaagc ttggggtaag 360 tccattctgt tcgctcctga actggctaac tccacctttg ttgttgacgg tccagaaaca 420 aaagagtgtc ctgacgaaca cagagcttgg aactctatgc aaattgagga ctttggtttc 480 ggaatcacct ctaccagagt ttggttgaag attagagagg aatctactga tgaatgtgat 540 ggtgccatta ttggtactgc tgttaagggt catgttgctg ttcactctga tttgtcttac 600 tggattgaat ctagatacaa cgacacttgg aagttggaaa gagctgtttt tggtgaagtt 660 aagtcttgta cttggccaga gacccacact ttgtggggtg atggtgttga agaatctgaa 720 ctgattattc cacacaccat tgctggtcca aagtctaagc acaacagaag agaaggttac 780 aagacccaaa accagggtcc atgggatgaa aacggtattg ttttggattt cgattactgt 840 ccaggtacta aggtcactat tactgaagat tgtggtaaga gaggtccatc tgttagaact 900 actaccgatt ctggtaagtt gattaccgac tggtgttgta gatcttgttc tttgccacca 960 ttgagattca gaactgaaaa cggttgttgg tacggtatgg aaattagacc agttagacat 1020 gatgaaacta ctttggttag atctcaagtt gatgct 1056 <210> 32 <211> 1056 <212> DNA <213> West nile virus <400> 32 gacactggtt gtgctattga tatttctaga caagaattga gatgtggttc cggtgttttc 60 attcataacg atgtagaggc ttggatggac 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gatcttgtac tttgccacca 960 ttgagatacc aaactgattc tggttgttgg tatggtatgg aaattagacc tcaaagacat 1020 gatgaaaaga ctttggttca atctcaagtt aacgct 1056 <210> 33 <211> 1056 <212> DNA <213> Yellow fever virus <400> 33 gaccagggtt gtgctatcaa ctttggtaag agagagctga agtgtggtga tggtattttc 60 atatttagag atagtgatga ttggttgaac aagtactcct actacccaga agatccagtg 120 aagttggctt ctattgttaa ggcttccttt gaagaaggta agtgcggttt gaattctgtt 180 gattccttag agcatgagat gtggagaagc agagctgatg agattaacgc tatctttgag 240 gagaatgaag ttgacatttc ggttgttgtt caagatccaa agaacgtata ccaaagaggt 300 acccacccat tctctagaat cagagacggt cttcaatacg gttggaagac ttggggtaag 360 aatttggttt tctcaccagg taggaagaac ggctctttta ttattgatgg aaagtctaga 420 aaagagtgtc cattttccaa cagagtttgg aattctttcc aaattgagga atttggaacc 480 ggtgttttca ccactagagt ttacatggat gctgtctttg agtacactat tgactgtgat 540 ggttctattt taggtgctgc tgttaacggt aagaagtctg ctcatggttc tccaactttc 600 tggatgggtt cacatgaagt taacggtact tggatgattc acaccttgga agctttggat 660 tacaaggaat gtgagtggcc attgacccac actattggta cttctgttga agaatccgaa 720 atgttcatgc ctagatctat tggtggtcca gtttcttctc acaaccacat cccaggttac 780 aaggttcaaa ctaacggtcc ttggatgcaa gttcctttgg aggttaagag agaagcttgt 840 ccaggtactt ctgttatcat cgatggtaac tgtgatggta gaggtaagtc tactagatct 900 accactgatt ctggtaaggt tattccagag tggtgttgta gatcttgtac tatgccacct 960 gtttctttcc acggatctga cggttgttgg tacccaatgg aaattagacc aagaaagacc 1020 catgaatctc acttggttag atcatgggtt actgct 1056 <210> 34 <211> 1056 <212> DNA <213> Zika virus <400> 34 gacgttggtt gttctgttga cttttctaag aaggaaacca gatgtggaac tggtgttttc 60 gtttacaacg atgttgaagc ttggagagat agatacaagt accatccaga ttctcctaga 120 agattggctg ctgccgttaa gcaagcctgg gaagatggta tttgtggtat ctcttccgtt 180 tctagaatgg agaacatcat gtggagatca gtcgagggtg agttgaacgc tattttggaa 240 gaaaacggtg ttcaattgac tgttgttgta ggcagcgtca agaacccaat gtggagagct 300 ccacaaagat taccagtccc agttaacgag cttccacatg gttggaaagc atggggtaag 360 tcttacttcg tcagagcagc caagactaac aactcttttg tcgttgatgg tgatactttg 420 aaagaatgtc ctttgaagca cagagcctgg aattcattct tggttgagga ccacggtttc 480 ggggttttcc atacatccgt ttggttgaag gttagagagg attactcttt ggagtgtgat 540 cctgctgtca ttggtacagc tgttaaggga aaggaggctg tccacagtga cttgggttac 600 tggattgaga gtgagaagaa tgacacttgg aggttgaaga gagctcactt gatagagatg 660 aagacttgtg aatggccaaa gtctcacact ttatggactg atggaattga ggaatctgat 720 ttgatcatcc caaagtcctt ggctggacca ttgtcccacc acaacactcg tgaaggttac 780 agaactcaaa tgaagggtcc ttggcactcc gaggaattgg agattagatt cgaagagtgt 840 ccaggtacca aggttcacgt tgaggagacc tgtggtacta gaggtccatc tttgagatct 900 actactgctt ctggtagagt tattgaagag tggtgttgta gagaatgtac catgccacca 960 ttgtctttca gagctaagga cggttgttgg tacggtatgg aaatcagacc aagaaaggag 1020 ccagaatcta acttggttag atctatggtt actgcg 1056

Claims

SEQ ID NOS: 1 내지 8로 이루어진 항원 펩타이드; 및
SEQ ID NOS: 9 내지 14로 이루어진 교차면역원성 검사용 항원 대조군을 포함하는, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
항원 펩타이드는 뎅기열 1형 내지 4형 바이러스 중 어느 하나의 NS1 항원 펩타이드인, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
항원 펩타이드는 뎅기열 1형 내지 4형 바이러스 중 어느 하나의 NS1 항원에 특이적인 항체 검출용 펩타이드인, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물.
제3항에 있어서,
뎅기열 바이러스의 NS1 항원에 특이적인 항체는 항-뎅기 IgM 또는 IgG를 포함하는, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
교차면역원성 검사용 항원 대조군은 하기 플라비바이러스종의 NS1 항원 펩타이드로 이루어진 것인, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물:
일본뇌염 바이러스 NS1 항원 펩타이드: SEQ ID NOS: 9 내지 11
웨스트 나일 바이러스 NS1 항원 펩타이드: SEQ ID NO: 12
황열 바이러스 NS1 항원 펩타이드: SEQ ID NO: 13
지카 바이러스 NS1 항원 펩타이드: SEQ ID NO: 14
제1항에 있어서,
뎅기열 바이러스 감염 진단은 항원 펩타이드, 교차면역원성 검사용 항원 대조군 및 생물학적 시료의 항원-항체 복합체 형성량을 측정하고, 상기 생물학적 시료가 뎅기열 바이러스에 특이적인 항체를 함유하는 경우 항원-항체 복합체 형성량의 증가를 통해 뎅기열 바이러스 감염을 진단하는 것인, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청 또는 혈액을 포함하는, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
항원-항체 복합체 형성량은 웨스턴 블랏(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip)을 이용하여 검출하는 것인, 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물.
제1항의 뎅기열 바이러스 감염 진단용 조성물을 포함하는 뎅기열 바이러스 감염 진단용 키트.