KR101541957B1 - ４가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 4가지 혈청형 뎅기 바이러스 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브, 이들을 포함하는 4가지 혈청형 뎅기 바이러스 다중 동시 감별 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 이용한 다중 실시간 RT-PCR 진단은 위-음성 및 위-양성 오류와 배경산물의 문제점을 극복하면서 하나의 반응 용기에서 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 존재 여부뿐만 아니라 뎅기 바이러스 혈청형의 구분을 용이하고 신속하면서도 매우 높은 신뢰도로 확인할 수 있으므로, 뎅기 바이러스의 조기 감염 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

４가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도{Oligonucleotides and use thereof for simultaneous multiplex diagnosis of 4 serotypes of dangue virus}

본 발명은 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 올리고뉴클레오티드 및 이들의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 4가지 혈청형 뎅기 바이러스 각각의 NS1 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브, 이들을 포함하는 4가지 혈청형 뎅기 바이러스 다중 동시 감별 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

뎅기 바이러스(dengue virus)는 플라비비리대 과(family Flaviviridae)의 플라비바이러스 속(genus Flavivirus)에 속하는 ssRNA 양성가닥 바이러스로, 고열을 동반하는 급성 열성 질환인 뎅기열(dengue fever)의 병인이 되는 바이러스이다. 뎅기 바이러스에 의한 감염증은 전 세계적으로 열대아시아, 서아프리카, 중미, 남태평양 등 넓은 영역에 걸쳐 풍토병으로 인지되고 있으며, 이러한 지역에 서식하는 이집트숲모기(Aedes aegypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus) 등의 모기를 매개체로 하여 인간에게 감염된다.

뎅기 바이러스에 감염되면 임상 증상에 따라 고열, 반점, 백혈구 감소증과 혈소판 감소증을 동반하는 뎅기열, 심한 경우인 출혈이 동반되는 뎅기출혈열(dengue haemorrhagic fever) 및 혈관의 투과성 증가와 저혈압성 쇼크를 동반하는 뎅기쇼크 증후군(dengue shock syndrome)이 나타나며, 매년 세계적으로 약 5천만 명 내지 1억 명의 뎅기 바이러스 감염자가 발생하고 있는 것으로 추정된다.

뎅기 바이러스는 혈청학적으로 다른 4가지 종류(DENV 1, DENV 2, DENV 3 및 DENV 4)가 있으며, 이들 뎅기 바이러스는 동일한 증상을 유발하기 때문에 증상만으로는 감염된 뎅기 바이러스의 혈청형을 구분할 수 없다. 동일한 혈청형에 대해서는 일생 방어 면역이 성립되지만 다른 혈청형에 재감염되면 방어되지 않을 뿐만 아니라 오히려 증상을 악화시킬 수 있다.

뎅기 바이러스를 비롯한 플라비바이러스는 캡시드(capsid), 막(membrane) 및 외피(envelope) 단백질로 이루어진 3개의 구조 단백질과, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5로 이루어진 7개의 비구조 단백질로 구성된다. 이중 당단백질인 NS1은 모든 플라비바이러스에 존재하며 바이러스의 생존에 필수적인 것으로 보인다. 뎅기 바이러스 NS1은 가용성 헥사머(hexamer) 형태로 감염된 포유동물 세포로부터 분비된다. 비공유적으로 결합된 헥사머 복합체(complex)는 3개의 이량체 서브유닛에 의해 형성되며, 310 kDa의 분자량을 가진다. 뎅기 바이러스의 감염 과정 동안 NS1 단백질은 강한 항체 반응을 일으키며, 이는 보체-매개성(complement-mediated) 경로 및 항체-의존성 세포독성(ADCC, antibody-dependent cell cytotoxicity)을 통하여 숙주에서 감염된 바이러스를 제거하는 것을 돕는 것으로 보인다.

한편, 뎅기 바이러스 감염에 의한 뎅기열은 환자의 혈청이나 조직에서 바이러스를 직접 검출하거나, 바이러스 항원이나 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 이용해 RNA를 검출함으로써, 또는 환자의 혈청에서 특이 항체를 찾아냄으로써 진단할 수 있다. 혈청학적 진단방법으로 혈구-응집 억제 검사(hemagglutination-inhibition reaction test), 항체-포획 ELISA(antibody capture ELISA), 보체(complement) 결합법, 중화항체 검사(neutralization antibody test), 점적(dot-blot) 면역분석법 등과 같이 뎅기 바이러스에 대한 항체를 이용하는 방법들이 이용되고 있으나, 이들 방법은 신속한 결과를 얻을 수 없고 조작하기도 쉽지 않으며 교차반응으로 인해 각각의 혈청형을 구분하기가 어렵다는 단점을 가지고 있다.

감염된 바이러스의 혈청형을 구분하는 일반적인 방법으로는 모기 혹은 세포 배양액을 통해 바이러스를 분리한 후 뎅기 바이러스 각 혈청형 특이적인 항체를 이용하여 면역형광법으로 분석하는 것이다. 그러나 바이러스 분리는 수일에서 수주가 소요되고, 검체의 부적절한 처리나 바이러스 항체 복합체 형성, 살아있는 바이러스의 낮은 카피수(copy number) 등으로 인해 검사 성공률이 매우 낮은 실정이다.

현재 뎅기열의 진단에 사용되는 방법은 ELISA에 의해 혈청에서 안티-뎅기 IgM 및 IgG의 혈청학적 검출에 기반을 두고 있다. 그러나 검체 시료 내에 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 등과 같은 유사 바이러스의 존재 시에는 중복 검출로 인해 진단 결과에 대한 신뢰도가 낮으며, 이러한 혈청학적 방법으로는 질병의 초기 단계에서 뎅기 바이러스의 감염을 검출할 수 없다는 단점이 있다.

최근에 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)이 신속하고 민감도가 높으며 간편하고, 정확하게 작동 시 재현성이 우수하다는 장점으로 인해 뎅기 바이러스를 비롯한 다수의 RNA 바이러스 검사를 위해 사용되고 있다. 비록 RT-PCR은 바이러스 분리 시스템과 유사한 민감성을 가지지만 일반적인 배양법에서처럼 서툰 조작이나 부적절한 시료 저장 상태, 항체로 인해 그 결과에 영향을 받지 않는다. 그러나 RT-PCR은 부적절한 프라이머 디자인 또는 PCR 조건, 그로 인한 비특이적 혼성화로 인해 나타나는 위-양성(false-positive) 결과가 문제시 되고 있다.
본 발명의 배경이 되는 기술은 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0028704호(2009.03.19)와 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0003989호(2008.01.09)에 개시되어 있다.

이에 본 발명자들은 뎅기열의 발병 초기에 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스를 신속하고 정확하게 동시에 검출할 수 있는 진단방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 뎅기 바이러스의 감염 초기에 나타나는 바이러스 항원인 NS1 유전자에 대해 각 혈청형의 뎅기 바이러스 별로 특이적인 프라이머 및 프로브를 고안하여 이들이 높은 민감도 및 정확도를 가지고 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스를 다중 실시간 RT-PCR에 의해 동시 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 4가지 혈청형 뎅기 바이러스 각각의 NS1 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브를 포함하는 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브를 포함하는 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 제공한다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 혼성화되어 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 프라이머는 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 핵산, 예컨대 뎅기 바이러스 타입 1(DENV 1), 타입 2(DENV 2), 타입 3(DENV 3) 및 타입 4(DENV 4)의 NS1 유전자에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명에서 용어 "바이러스 핵산"은 바이러스 게놈 자체뿐만 아니라 이로부터 유래되는 모든 RNA 또는 DNA(예컨대, cDNA)를 의미한다. 또한, 본 발명에서 용어 "바이러스 게놈" 역시 특별히 다르게 언급되지 않는 한 바이러스 핵산과 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에서 용어 "혼성화"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 일반적으로, 혼성화 온도가 높으면 완전한 매치일 경우에 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면 일부 미스매치가 존재하더라도 혼성화가 일어날 수 있다. 혼성화 온도가 낮으면 낮을수록 혼성화가 일어날 수 있는 미스매치의 정도는 증가할 것이다.

프라이머 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 족하다.

본 발명의 프라이머는 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 타입 1, 2, 3 및 4의 NS1 전장 유전자(full length nucleotide)에 특이적인 프라이머로, 바람직하게는 10개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 핵산으로 구성될 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예: 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예: ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예: 바이오틴) 등이 있다.

