CN102393454A

CN102393454A - 检测登革病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102393454A
Application number: CN2011102457592A
Authority: CN
Inventors: 王静; 杨宇; 杨永莉; 秦成峰; 张志华
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2011-08-24
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2012-03-28

Abstract

本发明公开了一种检测登革病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用，胶体金试纸条包括反应支撑物、连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分连接、硝酸纤维膜末端的上表面与金标抗体保护膜部分连接，金标抗体保护膜的上表面部分连接有样品垫，金标抗体保护膜包括膜本体、及其上的胶体金标记的SPA或重组登革病毒E蛋白涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置质控条带、靠近其末端处设置有检测条带。本发明建立登革病毒抗体的快速检测方法，建立的检测登革病毒的胶体金试纸条，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的登革病毒抗体，并可实现定量检测、适用于现场的快速检测及监测。

Description

检测登革病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测登革病毒抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

登革热是由登革病毒(Dengu e virus，DV)所致的一组虫媒性传染病，传播媒介主要是埃及伊蚊。感染DV后可发生登革热(Dengue fever， DF)、登革出血热(Dengu e hemorrhagic fever，DHF)、登革休克综合征(Dengue shock syndrome，DSS) 。DV有4种血清型，即DV1、2、3、4型。DV引起的感染广泛流行于全球热带和亚热带地区，特别是东南亚、西太平洋、中南美洲、非洲，发病率和病死率均较高，是最为严重的一种虫媒病毒性疾病。全球有100多个国家有该病发生，每年约5 000万人感染，50万人需入院治疗，病死率高达5%。DV感染的实验室诊断，主要有病毒分离、抗体和抗原检测、基因诊断等。WHO曾经把血凝抑制试验(H I)作为登革热的标准诊断方法。然而，病毒分离所需时间较长，达不到快速诊断的目的，而常规的血清学诊断又因存在广泛的交叉反应而受到干扰。胶体金标记的免疫层析方法具有快速、简便、不需要依赖重要装备、能够实现现场检测等特点，成为目前传染病快速诊断中研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用方便、检测快捷的检测登革病毒抗体的胶体金试纸条，本发明的另一目的是提供一种上述试纸条的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明一种检测登革病毒抗体的胶体金试纸条，包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的上表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，金标抗体保护膜包括膜本体、及均匀涂布在其上的胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）或重组登革病毒E蛋白涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组登革病毒E蛋白包被的检测条带。

进一步，所述反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸。

进一步，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。

进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。

进一步，所述试纸条整体的外部包裹设置有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。

一种上述胶体金试纸条的制备方法，具体为：

1）制备胶体金；

2）利用制得的胶体金标记SPA蛋白或重组登革病毒E蛋白；

3）用隔流喷金划线机以设定喷膜速度将羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG喷涂到硝酸纤维膜的起始端以形成质控条带，将重组登革病毒 E蛋白喷涂到硝酸纤维膜的末端以形成检测条带；

4）将胶体金标记的SPA蛋白或重组登革病毒E蛋白均匀涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥，制成金标抗体保护膜；

5）在反应支撑物上表面中部设置硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接，硝酸纤维膜末端的上表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接样品垫；

6）将步骤5）中形成的试纸切成规格大小的条，进行干燥、装壳，以形成试纸条。

进一步，所述步骤1）中制备胶体金的具体步骤为：

1）制备HAuCl₄水溶液：磁力搅拌下加入HAuCl₄，同时加入柠檬酸三钠水溶液，颜色稳定后继续加热，冷却至室温后加纯水补足至设定值，4 ℃避光保存；

2）用K₂CO₃调pH值为6.0-6.4；

3）将胶体金调至pH 6.0-6.4，用PB 稀释 SPA 至0.2 mg/ml；

4）保持胶体金稳定。

进一步，所述步骤3）中，喷膜速度为10-100mm/s；所述重组登革病毒 E2 蛋白的加入量为0.1-5mg/ml，该重组抗原的稀释液可以为PBS；羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG的浓度为0.1-5 mg/ml。

进一步，将胶体金标记的SPA蛋白或重组登革病毒E蛋白的pH为6.0-6.4；所述样品垫采用含有NP 40的磷酸盐缓冲液对玻璃纤维素膜进行预处理。

一种上述胶体金试纸条的应用，将所述胶体金试纸条与胶体金生物传感器有机整合成胶体金定量检测系统，以正确判读该试纸条检测结果。

本发明基于SPA 蛋白或重组登革病毒E蛋白标记胶体金，构建间接法或双抗原夹心法检测抗体，并对该方法的敏感性、特异性、稳定性进行评价。通过对人为掺入兔抗重组登革病毒 E2 抗体的健康人血清模拟环境样品检测，评价该方法检测血清样品中登革病毒抗体的可行性。利用本发明提供的试纸条进行检测，具有操作简单，检测时间短，无需专业人员，适合快速现场检测。

