CN111748039A

CN111748039A - 抗cea抗体及其应用、可分泌抗cea抗体的细胞及其制备方法

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Publication number: CN111748039A
Application number: CN202010500641.9A
Authority: CN
Inventors: 吴力强; 谢妮; 阎锡蕴; 刑智浩; 林晓涛; 钱纯亘; 胡鹍辉
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS; Shenzhen Yhlo Biotech Co Ltd; Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS; Shenzhen Yhlo Biotech Co Ltd; Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN111748039B

Abstract

本发明涉及一种抗CEA抗体及其应用、可分泌抗CEA抗体的细胞及其制备方法。抗CEA抗体包括第一结构域和第二结构域，第一结构域包括第一轻链可变区和第一重链可变区，第一轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，第一重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；第二结构域包括第二轻链可变区和第二重链可变区，第二轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，第二重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。上述抗CEA抗体的特异性较好。

Description

抗CEA抗体及其应用、可分泌抗CEA抗体的细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗CEA抗体及其应用、可分泌抗CEA抗体的细胞及其制备方法。

背景技术

癌症又称恶性肿瘤，能够无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗，癌细胞还能够释放出多种毒素，使人体产生一系列病变症状，癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖。癌症的发生给众多病人的生活带来极大的困扰，甚至直接威胁着机体的生命健康。对于癌症的治疗，越早发现，越早治疗，其治疗效果越好。

传统的肿瘤筛查方法主要为X线摄影或检测血清肿瘤标志物等，但X射线对人体产生的不可逆损伤作用也不容忽视。一般地，采用CEA(即癌胚抗原)抗体来检测CEA，以进行肿瘤筛查。然后，现有的抗CEA抗体的特异性较差，不能满足实际需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种特异性较好的抗CEA抗体及其应用。

此外，还提供一种可分泌抗CEA抗体的细胞及其制备方法。

一种抗CEA抗体，其特征在于，包括：

第一结构域，包括第一轻链可变区和第一重链可变区，所述第一轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第一重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；及

第二结构域，包括第二轻链可变区和第二重链可变区，所述第二轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述第二重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述抗CEA抗体具有第一结构域和第二结构域，第一结构域包括氨基酸序列如SEQID No.1所示的第一轻链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的第一重链可变区，第二结构域包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的第二轻链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示的第二重链可变区，使得第一结构域和第二结构域能够分别识别CEA的不同表位，使得抗CEA抗体具有较高的特异性，有利于CEA的准确检测。经试验验证，采用上述抗CEA抗体对CEA检测的特异性在98％以上，特异性较高。

其中一个实施例中，所述第一结构域还包括连接的第一轻链恒定区和第一重链恒定区，所述第一轻链恒定区和所述第一重链恒定区分别与所述第一轻链可变区和所述第一重链可变区连接，所述第二结构域还包括连接的第二轻链恒定区和第二重链恒定区，所述第二轻链恒定区和所述第二重链恒定区分别与所述第二轻链可变区和所述第二重链可变区连接，所述第二重链恒定区与所述第一重链恒定区连接。

其中一个实施例中，所述第一轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所述第二轻链恒定区的氨基酸序列与所述第一轻链恒定区的氨基酸序列相同，所述第一重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，所述第二重链恒定区的氨基酸序列与所述第一重链恒定区的氨基酸序列相同。

其中一个实施例中，所述第一轻链恒定区的编码序列如SEQ ID No.11所示，所述第二轻链恒定区的编码序列与所述第一轻链恒定区的编码序列相同，所述第一重链恒定区的编码序列如SEQ ID No.12所示，所述第二重链恒定区的编码序列与所述第一重链恒定区的编码序列相同。

一种可分泌抗CEA抗体的细胞的制备方法，包括如下步骤：

采用转染组合物转染动物细胞，培养，得到可分泌抗CEA抗体的细胞，其中，转染组合物包括第一质粒、第二质粒和转染试剂，所述第一质粒含有第一轻链可变区的编码序列和第一重链可变区的编码序列，所述第一轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第一重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述第二质粒含有第二轻链可变区的编码序列和第二重链可变区的编码序列，所述第二轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示，所述第二重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

其中一个实施例中，所述采用转染组合物转染动物细胞的步骤之前，还包括制备所述第一质粒的步骤：将所述第一轻链可变区的编码序列和所述第一重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到第一质粒，其中，所述第一轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.5所示，所述第一重链可变区的编码序列如SEQ ID No.6所示。

其中一个实施例中，所述将所述第一轻链可变区的编码序列和所述第一重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中的步骤之前，还包括如下步骤：

采用序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.14所示的引物对扩增所述第一轻链可变区的编码序列；及

采用序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示的引物对扩增所述第一重链可变区的编码序列。

其中一个实施例中，所述采用转染组合物转染动物细胞的步骤之前，还包括制备所述第二质粒的步骤：将所述第二轻链可变区的编码序列和所述第二重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到第二质粒，所述第二轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.7所示，所述第二重链可变区的编码序列如SEQ ID No.8所示。

其中一个实施例中，所述将所述第二轻链可变区的编码序列和所述第二重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中的步骤之前，还包括如下步骤：

采用序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.14所示的引物对扩增所述第二轻链可变区的编码序列；及

采用序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示的引物对扩增所述第二重链可变区的编码序列。

其中一个实施例中，所述可分泌抗CEA抗体的细胞的保藏号为CCTCC NO：C2019246。

上述抗CEA抗体或者上述可分泌抗CEA抗体的细胞在制备CEA检测试剂或者CEA检测设备中的应用。

一种CEA检测试纸，包括：

上述抗CEA抗体或者上述所述的可分泌抗CEA抗体的细胞分泌的抗CEA抗体；及

固相载体，与所述抗CEA抗体结合。

附图说明

图1为一实施方式的抗CEA抗体的结构示意图；

图2为pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒的图谱；

图3为一实施方式的CEA检测试纸条的结构示意图；

图4为实施例9中抗CEA抗体的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的抗CEA抗体具有较高的亲和力，对CEA具有较高的特异性，能够用于制备CEA检测试剂或者CEA检测设备，有利于肿瘤的准确筛查。其中，CEA检测试剂例如可以为CEA检测试剂盒，CEA检测设备例如可以为CEA检测试纸条。

具体地，包括第一结构域和第二结构域。第一结构域包括第一轻链可变区和第一重链可变区。第一轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，第一重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。第二结构域包括第二轻链可变区和第二重链可变区。第二轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，第二重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。其中，如SEQ ID No.1所示的序列为：MAPAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKSDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDPEDVATYFCQQGDMFMFGGGTKLEI。如SEQ ID No.2所示的序列为：MGWVWNLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGYTFTNYAMNWVKQAPGKGLKWMGWINTNTGEPTYAEEFKGRFAFSLETSATAAYLQINNLKNDDTASYFCARGWVLYAMDYWGQGTSVTVSS。如SEQ ID No.3所示的序列为：MAPAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKSDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDPEDVATYFCQQGDMFMFGGGTKLEIK。如SEQ ID No.4所示的序列为：MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSGYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPRSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKTTMYLQMSKVRSEDTALYYCIRLGYYGFFAYWGQGTLVTVSA。

