CN103175965A - 一种大便隐血检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大便隐血检测试剂盒，包括大便隐血检测试纸条或试纸卡、样品处理管或采便混合器和取样棒，所述试纸条或试纸卡包括包被有抗Hb1单克隆抗体的检测区(T)和包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控区(C)及包被有抗Hb2单克隆抗体的胶体金。上述试剂盒的制备方法包括处理液的配置、试剂盒的制备、胶体金复合物的制备、喷金、切割、组装、切割、包装等步骤。该大便隐血检测试剂盒特异性好、灵敏度高、检测快速、简单，不受饮食及药物限制。

Description

一种大便隐血检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及检测试剂盒领域，更具体地说涉及一种大便隐血检测试剂盒及制备方法。 

背景技术

消化道少量出血时，粪便外观无异常改变，因红细胞被溶解破坏，显微镜下查不到红细胞，这种外观和显微镜下都不能证实的出血称为隐血。用化学法或免疫法来证实出血的实验称为隐血试验。通常检查粪便是否带血的手段中，以检查隐血为一种最经济实效的方法。此试验对消化道出血的早期发现和消化道肿瘤的筛选有着重要的参考价值。因此，大便隐血检验对预防性用药是很重要的。 

现有技术中，临床常用潜血试验，主要有化学法和免疫学方法。化学法有邻联甲苯胺法、还原酚酞法、联苯胺法、氨基比林法、愈创木醋法等。其原理基于血红蛋白中的含铁血红素能催化试剂中的过氧化氢，使其释放新生态氧，氧化上述色原物质而显色。显色的深浅反映了血红蛋白的多少，亦即出血量的大小。化学法虽简单易行，但方法上缺乏特异性。由于现有化学法受其他干扰因素多、假阳性率高、冰醋酸配成的试剂易形成晶体等条件限制，因此，亟需一种特异性好、灵敏度高、检测快速、简单的大便隐血检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、检测快速、简单的大便隐血检测试剂盒，不受饮食及药物限制。 

本发明的另一目的在于提供这种大便隐血检测试剂盒的制备方法。 

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案： 

一种大便隐血检测试剂盒，它包括大便隐血检测试纸、样品处理管或采便混合器、取样棒，所述检测试纸包括检测区(T)、质控区(C)及胶体金，其特征在于所述检测区(T)包被有抗Hb1单克隆抗体，所述质控区(C)包被有羊抗鼠多克隆抗体，所述胶体金包被有抗Hb2单克隆抗体。 

在一个优选的实施方案中，所述检测试纸为试纸条。此时，大便隐血检测试剂盒包括大便隐血检测试纸条、样品处理管和取样棒。其中，所述大便隐血检测试纸条由下往上依次由浸入区、胶体金、检测区、质控区和手持区组成。 

在一个优选的实施方案中，所述检测试纸为试纸卡。此时，大便隐血检测试剂盒还包括有磷酸盐缓冲液，即大便隐血检测试剂盒包括大便隐血检测试纸卡、磷酸 盐缓冲液、采便混合器。其中，所述大便隐血检测试纸卡还包括加样孔，即所述大便隐血检测试纸卡由下往上依次由加样孔、胶体金、检测区、质控区和手持区组成。 

一种大便隐血检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤如下： 

(1)处理液的配置步骤：按浓度比例配置金标垫处理液、样品垫处理液、点膜抗体稀释液、标记抗体稀释液和胶体金复合物稀释液； 

(2)试剂盒的制备步骤：通过膜材的处理、点膜、胶体金复合物的制备、喷金、膜材的切割、组装、大板的切割和包装步骤得到铝箔袋封装完整的试剂盒。 

在点膜配液时，取羊抗鼠多克隆抗体，用含2％蔗糖的PBS稀释成0.5mg/ml的抗体溶液。取血红蛋白单克隆抗体1，用含2％蔗糖的PBS稀释成1.0mg/ml的抗体溶液。 

在胶体金复合物的制备过程中，所述胶体金复合物中每1ml胶体金加入0～16μlK₂CO₃，选择能够保持颜色不变的最低的pH值，一般选择1ml胶体金加入8μl1K₂CO₃

在胶体金复合物的制备过程中，所述胶体金复合物中每1ml胶体金结合8～16μg的抗Hb2单克隆抗体。选择能够保持颜色不变的最小的蛋白量，一般为1ml胶体金结合12μg的蛋白，在实际操作中每1ml胶体金多补加10％的抗体蛋白。 

本发明的优点有：(1)以试纸条一步法检测大便隐血，方法简单、快速；(2)无论是粪便还是尿、胃液，都具有很好的灵敏度和特异性；(3)不受饮食及药物限制，对Hb的最低检测限度可达0.2μg/mL；(4)异种动物血及化学法常见的干扰物均不受影响，提示试纸条仅与血红蛋白抗原发生特异性结合。 