본 발명에서 프라이머는 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머를 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머이다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥(single stranded) DNA 프로브, 이중가닥(double stranded) DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명의 프로브는 그의 5' 말단 및 3' 말단에 각각 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 이러한 표지로 형광단(fluorophore) 및 소광체(quencher)가 각각 5' 및 3' 말단에 표지될 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 5'-UTR에 결합된 상태에서는 형광단 및 소광체 간의 상호 간섭현상에 의해 발색이 제한되고, 증폭 과정에서 프로브가 분해되면서 5' 말단에 표지된 형광단은 소실되는 반면 3' 말단에 표지된 소광체가 발색반응을 하게 된다. 이와 같은 발색반응에 의하여 시료로부터 뎅기 바이러스의 존부를 판단할 수 있게 된다.

상기 5' 말단에 표지될 수 있는 형광단은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5(Cyanine-5, Cy5), 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우(Yakima Yellow, YG), 칼 플루오르 레드 610(Cal Fluor Red 610, CFR) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 3' 말단에 표지될 수 있는 소광체 또한 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 테트라메틸 로다민, 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA), BHQ-1,2,3(black hole quencher-1,2,3), 4'-(4-다이메틸아미노페닐아조)벤조산, 4-다이메틸아미노페닐 아조페닐-4'-말레이미드 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

이처럼 형광물질이 표지된 프로브를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하고 그로부터 증폭된 산물을 검출하는 경우에 증폭된 산물의 증가를 실시간으로 모니터링할 수 있으므로 DNA 및 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며 오염의 위험이 적다는 이점을 갖는다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉, 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 변형될 수 있는데, 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화(capping), 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알칼리화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해, 포스포트리에스테르 방법, 디에틸포스포라미다이트 방법 및 미국특허 제 4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명에서 프라이머 및 프로브의 제조에 기본이 되는 서열은 공지된 뎅기 바이러스의 서열을 참조하여 선택된 것이다. 예를 들어, 뎅기 바이러스 타입 1은 GenBank 등재번호 NC_001477.1(서열번호: 13), 타입 2는 GenBank 등재번호 NC_001474.2(서열번호: 14), 타입 3은 GenBank 등재번호 NC_001475.2(서열번호: 15) 및 타입 4는 GenBank 등재번호 NC_002640.1(서열번호: 16)로 기재된 서열을 참조할 수 있다.

본 발명에서는 NCBI의 GenBank 데이터베이스에서 뎅기 바이러스의 각 혈청형별로 총 743개(타입 1 415개, 타입 2 226개, 타입 3 95개, 및 타입 4 7개)의 NS1 전장 유전자를 나열하여 각각의 혈청형과는 상동성이 없는 염기 서열 부위를 설정하였다. 이어서, 4가지 혈청형의 NS1 유전자와 상동성이 없도록 설정된 염기 서열 부위를 대상으로 각 혈청형별로 보고된 NS1 유전자 염기 서열에서 가장 안정적이며 각 개체별 변이가 가장 적은 부분을 설정하고, 이렇게 설정된 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작하였다. 이때, 동일한 플라비바이러스에 속하는 웨스트나일 바이러스, 일본뇌염 바이러스 및 치쿤구니야 바이러스와의 상동성을 검색하여 특이도가 높은 부위를 확인하였다.

바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명에서는 공지된 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 NS1 전장 유전자를 비교하여 다른 혈청형과는 유전자 상동성이 없는 부위를 선택하고 상기 선택된 부위에 특이적으로 혼성화되어 이를 증폭하고 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 제작하였다.

구체적으로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 댕기 바이러스의 유전자 중에서 4가지 혈청형의 NS1 유전자로서 5' 말단으로부터,

뎅기 바이러스 타입 1의 경우 서열번호: 13의 264번째부터 285번째까지의 염기 서열에 상응하는 정방향 프라이머 D1NS1F, 343번째부터 364번째까지의 염기 서열에 상응하는 역방향 프라이머 D1NS1R, 및 308번째부터 335번째까지의 염기 서열에 상응하는 프로브 D1NS1P로 구성될 수 있고;

뎅기 바이러스 타입 2의 경우 서열번호: 14의 278번째부터 299번째까지의 염기 서열에 상응하는 정방향 프라이머 D2NS1F, 397에서 416번째까지의 염기 서열에 상응하는 역방향 프라이머 D2NS1R, 및 311번째부터 338번째까지의 염기 서열에 상응하는 프로브 D2NS1P로 구성될 수 있으며;

뎅기 바이러스 타입 3은 서열번호: 15의 214에서 241번째까지의 염기 서열에 상응하는 정방향 프라이머 D3NS1F, 291에서 317번째까지의 염기 서열에 상응하는 역방향 프라이머 D3NS1R, 및 259에서 284번째까지의 염기 서열에 상응하는 프로브 D3NS1P로 구성될 수 있고;

뎅기 바이러스 타입 4는 서열번호: 16의 230번째부터 252번째까지의 염기 서열에 상응하는 정방향 프라이머 D4NS1F, 305번째부터 329번째까지의 염기 서열에 상응하는 역방향 프라이머 D4NS1R, 및 257번째부터 281번째까지의 염기 서열에 상응하는 프로브 D4NS1P로 구성될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

이렇게 제작된 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는

뎅기 바이러스 타입 1의 경우 서열번호: 1의 D1NS1F 및 서열번호: 2의 D1NS1R 프라이머와 서열번호: 9의 D1NS1P 프로브일 수 있고,

뎅기 바이러스 타입 2의 경우 서열번호: 3의 D2NS1F 및 서열번호: 4의 D2NS1R 프라이머와 서열번호: 10의 D2NS1P 프로브일 수 있으며,

뎅기 바이러스 타입 3의 경우 서열번호: 5의 D3NS1F 및 서열번호: 6의 D3NS1R 프라이머와 서열번호: 11의 D3NS1P 프로브일 수 있고,

뎅기 바이러스 타입 4의 경우 서열번호: 7의 D4NS1F 및 서열번호: 8의 D4NS1R 프라이머와 서열번호: 12의 D4NS1P 프로브일 수 있다.

상기 제작된 프라이머 D1NS1F, D1NS1R, D2NS1F, D2NS1R, D3NS1F, D3NS1R, D4NS1F 및 D4NS1R과, 프로브 D1NS1P, D2NS1P, D3NS1P 및 D4NS1P는 각각 GC 함량이 54.5%, 50%, 50%, 50%, 39.3%, 44.4%, 47.8%, 52%, 42.9%, 57.1%, 50%, 및 56%가 되도록 제작된다. 또한, 프로브 D1NS1P, D2NS1P, D3NS1P 및 D4NS1P의 5' 말단 각각에는 Fam, 야키마 옐로우(Yakima Yellow, YG), 칼 플루오르 레드(Cal Fluor Red 610, CAL), 및 Cy5가 표지되고, 프로브 D1NS1P 및 D2NS1P의 3' 말단에는 BHQ-1(Black Hole Quencher 1)이, 프로브 D3NS1P 및 D4NS1P의 3' 말단에는 BHQ-2가 표지된다.

이렇게 제작된 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 핵산에 매우 높은 특이성으로 혼성화되어 뎅기 바이러스를 증폭하고 검출하는데 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 뎅기 바이러스의 각 혈청형, 즉 타입 1, 타입 2, 타입 3 및 타입 4에 특이적으로 혼성화되도록 고안된 것으로서 시료에 어떠한 혈청형의 뎅기 바이러스가 존재하는지를 매우 높은 신뢰도로 타입핑(typing)할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 하나의 반응물에 포함되어 단일 증폭반응을 통해 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스를 검출할 수 있다. 예를 들어 다중 실시간 RT-PCR 과정에 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 사용하면 시료에 어떠한 혈청형의 뎅기 바이러스가 존재하는지 여부를 용이하고 신속하면서도 매우 높은 신뢰도로 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 포함하는 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물 또는 키트가 RT-PCR에 사용되는 경우, 선택적으로 RT-PCR을 수행하기 위한 증폭반응 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. RT-PCR을 수행하기 위한 증폭반응 혼합물이란 증폭반응을 수행하기에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), Mg²⁺와 같은 DNA 중합효소 조인자, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dGTP) 등을 포함할 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 조성물 및 키트는 다양한 폴리뉴클레오티드 분자, 역전사 효소, 다양한 완충액 및 시약, DNA 중합효소의 활성을 억제하는 저해제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물 및 키트는 음성 및 양성 대조군 반응을 수행하는데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적량은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물 및 키트는 서열번호: 1 내지 8로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하며, 이들은 뎅기 바이러스 타입 1, 타입 2, 타입 3 및 타입 4의 핵산을 다중(multiplex) 증폭할 수 있도록 고안된 프라이머이다. 상기 프라이머를 사용하여 다중 증폭반응을 수행하는 경우, 시료에 어떠한 혈청형의 뎅기 바이러스가 존재하는지를 매우 높은 신뢰도로 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물 및 키트는 서열번호: 9 내지 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 추가적으로 포함한다. 서열번호: 9 내지 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드는 뎅기 바이러스 타입 1 내지 4의 핵산을 공통적으로 검출할 수 있도록 고안된 프로브이다. 상기 프로브를 사용하여 다중 증폭반응을 수행하는 경우, 뎅기 바이러스의 혈청형을 구분하는 동시에 감염된 바이러스가 뎅기 바이러스가 확실하다는 이중 검증을 할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브, 이를 포함하는 조성물 또는 키트를 이용하여 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 감염 여부를 다중 동시 감별 진단하기 위한 정보 제공방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 정보 제공방법은

i) 서열번호: 1 내지 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호: 9 내지 12의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 증폭반응 혼합물을 제조하는 단계;