上述抗CEA抗体具有第一结构域和第二结构域，第一结构域包括氨基酸序列如SEQID No.1所示的第一轻链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的第一重链可变区，第二结构域包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的第二轻链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示的第二重链可变区，使得第一结构域和第二结构域能够分别识别CEA的不同表位，使得抗CEA抗体具有较高的特异性，有利于肿瘤的准确筛查。

在其中一个实施例中，第一轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.5所示，第一重链可变区的编码序列如SEQ ID No.6所示。

其中，如SEQ ID No.5所示的序列为：ATGGCCCCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAATCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGACCCAGAAGATGTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTGATATGTTTATGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATC。

如SEQ ID No.6所示的序列为：ATGGGTTGGGTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATCCAAGCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGACTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGCAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCAACACTGGAGAGCCAACATACGCTGAAGAGTTCAAGGGACGTTTTGCCTTCTCTTTGGAGACCTCTGCCACCGCTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGATGACACGGCTTCATATTTCTGTGCAAGAGGCTGGGTCCTTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA。

在其中一个实施例中，第二轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.7所示，第二重链可变区的编码序列如SEQ ID No.8所示。其中，如SEQ ID No.7所示的序列为：ATGGCCCCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAATCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGACCCAGAAGATGTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTGATATGTTTATGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA。如SEQ ID No.8所示的序列为：ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTGGCTACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCACGTAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAAACTACGATGTATCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTATAAGACTGGGATACTACGGCTTCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。

需要说明的是，由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的编码序列。因此本申请中的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，除可由SEQ IDNO.5所示的编码序列所编码，也可由SEQ ID NO.5所示编码序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的编码序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的第二轻链可变区的氨基酸序列，因此，编码上述第二轻链可变区的编码序列并不仅限于SEQ ID NO.5所示的编码序列。如果编码得到的蛋白与本申请的抗CEA抗体没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

同理，本申请中的如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，除可由SEQ ID NO.6所示的编码序列所编码，也可由SEQ ID NO.6所示编码序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的编码序列所编码得到。本申请中的如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，除可由SEQ ID NO.7所示的编码序列所编码，也可由SEQ ID NO.7所示编码序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的编码序列所编码得到。本申请中的如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，除可由SEQ ID NO.8所示的编码序列所编码，也可由SEQ ID NO.8所示编码序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的编码序列所编码得到。

此外，由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。

一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述编码序列编码的到的多肽或上述氨基酸序列组成的多肽，如果编码得到的蛋白本申请的抗CEA抗体没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。

在其中一个实施例中，第一结构域还包括连接的第一轻链恒定区和第一重链恒定区，第一轻链恒定区和第一重链恒定区分别与第一轻链可变区和第一重链可变区连接，第二结构域还包括连接的第二轻链恒定区和第二重链恒定区，第二轻链恒定区和第二重链恒定区分别与第二轻链可变区和第二重链可变区连接，第二重链恒定区与第一重链恒定区连接。

在其中一个实施例中，第一轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，第二轻链恒定区的氨基酸序列与第一轻链恒定区的氨基酸序列相同，第一重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，第二重链恒定区的氨基酸序列与第一重链恒定区的氨基酸序列相同。其中，如SEQ ID No.9所示的序列为：RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*。其中，“*”表示终止或者结束，即终止密码子翻译成氨基酸后的输出结果。如SEQ ID No.10所示的序列为：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*。其中，“*”表示终止或者结束，即终止密码子翻译成氨基酸后的输出结果。

上述如SEQ ID No.9～SEQ ID No.10所示的氨基酸序列，使得抗CEA抗体的恒定区为人缘的，能够降低HAMA效应，提高抗CEA抗体的检测灵敏度。

在其中一个实施例中，第一轻链恒定区的编码序列如SEQ ID No.11所示，第二轻链恒定区的编码序列与第一轻链恒定区的编码序列相同，第一重链恒定区的编码序列如SEQ ID No.12所示，第二重链恒定区的编码序列与第一重链恒定区的编码序列相同。其中，如SEQ ID No.11所示的序列为：CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA。如SEQ ID No.12所示的序列为：GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA。

正如前文论述，本申请中的如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列，除可由SEQ IDNO.11所示的编码序列所编码，也可由SEQ ID NO.11所示编码序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的编码序列所编码得到。本申请中的如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列，除可由SEQ ID NO.12所示的编码序列所编码，也可由SEQ ID NO.12所示编码序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的编码序列所编码得到。

如图1所示，抗CEA抗体中，第一轻链可变区111和第一轻链恒定区113从N端靠近C端的方向依次连接，第一重链可变区115和第一重链恒定区117从N端靠近C端的方向依次连接，第一重链恒定区117与第一轻链恒定区113通过二硫键连接；第二轻链可变区211和第二轻链恒定区213从N端靠近C端的方向依次连接，第二重链可变区215和第二重链恒定区217从N端靠近C端的方向依次连接，第二重链恒定区217与第二轻链恒定区213通过二硫键连接，第二重链恒定区217与第一重链恒定区117通过二硫键连接。

可以理解，抗CEA抗体的结构不限于上述结构，第一轻链恒定区113、第一重链恒定区117、第二轻链恒定区213和第二重链恒定区217可以省略，此时，可以根据本领域的常规手段将本研究公开的第一轻链可变区111、第一重链可变区115、第二轻链可变区211和第二重链可变区215组装成抗CEA抗体。例如：第一轻链恒定区113、第一重链恒定区117、第二轻链恒定区213和第二重链恒定区217均省略时，第一轻链可变区111、第一重链可变区115、第二轻链可变区211和第二重链可变区215形成scFv(即单链抗体)。

上述实施方式的抗CEA抗体具有第一结构域和第二结构域，第一结构域包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的第一轻链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的第一重链可变区，第二结构域包括氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的第二轻链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的第二重链可变区，使得第一结构域和第二结构域能够分别识别CEA的不同表位，使得抗CEA抗体具有较高的特异性，有利于肿瘤的准确筛查。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，仅次于子宫癌。一般地，诊断CEA的方法包括超声检查、MRI检查、CT检查、X射线、肿瘤标志物检测等。这些检查方式不利用乳腺癌的早期筛查。并且，现有的肿瘤标志物检测主要是通过抗体检测血清基质中的CEA抗原，如果将抗体直接用于检测乳头溢液当中存在的CEA抗原时，容易出现因基质不同而导致检测结果存在假阴性以及假阳性的问题。上述抗CEA抗体的亲和力较高，能够与CEA的不同表位，特异性较高和灵敏度较高，能够用于乳腺癌的早期检测，并且假阴性率和假阳性率较低，有利于提高检测的准确性。

一实施方式的可分泌抗CEA抗体的细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用混合物转染动物细胞，培养，得到可分泌抗CEA抗体的细胞。

其中，转染组合物包括第一质粒、第二质粒和转染试剂第一质粒含有第一轻链可变区的编码序列和第一重链可变区的编码序列，第一轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，第一重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。第二质粒含有第二轻链可变区的编码序列和第二重链可变区的编码序列，第二轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示，第二重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

在其中一个实施例中，转染组合物中第一质粒、第二质粒和转染试剂的质量比为1：1：5～1：1：8。进一步地，转染组合物中第一质粒的浓度为10μg/mL～15μg/mL。转染时细胞密度为3×10⁶个细胞/mL～5×10⁶个细胞/mL，细胞培养液与转染组合物的体积比为10:1～30：1。此种设置，有利于提高转染效率。

