CN104880552A - 检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有恩诺沙星药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；本发明同时公开了上述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括胶体金的制备、金标抗体的制备及纯化及试纸条的组装步骤。本发明的胶体金免疫层析试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的特点。

Description

检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及水产品检测的技术领域，尤其涉及一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

恩诺沙星又称乙基环丙沙星，是由德国的拜尔公司最先研制的氟喹诺酮类药物，其渗透性强、活性高具有稳定的杀菌效果；恩诺沙星口服吸收好、组织穿透能力强、血药浓度高且稳定，能广泛分布于组织中，具有很好的杀菌作用，同时其代谢产物环丙沙星，依然持续起到抗菌效应。若恩诺沙星长期在体内蓄积代谢，给人们会带来严重的危害和不良反应。主要的不良反应有：第一，产生神经毒性。第二，损伤消化系统。长期性的摄入大量含有恩诺沙星的动物性食品，导致食欲下降或废绝、腹痛甚至呕吐。第三，对负重关节的软骨组织生长有不良影响，导致关节酸疼、僵硬等不良症状。第四，产生致敏反应。

恩诺沙星药物残留长期存在，除了对生体机能造成毒害作用之外，更重要的是造成了细菌的耐药性的产生，从而对疾病的治疗造成了困扰。Entdz等报道，在1982～1989年间，由畜禽产品中分离出的抗喹诺酮类耐药性菌株和从人体中分离到的耐药菌株，都以不同程度的速度增长。Nelson等报道，在美国每年有140万人感染弯曲菌。依据美国疾病控制与预防中心的调查与分析，在1998年里这些患病人群中，有将近13.6％的患者对氟喹诺酮类药物具有抗药性，仅仅过一年到1999年，体内持有抗药性的患者比例增加到了17.6％。细菌的耐药性还可以通过食物链、环境或者人和动物的接触进行传播，因而我们要从根源上控制耐药性的泛滥。

目前，常用于检测恩诺沙星药物残留量的方法主要包括：理化分析法、微生物学检测法和免疫分析检测法。常见的理化分析检测法有高效液相色谱法、色谱-质谱联用技术、薄层色谱法、毛细管电泳法等，这些检测方法灵敏度高，检测结果可靠，常作为确证方法检测药物残留，但设备昂贵，样品前处理过程复杂，对操作人员要求高，耗时较长，不适合批量样品的快速检测。微生物学检测法不需要专业昂贵的仪器，但操作耗时长，特异性、敏感性差，容易受其他药物的干扰，在定量上尚不成熟，检测结果有时不能满足国家最高残留限量的要求，不能满足现代检测的需要。随着免疫学和免疫技术的飞速发展，免疫分析法迅速发展起来，成为检测药物残留的一种新型方法。免疫分析法主要是利用抗原、抗体的特异性结合来检测药物、蛋白质、激素、微生物等各种物质，主要分为：放射性免疫法、酶联免疫吸附法、免疫传感器法、胶体金免疫层析技术等。胶体金免疫层析技术是一种新型的免疫标记技术，是在免疫层析的基础上建立起来的，以胶体金为示踪物与抗原、抗体特异性反应相结合的一种检测技术。该检测方法结果判读简单，不需要专业的操作人员，检测时间短，携带方便，特别适合大批量样品的药物残留的快速筛查。

在现有技术中，利用胶体金免疫法检测恩诺沙星药物残留的研究也有不少，ZHU等研制了检测恩诺沙星的胶体金免疫检测试纸，检测限为50μg/L。目前的市场上有许多的公司，已研发出成功的恩诺沙星试纸条产品。上海容晖生物科技有限公司研制出的试纸条，恩诺沙星的检出限为20ng/mL；上海研拓生物科技有限公司，所研制出的恩诺沙星试纸条(组织)的灵敏度为25ng/mL；苏州艾瑞德生物科技有限公司生产的试纸条，恩诺沙星(组织)的检出限为20ng/mL。欧美等国于20世纪70、80年代，就已经开始关注在动物体内抗生素的残留问题，制定了兽药的最高残留量(MRL)、休药期(WDT)及相关的法规和标准。欧盟(EU)和WHO相继规定了，恩诺沙星最高残留限量(MRL)，分别为30μg/kg和40μg/kg。因此，现有技术的检测恩诺沙星的胶体金免疫检测试纸尚不能满足欧美等西方国家的标准，对于产品出口来说，对于我国的水产企业带来了很大的困难。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的专门用于检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，以便对恩诺沙星药物进行高灵敏度的检测，符合欧盟及WTO的最低检出限的规定。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：

