CN105467124A - 一种检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法，由底衬以及顺次搭接粘贴在底衬上的样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸组成，所述标记垫上包含有胶体金标记的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1，鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1浓度为5～20μg/mL，鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1浓度为5～20μg/mL。本发明对粪便中血红蛋白和转铁蛋白进行同步检测，特异性强，灵敏度高(Hb检出限为200ng/ml，Tf检出限均为40ng/ml)，对消化道出血性疾病的阳性检出率有显著提高，能准确检测无症状、少量、持续，肉眼和显微镜下看不到的消化道出血，并且不受动物血等药物干扰。

Description

一种检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法
(一)技术领域
本发明涉及一种检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法。
(二)背景技术
粪便隐血是指消化道少量出血，红细胞被消化破坏，粪便外观无异常改变，肉眼和显微镜下均不能证实的出血。粪便隐血检测是粪便常规检验项目之一，对于消化道出血及消化道肿瘤的诊断和鉴别诊断有重要的参考价值，常作为诊断消化道出血的筛选指标。
粪便隐血检测通常有化学法和免疫法两种。以愈创木酯、联苯胺、邻甲苯胺、还原酚酞、四甲基联苯胺等色原性物质为主体的化学检测方法，其中以邻甲苯胺化学法使用最多。化学法虽然费用低廉﹑反应快速﹑结果容易判断，但是易受多种因素干扰﹑易出现假阳性。基于特异性抗原抗体反应的免疫学方法，如乳胶免疫化学凝集法、ELISA法、免疫层析法等逐渐在临床广泛使用，其中免疫层析法被世界卫生组织和世界胃镜检查协会推荐用于粪便隐血检测。
目前研究较多方法即为便隐血试剂双联检测法，是特异性检测人粪便中的血红蛋白(Hb)和转铁蛋白(Tf)的检测方法。由于转铁蛋白在肠道内的稳定性及抗菌能力都高于血红蛋白，克服了血红蛋白易被胃酸、细菌降解消化的缺点，提高了在上消化道失血检测的阳性率。同时，由于在血液中Hb和Tf的比值为51.2/1，而粪便中Hb和Tf的比值为5.4/1，因此转铁蛋白法的敏感性高于血红蛋白胶体金检测法。而在遗传性无转铁蛋白血症，各种恶性疾病，炎症为主的多种疾病(如手术、创伤、心肌梗死、感染等)均可导致转铁蛋白值低下的情况中，Hb检测能弥补Tf检测的不足。所以，联合检测Hb和Tf法，灵敏度高、特异性强，对检测消化道出血的临床意义可起到优势互补的作用。
万华普曼公司率先研发出TF/Hb双联胶体金诊断试纸检测粪便隐血的新方法，将抗人TF抗体和抗人Hb抗体整合在同一试纸带上(两张试纸条拼接在一起，有两个加样口)，可同步检测TF与Hb，互不干扰，二者优势互补，但其Hb检出限有限(经测试，20μg/ml能检出，1μg/ml不能检出)，灵敏度和检出限有待进一步提高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种灵敏度高和检出限高、只需一次加样的检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法。
本发明采用的技术方案是：
一种检测便隐血的胶体金双联试纸条，由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸组成，其特征在于：所述样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸按层析方向顺次搭接粘贴在底衬上；
所述标记垫上包含有胶体金标记的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1，鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1浓度为5～20μg/mL，鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1浓度为5～20μg/mL；
所述包被膜上依次设置有检测线一、检测线二和质控线，检测线一和检测线二包被有与标记垫中的抗体具有不同表位的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2，质控线包被有鼠抗IgG；检测线一包被的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2的浓度为0.5～2mg/mL，用量按膜包被液量为30μl/27～35cm(采用专门的包膜机进行喷涂，设置速度为30μl/27～35cm，以1μl/cm为宜)；所述检测线二包被的鼠抗人Tf单克隆抗体Hb2的浓度为0.5～2mg/mL，用量按膜包被液量为30μl/27～35cm；所述质控线包被的羊抗鼠IgG浓度为0.5～2mg/mL，用量按膜包被液量为30μl/27～35cm。
所述胶体金颗粒的紫外扫描最大吸收波长为500～550nm(500～550nm吸收峰值3.0Abs，450nm是2.1Abs，600nm是1.5Abs)。
检测线一、检测线二和质控线间隔距离为3～5mm。
一种制备所述胶体金双联试纸条的方法，所述方法包括：
(1)制备0.01％～0.04％的胶体金颗粒溶液，将鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1分别进行标记，待充分混匀后，加入1％BSA，封闭5～15分钟后，以12000rpm离心5～15分钟，弃上清，沉淀用20～100mM、pH7.5～8.5磷酸盐缓冲液溶解(至原胶体金溶液体积的10％)，放置于2～8℃条件下备用；用含1％BSA、2％蔗糖的20～100mM、pH7.5～8.5磷酸盐缓冲液将两种胶体金溶液按2～10倍进行稀释后混合，将稀释后的溶液按40～60μL/cm2玻璃纤维均匀涂垫，37℃真空干燥0.5～1.5小时，裁剪宽度为5～10mm，得到标记垫；所述胶体金溶液中每1ml胶体金加入0～20μlK2CO3，选择能够保持颜色不变的最低的pH值，一般选择1ml胶体金加入10μlK2CO。所述胶体金溶液中每1ml胶体金结合8～20μg的单克隆抗体，选择能够保持颜色不变的最小的蛋白量，一般为1ml胶体金结合15μg的蛋白。