在其中一个实施例中，转染温度为36℃～38℃。培养时间为48h～96h。

在其中一个实施例中，动物细胞为HEK293细胞。需要说明的是，动物细胞不限于上述指出的细胞，也可以为其他细胞，例如CHO细胞。

在其中一个实施例中，采用混合物转染动物细胞的步骤之前，还包括制备第一质粒的步骤：将第一轻链可变区的编码序列和第一重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到第一质粒，其中，第一轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.5所示，第一重链可变区的编码序列如SEQ ID No.6所示。

其中，pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒的图谱如图2所示。pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒包括人缘抗体重链恒定区和人缘抗体轻链恒定区，人缘抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，人缘抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，人缘抗体轻链恒定区的编码序列如SEQ ID No.11所示，人缘抗体重链恒定区的编码序列如SEQ ID No.12所示。

具体地，将第一轻链可变区的编码序列和第一重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到第一质粒的步骤包括S111～S112：

S111、将第一重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到含有第一重链可变区编码序列的质粒。

具体地，在第一重链可变区的编码序列的上游添加Xho1酶切位点，且其下游添加Nhe1酶切位点，然后克隆到pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒，得到含有第一重链可变区编码序列的质粒。

S112、将第一轻链可变区的编码序列克隆至含有第一重链可变区编码序列的质粒中，得到第一质粒。

具体地，在第一轻链可变区的编码序列的上游添加Sac1酶切位点，且其下游添加Hind111酶切位点，然后克隆到含有第一重链可变区编码序列的质粒中，得到第一质粒。

在其中一个实施例中，将第一轻链可变区的编码序列和第一重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中的步骤之前，还包括如下步骤S120～S130：

S120、采用序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.14所示的引物对扩增第一轻链可变区的编码序列。

其中，如SEQ ID No.13所示的序列为：5’-ATGGAGACACACTACAGTGACCTGCTAT-3’；如SEQ ID No.14所示的序列为：5’-GTCGACTTACCAGTGTTTGATTTCCAGCTT-3’。第一轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.5所示。

需要说明的是，扩增第一轻链可变区的编码序列的模板可以为根据编码第一轻链可变区的核苷酸序列(例如如SEQ ID No.5所示的序列)化学合成的核苷酸序列，也可以为能够表达含有第一轻链可变区的抗体的杂交瘤细胞的基因。

在其中一个实施例中，扩增采用热启动。扩增反应条件为：94℃5min；94℃45s，54℃45s，72℃1min，30个循环；72℃7min。

S130、采用序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示的引物对扩增第一重链可变区的编码序列。

其中，如SEQ ID No.15所示的序列为：5’-TGGCATGAAGCTGAGTGATCCTCTT-3’；如SEQID No.16所示的序列为：5’-TGTCGTGCTAGCTGGGGAGACAGTGA-3’。第一重链可变区的编码序列如SEQ ID No.6所示。

其中，扩增采用热启动。扩增反应条件为：94℃5min；94℃45s，54℃45s，72℃1min，30个循环；72℃7min。

需要说明的是，扩增第一重链可变区的编码序列的模板可以为根据编码第一重链可变区的核苷酸序列(例如如SEQ ID No.6所示的序列)化学合成的核苷酸序列，也可以为能够表达含有第一重链可变区的抗体的杂交瘤细胞的基因。

需要说明的是，S130和S120的顺序不限，可以先进行S130再进行S120，也可以先进行S120再进行S130，还可以S130和S120并行。

在其中一个实施例中，采用混合物转染动物细胞的步骤之前，还包括制备第二质粒的步骤：将第二轻链可变区的编码序列和第二重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到第二质粒，第二轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.7所示，第二重链可变区的编码序列如SEQ ID No.8所示。

具体地，将第二轻链可变区的编码序列和第二重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到第二质粒的步骤包括S211～S212：

S211、将第二重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到含有第二重链可变区编码序列的质粒。

具体地，在第二重链可变区的编码序列的上游添加Xho1酶切位点，且其下游添加Nhe1酶切位点，然后克隆到pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒，得到含有第二重链可变区编码序列的质粒。

S212、将第二轻链可变区的编码序列克隆至含有第二重链可变区编码序列的质粒中，得到第二质粒。

具体地，在第二轻链可变区的编码序列的上游添加Sac1酶切位点，且其下游添加Hind111酶切位点，然后克隆到含有第二重链可变区编码序列的质粒中，得到第二质粒。

在其中一个实施例中，将第二轻链可变区的编码序列和第二重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中的步骤之前，还包括如下步骤S220～S230：

S220、采用序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.14所示的引物对扩增第二轻链可变区的编码序列。

其中，第二轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.7所示。

需要说明的是，扩增第二轻链可变区的编码序列的模板可以为根据编码第二轻链可变区的核苷酸序列(例如如SEQ ID No.7所示的序列)化学合成的核苷酸序列，也可以为能够表达含有第二轻链可变区的抗体的杂交瘤细胞的基因。

S230、采用序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示的引物对扩增第二重链可变区的编码序列。

其中，第二重链可变区的编码序列如SEQ ID No.8所示。

需要说明的是，扩增第二重链可变区的编码序列的模板可以为根据编码第二重链可变区的核苷酸序列(例如如SEQ ID No.8所示的序列)化学合成的核苷酸序列，也可以为能够表达含有第二重链可变区的抗体的杂交瘤细胞的基因。需要说明的是，S230和S220的顺序不限，可以先进行S230再进行S220，也可以先进行S220再进行S230，还可以S230和S220并行。

在一个具体示例中，可分泌抗CEA抗体的细胞于2019年9月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2019246，分类命名：CEA双特异性抗体293T细胞株。该细胞株能够分泌上述实施方式的抗CEA抗体，抗体亲和力较高，对CEA的特异性较高，有利于对CEA的准确检测。

上述可分泌抗CEA抗体的细胞的制备方法，得到的细胞株能够分泌上述实施方式的抗CEA抗体，对CEA的特异性较高，有利于对CEA的准确检测，能够用于制备CEA检测试剂或者CEA检测装置。其中，CEA检测试剂例如可以为CEA检测试剂盒，CEA检测设备例如可以为CEA检测试纸条。

如图3所示，一实施方式的CEA检测试纸包括上述实施方式的抗CEA抗体以及与抗CEA抗体结合的固相载体。CEA检测试纸能够准确检测待测样品中的CEA含量，能够应用于CEA检测装置中。

在其中一个实施例中，待测样品为乳头溢液或血液。

具体地，CEA检测试纸包括底板300、以及设于底板300上的上样垫400、结合垫500、包被膜600以及吸收垫700。上样垫400、结合垫500、包被膜600以及吸收垫700从底板300的一端至另一端顺次连接。结合垫500上设有纳米酶标记抗CEA抗体。包被膜600上设有检测线610。检测线610设有抗CEA抗体。

由于上述抗CEA抗体能够与CEA的不同表位结合，使得样本中的CEA能够与纳米酶标记抗CEA抗体、抗CEA抗体结合形成双抗体夹心复合物，结合效果更好，提高检测的准确性，并且，还能够避免包被膜600和检测线610设置两种不同的CEA抗体，操作简单，节省生产成本。

底板300为CEA检测试纸的承载体。在其中一个实施例中，底板300为PVC板(聚氯乙烯底板)或玻璃基板等。在图示实施例中，底板300为PVC板。PVC板轻薄，且具有良好的耐腐蚀性能以及良好的防水性能，避免抗体以及待测样本渗漏。