一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有恩诺沙星药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。

一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、胶体金的制备：取1个250mL烧杯，加入100mL 0.01％氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档200℃对其进行加热，转速为200r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100℃，向烧杯中快速加入2mL 1％柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10min，直至溶液透亮，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金；

步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7.4的所述胶体金1mL于2.0mL离心管中，向离心管中加入9.6μg/ml的恩诺沙星单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10min后静置15min；向离心管中加入60μL 10％BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，静置10min，制得金标抗体，即恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；

同时，将制得的金标抗体溶液于4℃2500r/min，离心10min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4℃11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20，于4℃保存备用；

步骤三、试纸条的组装：(1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2mm；(2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4mm宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37℃烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成1cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2mm，根据试纸条长度修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被恩诺沙星抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0.8μL/cm，质控线为1.0μL/cm，使得恩诺沙星抗原包被浓度为0.05mg/mL；羊抗鼠IgG包被浓度为0.8mg/mL。

作为实施例的优选方式，在所述步骤三(3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4mm宽的长条，用含有5％的蔗糖、5％BSA和终体积浓度为0.1％的pH为7.4的0.01mol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37℃条件下烘干12h备用。

作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5％的氯仿中浸泡1min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37℃进行干燥处理，备用。

与现有技术相比，本发明具有下列优点：

1、本发明的检测恩诺沙星药物的胶体金免疫层析试纸条，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短等优点，在水产品中的检测限为15μg/L，大大高于市场同类型产品的灵敏度，符合欧盟最高残留限量的标准。

2、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，可现场操作，检测成本低。

3、本发明的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作。

4、本发明对样品垫与金标垫进行了前处理，使得样品垫与金标垫具有优异的吸水能力及释放能力，进而大大提高了检测能力。

5、本发明对试验所用容器都进行清洗，最终增强了金标抗体的稳定性。

6、本发明可以同时检测液体样品和组织样品，无需分开检测，而传统的试纸条对于这两种样品是分开检测的。

7、本发明的胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定采用了氯化钠破坏法与性能实验相结合的方法，在提高检测的灵敏度的同时，节省了抗体使用量。

说明书附图

图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；

图2为本发明实施例4性能评价恩诺沙星试纸条灵敏度测试结果图；其中，从左到右添加的恩诺沙星标准品的浓度依次为0、10、25、50、60、70、80、100、120ng/ml；

图3为本发明实施例4性能评价恩诺沙星试纸条稳定性测试结果图；其中，a、b、c、d、e、f组试纸条依次在37℃下保存时间为1d、2d、3d、4d、5d、6d，每组从左到右恩诺沙星添加的浓度依次为0、60、80、100ng/mL；

图4为本发明实施例4性能评价恩诺沙星试纸条稳定性测试结果图；其中，A、B、C、D、E、F试纸条组依次在4℃下保存时间为1月、2月、3月、4月、5月、6月，每组从左到右恩诺沙星添加的浓度依次为0、60、80、100ng/mL；

图5为本发明实施例5样品测试的测试结果图。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，本发明揭示了一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素包被膜3、吸水垫4及PVC底板5，所述样品垫1、所述结合垫2、所述硝酸纤维素包被膜3及所述吸水垫4依次搭接在所述PVC底板5上：所述结合垫2包被设有恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜3上设有检测线31和质控线32，所述检测线31包被有恩诺沙星药物抗原，所述质控线32包被有羊抗鼠IgG。

实施例2

一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、胶体金的制备：取1个250mL烧杯，加入100mL 0.01％氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档200℃对其进行加热，转速为200r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100℃，向烧杯中快速加入2mL 1％柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10min，直至溶液透亮，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金；

步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7.4的所述胶体金1mL于2.0mL离心管中，向离心管中加入9.6μg/ml的恩诺沙星单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10min后静置15min；向离心管中加入60μL 10％BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，静置10min，制得金标抗体，即恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；