附图说明

图1为大便隐血检测试纸条结构示意图。 

图2为大便隐血检测试纸卡结构示意图。 

具体实施方式

下面结合图1对本发明做进一步展开说明，但需要指出的是，本发明的大便隐血检测试纸条并不限于这种特定的形状或结构。对于本领域技术人员显然可以理解的是，以下的说明内容即使不做任何调整或修正，也可以直接适用于在此未指明的其他类型或结构的试纸条。 

图1为大便隐血检测试纸条结构示意图，包括：其中，浸入区1、胶体金2、检测区3、质控区4、手持区5。在检测区(T)3包被有抗Hb1单克隆抗体，质控区(C)4包被羊抗鼠多克隆抗体，胶体金2包被有抗Hb2单克隆抗体。 

此时，大便隐血检测试剂盒包括大便隐血检测试纸条、样品处理管和取样棒。在使用过程中，应先查看盒中所有物品。在未做好测试准备前，不要提前撕开铝箔 袋。使用方法如下：1)用采便棒取豆粒大小的粪便于样品处理管里，在样品管中加入0.5ml蒸馏水，尽量搅拌均匀，让样品完全与蒸馏水混合。2)检测试剂条及病人样品应提前平衡至室温。3)撕开铝箔袋，取出检测试纸，请勿触摸到试纸中段白色部分。4)将试纸条按照箭头方向插入样本样品混合液中，注意不能浸没试剂条“MAX”线以上的部分，可在浸入15秒后取出试剂条平放于水平桌面，静置等待结果的出现。5)观察结果：在5分钟内判读结果，为保证结果的准确性，请勿在10分钟后判读结果。 

可通过检测区和质控区出现的色带情况判断结果如下：1)阳性：在检测区(T)及控制区(C)各出现一条色带，检测结果为阳性。2)阴性：仅在控制区(C)出现一条色带，检测结果为阴性。3)无效：控制区(C)无色带出现，表明试验无效，应重新进行检测。该试剂盒能检测出的血红蛋白的检测范围是0.2μg/mL-2000μg/mL。 

图2为大便隐血检测试纸卡结构示意图，包括：其中，胶体金2、检测区3、质控区4、手持区5、加样孔6。此种型式的检测试纸仅独立设置了加样孔，这就需要试剂盒中带有磷酸盐缓冲溶液，将待测样品溶液滴加至加样孔，其他步骤和结果判断方法同上，再此不做赘述。 

大便隐血检测试剂盒的制备方法，包括处理液的配置和试剂盒的制备两个大步骤，具体步骤明细如下： 

1)处理液的配制 

A金标垫处理液的配制：Tris-Hcl(10mM，PH＝7.4)+0.5％PVP+0.5％TW-20 

B样品垫处理液配制：Tris-Hcl(10mM，PH＝7.4)+1％PVP+1.8％S17+0.8％Casein 

C点膜抗体稀释液配制：PBS{PB(10mM，PH＝7.4)，0.85％NaCl} 

D标记抗体稀释液的配制：PB(10mM，PH＝7.4) 

E胶体金复合物稀释液的配制：PB(10mM，PH＝7.4)+20％蔗糖+1％BSA 

2)试剂盒的制备 

A膜材的处理： 

a样品垫的处理：将领用的样品垫(SB08)，用已经配制好的处理液浸泡，充分浸泡后置于烘房烘至湿度降到30％以下就可以收取膜材，收取的膜材要放置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口待用。 

b样品垫的处理：将领用的金标垫(KB50)，用已经配制好的处理液浸泡，充分浸泡后置于烘房烘至湿度降到30％以下就可以收取膜材，收取的膜材要放置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口待用。 

B点膜： 

a配液：取羊抗鼠多克隆抗体，用含2％蔗糖的PBS稀释成0.5mg/ml的抗体溶液。取血红蛋白单克隆抗体1，用含2％蔗糖的PBS稀释成1.0mg/ml的抗体溶液。 

b贴膜：领取NC膜和PVC胶板，将NC膜贴于PVC胶板的指定区域。 

c点膜：开启点膜喷金仪，设置好对应的参数，点膜浓度为1μl/cm，开始点膜。点好膜的胶板置于37℃烘箱中，烘12个小时，开启除湿机使烘箱所处的环境温度降为30％后即可收取胶板，收取的胶板置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。 

C胶体金复合物的制备 

a最佳PH值的测定 

按上表配制胶体金复合物，选择能够保持颜色不变的最低的PH值，一般选择1ml胶体金+18μlK₂CO₃

b最小蛋白结合量 

按上表配制胶体金复合物，选择能够保持颜色不变的最小的蛋白量，一般为1ml胶体金结合12μg的蛋白，在实际操作中每1ml胶体金多补加10％的抗体蛋白。通常，每更换一次胶体金或者抗体，将重新找最佳PH值和最小蛋白结合量。 

c胶体金复合物的制备：取一定量的胶体金，加入相应量的0.1MK₂CO₃，在磁力搅拌器上混匀，加入相应量的抗体溶液，磁力搅拌30min，再加入PEG20000使终浓度为0.1％，再磁力搅拌30min，4℃8000r离心40min，弃上清，沉淀用金标稀释液复溶(每30ml胶体金最后浓缩为1ml)。4℃储存备用。 