在其中一个实施例中，上样垫400为聚酯纤维素膜。结合垫500为聚酯纤维素膜。包被膜600为硝酸纤维素膜。进一步地，包被膜600为密理博HF120硝酸纤维素膜。

在其中一个实施例中，纳米酶标记抗CEA抗体中，纳米酶与抗CEA抗体的质量比为1:5～1:20。该比例下能够保证得到的反应曲线更加平滑，避免因抗体浓度过低导致低端灵敏度较低，也避免因抗体浓度过高而导致高端梯度不足。

在其中一个实施例中，纳米酶能够催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色。3,3',5,5'-四甲基联苯胺即TMB，为一种新型安全的色原试剂。需要说明的是，纳米酶不限于能够催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色的纳米酶，也可以为能够催化其他显色剂的纳米酶，例如能够催化DAB显色剂显色的纳米酶。

在其中一个实施例中，纳米酶为磁性四氧化三铁纳米颗粒。进一步地，纳米酶表面具有结合基团，结合基团能够与抗CEA抗体结合。具体地，结合基团选自有羧基(-COOH)、氨基(-NH₂)、甲苯磺酰基(-CH₃-C₆H₅-SO₂)及氯甲苯基(-C₆H₄-CH₂Cl)中的至少一种。

在其中一个实施例中，纳米酶的粒径为90nm～200nm。

在其中一个实施例中，纳米酶为采用专利201610416819.5公开的方法制备得到的纳米酶。

在其中一个实施例中，纳米酶标记抗CEA抗体的通过如下步骤制备得到：将纳米酶、碳二亚胺及N-羟基琥珀酰亚胺混合并反应，固液分离，收集沉淀；将沉淀与抗CEA抗体进行反应，得到纳米酶标记抗CEA抗体。

具体地，将10mM～100mM、pH4～6的MES缓冲液与纳米酶混匀，得到纳米酶混合液，纳米酶混合液中纳米酶的浓度为0.2mg/mL～2mg/mL；加入终浓度为0.1mg/mL～5mg/mL的碳二亚胺和终浓度为0.1mg/mL～5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温孵育20min～40min，孵育过程中进行搅拌以使纳米酶呈悬浮状态；固液分离，收集沉淀；采用10mM～100mM、pH6.0～8.0的MES缓冲液将沉淀复溶后，按照抗CEA抗体与纳米酶的质量比为1:5～1:20加入0.1mg/mL～1mg/mL的抗CEA抗体于室温下反应2h，固液分离，弃去上清，得到纳米酶标记抗CEA抗体。进一步地，将10mM～100mM、pH4～6的MES缓冲液与纳米酶混匀之前，还包括采用10mM～100mM、pH4～6的MES缓冲液将纳米酶清洗1次～2次。

采用10mM～100mM、pH6.0～8.0的MES缓冲液将沉淀复溶，然后加入抗CEA抗体于室温下反应2h的步骤之前，还包括如下步骤：10mM～100mM、pH6.0～8.0的MES缓冲液将沉淀清洗至少3次。

采用10mM～100mM、pH6.0～8.0的MES缓冲液将沉淀复溶，然后加入抗CEA抗体进行反应的步骤之后，还包括如下步骤：清洗沉淀与抗CEA抗体反应得到的反应物，清洗液为10mM～100mM、pH6.0～8.0的MES缓冲液。

在其中一个实施例中，向沉淀中加入抗CEA抗体进行反应之后，还包括如下步骤：向沉淀与抗CEA抗体反应得到的反应物中加入封闭液进行反应。封闭液包括0.01M～0.1M的Tris-HCl缓冲液、质量百分含量为0.1％～1％的PEG2000及质量百分含量为0.01％～0.1％的Tween20。采用此封闭液能够封闭纳米酶上未结合的基团位点，以降低纳米酶标记抗CEA抗体的非特异性反应。进一步地，加入封闭液后的反应时间为至少1h。

进一步地，向沉淀与抗CEA抗体反应得到的反应物中加入封闭液进行反应的步骤具体为：将沉淀与抗CEA抗体反应得到的反应物固液分离，得到反应沉淀；向反应沉淀中加入封闭液进行反应。

进一步地，向沉淀与抗CEA抗体反应得到的反应物中加入封闭液进行反应的步骤之后，还包括采用封闭液清洗纳米酶标记抗CEA抗体。清洗次数为1次～2次。更进一步地，向纳米酶标记抗CEA抗体中加入保存液，得到终浓度为0.1mg/mL～1mg/mL的抗体储备液。保存液包括0.01M～0.1M的PBS缓冲液、质量百分含量为0.1％～1％的牛血清白蛋白、质量百分含量为0.01％～0.1％的Triton X-100及质量百分含量为1％～5％的海藻糖。

在其中一个实施例中，结合垫500上还设置有纳米酶标记兔IgG。包被膜600上还设有与检测线610间隔的质控线620。质控线620位于检测线610靠近吸收垫700的一侧。质控线620设有羊抗兔IgG。

在其中一个实施例中，纳米酶标记兔IgG中，纳米酶与兔IgG的质量比为1:4～1:20。进一步地，纳米酶标记兔IgG的制备过程包括：取纳米酶，用10mM～100mM、pH6.0～8.0的MES缓冲液清洗2次(每次清洗混悬1～2次)，磁性分离，取出上清；用10mM～100mM，pH6.0～8.0的MES缓冲液调节兔IgG的蛋白浓度至0.2mg/mL～2mg/mL，加入到纳米酶中，然后在室温状态下反应2h～4h，加入终止液(即质量百分含量为50％的乙醇胺的水溶液)，轻微振荡，反应30min；反应结束后，加入保存液(保存液包括0.01M～0.1M的PBS缓冲液、质量百分含量为0.1％～1％的牛血清白蛋白、质量百分含量为0.01％～0.1％的Triton X-100及质量百分含量为1％～5％的海藻糖)定容，得到终浓度为0.1mg/mL～1mg/mL的质控液，4℃保存。

进一步地，检测线610从第一方向跨越包被膜600。第一方向为能够与结合垫500至吸收垫700的连线相交的方向。质控线620从第二方向跨越包被膜600。第二方向为能够与结合垫500至吸收垫700的连线相交的方向。例如检测线610和质控线620横跨或斜跨包被膜600，使得从结合垫500至吸收垫700，待测样本必然要经过检测线610与质控线620，防止漏检，出现假阴性的结果。

在图示实施例中，第一方向为与结合垫500至吸收垫700的连线垂直的方向。第二方向为与结合垫500至吸收垫700的连线垂直的方向。检测线610与质控线620平行设置。这种设计能够减少检测线610与质控线620上的抗体的用量，节约成本。

进一步地，检测线610与质控线620之间的间距为4mm～8mm。

在其中一个实施方式中，吸收垫700为具有良好吸水性能的吸水纸，使得待检测的样本能够在吸收垫700的吸引下从上样垫400出发依次经过结合垫500以及包被膜600。

在其中一个实施方式中，上样垫400、结合垫500、包被膜600以及吸收垫700从底板300的一端向另一端依次设置在底板300上，上样垫400与结合垫500重叠的长度为1mm～5mm。结合垫500与包被膜600重叠的长度为1mm～5mm。包被膜600与吸收垫700重叠的长度为1mm～5mm。此种设置下，待测样本加入上样垫400后，能够在吸收垫700的作用下依次经过结合垫500和包被膜600，并根据包被膜600的检测线610和质控线620的信号值变化，检测待测样本中CEA的含量。