ⅱ) 상기에서 제조된 증폭반응 혼합물에 검체 RNA를 첨가하여 반응액을 제조하는 단계; 및

ⅲ) 상기에서 제조된 검체 RNA를 포함하는 반응액으로 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여 검체 내 뎅기 바이러스 핵산을 증폭하는 단계.

상기 단계 i)에서 서열번호: 1 내지 8의 프라이머 및 서열번호: 9 내지 12의 프로브는 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 NS1 유전자에 특이적으로 혼성화되어 검체 내 뎅기 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서, 이에 대한 상세한 설명은 앞서 언급된 바와 같다. 이들을 이용해 다중 실시간 RT-PCR을 실시하면 동일한 검체로부터 하나의 용기 내에서 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스를 동시에 진단 및 구분할 수 있으며, 뎅기 바이러스 감염 여부를 보다 확정적으로 진단할 수 있다.

단계 i)에서 증폭반응 혼합물은 서열번호: 1 내지 8의 프라이머 및 서열번호: 9 내지 12의 프로브에 더하여 증폭반응을 위한 기본적인 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 성분으로 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소, DNA 중합효소, Mg^{2 +}와 같은 조인자, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 완충액 등이 사용될 수 있다. 본 발명에서 증폭반응에 사용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 실제로, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

단계 ⅱ)에서 검체는 뎅기 바이러스의 감염 여부를 확인하기 위하여 단계 i)의 증폭반응 혼합물을 이용하여 뎅기 바이러스의 NS1 유전자 발현을 검출할 수 있는 생물학적 시료를 의미하는 것으로, 혈액, 혈청, 침 또는 가래와 같은 시료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

단계 ⅲ)에서는 서열번호: 1 내지 8의 프라이머 및 서열번호: 9 내지 12의 프로브를 포함하는 증폭반응 혼합물과 검체 RNA를 포함하는 반응액을 이용하여 다중 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계이다. 다중 실시간 RT-PCR을 수행함에 있어 상기 프라이머 및 프로브가 검체 RNA에 혼성화되기에 적합한 조건이 채용된다. 본 발명에서 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오티드의 길이 및 GC 함량, 표적 뉴클레오티드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y., 1999)에서 확인할 수 있다.

본 발명에서 혼성화는 표적 뉴클레오티드 서열과 프라이머 및 프로브 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건(즉, 분할 구역이 표적 서열에 수소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 혼성화를 위한 엄격 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 혼성화 온도는 54 내지 64℃이고, 바람직하게는 54 내지 60℃이고, 보다 바람직하게는 54 내지 56℃이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 다중 실시간 RT-PCR은 50℃에서 10분간 역전사(reverse transcription) 후, 95℃에서 5분간의 전-변성(pre-denaturation)에 이어서 95℃에서 15초간의 변성(denaturation), 56℃에서 30초간의 어닐링(annealing) 및 72℃에서 30초간의 신장(elongation)으로 구성된 사이클을 40회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 신장을 수행하여 이루어진다. 상기 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여 검체에 존재하는 뎅기 바이러스 핵산을 증폭한 후 이를 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하고 밴드를 확인한다.

한편, 본 발명의 방법에 있어서 다중 실시간 RT-PCR은 동일한 반응물에서 2 이상의 프라이머를 이용하여 하나 이상의 표적 서열을 동시에 증폭할 수 있다. 그러나 다중 실시간 RT-PCR로부터 얻은 결과는, 증폭 과정의 인위적 요소 때문에 종종 복잡하게 나오며, 이러한 오류의 결과는 반응 실패에 의한 위-음성 결과 및 가짜 생성물의 증폭과 같은 위-양성 결과를 포함한다. 따라서 이러한 오류를 줄이기 위하여 다중 실시간 RT-PCR의 반응 조건을 최적화하는 데 인력과 시간을 많이 소비하지만, 만족할만한 결과를 얻기는 극히 힘들다. 본 발명의 방법은 이러한 종래의 다중 실시간 RT-PCR의 문제점을 극복하여, 하나의 증폭반응 세트에서 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스를 동시에 오류 없이 증폭할 수 있다.

본 발명은 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 핵산에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브, 이들을 포함하는 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다. 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용하면 종래의 뎅기 바이러스 검출방법에서 발생할 수 있는 위-음성 및 위-양성 오류뿐만 아니라 배경산물의 문제점을 극복하면서 하나의 반응 용기에서 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 존재 여부뿐만 아니라 뎅기 바이러스 혈청형의 구분을 용이하고 신속하면서도 매우 높은 신뢰도로 수행할 수 있으므로, 뎅기 바이러스의 조기 감염 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 특이적 프라이머 및 프로브의 실시간 RT-PCR 증폭용 양성 대조군 주형 DNA의 클로닝 결과를 나타낸 것이다. 도 1에서 a)는 뎅기 바이러스 타입 1에 대한, b)는 뎅기 바이러스 타입 3에 대한, c)는 뎅기 바이러스 타입 4에 대한 양성 대조군 주형 DNA를 제한효소 분해 후에 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 2 내지 도 5는 본 발명에 따른 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 단단계(One step) 실시간 RT-PCR을 수행한 결과로, 도 2는 서열번호: 1 및 2의 프라이머 및 서열번호: 9의 프로브를 이용한 뎅기 바이러스 타입 1에 대한 결과이고, 도 3은 서열번호: 3 및 4의 프라이머 및 서열번호: 10의 프로브를 이용한 뎅기 바이러스 타입 2에 대한 결과이고, 도 4는 서열번호: 5 및 6의 프라이머 및 서열번호: 11의 프로브를 이용한 뎅기 바이러스 타입 3에 대한 결과이고, 도 5는 서열번호: 7 및 8의 프라이머 및 서열번호: 12의 프로브를 이용한 뎅기 바이러스 타입 4에 대한 결과이다. 도 2 내지 도 5에서 a)는 증폭 산물의 증가에 따라 나타나는 형광체의 신호 증가를 나타내고, b)는 10배씩 희석된 주형 RNA 시료에 따라 실시간 RT-PCR을 수행한 결과를 보여주는 표준 곡선(standard cure)을 나타내며, c)는 각 농도별 주형 RNA 시료로 RT-PCR을 수행하여 얻어진 Ct 값을 나타내고, d)는 해당 실시간 RT-PCR로부터 수득된 최종 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 다중(Multiplex) 실시간 RT-PCR을 수행한 결과로, 서열번호: 1 내지 8의 프라이머 및 서열번호: 9 내지 12의 프로브를 모두를 이용한 결과이다. 도 6에서 a)는 각 혈청형별 증폭 산물의 증가에 따라 나타나는 서로 다른 형광체의 신호 증가를 나타내고, b)는 각 농도별 주형 RNA 시료로 다중(Mutiplex) 실시간 RT-PCR을 수행하여 얻어진 혈청형 각각의 Ct 값을 나타내며, c)는 해당 다중 실시간 RT-PCR로부터 수득된 최종 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 다중 실시간 RT-PCR 진단의 임상적 유용성을 항-뎅기 혼합 역가 성능 패널(Anti-dengue mixed titer performance panel)을 이용하여 평가한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1: 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브 제작

공지된 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 NS1 전장 유전자를 비교하여 다른 혈청형과 유전자 상동성이 없는 부위의 영역을 선택하고 상기 선택된 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 D1NS1F, D1NS1R, D2NS1F, D2NS1R, D3NS1F, D3NS1R, D4NS1F 및 D4NS1R와 이 부위에 특이적으로 혼성화되는 프로브 D1NS1P, D2NS1P, D3NS1P 및 D4NS1P를 제작하였다.