同时，将制得的金标抗体溶液于4℃2500r/min，离心10min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4℃11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20，于4℃保存备用；

步骤三、试纸条的组装：(1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2mm；(2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4mm宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37℃烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成1cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2mm，根据试纸条长度修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被恩诺沙星抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0.8μL/cm，质控线为1.0μL/cm，使得恩诺沙星抗原包被浓度为0.05mg/mL；羊抗鼠IgG包被浓度为0.8mg/mL。

作为实施例的优选方式，在所述步骤三(3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4mm宽的长条，用含有5％的蔗糖、5％BSA和终体积浓度为0.1％的pH为7.4的0.01mol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37℃条件下烘干12h备用。

作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5％的氯仿中浸泡1min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37℃进行干燥处理，备用。

实施例3胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定

氯化钠破坏法：用pH＝7.4、0.01mol/L PBS将恩诺沙星单克隆抗体稀释至1mg/mL。将胶体金溶液调制最佳pH，取若干个小离心管，每管准确量取1mL胶体金溶液，分别加入0、3、5、7、9、11、13、15、17μL1mg/mL恩诺沙星单克隆抗体，振荡混匀3min，室温静置12min；然后再加入100μl 10％NaCl于每管胶体金中，混匀、并静置2h，观察颜色变化及聚沉情况。最适抗体浓度在最低稳定量的基础上再加20％。胶体金溶液在2000r/min、4℃的条件下离心15min，取上清液于520nm处测吸光值，以添加的不同抗体量为横坐标，对应520nm下的吸光值为纵坐标。

表1最低标记蛋白量的确定

性能实验：取3个离心管，编号为1～3号，各加1mL胶体金溶液，调节溶液至最佳pH，根据氯化钠破坏法的实验结果，实验中对1～3号管分别标记0μg、8.8μg、9.2μg的抗体蛋白，加入100μL 10％BSA封闭保护金标液，金标液经纯化、稀释，耦合到金标垫上，与NC膜组装成试纸条，分别测试100μg/L的阳性标准品和阴性PBS溶液，对比抗体加入量的不同对试纸条显色的影响，准确判断最佳标记量。

探索胶体金标记抗体蛋白的最佳标记量，各离心管中的溶液发生反应后颜色发生了变化，其中，1、2、3号管抗体蛋白的加入量不能够稳定胶体金体系，加入氯化钠后，产生的盐离子效应，破坏了胶体金的平衡，使溶液出现了由红色变蓝色或紫色的不同程度的聚沉现象，4号管溶液有轻微变色，说明加入氯化钠后对溶液的影响较小，5号管加入的抗体量可以稳定胶体金体系，所以加入氯化钠后对溶液没有影响，考虑到胶体金标记抗体后加入的稳定剂BSA对体系的保护作用，本探索实验初步选择4号、5号管两组为合适的抗体加入量，即最低抗体标记量为9.6μg/mL或10μg/mL。

为更准确的确定最佳抗体标记量，结合氯化钠实验法的选择结果，选择抗体标记量为9.6μg/ml、10μg/ml、10.4μg/ml进行了性能实验，分别对三种标记量的试纸条进行同浓度的阴性样本和阳性样本测试，三组试纸条的检测结果无差异，说明抗体标记量为9.6μg/ml时稳定剂BSA保护了反应体系，不影响试纸条性能，因此为节省抗体使用量和提高检测的灵敏度，本实验选择胶体金标记抗体蛋白时，最佳抗体标记量为9.6μg/ml。

实施例4试纸条的性能评价

4.1试纸条的灵敏度

用pH＝7.4、0.01mol/L PB，5％甲醇溶液将恩诺沙星标准品稀释成不同质量浓度的样品溶液：0(阴性空白样液PB作对照)、10、25、50、60、70、80、100、120ng/mL，并用试纸条进行检测，12min后观察结果。