进一步地，上样垫400、结合垫500、包被膜600以及吸收垫700依次搭接。上样垫400部分位于结合垫500远离底板300的一侧上。结合垫500部分位于包被膜600远离底板300的一侧上。吸收垫700部分位于包被膜600远离底板300的一侧上。这种设计使得待测样本从上样垫400出发依次经过结合垫500和包被膜600，流动更加顺畅。

具体地，在底板300上顺次相互搭接地黏贴上样垫400、结合垫500、包被膜600和吸收垫700得到试纸条，按照切割要求切割成2.5mm～6mm宽度的试纸条，得到CEA检测试纸。

上述实施方式的CEA检测试纸的使用过程如下：

使用时，将待测样本加入上述CEA检测试纸的上样垫400上。待测样本在吸收垫700的吸引下从上样垫400出发依次经过结合垫500及包被膜600。若待测样本中含有CEA，则CEA在毛细管作用下与结合垫500上的纳米酶标记抗CEA抗体结合形成复合物。该复合物在毛细管作用下移动至包被膜600上的检测线610，并与检测线610上的抗CEA抗体反应而结合，形成双抗体夹心复合物，并聚集在检测线610。反应5min～10min后，加入TMB显色剂，反应完全后，检测线610呈深蓝色，且检测线610的颜色的深浅与待测样本中的CEA浓度呈正相关。

结合垫500上的纳米酶标记兔IgG移动至包被膜600上的质控线620，与羊抗兔IgG反应而结合，形成抗体复合物，并聚集在质控线620。反应5min～10min后，加入TMB显色剂，反应完全后，质控线620呈深蓝色。正常情况下，无论待检测的样本是否含有CEA，质控线620都应当呈深蓝色，如质控线620无颜色变化则说明检测结果无效，避免假阴性或假阳性的检测结果。

通过检测系统将色差信号转化为数字信号，以浓度点为横坐标，检测线610信号值比质控线620信号值(T/C)为纵坐标绘制标准曲线，从而可准确定量的计算出待测样本中CEA的浓度。

上述CEA检测试纸包括上述实施方式的抗CEA抗体以及与抗CEA抗体结合的固相载体，上述实施方式的抗CEA抗体能够与CEA的抗体的两个抗原表位结合，特异性较强，能够提高CEA检测的准确度，有利于癌症(尤其是乳腺癌)的早期诊断。

由于上述抗CEA抗体能够与CEA的不同表位结合，使得样本中的CEA能够与抗CEA抗体结合形成双抗体夹心复合物，结合效果更好，提高检测的准确性，并且，还能够避免包被膜600和检测线610设置两种不同的CEA抗体，操作简单，节省生产成本。

传统的胶体金法采用的标记物为胶体金，胶体金为无机物，性质稳定，但是胶体金法的灵敏度较差，样本量较少时检测结果的准确性较低。本研究采用纳米酶标记抗CEA抗体，并设置缓冲垫400，使得检测灵敏度较高，最低检测限可达0.1ng/mL，对CEA含量较少的待测样品也能够准确检测，有利于癌症的早期筛查。

传统地，通过检测血清中CEA含量来确定是否有乳腺癌。CEA可产生自乳腺肿瘤组织，由上皮细胞产生的CEA首先分泌到乳腺导管中，故而在早期乳腺癌和癌前病变患者血清中的CEA值并不明显升高，因此血清CEA值升高主要见于有转移的晚期癌症病例，主要用于乳腺癌晚期患者预后的判断，血清CEA检测难以对早期乳腺癌的诊断和筛查提供帮助。上述实施方式的CEA试纸条不仅能够检测血液中的CEA含量，还能够检测乳头溢液中的CEA含量，从而能够对早期乳腺癌进行诊断和筛查。

上述CEA检测试纸中，检测线610与质控线620间隔，检测线610的颜色变化取决于样本中的CEA含量，质控线620的发光的强度取决于兔IgG，两者互不干扰和影响。可采用T/C值的方式进行定量，保证了测试结果的准确度。并且上试纸条使用时，操作简便，成本低。使用的检测仪无需专业操作人员，15分钟即可得到检测结果。

传统的CEA检测方法主要有酶联免疫吸附法等，采用离体样本进行检测，安全性较高。然而，酶联免疫吸附法与化学发光法采用的标记物大多是天然酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。由于大多数天然酶都是蛋白质，遇到热、酸、碱等非生理条件，容易发生结构变化而失去催化活性。而纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。纳米酶具有催化效率高、酶活性稳定、经济和规模化制备的特点，能够通过纳米酶标记抗体来检测CEA，以克服天然酶的稳定性较差的问题。然而传统的采用纳米酶标记抗体对CEA进行检测中，假阴性现象比较严重，导致检测结果不准确。上述实施方式的纳米酶与特异性较高的抗CEA抗体结合，特异性较强，假阴性率低。

本研究还提供上述实施方式的CEA检测试纸条的制备方法，包括如下步骤S310～S330：

S310、将纳米酶标记抗CEA抗体设置于聚酯纤维素膜上，干燥，得到结合垫。

在具体地，将纳米酶标记抗CEA抗体与纳米酶标记兔IgG分别设置于至聚酯纤维素膜上，干燥，得到结合垫。

具体地，将纳米酶标记抗CEA抗体设置于聚酯纤维素膜上的步骤包括：将纳米酶标记抗CEA抗体与处理液混合，得到抗体喷涂液；将抗体喷涂液喷涂至聚酯纤维素膜上。处理液包括质量百分含量为0.1％～1％的牛血清白蛋白、质量百分含量为5％～20％的海藻糖、质量百分含量为0.1％～2％的酪蛋白、质量百分含量为0.1％～1％的Brj35(即聚氧乙烯月桂醚，一种非离子型表面活性剂)、0.01M～0.2M的pH7.4～9.0的Tris-HCl缓冲液。进一步地，将纳米酶标记兔IgG设置于至聚酯纤维素膜上的步骤包括：将纳米酶标记兔IgG与处理液混合，得到兔IgG喷涂液；将兔IgG喷涂液喷涂至聚酯纤维素膜上。

采用上述处理液将纳米酶标记抗CEA抗体制成抗体喷涂液，使得纳米酶标记抗CEA抗体能够更好地附着于聚酯纤维素膜上，避免了因纳米酶标记抗CEA抗体脱离而出现假阴性的问题。需要说明的是，上述纳米酶标记抗CEA抗体与纳米酶标记兔IgG不限于通过喷涂的方式设置于聚酯纤维膜上，还可以通过涂覆的方式设置于聚酯纤维膜上。

进一步地，抗体喷涂液中纳米酶标记抗CEA抗体的质量百分含量为5％～25％。抗体喷涂液的喷量为4μL/cm～8μL/cm。此种设置能够提高CEA检测试纸条的灵敏度和准确性。兔IgG喷涂液中纳米酶标记兔IgG的质量百分含量为5％～25％。兔IgG喷涂液的喷量为4μL/cm～8μL/cm。

在其中一个实施例中，对聚酯纤维素膜进行干燥的步骤具体为：将聚酯纤维素膜至于湿度小于15％、25℃～50℃下干燥12h～24h，得到结合垫。采用电热鼓风干燥箱进行干燥。