附图说明

图1为本实用新型检测试纸条内部结构的正面示意图；

图2为本实用新型检测试纸条内部结构的侧面结构示意图；

图3为本实用新型检测试纸条的阳性检测结果示意图；

图4为本实用新型检测试纸条的阴性检测结果示意图；

图5为本实用新型检测试纸条的无效检测结果示意图。

具体实施方式

下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。

为了易于说明，在这里可以使用诸如“上”、“下”“左”“右”等空间相对术语，用于说明图中示出的一个元件或特征相对于另一个元件或特征的关系。应该理解的是，除了图中示出的方位之外，空间术语意在于包括装置在使用或操作中的不同方位。例如，如果图中的装置被倒置，被叙述为位于其他元件或特征“下”的元件将定位在其他元件或特征“上”。因此，示例性术语“下”可以包含上和下方位两者。装置可以以其他方式定位（旋转90度或位于其他方位），这里所用的空间相对说明可相应地解释。

一种检测登革病毒抗体的胶体金试纸条，包括：

（1）反应支持物5；

（2）吸水垫1；

（3）硝酸纤维膜2，该膜包被有重组登革病毒 E抗原和质控抗体的检测条带和质控条带；

（4）金标抗体保护膜3，其中含有胶体金标记的SPA 蛋白或重组登革病毒E蛋白；

（5）样品垫4，采用含有NP 40的磷酸盐缓冲液对玻璃纤维素膜进行预处理；

如图1、图2、图3所示，其具体结构为：反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，硝酸纤维膜2的T处是重组E2蛋白包被的检测条带，C处是羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG包被的质控条带；金标抗体保护膜3位于硝酸纤维膜2上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的重组登革病毒抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于金标抗体保护膜3而言的另一侧、并与硝酸纤维膜2部分重叠；样品垫4位于硝酸纤维膜2上与吸水垫1相反的一侧并与金标抗体保护膜3部分重叠。

其中反应支持物5为PCV板，吸水垫1为滤油纸，硝酸纤维膜2依次包被羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG 0.5-5 mg/ml、重组登革病毒 E 抗原0.1-5mg/ml，金标抗体保护膜3为含有胶体金标记的SPA 蛋白或重组登革病毒E蛋白的玻璃纤维膜或聚脂膜或滤纸纤维，样品垫4选用玻璃纤维膜或聚脂膜或滤纸纤维。试纸条整体的外部包裹设置有外壳6，外壳6上对应于样品垫处设置有样品孔7，外壳上对应于质控条带、检测条带处设置有观察窗8。

本发明的试纸条，以吸水垫一侧为起始端，样品垫一侧为末端，重组登革病毒 E抗原检测条带位于接近末端，羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG包被的质控条带接近于起始端。

一种检测登革病毒抗体的胶体金试纸条的制备方法，该方法包括以下步骤：胶体金探针的制备，金标垫的制备，硝酸纤维膜的喷涂包被，样品垫的预处理。

1、胶体金探针的制备

（1）将HAuCl₄先配制为0.01%水溶液。磁力搅拌下准确加入1 ml 1%的HAuCl₄，同时加入1.5-3ml 1%的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定后继续加热，冷却至室温后加纯水补足至100 ml, 4 ℃避光保存。

（2）用K₂CO₃调pH值为约6.0-8.0，优选为约6.0-6.8，更优选约为6.0-6.4。

（3）将胶体金调至pH 6.0-6.4，用PB 稀释 SPA 至0.2 mg/ml。

（4）保持胶体金稳定。

一种获得维持胶体金稳定的抗体/抗原最佳标记剂量的方法，该方法包括：

a.取10 支洁净的1.5 ml离心管，分别加入胶体金溶液1ml。

b.在1-10 号管内分别加入10 ml、20 ml、30 ml、40 ml、50ml、60 ml、70 ml、80 ml、90 ml、100 ml的PB，再依次加入稀释好的0.2 mg/ml 的待标记 SPA溶液 90 ml、80 ml、70 ml、60 ml、50 ml、40 ml、30 ml、20 ml、10 ml、0 ml，混匀，静置5分钟。

c.在10个管内分别加入10% NaCl 溶液100 ml，混匀后室温静置2小时，观察颜色变化。

未加抗体/抗原及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色会呈现由蓝变红的变化，而加入抗体/抗原量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管（1 号管）相比，颜色最接近、含抗体/抗原剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为1 ml 胶体金所必须的抗体稳定剂量，在此基础上再加20%抗体，即为抗体/抗原最佳标记剂量。本发明经过反复试验和分析，得出的结果表明：维持胶体金溶液适宜蛋白量为0.2－10μg，优选蛋白量0.2－8μg，最优选为0.5-3μg。