从图2可以看出，当添加的样品为阴性空白对照时，试纸条的颜色指示呈阴性，且颜色指示很明显与理论相符合；当添加不同浓度的恩诺沙星标准品时，试纸条的理论检测结果应该是全部呈阳性，但在实际的检测结果中，试纸条的灵敏度并未达到理论的检测要求，在标准品的浓度为10、25、50ng/mL时，检测结果出现了假阴性与理论不符合，说明试纸条未能检测到这么低浓度的恩诺沙星。但随着浓度的依次递增，试纸条的检测线颜色指示的强度在逐渐减弱，在最开始时有明显的颜色指示，到最后的完全消失，在这个过程中颜色的指示是一个渐变的过程。当标准品浓度为60ng/mL时，检测线的颜色指示已经完全消失，在其后较高浓度的标准品检测中，其T线也完全看不见。所以试纸条能检测出恩诺沙星最低浓度为60ng/mL。

4.2试纸条的特异性

一般用交叉反应率来表示特异性，反应抗体与结构不同的的抗原决定簇发生结合的能力。取恩诺沙星相似物、达氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、磺胺嘧啶、氯霉素，分别用pH＝7.4、0.01mol/L PB，5％甲醇稀释成浓度为0、10、50、60、80和100ng/mL，用空白溶液作阴性对照。观察不同类似物在试纸条上的颜色显色指示情况。

在最佳实验环境条件下，选用了几种类喹诺酮类药物及几种常用兽药来进行试纸条的现场测试。由表2可知，对于恩诺沙星标准品检测中，在浓度大于60ng/mL时，才会显示出阳性结果，而小于60ng/mL浓度范围内都显示阴性结果；而对于其他类似物的标准品，试纸条的检测线都有不同程度的显色，表示不同浓度其他药物的标准品检测结果都呈阴性，说明该金标抗体与恩诺沙星可特异性结合，与其它抗生素结合率很小。所以该试纸条对ENR具有很好的特异性。

表2恩诺沙星胶体金试纸条特异性检测

(注：表中“—”表示检测结果为阴性；“+”表示检测结果为阳性)

4.3试纸条的稳定性

利用破坏性试验对试纸条的稳定性进行测试，即将同一批次组装好的胶体金试纸条，装入铝箔袋中保存，然后放在37℃的电热恒温干燥箱中(加剧试纸条的贮存条件)；另外也取相同批次的试纸条，将它们装入带有干燥剂的铝箔袋中密封好，于4℃的冰箱中，放置6个月。每天(月)在固定的时间段取出试纸条，并进行进行阴性、不同浓度阳性条件下的测试，观察试纸条的检测线(T线)、质控线(C线)的显色情况，连续测试6天(月)。

一般认为在37℃条件下避光保存1d相当于在4℃条件下避光保存45d左右，通过试纸条的检测，由图3可以看出，在1d、2d、3d检测的试纸条都呈正常的显色情况，显色效果良好，颜色指示与理论相符合；从第4天开始，阴性样本的试纸条颜色指示开始减弱，检测线和质控线颜色变浅。在浓度为60ng/mL的阳性样本中，试纸条的检测线可以模糊的看出印迹，检测结果指示趋向于假阴性，说明试纸条已开始变性，性能不稳定检测的结果不准确，同时系列梯度阳性样本试纸条的质控线颜色变浅；到了第5天、6天，阴性样本的试纸条显色效果明显变差，在浓度为60ng/mL的阳性样本中，试纸条的检测线有模糊印迹，同时系列梯度阳性样本试纸条的质控线颜色指示变弱。试纸条在37℃条件下的稳定性试验，可以说明试纸条在第1、2、3天稳定性良好，而从第4天开始稳定性逐渐减弱。如图4所示，试纸条在4℃条件下连续保存6个月，在前4个月里，试纸条检测的颜色指示结果与理论结果一致，试纸条并未发生变性；当到第5个月检测时，阴性样本中的试纸条，检测线开始变模糊；而阳性样本中的试纸条，检测线上有一段淡淡的痕迹，检测效果不佳，说明试纸条已开始变性。由此可以得出实验结论：将制备好的胶体金试纸条和干燥剂一起放入密封的铝箔袋中在4℃条件下避光保存，在4个月内试纸条都有较高的稳定性。

4.4试纸条的重复性

试纸条的研制有很多影响因素，相同条件下制备的不同批次的试纸条在显色效果上都会有细微的差别。在4℃密封保存条件下(贮存的时间也相同)，随机抽取不同批次和相同批次的试纸条，对试纸条的重复性进行测试，并观察试纸条的显色情况。