在其中一个实施例中，S110之前，还包括制备纳米酶标记抗CEA抗体的步骤，具体详见上文，此处不再赘述。

在其中一个实施例中，S110之前，还包括制备纳米酶标记兔IgG的步骤，具体详见上文，此处不再赘述。

S320、将抗CEA抗体设置于硝酸纤维素膜上，干燥，得到具有检测线的包被膜，抗CEA抗体与纳米酶标记抗CEA抗体中的抗CEA抗体相同。

具体地，将抗CEA抗体设置于硝酸纤维素膜上，将羊抗兔IgG抗体设置于硝酸纤维膜上，干燥，得到包被膜，包被膜具有间隔的检测线和质控线。其中，检测线由抗CEA抗体干燥形成，质控线由羊抗兔IgG抗体干燥形成。

在其中一个实施例中，将抗CEA抗体设置于硝酸纤维素膜上的步骤具体为：采用包被液调节抗CEA抗体的浓度至0.5mg/mL～2.0mg/mL后，再划到硝酸纤维素膜上。包被液包括0.01M～0.05M的PBS缓冲液、质量百分含量为5％～20％的海藻糖、质量百分含量为1％～3％的甲醇。进一步地，将羊抗兔IgG抗体设置于硝酸纤维膜上的步骤具体为：采用包被液调节羊抗兔IgG抗体的浓度至0.5mg/mL～2.0mg/mL后，再喷到硝酸纤维素膜上。此种设置，使得抗CEA抗体与羊抗兔IgG抗体能够更加牢固地固定于包被膜上。

进一步地，含有抗CEA抗体的包被液在划线过程中的用量为0.05μL/mm～0.2μL/mm。含有羊抗兔IgG抗体的包被液在划线过程中的用量为0.05μL/mm～0.2μL/mm。

在其中一个实施例中，对划线后的硝酸纤维素膜进行干燥的操作具体为：将划线后的硝酸纤维素膜至于湿度小于15％、25℃～50℃下干燥12h～24h，得到包被膜。

S330、在底板上从底板的一端至另一端顺次连接上样垫、结合垫、包被膜以及吸收垫，结合垫与上样垫部分重叠，包被膜与结合垫部分重叠，吸收垫与包被膜部分重叠，得到CEA检测试纸条。

在其中一个实施例中，在S330之前，还包括制备上样垫的步骤：将聚酯纤维素膜用封闭液浸泡后，置于湿度为<15％、25℃～50℃下干燥12h～24h，得到上样垫。封闭液包括0.01M～0.2M的Tris、质量百分含量为0.1％～2％的Tween20、质量百分含量为0.1％～1％的水解酪蛋白及质量百分含量为0.1％～2％的PEG8000。

上述实施方式的CEA检测试纸条的制备方法中，通过选择合适的包被液、封闭液及处理液，并优化CEA检测试纸条的结果，能够制备检测结果准确性较高、灵敏度较高的CEA检测试纸条，进而能够应用于CEA检测装置中。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

以下实施例中，如未特别说明，免疫原为重组CEA蛋白，购于上海欣百诺生物有限公司。纳米酶为四氧化三铁包裹的纳米酶，纳米酶表面有羧基。纳米酶为采用专利201610416819.5公开的方法制备得到的纳米酶。pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3(Progen)质粒的图谱见图2，pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒包括人缘抗体重链恒定区和人缘抗体轻链恒定区，人缘抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，人缘抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，人缘抗体轻链恒定区的编码序列如SEQ ID No.11所示，人缘抗体重链恒定区的编码序列如SEQ ID No.12所示。

实施例1

单克隆抗体制备

将免疫原与弗氏佐剂等体积混合并充分乳化后得到混合物，用混合物腹腔注射Balb/c小鼠以对Balb/c小鼠进行免疫，共免疫3次，相邻两次免疫的间隔时间为15天，每次免疫的免疫原剂量为25μg/每只小鼠。

免疫完成后，取出免疫小鼠的脾脏细胞，将2.0×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞与2.0×10⁸个经免疫的Balb/c小鼠的脾脏细胞混匀，离心，弃上清，轻微振荡混匀，于37℃水浴中，并在90秒内滴加1mL、体积百分比为50％的PEG1500水溶液，然后滴加20mL的1640培养基，离心，弃上清，再按照上述操作采用PEG1500水溶液和1640培养基洗一次，离心，弃上清，得到杂交瘤细胞。

使用HAT选择培养基(购于Sigma公司)在96孔细胞培养板上选择杂交瘤细胞，镜下检测进行总融合率检测。采用免疫原对装有单克隆细胞(该单克隆细胞的总融合率大于95％)的培养孔内的上清进行检测，挑取OD450大于0.8的孔内细胞进行亚克隆，最终获得对免疫原反应阳性率大于99％的单克隆细胞，即为阳性细胞株。

使用有限稀释法对获得的阳性细胞株进行克隆，克隆3次，检测克隆后的杂交瘤细胞分泌的抗体的效价，得到7株产生高效价的抗CEA单克隆抗体的杂交瘤细胞，扩大培养，冻存。其中，检测克隆后的杂交瘤细胞分泌的抗体的效价的步骤包括：对6～8周龄雌性Balb/c小鼠用石蜡处理10天后，取杂交瘤细胞以2×10⁶个细胞/只小鼠进行腹腔注射，10天后从小鼠腹腔中获取富含抗体的腹水，采用间接ELISA方法测定腹水中抗体的效价。上述7株杂交瘤细胞分泌的抗CEA单克隆抗体的效价均大于10⁵。其中，使用CB缓冲液稀释免疫原至终浓度为1μg/mL，得到含有免疫原的CB液。向酶标板的每孔中加入100uL的含有免疫原的CB液，37℃包被3h。采用0.01M的PBST溶液(0.01M PBS，0.1％Tween 20)清洗酶标板一次，加入封闭液(即含有质量百分含量为20％的胎牛血清的PBS溶液)在37℃封闭2h。采用0.01M的PBST溶液清洗酶标板一次。每个孔添加100uL的稀释好的抗体(即采用腹水将上述抗CEA单克隆抗体稀释1000倍、3000倍、9000倍、27000倍、81000倍)37℃反应1h，采用0.01M的PBST溶液清洗酶标板2次，加入100uL的二抗(即羊抗鼠IgG-HRP)于37℃反应0.5h，采用0.01M的PBST溶液清洗酶标板2次，加入50μL的TMB显色液于37℃反应10min，添加50μL的终止液(即稀硫酸)终止反应，再采用酶标仪测定波长为630nm、波长为450nm检测读数，并计算最终OD值。最终OD值等于630nm的OD值减去450nm的OD值。其中，腹水稀释81000倍后检测结果仍为阳性(OD值大于2.5倍的空白检测值)，则说明腹水抗体效价大于10⁵。

采用proteinG亲和层析法纯化抗CEA单克隆抗体，具体步骤包括：制备proteinG亲和层析柱，用PBS平衡柱子后，取腹水过柱，然后用PBS清洗柱子，以50nmol/L的甘氨酸盐酸盐溶液洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，洗脱液经透析后收集。经SDS-PAGE电泳鉴定，上述7株杂交瘤细胞分泌的抗CEA单克隆抗体经纯化的纯度均在98％以上。纯化后上述7株杂交瘤细胞分泌的抗CEA单克隆抗体分别命名为1#单抗、2#单抗、3#单抗、4#单抗、5#单抗、6#单抗、7#单抗。