2、金标抗体保护膜的制备

　　取上述pH的胶体金以1ml/管分装于1.5 ml的离心管中。每支管中为0.2－10μg，优选抗体量0.2－8μg，最优选为0.5-3μg，轻摇混匀后放置。每管中加入10%的BSA 100 μl，混匀放置。将上面初步制得的胶体金探针在12000 rpm、4℃下离心30分钟，弃上清液。每支离心管中加入1 ml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上清液，管底得到暗红色的疏松状沉淀，加入500 μl 重悬液重悬后置于4 ℃，1000 rpm，离心10分钟；取上清液，均匀滴加在1cm宽的玻璃纤维上，37℃干燥。

3、硝酸纤维膜的喷涂

（1）利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被检测线重组登革病毒 E 抗原和质控线羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG两个条带的硝酸纤维膜；

在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s，更优选是45-55mm/s，最优选是50mm/s；所述重组登革病毒 E 抗原，其加入量为其浓度为0.1-5mg/ml，更优选是0.5-2.5mg/ml，最优选为1 mg/ml；该抗原的稀释液可以为PBS；质控羊抗兔IgG可以购自鼎国生物技术公司，其浓度为0.1-5 mg/ml，更优选是0.5-2.5 mg/ml，最优选为1 mg/ml；

（2）制备一种含有胶体金标记的SPA蛋白的玻璃纤维膜，将胶体金标记的SPA蛋白均匀涂布在玻璃纤维膜上。蛋白用PB稀释，pH为6-8，优选6-6.8，最适PH值为6.0-6.4。

　　利用本发明的试纸条检测登革病毒抗体中，先将待测标本放入装有稀释液的小瓶内，再用移液器将样品混合液加入试纸条的样品孔7内，样品中的液体依靠虹吸作用上行，一般需10-15分钟之后进行判读结果：

如图3、图4、图5所示，如果标本中含有登革病毒抗体，则它将与试纸上胶体金标记的SPA 蛋白或重组登革病毒E蛋白形成相应的复合物，液体展开上行并与硝酸纤维膜上的重组登革病毒抗原结合，形成红色线条，即在“T”处形成红色条带，胶体金标记的SPA 蛋白或重组登革病毒E蛋白与质控线的羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG形成相应的复合物, 即在“C”处形成红色条带；如果不含有登革病毒抗体，则它将不会与试纸上胶体金标记的SPA 蛋白或重组登革病毒E蛋白形成相应的复合物，即在“T”处不会形成红色条带，但胶体金标记的SPA 蛋白或重组登革病毒E2蛋白与质控线的羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG仍形成相应的复合物, 即在“C”处形成红色条带，如果胶体金标记的SPA 蛋白或重组登革病毒E蛋白失效将不会形成红色条带。

　　无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记蛋白继续随液体继续上行并与该膜上的羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金试纸条失效，此线就不会出现，说明试纸失效。

　　阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果只出现1条红色沉淀线，如不出现线条说明试纸失效。如若肉眼无法辨别T处红色条带，可利用金标免疫分析仪进行定量检测。

　　本发明的技术方案是：采用重组登革病毒抗原和羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG分别固相于硝酸纤维膜上，结合胶体金标记的SPA 蛋白，应用膜层析间接法的原理检测标本中的登革病毒抗体。

一种将胶体金试纸条与胶体金生物传感器有机整合的胶体金定量检测系统。运用胶体金测试条判读仪的优势在于，判读仪能够在人眼无法正确识别可疑物检测是否存在阳性的情况下，正确判读该试纸条检测结果。减少了因人为主观判读带来的错误率，增加了客观性、准确性；并且可实现定量检测。此外，胶体金判读仪携带方便、使用简单、判定准确、结果客观、易保留，为检验检疫工作带来了方便。