由表3可得，选取不同批次的试纸条进行检测，空白阴性测试检测结果都呈阴性，且试纸条显色清晰、效果不错；在不同浓度的阳性样本检测中，试纸条的显色指示结果均呈阳，且颜色显色指示明了。理论结果与实际检测结果一致，由此说明在4℃密封保存条件下，试纸条重复性良好。

表3恩诺沙星胶体金试纸条重复性测试

(注：“+”：有明显显色；“±”：有显色，但颜色很淡；“－”没有颜色；)

实施例5样品测试

样品处理：称取5.0g均质好的组织匀浆，并加入不量的恩诺沙星标准品，分别加入400μl、500μl浓度为200ng/ml的恩诺沙星标准品，使其最终浓度为16μg/kg，20μg/kg。样品经优化处理后，用试纸条来进行检测。处理方法如下：

(1)甲酸乙腈提取、浓缩

精确称取5.0g均质好的组织匀浆，于50mL离心管中。加入5mL甲酸/乙腈(1:99)溶液，在恒温振荡器中振荡混合15min后，再超声提取30min。将均质混合物在12℃、6000r/min的条件下离心10min，取上清液于玻璃试管中，在60℃条件下氮吹至近干。

(2)正己烷萃取、净化

加入1ml的pH＝7.4、0.01mol/L PB、5％的甲醇溶液，再加入1.0ml正己烷，漩涡混匀，并在6000r/min的条件下离心10min，弃掉上层，取下层清液用于分析。

现场检测时，将制备好的试纸条水平、平整的放置在试验台上，然后用一次性吸管吸取样品，滴加到样品垫上(应无气泡)。加样后在12min后观察试纸条的显色情况，并得出结果。

将恩诺沙星标准品溶液加入均质的阴性鱼肉样品中，按如前所述的方法处理，然后用制备好的试纸条进行检测。用试纸条分别检测罗非、草鱼鱼肉样品，每种鱼样品分为3组来检测，一组为阴性样品(LC-MS检测为阴性)，另外两组为阳性样品(所添加的恩诺沙星最终含量为16μg/kg、20μg/kg)。

由图5可看出，在罗非鱼样品检测中，鱼肉阴性样品试纸条检测，试纸条颜色显色指示结果为阴性，试纸条检测结果与实际结果一致；两组阳性样品检测，试纸条只有质控线上有颜色显色指示，检测线的颜色显色没有指示，检测结果呈阳性；草鱼样品检测，鱼肉阴性样品试纸条检测，检测结果为阴性，在另外两组所添加的恩诺沙星最终含量为16μg/kg、20μg/kg的鱼肉样品检测中，试纸条只有质控线显色，定性检测结果为阳性。由罗非鱼和草鱼的样品检测结果，可以说明试纸条实际应用效果不错。

本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，其特征在于：所述结合垫包被设有恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有恩诺沙星药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。

2.一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、胶体金的制备：取1个250mL烧杯，加入100mL 0.01％氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档200℃对其进行加热，转速为200r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100℃，向烧杯中快速加入2mL 1％柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10min，直至溶液透亮，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金；

步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7.4的所述胶体金1mL于2.0mL离心管中，向离心管中加入9.6μg/ml的恩诺沙星单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10min后静置15min；向离心管中加入60μL 10％BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，静置10min，制得金标抗体，即恩诺沙星单克隆抗体-胶体金标记物；

同时，将制得的金标抗体溶液于4℃2500r/min，离心10min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4℃11000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20，于4℃保存备用；

步骤三、试纸条的组装：(1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2mm；(2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4mm宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37℃烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成1cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2mm，根据试纸条长度修剪样品垫；(5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被恩诺沙星抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0.8μL/cm，质控线为1.0μL/cm，使得恩诺沙星抗原包被浓度为0.05mg/mL；羊抗鼠IgG包被浓度为0.8mg/mL。

3.如权利要求2所述的一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：在所述步骤三(3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4mm宽的长条，用含有5％的蔗糖、5％BSA和终体积浓度为0.1％的pH为7.4的0.01mol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37℃条件下烘干12h备用。

4.如权利要求2所述的一种检测恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5％的氯仿中浸泡1min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37℃进行干燥处理，备用。