实施例2

抗体效价检测

将实施例1各纯化后的抗体均分别稀释浓度为3μg/mL、1μg/mL、0.33μg/mL、0.11μg/mL、0.036μg/mL、0.012μg/mL，使用间接ELISA法检测抗体效价，ELISA检测结果见表1。其中，使用CB缓冲液稀释免疫原至终浓度为1μg/mL，得到含有免疫原的CB液。向酶标板的每孔中加入100uL的含有免疫原的CB液，37℃包被3h。采用0.01M的PBST溶液清洗酶标板一次，加入封闭液(即含有质量百分含量为20％的胎牛血清的PBS溶液)在37℃封闭2h。采用0.01M的PBST溶液清洗酶标板一次。每个孔添加100uL的稀释好的抗体(即采用腹水将上述抗CEA单克隆抗体稀释1000倍、3000倍、9000倍、27000倍、81000倍)37℃反应1h，采用0.01M的PBST溶液清洗酶标板2次，加入100uL的二抗(即羊抗鼠IgG-HRP)于37℃反应0.5h，采用0.01M的PBST溶液清洗酶标板2次，加入50μL的TMB显色液于37℃反应10min，添加50μL的终止液(即稀硫酸)终止反应，再采用酶标仪测定波长为630nm、波长为450nm检测读数，并计算最终OD值。最终OD值等于630nm的OD值减去450nm的OD值。表1表示的是1#单抗、2#单抗、3#单抗、4#单抗、5#单抗、6#单抗、7#单抗的最终OD值。

表1 1#单抗、2#单抗、3#单抗、4#单抗、5#单抗、6#单抗、7#单抗的效价

	1#单抗	2#单抗	3#单抗	4#单抗	5#单抗	6#单抗	7#单抗
								3μg/mL	3.521	3.221	2.821	2.678	2.512	2.361	2.207
1μg/mL	3.235	2.835	2.235	2.015	1.835	1.628	1.428
								0.33μg/mL	1.562	1.226	0.862	0.687	0.762	0.57	0.62
0.11μg/mL	0.568	0.428	0.368	0.286	0.368	0.241	0.341
								0.036μg/mL	0.136	0.136	0.092	0.076	0.016	0.015	0.023
0.012μg/mL	0.045	0.042	0.023	0.022	0.032	0.015	0.016
								1*PBS	0.012	0.011	0.009	0.011	0.012	0.012	0.011

从表1可以看出，1#单抗、2#单抗、3#单抗、4#单抗的效价高于5#单抗、6#单抗、7#单抗的效价。

实施例3

HRP标记抗体

分别选择1#单抗、2#单抗、3#单抗、4#单抗进行HRP标记，以进行抗体位点竞争检测筛选实验。具体操作如下：

每种单抗的总量为200μg，体积为200μL，装进透析袋，在50mM、pH9.6的CB缓冲液中4℃低温过夜透析，第二天早上就更换CB缓冲液。配置含有5mg/mL的NaIO₃的水溶液和含有5mg/mL的HRP(40KD的糖蛋白，购于生工生物工程(上海)股份有限公司)的水溶液，将两者搅拌混匀，添加乙二醇终止反应，得到氧化HRP。将160μL的氧化HRP(即每株抗体的氧化HRP添加量)添加至装有透析抗体的透析袋中，混匀，4℃下边透析边反应3h，每反应1h后换CB缓冲液，得到含有HRP标记抗体的溶液。取出透析袋中含有HRP标记抗体的溶液，记录其体积V。配置5mg/mL的NaBH₄溶液，每种含有HRP标记抗体的溶液中加入8μL的NaBH₄溶液，4℃混匀1h。混匀后，加入牛血清(牛血清与含有HRP标记抗体的溶液的体积比为1:2)和饱和硫酸铵溶液(饱和硫酸铵溶液与含有HRP标记抗体的溶液的体积比为1:1)，混匀，4℃静置30min，然后12000rpm离心10min，弃上清。先加100μL的混合溶液(含有体积百分含量为80％的1×PBS和体积百分含量为20％的牛血清)复溶，再加入100μL的甘油，得到浓度为1mg/mL的HRP标记抗体溶液。其中，1#单抗、2#单抗、3#单抗、4#单抗对应的HRP标记抗体分别为1#HRP标记抗体、2#HRP标记抗体、3#HRP标记抗体、4#HRP标记抗体。

实施例4

抗体位点竞争筛选

采用间接法(ELISA法)，以浓度为1μg/mL的免疫原，进行抗体位点竞争筛选。具体操作如下：

(1)将酶标板的孔分为4个大组，每个大组有5个小组。向每个孔酶标板孔中添加50μL、5μg/mL的单抗，立即向每个大组的5个小组的酶标板孔中分别添加1#HRP标记抗体、2#HRP标记抗体、3#HRP标记抗体、4#HRP标记抗体和PBS，置于37℃恒温培养箱反应1h。其中，4个大组的酶标板孔中的单抗分别为1#单抗、5μg/mL的2#单抗、5μg/mL的3#单抗、5μg/mL的4#单抗，每个大组的每个小组的单抗相同。HRP标记抗体的添加量为50μL，HRP标记抗体的浓度为1mg/mL。

(2)反应结束后，清洗酶标板3次后，每孔添加100μL的含TMB底物显示液，置于37℃恒温培养箱反应10min，取出酶标板，每孔添加100μL、1mM的H₂SO₄终止液。采用酶标仪在波长为630nm、波长为450nm检测读数，最终OD值等于630nm的OD值减去450nm的OD值。如果ELISA检测结果为阳性则为抗体位点不一致，且OD值越高说明抗体位点在蛋白空间距离越远；如果ELISA检测结果为阴性则为抗体位点一致，且OD值越低说明抗体位点在蛋白空间距离越近。具体实验数据见表2。

表2：抗体竞争位点检测结果

从表2可以看出，1#细胞株、2#细胞株的单克隆抗体的蛋白空间距离最远。

(3)测定1#细胞株、2#细胞株的单克隆抗体(即1#单抗和2#单抗)的重链和轻链的序列。

经测序检测后，1#单抗的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，1#单抗的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，2#单抗的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，2#单抗的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。1#单抗的重链的氨基酸序列如SEQ IDNo.21所示，1#单抗的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示，2#单抗的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.23所示，2#单抗的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。

具体地，如SEQ ID No.17所示的序列为：ATGGGTTGGGTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATCCAAGCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGACTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGCAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCAACACTGGAGAGCCAACATACGCTGAAGAGTTCAAGGGACGTTTTGCCTTCTCTTTGGAGACCTCTGCCACCGCTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGATGACACGGCTTCATATTTCTGTGCAAGAGGCTGGGTCCTTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATAA；

如SEQ ID No.18所示的序列为：ATGGCCCCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAATCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGACCCAGAAGATGTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTGATATGTTTATGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCCGTACGCGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGCTAA；

如SEQ ID No.19所示的序列为：ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTGGCTACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCACGTAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAAACTACGATGTATCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTATAAGACTGGGATACTACGGCTTCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATAA；