프라이머 및 프로브 제작을 위하여, 뎅기 바이러스 타입 1은 GenBank 등재번호 NC_001477.1(서열번호: 13), 타입 2는 GenBank 등재번호 NC_001474.2(서열번호: 14), 타입 3은 GenBank 등재번호 NC_001475.2(서열번호: 15) 및 타입 4는 GenBank 등재번호 NC_002640.1(서열번호: 16)로 기재된 서열을 참조하였다.

뎅기 바이러스 타입 1의 경우, 서열번호: 13으로 기재되는 NS1 유전자의 5' 말단으로부터 264번째부터 285번째까지의 염기 서열에 상응하는 정방향 프라이머 D1NS1F, 343번째부터 364번째까지의 염기 서열에 상응하는 역방향 프라이머 D1NS1R, 및 308번째부터 335번째까지의 염기 서열에 상응하는 프로브 D1NS1P를 제작하였다. 뎅기 바이러스 타입 1에 특이적인 프라이머 D1NS1F 및 D1NS1R은 서열번호: 1 및 2의 염기 서열을, 프로브 D1NS1P는 서열번호: 9의 염기 서열을 갖는다. 또한, 이렇게 제작된 프라이머 D1NS1F 및 D1NS1R의 GC 함량은 각각 54.5% 및 50%이고, 프로브 D1NS1P의 GC 함량은 42.9%이다.

뎅기 바이러스 타입 2의 경우, 서열번호: 14로 기재되는 NS1 유전자의 5' 말단으로부터 278번째부터 299번째까지의 염기 서열에 상응하는 정방향 프라이머 D2NS1F, 397번째부터 416번째까지의 염기 서열에 상응하는 역방향 프라이머 D2NS1R, 및 311번째부터 338번째까지의 염기 서열에 상응하는 프로브 D2NS1P를 제작하였다. 뎅기 바이러스 타입 2에 특이적인 프라이머 D2NS1F 및 D2NS1R은 서열번호: 3 및 4의 염기 서열을, 프로브 D2NS1P는 서열번호: 10의 염기 서열을 갖는다. 또한, 이렇게 제작된 프라이머 D2NS1F 및 D2NS1R의 GC 함량은 모두 50%이고, 프로브 D1NS1P의 GC 함량은 57.1%이다.

뎅기 바이러스 타입 3의 경우, 서열번호: 15로 기재되는 NS1 유전자의 5' 말단으로부터 214번째부터 241번째까지의 염기 서열에 상응하는 정방향 프라이머 D3NS1F, 291번째부터 317번째까지의 염기 서열에 상응하는 역방향 프라이머 D3NS1R, 및 259번째부터 284번째까지의 염기 서열에 상응하는 프로브 D3NS1P를 제작하였다. 뎅기 바이러스 타입 3에 특이적인 프라이머 D3NS1F 및 D3NS1R은 서열번호: 5 및 6의 염기 서열을, 프로브 D3NS1P는 서열번호: 11의 염기 서열을 갖는다. 또한, 이렇게 제작된 프라이머 D3NS1F 및 D3NS1R의 GC 함량은 각각 39.3% 및 44.4%이고, 프로브 D3NS1P의 GC 함량은 50%이다.

뎅기 바이러스 타입 4의 경우, 서열번호: 16으로 기재되는 NS1 유전자의 5' 말단으로부터 230번째부터 252번째까지의 염기 서열에 상응하는 정방향 프라이머 D4NS1F, 305번째부터 329번째까지의 염기 서열에 상응하는 역방향 프라이머 D4NS1R, 및 257번째부터 281번째까지의 염기 서열에 상응하는 프로브 D4NS1P를 제작하였다. 뎅기 바이러스 타입 4에 특이적인 프라이머 D4NS1F 및 D4NS1R은 서열번호: 7 및 8의 염기 서열을, 프로브 D4NS1P는 서열번호: 12의 염기 서열을 갖는다. 또한, 이렇게 제작된 프라이머 D4NS1F 및 D4NS1R의 GC 함량은 각각 47.8% 및 52%이고, 프로브 D4NS1P의 GC 함량은 56%이다.

또한, 상기와 같이 제작된 프로브 D1NS1P, D2NS1P, D3NS1P 및 D4NS1P의 5' 말단 각각에는 형광단으로 Fam, 야키마 옐로우(Yakima Yellow, YG), 칼 플루오르 레드(Cal Fluor Red 610, CAL), 및 Cy5를 표지하였고, 소광체로 프로브 D1NS1P 및 D2NS1P의 3' 말단에는 BHQ-1(Black Hole Quencher 1)을, 프로브 D3NS1P 및 D4NS1P의 3' 말단에는 BHQ-2를 표지하였다.

본 발명에 따라 제작된 상기 서열번호: 1 내지 8의 프라이머 및 서열번호: 9 내지 12의 프로브의 염기 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

	염기 서열	서열번호
D1NS1F	5'-TTGTAGGAGATGTTGCTGGG-3'	1
D1NS1R	5'-TAGCCTTTCCCCAGCTTTTCCA-3'	2
D2NS1F	5'-TCAAAGGAATCATGCAGGCAGG-3'	3
D2NS1R	5'-TCGGGGCCATCAATGAGAAA-3'	4
D3NS1F	5'-GCCAATGAACTGAACTACATATTATGGG-3'	5
D3NS1R	5'-GGTGTTAGTGTTCTTTTCCCTTGCTCT-3'	6
D4NS1F	5'-ATGTTCTCTGGGAAGGAGGACAT-3'	7
D4NS1R	5'-TCATTCACTGGAGGTGTGAGTGCTC-3'	8
D1NS1P*	5'-FAM-TGATTAGGCCACAACCCATGGAATACAA-BHQ1-3'	9
D2NS1P*	5'-YG-TGCGGCCTCAGCCCACTGAGCTAAAGTA-BHQ1-3'	10
D3NS1P*	5'-CFR-ACGGTAGTTGTGGGCGACATAATTGG-BHQ2-3'	11
D4NS1P*	5'-Cy5-TCACTGTAGTGGCTGGGGACGTGAA-BHQ2-3'	12

^*상기 표 1에서 프로브 D1NS1P 내지 D4NS1P는 실제로 형광단-서열번호: 9 내지 12-소광체의 구조를 가지나, 편의상 형광단과 소광체를 모두 포함하여 서열번호로 기재한다.

실시예 2: 뎅기 바이러스 RNA 및 cDNA 의 준비

상기 실시예 1에서 제작된 프라이머를 이용한 실시간 PCR을 통해 증폭되는 염기 서열 부위를 양성 대조군으로 사용하고자 각 해당 부분의 주형 DNA를 합성하고(COSMO GENETEC, Korea), 합성된 주형 DNA를 pUC57 플라스미드에 클로닝하여 각 혈청형 특이적인 양성 대조군 DNA 주형을 제조하였다. 상기 혈청형 특이적인 양성 대조군 DNA 주형을 제한효소 BamHI 및 SalI으로 처리한 후 아가로스 겔에 전기영동하여 합성된 주형 DNA가 올바르게 클로닝되었음을 확인하였다(도 1)

제한효소 BamHI/SalI 처리에 의해 분리된 주형 DNA 단편을 pGEM-T 이지 벡터 시스템(pGEM-T Easy Vector Systems, Promega, USA)에 클로닝한 후 클로닝된 벡터와 RNA 제조 시스템(RiboMAX^TM Large Scale RNA Production System-T7, Promega, USA)을 이용하여 인 비트로 전사(in vitro transcription)를 수행하였다. 이로부터 뎅기 바이러스의 NS1 유전자 영역의 RNA를 합성하였고 분광광도계(spectrophotometer)를 이용해 정량한 후 카피수로 환산하여 주형 RNA 시료를 완성하였다.