胶体金免疫层析试纸条的制备过程如下：

1、抗原及抗体

纯化的登革病毒E蛋白与兔抗重组登革病毒蛋白的多克隆抗体由中国检科院卫生检疫研究所提供。羊抗兔IgG（购自鼎国生物技术公司）

2、层析测试条耗材

结合垫(玻璃纤维)、硝酸纤维素膜(NC膜，SHF 1350225)、样品垫及吸水垫购自Millipore公司。

3、胶体金免疫层析试纸条的制备

胶体金结合垫：将 SPA 或重组登革病毒E蛋白标记于柠檬酸钠法制备25nm的pH值为6.0～6.4胶体金颗粒，37℃干燥。

硝酸纤维素膜：检测带：重组登革病毒 E2 蛋白1mg/ml；质控带：羊抗兔或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG1 mg/ml，37℃干燥。

组装：将样品垫、结合垫、吸水垫依次贴在底衬卡，切成0.4cm的条，干燥，装壳，室温贮存备用。

灵敏度试验

1、样品的处理

取待检测样品10μL和样品处理液90μL加入到制备好的层析条样品垫端，10-15min后，若检测带和质控带均出现红色即判为阳性；若只有质控带出现红色即判为阴性；若质控带不显色，则为试纸条失效，应取新的试纸条重新检测。

2、直观检测灵敏度评价

按确定的最佳反应条件制备胶体金免疫层析试纸条，检测不同浓度的登革病毒抗体。将登革病毒抗体用样品处理液稀释成浓度依次为1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵。1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵,同时进行检测。结果显示直接目测的灵敏度1:10⁴。

特异性试验

分别检测以0.85%的生理盐水稀释至10⁴倍的DV1+2+3+4型血清、WNV血清、JEV血清，检测结果JEV血清无阳性结果，DV1+2+3+4型血清、WNV血清均为阳性结果，表明该检测方法特异性良好。

稳定性试验

将登革病毒胶体金免疫层析试纸条于37℃存放7 d 后，用稀释度为1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵/test的DV1+2+3+4型血清及以正常人血清同时进行检测，胶体金试纸条仍能检出稀释度为1:10⁵/test，敏感性没有下降。

正常人血清检测

将正常人血清作为阴性样品检测20 次，用金标免疫分析仪扫描读取信号T/C 比值（表1）。20个样品T/C 比值的平均值与3倍标准差之和即为判定值（Cot-off值）。将显色后的金标条放入金标免疫分析仪扫描，读取T/C 比值，若比值大于判定值即为阳性，反之则为阴性。经计算， Cot-off值为0.007，金标免疫分析仪扫描读取值见表1。

表1 20份阴性样品检测结果

Figure 2011102457592100002DEST_PATH_IMAGE001

Claims

1.一种检测登革病毒抗体的胶体金试纸条，其特征在于，该胶体金试纸条包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的上表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，金标抗体保护膜包括膜本体、及均匀涂布在其上的胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白或重组登革病毒E蛋白涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组登革病毒E2蛋白包被的检测条带。

2. 如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸。

3. 如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。

4. 如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。

5. 如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条整体的外部包裹设置有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。

6. 一种如权利要求1所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，该制备方法具体为：

1）制备胶体金；

2）利用制得的胶体金标记SPA蛋白或重组登革病毒E蛋白；

3）用隔流喷金划线机以设定喷膜速度将羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG喷涂到硝酸纤维膜的起始端以形成质控条带，将重组登革病毒 E2 蛋白喷涂到硝酸纤维膜的末端以形成检测条带；

7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中制备胶体金的具体步骤为：

2）用K₂CO₃调pH值为6.0-6.4；

3）将胶体金调至pH 6.0-6.4，用PB 稀释 SPA 至0.2 mg/ml；

4）保持胶体金稳定。

8. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中，喷膜速度为10-100mm/s；所述重组登革病毒 E2 蛋白的加入量为0.1-5mg/ml，该重组抗原的稀释液可以为PBS；羊抗兔IgG或羊抗重组登革病毒E蛋白IgG的浓度为0.1-5 mg/ml。

9. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将胶体金标记的SPA蛋白或重组登革病毒E蛋白的pH为6.0-6.4；所述样品垫采用含有NP 40的磷酸盐缓冲液对玻璃纤维素膜进行预处理。

10. 一种如权利要求1所述的胶体金试纸条的应用，其特征在于，将所述胶体金试纸条与胶体金生物传感器有机整合成胶体金定量检测系统，以正确判读该试纸条检测结果。