(2)分别将与步骤(1)中抗体具有不同表位的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2用包被缓冲液调节至浓度为0.5～2mg/mL，将羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节至浓度为0.5～2mg/mL，将鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2分别喷到包被膜上检测线一和检测线二处，将羊抗鼠IgG喷到包被膜上的质控线处；所述鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2、鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2和羊抗鼠IgG的用量按包膜包被液量均为30μl/27～35cm；质控线以及两条检测线间隔3～5mm，在湿度<30％，温度30～40℃烘箱中晾干8～12小时，封袋，备用；
(3)在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述试纸条。
所述样品垫为经过20～100mM、pH7.5～8.5的Tris-HCl缓冲液处理过的玻璃纤维棉材质，标记垫为玻璃纤维棉材质，包被膜为硝酸纤维素材质，底衬为PVP胶板材质。
本发明检测便隐血的胶体金双联试纸条的检测原理是双抗体夹心法，检测人粪便样本中微量血红蛋白(Hb)和转铁蛋白(Tf)。含血红蛋白抗原和/或转铁蛋白抗原的粪便样本稀释液层析至胶体金结合垫，与胶体金标记的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb1和/或鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf1形成胶体金抗体-抗原复合物，层析至检测区，分别与预包被的另一鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb2(检测线T1)和/或鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf2(检测线T2)，在检测区形成双抗体夹心复合物，呈现红色沉淀线；余下的未结合胶体金层析至质控线(C)与预包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体结合呈现红色的沉淀线。若样本中不含血红蛋白抗原和/或转铁蛋白抗原，则检测区没有其对应的红色沉淀线。无论样本中是否存在血红蛋白抗原和/或转铁蛋白抗原，质控线(C)都会出现一条红色沉淀线。
本发明对粪便中血红蛋白和转铁蛋白进行同步检测，特异性强，灵敏度高(Hb检出限为200ng/ml，Tf检出限均为40ng/ml)，对消化道出血性疾病的阳性检出率有显著提高，能准确检测无症状、少量、持续，肉眼和显微镜下看不到的消化道出血，并且不受动物血等药物干扰。
(四)附图说明
图1为本发明的检测便隐血的胶体金双联试纸条的结构示意图；
其中：1、样品垫；2、标记垫；3、包被膜；4、吸水纸；5、检测线；6、质控线；7、底衬。
图2为本发明产品与现有双联检测试剂检测结果对照；其中A为Hb200ng/mL，B为Hb400ng/mL，C为Hb1μg/mL，D为Hb20μg/mL，E为If40ng/mL，F为If200ng/mL，G为If400ng/mL，F为If40μg/mL；各图左侧条为本发明产品，右侧条为市购现有产品；
图3为本发明产品配套的塑料外壳。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
采用双抗体夹心法免疫层析原理，检测人粪便中微量血红蛋白和转铁蛋白。
如图1所示，在该实施例中，底衬7上顺次搭接样品垫1、标记垫2、包被膜3以及吸水纸4，样品垫1是加样区，用于吸取待测便隐血检测样本，包被膜3上设有检测线和质控线。
标记垫2上使用的是胶体金标记的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1(15μg/mL)和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1(18μg/mL)；包被膜3的检测线一和检测线二分别包被另一株鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2(1.8mg/mL)和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2(1.5mg/mL)。包被膜3的质控线包被浓度为0.8mg/mL的羊抗鼠IgG(其中鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1和Hb2采购自广州格瑞林生物科技有限公司，鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1和Tf2采购自山东奥创生物技术有限公司，羊抗鼠IgG来自长沙博优生物科技有限公司)，用于检测试纸条的有效性，鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2、鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2和羊抗鼠IgG的用量按膜包被液量均为1μl/cm。
检测便隐血的胶体金双联卡试纸条的制备包括以下步骤：
1.胶体金溶液的制备
加热一份595g纯化水，加入2.4ml10％氯金酸，煮沸。在搅拌的条件下再加入3.6ml10％柠檬酸三钠，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后继续煮沸，10min后停止加热，继续搅拌至冷却，得到胶体金溶液。使用紫外扫描确定最大吸收峰波长为530nm。
2.胶体金标记蛋白的制备
取两个试管加入胶体金溶液分别标记鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1。试管1加入12μl/mL的0.1M碳酸钾水溶液，再加入15μg/mL鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1；试管2加入10μl/mL的0.1M碳酸钾水溶液，再加入18μg/mL鼠抗人Hb单克隆抗体Tf1；两试管待充分混匀后，分别加入1％BSA，封闭10分钟后，以12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用50mM、pH8.0磷酸盐缓冲液溶解至原体积的10％。用含1％BSA、2％蔗糖的20mM、pH8.0磷酸盐缓冲液将两种胶体金复溶液分别稀释4倍后混合，将稀释后的基础液按50μL/cm2玻璃纤维均匀涂垫，37℃真空干燥1小时，裁剪宽度为7mm，得到标记垫。
3.包被膜的制备