실시예 3: 단단계 ( one - step ) 실시간 RT - PCR

상기 실시예 1에서 제작된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 이용하여 각각이 표적하는 혈청형의 뎅기 바이러스 핵산을 선택적으로 증폭하는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 단단계 실시간 RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, 서열번호: 1 내지 8의 프라이머는 각각 0.3 μM의 농도로 사용하고, 서열번호: 9 내지 12의 프로브의 경우 D1NS1P는 0.2 μM, D2NS1P 및 D4NS1P는 0.3 μM, D3NS1P는 0.15 μM의 농도로 사용하였다. 상기 실시예 2에서 준비된 주형 RNA 시료를 10¹⁰ 내지 10⁰ 카피수의 농도로 단계 희석하여 사용하였다. 상기와 같은 농도의 RNA 시료 2 ㎕, 상기와 같은 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 각각 0.5 ㎕, 상기와 같은 농도의 프로브 0.5 ㎕, dNTP(각각 2 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 0.2 ㎕, 25 mM MgCl₂ 1.5 ㎕, Taq DNA 폴리머라제 2.5 유닛, 역전사효소 2 유닛, 및 1× PCR 완충액(10 ml Tris-HCl, pH 8.3, 50 ml KCl)을 포함하는 최종 20 ㎕의 반응 혼합물을 사용하여 단단계 실시간 RT-PCR을 실시하였다.

또한, 단일 실시간 RT-PCR은 50℃에서 10분간 역전사 후, 95℃에서 5분간 전변성에 이어서 95℃에서 15초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 30초간 신장 과정을 40회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 신장을 수행하는 조건으로 바이오-라드 실시간 RCR 기기(CFX96 Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다. 각각의 반응은 음성 대조군으로서 증류수를 주형으로 사용하였고, 이중으로 수행하였다.

이때, 각각의 혈청별 PCR 반응의 최저 검출 농도를 확인하기 위하여 서열번호: 1 내지 8의 프라이머와 서열번호: 9 내지 12의 프로브 모두를 혼합한 상태에서 각각의 혈청형 뎅기 바이러스 주형 RNA를 단계 희석된 농도로 첨가하고 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 산물을 EtBr을 포함하는 아가로스 겔에 전기영동하고, 나타난 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 2 내지 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 특이적으로 뎅기 바이러스 타입 1 내지 4의 표적 핵산을 증폭하고 있음을 알 수 있다. 구체적으로, 서열번호: 1 및 2의 프라이머 및 서열번호: 9의 프로브를 이용한 RT-PCR은 뎅기 바이러스 타입 1의 핵산을 특이적으로 증폭하였고(도 2), 서열번호: 3 및 4의 프라이머 및 서열번호: 10의 프로브를 이용한 RT-PCR은 뎅기 바이러스 타입 2의 핵산을 특이적으로 증폭하였으며(도 3), 서열번호: 5 및 6의 프라이머 및 서열번호: 11의 프로브를 이용한 RT-PCR은 뎅기 바이러스 타입 3의 핵산을 특이적으로 증폭하였고(도 4), 서열번호: 7 및 8의 프라이머 및 서열번호: 12의 프로브를 이용한 RT-PCR은 뎅기 바이러스 타입 4의 핵산을 특이적으로 증폭하였다(도 5). 또한, 단단계 RT-PCR의 진단 민감도는 뎅기 바이러스 타입 1에 대해서는 10³ RNA 카피수, 뎅기 바이러스 타입 2 내지 4에 대해서는 모두 10² RNA 카피수로 나타났다.

실시예 4: 다중( multiplex ) 실시간 RT - PCR

상기 실시예 1에서 제작된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브 전부를 이용하여 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스의 다중 동시 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 서열번호: 1 내지 8의 프라이머와 서열번호: 9 내지 12의 프로브 모두를 혼합한 상태에서 각각의 혈청형 뎅기 바이러스 주형 RNA 모두를 단계 희석된 농도로 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3에 기재된 방법에 따라 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 산물을 EtBr을 포함하는 아가로스 겔에 전기영동하고, 나타난 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 및 프로브는 다중 RT-PCR의 조건에서도 위-양성 및 위-음성 오류 없이 뎅기 바이러스의 혈청형을 정확히 구분해 내었고, 뎅기 바이러스의 핵산을 다중 RT-PCR 조건에서 선택적으로 증폭할 수 있음을 확인하였다. 또한, 다중 RT-PCR의 진단 민감도는 뎅기 바이러스 타입 1에 대해서는 10³ RNA 카피수, 뎅기 바이러스 타입 2에 대해서는 10² RNA 카피수, 뎅기 바이러스 타입 3에 대해서는 10⁰ RNA 카피수, 및 뎅기 바이러스 타입 4에 대해서는 10¹ RNA 카피수로 나타났다.

따라서 뎅기 바이러스 감염이 의심되는 환자의 경우 뎅기 바이러스 검출과 뎅기 바이러스 혈청형의 구분을 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 PCR 기반 기술의 프라이머로서 뿐만 아니라 마이크로어레이 기반 기술에서 뎅기열 병원체를 검출하는 프로브로도 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 5: 다중 실시간 RT - PCR 의 임상적 유용성 평가

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 이용한 다중 실시간 RT-PCR 진단의 임상적 유용성을 평가하기 위하여, WHO나 CDC와 같은 국제기관에서 표준으로 사용한 바 있는 임상 시료인 항-뎅기 혼합 역가 성능 패널(Anti-dengue mixed titer performance panel, SeraCare Life Science)을 사용하였다. 상기 패널은 다양한 검사 키트(예컨대, Calbiotech Dengue Virue IgM or IgG ELISA, EUROIMMUN Anti-Dengue Virus IgM or IgG ELISA, Focuse Dengue Virus IgM or IgG DxSelect, Panbio Dengue IgM or IgG Capture ELISA, SD Dengue IgM or IgG ELISA, Panbio Dengue DuoCassette Rapid test 및 BIOLINE Dengue Duo (NS1 Ag+Ab combo) Rapid test)의 IgM과 IgG 항체반응을 통해 뎅기 바이러스의 감염이 검증된 것으로, 혈액 감염에서 자주 나타나는 HIV, HBV 및 HCV 감염에 대해서는 음성으로 확인되었다. 이 패널을 대상으로 본 발명에 따른 서열번호: 1 내지 8의 프라이머 및 서열번호: 9 내지 12의 프로브를 사용하여 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 다중 실시간 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용한 다중 실시간 RT-PCR에 의해서는 20개의 시료가 양성으로 확인되어 95.23%의 진단 민감도를 나타내었다.

	뎅기 바이러스 혈청형
시료	타입 1(FAM)	타입 2(YAC)	타입 3(Cal Red)	타입 4(Cy5)
PVD201-01	NA	NA	NA	36.47, 33.11
PVD201-02	NA	NA	NA	29.47, 33.61
PVD201-03	NA	NA	NA	39.39
PVD201-04	NA	NA	NA	NA
PVD201-05	NA	NA	NA	37.75
PVD201-06	NA	NA	NA	18.82, 27.92
PVD201-07	NA	NA	28.79	28.43, 36.98
PVD201-08	NA	NA	NA	25.18, 24.88
PVD201-09	NA	NA	27.95, 31.08	25.92, 29.22
PVD201-10	NA	31.60, 31.31	32.25, 30.78	31.69, 30.80
PVD201-11	34.74	NA	NA	NA
PVD201-12	32.74, 33.69	NA	NA	NA
PVD201-13	31.67, 39.30	NA	NA	NA
PVD201-14	NA	NA	NA	30.18, 33.64
PVD201-15	NA	31.60, 31.31	36.37, 38.95	31.37, 32.15
PVD201-16	NA	NA	23.21, 24.54	NA
PVD201-17	NA	NA	16.01, 10.84	NA
PVD201-18	32.53	NA	NA	NA
PVD201-19	NA	NA	NA	39.91
PVD201-20	33.23	NA	NA	NA
PVD201-21	28.72	NA	NA	10.88, 18.11
NA	NA	NA	NA	NA
양성으로 진단된 시료의 개수	6	2	6	13
혼합 감염	5

상기 표 2에서, 시료 PVD201-4는 다양한 면역 진단 검사 결과에서도 음성으로 확인되었고 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브에 의한 다중 실시간 RT-PCR에 의해서도 음성으로 확인되었으므로, 이 시료가 뎅기 바이러스 음성일 경우를 고려하면 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 사용한 다중 실시간 RT-PCR 방법의 진단 민감도는 100%에 이른다.