D喷金 

a调试：开启喷金仪，取出已处理好的的金标垫，用配制好的胶体金复合物进行喷金，先调试不同的喷金浓度(如2μl/cm、3μl/cm、4μl/cm、5μl/cm)置于37℃烘箱中，烘两个小时，挑选适合的原材料组装成板，最终确定哪种喷金浓度最合适。 

b喷金：按照调试的结果用点膜喷金仪进行喷金，喷好后置37℃烘箱中，烘两个小时，开启除湿机使烘箱所处的环境温服降为30％后即可收取金标垫，收取的金标垫置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。 

E膜材的切割：领取吸水纸CH27、已处理的样品垫和已喷金的金标垫，开启除湿机，使环境的温度降为30％以下后，按照一定的尺寸进行切割，切割好后的金标垫、样品垫、吸水纸置于不同的铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。 

F组装：领取PE膜条和MAX线，开启除湿机，使环境的湿度降为30％以下后取出已切割好的金标垫、样品垫、吸水纸和点过膜的胶板，揭掉金标垫位置的贴条，贴上金标垫，使金标垫少部分压着NC膜，再贴上样品垫，使使样品垫部分压着金标垫，贴上吸水纸，吸水纸少部分压着NC膜，最后贴上PE膜条和MAX线。组装好的胶板置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。 

G大板的切割：开启除湿机，使环境的湿度降为30％以下后取出已组装好的大板，再开启切割机，按照一定的尺寸切割，将切割好的试纸条置于铝箔袋中(铝箔袋中要放置一些干燥剂)，最后封口备用。 

H内包封口：将试纸条和干燥剂放入铝箔袋内，一个铝箔袋放一个试纸条和干燥剂。按生产日期调整封口机字码，开启封口机，预热至180℃，进行封口。封好后关闭封口机，贴待验证及流动卡，注明品名、批号、规格、生产日期、操作人。入中间站或外包，填写记录。 

本发明对于切割试纸的宽度没有任何限制，只要能实现本发明的技术方案即可，通常试纸宽度应不小于2.5mm，以保证液体移行速度应不低于10mm/min。最终大便隐血检测试剂盒的包装没有任何限制，试剂盒内包装的数量可随机，例如可以为1人份/盒、2人份/盒、3人份/盒、5人份/盒、10人份/盒、20人份/盒、50人份/盒、100人份/盒等等。 

实施例 

通过采用前述使用方法对本发明的大便隐血检测试剂盒(血红蛋白检测试剂盒)(胶体金免疫层析法)进行了200例临床样本的验证试验，对照组采用上海创凯生物技术有限公司生产的大便隐血检测试剂盒(胶体金法)进行检测。结果显示试验产品与对照组无显著性差异，与已上市同类产品检测结果基本一致，符合产品上市标准。 

尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我 们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书及附图所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。 

Claims (11)

1.一种大便隐血检测试剂盒，包括大便隐血检测试纸、样品处理管或采便混合器、取样棒，所述检测试纸包括检测区(T)、质控区(C)及胶体金，其特征在于所述检测区(T)包被有抗Hb1单克隆抗体，所述质控区(C)包被有羊抗鼠多克隆抗体，所述胶体金包被有抗Hb2单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的大便隐血检测试剂盒，其特征在于所述检测试纸为试纸条。

3.如权利要求2所述的大便隐血检测试剂盒，其特征在于所述试纸条由下往上依次由浸入区、胶体金、检测区、质控区和手持区组成。

4.如权利要求1所述的大便隐血检测试剂盒，其特征在于所述检测试纸为试纸卡。

5.如权利要求4所述的大便隐血检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求4或5所述的大便隐血检测试剂盒，其特征在于所述试纸卡还包括加样孔，由下往上依次由加样孔、胶体金、检测区、质控区和手持区组成。

7.权利要求1-6任一项大便隐血检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：

(1)处理液的配置步骤：按浓度比例配置金标垫处理液、样品垫处理液、点膜抗体稀释液、标记抗体稀释液和胶体金复合物稀释液；

(2)试剂盒的制备步骤：通过膜材的处理、点膜、胶体金复合物的制备、喷金、膜材的切割、组装、大板的切割和包装步骤得到铝箔袋封装完整的试剂盒。

8.如权利要求7所述的大便隐血检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述羊抗鼠多克隆抗体溶液的浓度为0.5mg/ml。

9.如权利要求7所述的大便隐血检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述血红蛋白单克隆抗体1溶液的浓度为1.0mg/ml。

10.如权利要求7所述的大便隐血检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述胶体金复合物中每1ml胶体金加入0～16μlK₂CO₃。

11.如权利要求7所述的大便隐血检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述胶体金复合物中每1ml胶体金结合8～16μg的抗Hb2单克隆抗体。

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