分别将另一种鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb2和鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf2用包被缓冲液调节至浓度为1.8mg/mL，将羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节至浓度为1.5mg/mL，将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb2和鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf2喷到包被膜上检测线T1和T2线，将羊抗鼠IgG喷到包被膜上的质控区C线，所述鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb2、鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf2和羊抗鼠多克隆抗体的用量按包膜包被液量均为1μl/cm。质控线和两条检测线间隔4mm，在湿度<30％，温度37℃烘箱中晾干10小时，封袋，备用；
4.在底衬(尺寸为60*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(尺寸为18*300mm，玻璃纤维棉材质，先经50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液浸渍处理2h)、标记垫(尺寸为7*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸(尺寸为16*300mm)得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
本发明检测便隐血的胶体金双联卡试纸条，在使用时，组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中(参见图3)，塑料上壳设有两个开孔，加样窗和显示孔，加样窗对应于所述的检测便隐血胶体金双联卡试纸条样品垫1，结果显示窗对应于所述检测便隐血胶体金双联卡试纸条的检测线5和质控线6，该检测便隐血胶体金双联卡试纸条可以从该塑料外壳中取出。
采用质控品(血红蛋白配制浓度200ng/ml，400ng/ml，1μg/ml，20μg/ml；转铁蛋白配制浓度40ng/ml，100ng/ml，400ng/ml，40μg/ml)对本发明产品和市购产品进行检出限检测，结果见图2，结果显示：本发明产品Hb检出限为200ng/ml，万华产品1μg/ml仍检不出来，20μg/ml检出；本发明产品Tf和万华Tf检出限均为40ng/ml，可见本发明产品灵敏度较高，而且本发明产品仅需一次加样即可，操作更为方便。

Claims (5)

1.一种检测便隐血的胶体金双联试纸条，由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸组成，其特征在于：所述样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；
所述标记垫上包含有胶体金标记的鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体，鼠抗人Hb单克隆抗体浓度为5～20μg/mL，鼠抗人Tf单克隆抗体浓度为5～20μg/mL；
所述包被膜上依次设置有检测线一、检测线二和质控线，检测线一和检测线二包被有与标记垫中的抗体具有不同表位的鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体，质控线包被有鼠抗IgG；检测线一包被的鼠抗人Hb单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/mL，用量按膜包被液量为30μl/27～35cm；所述检测线二包被的鼠抗人Tf单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/mL，用量按膜包被液量为30μl/27～35cm；所述质控线包被的羊抗鼠IgG浓度为0.5～2mg/mL，用量按膜包被液量为30μl/27～35cm。
2.如权利要求1所述的胶体金双联试纸条，其特征在于：所述胶体金颗粒的紫外扫描最大吸收波长为500～550nm。
3.如权利要求1所述的胶体金双联试纸条，其特征在于：检测线一、检测线二和质控线间隔距离为3～5mm。
4.一种制备如权利要求1所述胶体金双联试纸条的方法，所述方法包括：
(1)制备0.01％～0.04％的胶体金颗粒溶液，将鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体分别进行标记，待充分混匀后，加入1％BSA，封闭5～15分钟后，以12000rpm离心5～15分钟，弃上清，沉淀用20～100mM、pH7.5～8.5磷酸盐缓冲液溶解至原胶体金颗粒溶液体积的10％，放置于2～8℃条件下备用；用含1％BSA、2％蔗糖的20～100mM、pH7.5～8.5磷酸盐缓冲液将两种胶体金溶液按2～10倍进行稀释后混合，将稀释后的溶液按40～60μL/cm2玻璃纤维均匀涂垫，37℃真空干燥0.5～1.5小时，裁剪宽度为5～10mm，得到标记垫；
(2)分别将与步骤(1)中抗体具有不同表位的鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体用包被缓冲液调节至浓度为0.5～2mg/mL，将羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节至浓度为0.5～2mg/mL，将鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体分别喷到包被膜上检测线一和检测线二处，将羊抗鼠IgG喷到包被膜上的质控线处；所述鼠抗人Hb单克隆抗体、鼠抗人Tf单克隆抗体和羊抗鼠IgG的用量按包膜包被液量均为30μl/27～35cm；质控线以及两条检测线间隔3～5mm，在湿度<30％，温度30～40℃烘箱中晾干8～12小时，封袋，备用；
(3)在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述试纸条。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述样品垫为经过20～100mM、pH7.5～8.5的Tris-HCl缓冲液处理过的玻璃纤维棉材质，标记垫为玻璃纤维棉材质，包被膜为硝酸纤维素材质，底衬为PVP胶板材质。
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