뿐만 아니라 면역학적 방법으로는 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 감염(mixed infection)을 동시에 감별 진단할 수 없으나, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용한 다중 실시간 RT-PCR 진단법에 의해서는 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스의 동시 검출이 가능하여 이들의 혼합 감염을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 상기 패널의 임상 시료는 모두 면역학적 방법으로 검증된 것으로서, 특히 감염 초기 진단의 척도가 되는 IgM 항체 반응에 대해 양성으로 나온 시료는 5~10개 정도로 나타났다. 또한 바이러스 감염 후 가장 초기에 나타나는 것으로 알려진 바이러스의 NS1 항원에 대한 면역반응은 모두 음성으로 나타났다. 그러나 NS1 항원을 표적하여 제작된 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용한 다중 실시간 RT-PCR 방법을 사용하면 총 21개 시료 중 하나의 시료(PVD201-4)를 제외하고는 20개가 뎅기 바이러스에 대해 양성으로 진단되어 면역학적 방법으로 놓칠 수 있는 초기 뎅기 바이러스의 감염을 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있다.

상기 결과들은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 이용하면 종래의 면역학적 방법에서 발생할 수 있는 위-음성 및 위-양성 오류뿐만 아니라 배경산물의 문제점을 유발하지 않으면서 뎅기 바이러스 감염을 초기에 진단할 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 사용한 다중 실시간 RT-PCR 진단법은 하나의 PCR 반응 세트에서 뎅기 바이러스의 존재 여부는 물론 4가지 혈청형의 구분을 용이하고 신속하면서도 매우 높은 신뢰도로 동시에 확인할 수 있다.

<110> Wonkwang University Center For Industry-Academy Cooperation <120> Oligonucleotides and use thereof for simultaneous multiplex diagnosis of 4 serotypes of dangue virus <130> PA130585 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus type 1 specific forward primer D1NS1F <400> 1 ttgtaggaga tgttgctggg 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus type 1 specific reverse primer D1NS1R <400> 2 tagcctttcc ccagcttttc ca 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus type 2 specific forward primer D2NS1F <400> 3 tcaaaggaat catgcaggca gg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus type 2 specific reverse primer D2NS1R <400> 4 tcggggccat caatgagaaa 20 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue virus type 3 specific forward primer D3NS1F <400> 5 gccaatgaac tgaactacat attatggg 28 <210> 6 <211> 27 <212> 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<400> 12 tcactgtagt ggctggggac gtgaa 25 <210> 13 <211> 10179 <212> DNA <213> Dengue virus type 1, complete genome <400> 13 atgaacaacc aacggaaaaa gacgggtcga ccgtctttca atatgctgaa acgcgcgaga 60 aaccgcgtgt caactgtttc acagttggcg aagagattct caaaaggatt gctttcaggc 120 caaggaccca tgaaattggt gatggctttt atagcattcc taagatttct agccatacct 180 ccaacagcag gaattttggc tagatggggc tcattcaaga agaatggagc gatcaaagtg 240 ttacggggtt tcaagaaaga aatctcaaac atgttgaaca taatgaacag gaggaaaaga 300 tctgtgacca tgctcctcat gctgctgccc acagccctgg cgttccatct gaccacccga 360 gggggagagc cgcacatgat agttagcaag caggaaagag gaaaatcact tttgtttaag 420 acctctgcag gtgtcaacat gtgcaccctt attgcaatgg atttgggaga gttatgtgag 480 gacacaatga cctacaaatg cccccggatc actgagacgg aaccagatga cgttgactgt 540 tggtgcaatg ccacggagac atgggtgacc tatggaacat gttctcaaac tggtgaacac 600 cgacgagaca aacgttccgt cgcactggca ccacacgtag ggcttggtct agaaacaaga 660 accgaaacgt ggatgtcctc tgaaggcgct tggaaacaaa tacaaaaagt ggagacctgg 720 gctctgagac acccaggatt cacggtgata gccctttttc tagcacatgc cataggaaca 780 tccatcaccc agaaagggat catttttatt ttgctgatgc tggtaactcc atccatggcc 840 atgcggtgcg tgggaatagg caacagagac ttcgtggaag gactgtcagg agctacgtgg 900 gtggatgtgg tactggagca tggaagttgc gtcactacca tggcaaaaga caaaccaaca 960 ctggacattg aactcttgaa gacggaggtc acaaaccctg ccgtcctgcg caaactgtgc 1020 attgaagcta aaatatcaaa caccaccacc gattcgagat gtccaacaca aggagaagcc 1080 acgctggtgg aagaacagga cacgaacttt gtgtgtcgac gaacgttcgt ggacagaggc 1140 tggggcaatg gttgtgggct attcggaaaa ggtagcttaa taacgtgtgc taagtttaag 1200 tgtgtgacaa aactggaagg aaagatagtc caatatgaaa acttaaaata ttcagtgata 1260 gtcaccgtac acactggaga ccagcaccaa gttggaaatg agaccacaga acatggaaca 1320 actgcaacca taacacctca agctcccacg tcggaaatac agctgacaga ctacggagct 1380 ctaacattgg attgttcacc tagaacaggg ctagacttta atgagatggt gttgttgaca 1440 atgaaaaaaa aatcatggct cgtccacaaa caatggtttc tagacttacc actgccttgg 1500 acctcggggg cttcaacatc ccaagagact tggaatagac aagacttgct ggtcacattt 1560 aagacagctc atgcaaaaaa gcaggaagta gtcgtactag gatcacaaga aggagcaatg 1620 cacactgcgt tgactggagc gacagaaatc caaacgtctg gaacgacaac aatttttgca 1680 ggacacctga aatgcagatt aaaaatggat aaactgattt taaaagggat gtcatatgta 1740 atgtgcacag ggtcattcaa gttagagaag gaagtggctg agacccagca tggaactgtt 1800 ctagtgcagg ttaaatacga aggaacagat gcaccatgca agatcccctt ctcgtcccaa 1860 gatgagaagg gagtaaccca gaatgggaga ttgataacag ccaaccccat agtcactgac 1920 aaagaaaaac cagtcaacat tgaagcggag ccaccttttg gtgagagcta cattgtggta 1980 ggagcaggtg aaaaagcttt gaaactaagc tggttcaaga agggaagcag tatagggaaa 2040 atgtttgaag caactgcccg tggagcacga aggatggcca tcctgggaga cactgcatgg 2100 gacttcggtt ctataggagg ggtgttcacg tctgtgggaa aactgataca ccagattttt 2160 gggactgcgt atggagtttt gttcagcggt gtttcttgga ccatgaagat aggaataggg 2220 attctgctga catggctagg attaaactca aggagcacgt ccctttcaat gacgtgtatc 2280 gcagttggca tggtcacact gtacctagga gtcatggttc aggcggactc gggatgtgta 2340 atcaactgga aaggcagaga actcaaatgt ggaagcggca tttttgtcac caatgaagtc 2400 cacacctgga cagagcaata taaattccag gccgactccc ctaagagact atcagcggcc 2460 attgggaagg catgggagga gggtgtgtgt ggaattcgat cagccactcg tctcgagaac 2520 atcatgtgga agcaaatatc aaatgaatta aaccacatct tacttgaaaa tgacatgaaa 2580 tttacagtgg tcgtaggaga cgttagtgga atcttggccc aaggaaagaa aatgattagg 2640 ccacaaccca tggaacacaa atactcgtgg aaaagctggg gaaaagccaa aatcatagga 2700 gcagatgtac agaataccac cttcatcatc gacggcccaa acaccccaga atgccctgat 2760 aaccaaagag catggaacat ttgggaagtt gaagactatg gatttggaat tttcacgaca 2820 aacatatggt tgaaattgcg tgactcctac actcaagtgt gtgaccaccg gctaatgtca 2880 gctgccatca aggatagcaa agcagtccat gctgacatgg ggtactggat agaaagtgaa 2940 aagaacgaga cttggaagtt ggcaagagcc tccttcatag aagttaagac atgcatctgg 3000 ccaaaatccc acactctatg gagcaatgga gtcctggaaa gtgagatgat aatcccaaag 3060 atatatggag gaccaatatc tcagcacaac tacagaccag gatatttcac acaaacagca 3120 gggccgtggc acttgggcaa gttagaacta gattttgatt tatgtgaagg taccactgtt 3180 gttgtggatg aacattgtgg aaatcgagga ccatctctta gaaccacaac agtcacagga 3240 aagacaatcc atgaatggtg ctgtagatct tgcacgttac cccccctacg tttcaaagga 3300 gaagacgggt gctggtacgg catggaaatc agaccagtca aggagaagga agagaaccta 3360 gttaagtcaa tggtctctgc agggtcagga gaagtggaca gtttttcact aggactgcta 3420 tgcatatcaa taatgatcga agaggtaatg agatccagat ggagcagaaa aatgctgatg 3480 actggaacat tggctgtgtt cctccttctc acaatgggac aattgacatg gaatgatctg 3540 atcaggctat gtatcatggt tggagccaac gcttcagaca agatggggat gggaacaacg 3600 tacctagctt tgatggccac tttcagaatg agaccaatgt tcgcagtcgg gctactgttt 3660 cgcagattaa catctagaga agttcttctt cttacagttg gattgagtct ggtggcatct 3720 gtagaactac caaattcctt agaggagcta ggggatggac ttgcaatggg catcatgatg 3780 ttgaaattac tgactgattt tcagtcacat cagctatggg ctaccttgct gtctttaaca 3840 tttgtcaaaa caactttttc attgcactat gcatggaaga caatggctat gatactgtca 3900 attgtatctc tcttcccttt atgcctgtcc acgacttctc aaaaaacaac atggcttccg 3960 gtgttgctgg gatctcttgg atgcaaacca ctaaccatgt ttcttataac agaaaacaaa 4020 atctggggaa ggaaaagctg gcctctcaat gaaggaatta tggctgttgg aatagttagc 4080 attcttctaa gttcacttct caagaatgat gtgccactag ctggcccact aatagctgga 4140 ggcatgctaa tagcatgtta tgtcatatct ggaagctcgg ccgatttatc actggagaaa 4200 gcggctgagg tctcctggga agaagaagca gaacactctg gtgcctcaca caacatacta 4260 gtggaggtcc aagatgatgg aaccatgaag ataaaggatg aagagagaga tgacacactc 4320 accattctcc tcaaagcaac tctgctagca atctcagggg tatacccaat gtcaataccg 4380 gcgaccctct ttgtgtggta tttttggcag aaaaagaaac agagatcagg agtgctatgg 4440 gacacaccca gccctccaga agtggaaaga gcagtccttg atgatggcat ttatagaatt 4500 ctccaaagag gattgttggg caggtctcaa gtaggagtag gagtttttca agaaggcgtg 4560 ttccacacaa tgtggcacgt caccagggga gctgtcctca tgtaccaagg gaagagactg 4620 gaaccaagtt gggccagtgt caaaaaagac ttgatctcat atggaggagg ttggaggttt 4680 caaggatcct ggaacgcggg agaagaagtg caggtgattg ctgttgaacc ggggaagaac 4740 cccaaaaatg tacagacagc gccgggtacc ttcaagaccc ctgaaggcga agttggagcc 4800 atagctctag actttaaacc cggcacatct ggatctccta tcgtgaacag agagggaaaa 4860 atagtaggtc tttatggaaa tggagtggtg acaacaagtg gtacctacgt cagtgccata 4920 gctcaagcta aagcatcaca agaagggcct ctaccagaga ttgaggacga ggtgtttagg 4980 aaaagaaact taacaataat ggacctacat ccaggatcgg gaaaaacaag aagatacctt 5040 ccagccatag tccgtgaggc cataaaaaga aagctgcgca cgctagtctt agctcccaca 5100 agagttgtcg cttctgaaat ggcagaggcg ctcaagggaa tgccaataag gtatcagaca 5160 acagcagtga agagtgaaca cacgggaaag gagatagttg accttatgtg tcacgccact 5220 ttcactatgc gtctcctgtc tcctgtgaga gttcccaatt ataatatgat tatcatggat 5280 gaagcacatt ttaccgatcc agccagcata gcagccagag ggtatatctc aacccgagtg 5340 ggtatgggtg aagcagctgc gattttcatg acagccactc cccccggatc ggtggaggcc 5400 tttccacaga gcaatgcagt tatccaagat gaggaaagag acattcctga aagatcatgg 5460 aactcaggct atgactggat cactgatttc ccaggtaaaa cagtctggtt tgttccaagc 5520 atcaaatcag gaaatgacat tgccaactgt ttaagaaaga atgggaaacg ggtggtccaa 5580 ttgagcagaa aaacttttga cactgagtac cagaaaacaa aaaataacga ctgggactat 5640 gttgtcacaa cagacatatc cgaaatggga gcaaacttcc gagccgacag ggtaatagac 5700 ccgaggcggt gcctgaaacc ggtaatacta aaagatggcc cagagcgtgt cattctagcc 5760 ggaccgatgc cagtgactgt ggctagcgcc gcccagagga gaggaagaat tggaaggaac 5820 caaaataagg aaggcgatca gtatatttac atgggacagc ctctaaacaa tgatgaggac 5880 cacgcccatt ggacagaagc aaaaatgctc cttgacaaca taaacacacc agaagggatt 5940 atcccagccc tctttgagcc ggagagagaa aagagtgcag caatagacgg ggaatacaga 6000 ctacggggtg aagcgaggaa aacgttcgtg gagctcatga gaagaggaga tctacctgtc 6060 tggctatcct acaaagttgc ctcagaaggc ttccagtact ccgacagaag gtggtgcttt 6120 gatggggaaa ggaacaacca ggtgttggag gagaacatgg acgtggagat ctggacaaaa 6180 gaaggagaaa gaaagaaact acgaccccgc tggctggatg ccagaacata ctctgaccca 6240 ctggctctgc gcgaattcaa agagttcgca gcaggaagaa gaagcgtctc aggtgaccta 6300 atattagaaa tagggaaact tccacaacat ttaacgcaaa gggcccagaa cgccttggac 6360 aatctggtta tgttgcacaa ctctgaacaa ggaggaaaag cctatagaca cgccatggaa 6420 gaactaccag acaccataga aacgttaatg ctcctagctt tgatagctgt gctgactggt 6480 ggagtgacgt tgttcttcct atcaggaagg ggtctaggaa aaacatccat tggcctactc 6540 tgcgtgattg cctcaagtgc actgttatgg atggccagtg tggaacccca ttggatagcg 6600 gcctctatca tactggagtt ctttctgatg gtgttgctta ttccagagcc ggacagacag 6660 cgcactccac aagacaacca gctagcatac gtggtgatag gtctgttatt catgatattg 6720 acagtggcag ccaatgagat gggattactg gaaaccacaa agaaggacct ggggattggt 6780 catgcagctg ctgaaaacca ccatcatgct gcaatgctgg acgtagacct acatccagct 6840 tcagcctgga ctctctatgc agtggccaca acaattatca ctcccatgat gagacacaca 6900 attgaaaaca caacggcaaa tatttccctg acagctattg caaaccaggc agctatattg 6960 atgggacttg acaagggatg gccaatatca aagatggaca taggagttcc acttctcgcc 7020 ttggggtgct attctcaggt gaacccgctg acgctgacag cggcggtatt gatgctagtg 7080 gctcattatg ccataattgg acccggactg caagcaaaag ctactagaga agctcaaaaa 7140 aggacagcag ccggaataat gaaaaaccca actgtcgacg ggatcgttgc aatagatttg 7200 gaccctgtgg tttacgatgc aaaatttgaa aaacagctag gccaaataat gttgttgata 7260 ctttgcacat cacagatcct cctgatgcgg accacatggg ccttgtgtga atccatcaca 7320 ctagccactg gacctctgac tacgctttgg gagggatctc caggaaaatt ctggaacacc 7380 acgatagcgg tgtccatggc aaacattttt aggggaagtt atctagcagg agcaggtctg 7440 gccttttcat taatgaaatc tctaggagga ggtaggagag gcacgggagc ccaaggggaa 7500 acactgggag aaaaatggaa aagacagcta aaccaattga gcaagtcaga attcaacact 7560 tacaaaagga gtgggattat agaggtggat agatctgaag ccaaagaggg gttaaaaaga 7620 ggagaaacga ctaaacacgc agtgtcgaga ggaacggcca aactgaggtg gtttgtggag 7680 aggaaccttg tgaaaccaga agggaaagtc atagacctcg gttgtggaag aggtggctgg 7740 tcatattatt gcgctgggct gaagaaagtc acagaagtga aaggatacac gaaaggagga 7800 cctggacatg aggaaccaat cccaatggca acctatggat ggaacctagt aaagctatac 7860 tccgggaaag atgtattctt tacaccacct gagaaatgtg acaccctctt gtgtgatatt 7920 ggtgagtcct ctccgaaccc aactatagaa gaaggaagaa cgttacgtgt tctaaagatg 7980 gtggaaccat ggctcagagg aaaccaattt tgcataaaaa ttctaaatcc ctatatgccg 8040 agtgtggtag aaactttgga gcaaatgcaa agaaaacatg gaggaatgct agtgcgaaat 8100 ccactctcaa gaaactccac tcatgaaatg tactgggttt catgtggaac aggaaacatt 8160 gtgtcagcag taaacatgac atctagaatg ctgctaaatc gattcacaat ggctcacagg 8220 aagccaacat atgaaagaga cgtggactta ggcgctggaa caagacatgt ggcagtagaa 8280 ccagaggtgg ccaacctaga tatcattggc cagaggatag agaatataaa aaatgaacac 8340 aaatcaacat ggcattatga tgaggacaat ccatacaaaa catgggccta tcatggatca 8400 tatgaggtca agccatcagg atcagcctca tccatggtca atggtgtggt gagactgcta 8460 accaaaccat gggatgtcat tcccatggtc acacaaatag ccatgactga caccacaccc 8520 tttggacaac agagggtgtt taaagagaaa gttgacacgc gtacaccaaa agcgaaacga 8580 ggcacagcac aaattatgga ggtgacagcc aggtggttat ggggttttct ctctagaaac 8640 aaaaaaccca gaatctgcac aagagaggag ttcacaagaa aagtcaggtc aaacgcagct 8700 attggagcag tgttcgttga tgaaaatcaa tggaactcag caaaagaggc agtggaagat 8760 gaacggttct gggaccttgt gcacagagag agggagcttc ataaacaagg aaaatgtgcc 8820 acgtgtgtct acaacatgat gggaaagaga gagaaaaaat taggagagtt cggaaaggca 8880 aaaggaagtc gcgcaatatg gtacatgtgg ttgggagcgc gctttttaga gtttgaagcc 8940 cttggtttca tgaatgaaga tcactggttc agcagagaga attcactcag tggagtggaa 9000 ggagaaggac tccacaaact tggatacata ctcagagaca tatcaaagat tccaggggga 9060 aatatgtatg cagatgacac agccggatgg gacacaagaa taacagagga tgatcttcag 9120 aatgaggcca aaatcactga catcatggaa cctgaacatg ccctattggc cacgtcaatc 9180 tttaagctaa cctaccaaaa caaggtagta agggtgcaga gaccagcgaa aaatggaacc 9240 gtgatggatg tcatatccag acgtgaccag agaggaagtg gacaggttgg aacctatggc 9300 ttaaacacct tcaccaacat ggaggcccaa ctaataagac aaatggagtc tgagggaatc 9360 ttttcaccca gcgaattgga aaccccaaat ctagccgaaa gagtcctcga ctggttgaaa 9420 aaacatggca ccgagaggct gaaaagaatg gcaatcagtg gagatgactg tgtggtgaaa 9480 ccaatcgatg acagatttgc aacagcctta acagctttga atgacatggg aaaggtaaga 9540 aaagacatac cgcaatggga accttcaaaa ggatggaatg attggcaaca agtgcctttc 9600 tgttcacacc atttccacca gctgattatg aaggatggga gggagatagt ggtgccatgc 9660 cgcaaccaag atgaacttgt aggtagggcc agagtatcac aaggcgccgg atggagcttg 9720 agagaaactg catgcctagg caagtcatat gcacaaatgt ggcagctgat gtacttccac 9780 aggagagact tgagattagc ggctaatgct atctgttcag ccgttccagt tgattgggtc 9840 ccaaccagcc gcaccacctg gtcgatccat gcccaccatc aatggatgac aacagaagac 9900 atgttgtcag tgtggaatag ggtttggata gaggaaaacc catggatgga ggacaagact 9960 catgtgtcca gttgggaaga cgttccatac ctaggaaaaa 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ctaaactcat 7620 tagacagaaa agagtttgaa gagtataaaa gaagtggaat actagaagtg gacaggactg 7680 aagccaagtc tgccctgaaa gatgggtcta aaatcaagca tgcagtatca agagggtcca 7740 gtaagatcag atggattgtt gagagaggga tggtaaagcc aaaagggaaa gttgtagatc 7800 ttggctgtgg gagaggagga tggtcttatt acatggcgac actcaagaac gtgactgaag 7860 tgaaagggta tacaaaagga ggtccaggac atgaagaacc gattcccatg gctacttatg 7920 gttggaattt ggtcaaactc cattcagggg ttgacgtgtt ctacaaaccc acagagcaag 7980 tggacaccct gctctgtgat attggggagt catcttctaa tccaacaata gaggaaggaa 8040 gaacattaag agttttgaag atggtggagc catggctctc ttcaaaacct gaattctgca 8100 tcaaagtcct taacccctac atgccaacag tcatagaaga gctggagaaa ctgcagagaa 8160 aacatggtgg gaaccttgtc agatgcccgc tgtccaggaa ctccacccat gagatgtatt 8220 gggtgtcagg agcgtcggga aacattgtga gctctgtgaa cacaacatca aagatgttgt 8280 tgaacaggtt cacaacaagg cataggaaac ccacttatga gaaggacgta gatcttgggg 8340 caggaacgag aagtgtctcc actgaaacag aaaaaccaga catgacaatc attgggagaa 8400 ggcttcagcg attgcaagaa gagcacaaag aaacctggca ttatgatcag 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Claims (11)

1. 서열번호: 1 내지 12로 기재되는 염기 서열로 이루어지는 올리고 뉴클레오티드를 모두 포함하며, 상기 서열번호: 1 및 2로 기재되는 염기 서열이 각각 뎅기 바이러스 타입 1 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머이고, 상기 서열번호: 9로 기재되는 염기 서열이 뎅기 바이러스 타입 1 특이적인 프로브이며, 상기 서열번호: 3 및 4로 기재되는 염기서열이 각각 뎅기 바이러스 타입 2 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머이고, 상기 서열번호: 10으로 기재되는 염기 서열이 뎅기 바이러스 타입 2 특이적인 프로브이며, 상기 서열번호: 5 및 6으로 기재되는 염기 서열이 각각 뎅기 바이러스 타입 3 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머이고, 상기 서열번호: 11로 기재되는 염기 서열이 뎅기 바이러스 타입 3 특이적인 프로브이며, 상기 서열번호: 7 및 8로 기재되는 염기 서열이 각각 뎅기 바이러스 타입 4 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머이고, 상기 서열번호: 12로 기재되는 염기 서열이 뎅기 바이러스 타입 4 특이적인 프로브인 것인, 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 프로브의 5' 말단에 형광단이 표지되고, 그의 3' 말단에 소광체가 표지된 것인 프라이머 및 프로브 세트.
4. 제3항에 있어서, 5' 말단에 표지되는 형광단이 플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5(Cyanine-5, Cy5), 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우(Yakima Yellow, YG), 및 칼 플루오르 레드 610(Cal Fluor Red 610, CFR)으로 구성된 군으로터 선택되고, 3' 말단에 표지되는 소광체가 테트라메틸 로다민, 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA), BHQ-1,2,3(black hole quencher-1,2,3), 4'-(4-다이메틸아미노페닐아조)벤조산, 및 4-다이메틸아미노페닐 아조페닐-4'-말레이미드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 프라이머 및 프로브 세트.
5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 조성물.
6. 제5항에 있어서, RT-PCR 증폭반응 혼합물을 추가로 포함하는 것인 조성물.
7. 제6항에 있어서, RT-PCR 증폭반응 혼합물이 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), DNA 중합효소 및 역전사 효소를 포함하는 것인 조성물.
8. 제5항에 따른 조성물을 포함하는 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단용 키트.
9. 하기 단계를 포함하는, 4가지 혈청형 뎅기 바이러스의 다중 동시 감별 진단을 위한 정보 제공방법:
   i) 서열번호: 1 내지 8의 프라이머 및 서열번호: 9 내지 12의 프로브를 포함하는 증폭반응 혼합물을 제조하는 단계;
   ⅱ) 상기에서 제조된 증폭반응 혼합물에 검체 RNA를 첨가하여 반응액을 제조하는 단계; 및
   ⅲ) 상기에서 제조된 검체 RNA를 포함하는 반응액으로 다중 실시간 RT-PCR을 수행하여 검체 내 뎅기 바이러스 핵산을 증폭하는 단계.
10. 제9항에 있어서, 타입 1 내지 4의 4가지 혈청형 뎅기 바이러스를 하나의 반응 용기에서 동시에 감별 진단하는 것을 특징으로 하는 정보 제공방법.
11. 제9항에 있어서, 검체가 뎅기 바이러스의 감염 여부를 진단하고자 하는 개체로부터 분리된 혈액, 혈청, 침 또는 가래인 것인 정보 제공방법.

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