如SEQ ID No.20所示的序列为：

ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGTCACAGTGTCCAGAGGAGAAATTGTGCTCACTCAGTCTCCAGCCATCACAGCTGCATCTCTGGGGCAAAAGGTCACCATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATACACTGGTTCCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAGACCATGGATTTATGAAATTTCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCTTGGAGGCTGAAGATGCTGCCATTTATTACTGCCAGCAGTGGACTTATCCTCTTATCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTAGAGCTGAAACGTACGCGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGCTAA；

如SEQ ID No.21所示的序列为：MGWVWNLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGYTFTNYAMNWVKQAPGKGLKWMGWINTNTGEPTYAEEFKGRFAFSLETSATAAYLQINNLKNDDTASYFCARGWVLYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK；

如SEQ ID No.22所示的序列为：MAPAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKSDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDPEDVATYFCQQGDMFMFGGGTKLEIRTRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；

如SEQ ID No.23所示的序列为：MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSGYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPRSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKTTMYLQMSKVRSEDTALYYCIRLGYYGFFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK；

如SEQ ID No.24所示的序列为：MDFQVQIFSFLLISVTVSRGEIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVSYIHWFQQKSGTSPRPWIYEISKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSLEAEDAAIYYCQQWTYPLITFGAGTKLELKRTRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。

实施例5

扩增抗体的可变区基因

用Trizol试剂分别提取1×10⁶个1#杂交瘤细胞的总RNA和1×10⁶个2#的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.14所示的引物对1#杂交瘤细胞的抗体(即1#单抗)的重链可变区，用序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示的引物对扩增1#杂交瘤细胞的分泌抗体的轻链可变区。用序列如SEQ ID No.13～SEQ ID No.14所示的引物对2#杂交瘤细胞的抗体(即2#单抗)的重链可变区，用序列如SEQ ID No.15～SEQ IDNo.16所示的引物对扩增2#杂交瘤细胞的抗体的轻链可变区。

其中，扩增采用热启动。扩增反应条件为：94℃5min；94℃45s，54℃45s，72℃1min，30个循环；72℃7min。PCR产物委托上海生工进行测序。1#单抗的轻链可变区(即第一轻链可变区)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，1#单抗的重链可变区(即第一重链可变区)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2#单抗的轻链可变区(即第二轻链可变区)的氨基酸序列如SEQID No.3所示，2#单抗的重链可变区(即第二重链可变区)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

实施例6

抗体可变区基因的克隆

(1)委托生工生物工程(上海)股份有限公司将1#单抗的重链可变区的编码序列上游添加Xho1酶切位点，且其下游添加Nhe1酶切位点，然后克隆到pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒(购于Progen公司)中，得到含有1#单抗的重链可变区的编码序列的质粒。将1#单抗的轻链可变区的编码序列上游添加Sac1酶切位点，且其基因下游添加Hind111酶切位点，然后克隆到含有1#单抗的重链可变区的编码序列的质粒中，得到第一质粒。其中，1#单抗的轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.5所示，1#单抗的重链可变区的编码序列如SEQ ID No.6所示。

(2)将2#单抗的重链可变区的编码序列上游添加Xho1酶切位点，且其基因下游添加Nhe1酶切位点，克隆到pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒(购于Progen公司)中，得到含有单抗的重链可变区的编码序列的质粒。将单抗的轻链可变区的编码序列上游添加Sac1酶切位点，且其基因下游添加Hind111酶切位点，克隆到含有2#单抗的重链可变区的编码序列的质粒中，得到第二质粒。其中，2#单抗的轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.7所示，2#单抗的重链可变区的编码序列如SEQ ID No.8所示。

实施例7

质粒转染动物细胞(293T细胞)

采用处在对数生长期且活率高于90％的HEK293细胞进行转染。转染当天，取样计数细胞密度和活率，细胞密度应该在3×10⁶个细胞/mL～5×10⁶个细胞/mL，活率高于90％。调整细胞密度至3×10⁶个细胞/mL，每瓶细胞液体积为20mL，得到细胞培养液。用150mM的NaCl水溶液稀释20μg的DNA(包括10μg的第一质粒和10μg的第二质粒)至总体积为0.5mL，温和混匀，得到稀释后的DNA。用150mM的NaCl稀释100μL的Sinofection转染试剂至总体积为0.5mL，温和混匀，得到稀释后的转染试剂。将稀释后的DNA和稀释后的转染试剂同时单独静置约5分钟后温和混匀，总体积1mL，之后室温静置10分钟，得到转染组合物。

将细胞培养液稀释后加入到96孔酶标板的每个孔中，每孔中1个～2个细胞。将转染组合物以每孔0.1μgDNA的添加量逐滴加入到每个孔中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回摇床置于37℃下继续培养，48小时后分别收集每个孔中细胞上清，得到多组细胞上清。

实施例8

双特异性抗体的检测-间接法

(1)将酶标板的孔分为4个大组，每个大组有多个小组。向每个孔中添加100μL、1μg/mL的免疫原，然后添加50μL、10μg/mL的单抗，其中，3个大组的单抗分别为1#单抗、2#单抗，复合单抗(包括10μg/mL的1#单抗和10μg/mL的2#单抗)，最后一个大组中采用PBS替代单抗，以作为空白对照。

(2)单抗添加后，立即向每个孔中分别添加50μL的实施例7得到的细胞上清，每个孔添加一组细胞上清，每个大组的各个小组中添加的细胞上清不同，将酶标板置于37℃恒温培养箱中反应1h。清洗酶标板2次，每个孔添加100μL的二抗(即鼠抗人IgG-HRP，购于菲鹏生物股份有限公司)，将酶标板放置于37℃恒温培养箱，反应0.5h，清洗酶标板3次后，向各个孔中添加100μL的含TMB底物显示液，置于37℃恒温培养箱反应10min。反应结束后，取出酶标板，各个孔添加100μL、1mM的H₂SO₄终止液。采用酶标仪在波长为630nm、波长为450nm检测读数，并计算最终OD值。最终OD值等于630nm的OD值减去450nm的OD值。

如果添加1#抗体、2#抗体的最终OD值低于空白对照的最终OD值的二分之一，且添加1#抗体和2#抗体(即复合抗体)的最终OD值为阴性(即最终OD值小于或等于0.1)，则说明转染后细胞株分泌双特异性抗体。如果添加1#抗体或2#抗体的最终OD值高于空白对照的最终OD值的二分之一，说明转染后细胞株分泌抗体非双特异性抗体。实验结果如表3所示，表3中列举了四组细胞上清的检测结果。

表3转染后细胞分泌抗体检测

从表3可以看出，A组细胞上清中的抗体为双特异性抗体(即本申请保护的抗CEA抗体)。将A组细胞上清对应的细胞株扩大培养后，于2019年9月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2019246，分类命名：CEA双特异性抗体293T细胞株。

实施例9

抗CEA抗体纯化

采用proteinG亲和层析法纯化A细胞株分泌的抗CEA抗体。具体步骤包括：制备proteinG亲和层析柱，用PBS平衡柱子后，取含有抗CEA抗体的细胞上清过柱，然后用PBS清洗柱子，以50nmol/L的甘氨酸盐酸盐溶液洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，洗脱液经透析后收集。经SDS-PAGE电泳鉴定，纯化的抗CEA抗体的纯度在98％以上。其中，SDS-PAGE电泳图详见图4。图4中，泳道1为marker，泳道2、泳道6、泳道7、泳道8、泳道9均为3μg纯化后的抗CEA抗体的条带，泳道3和泳道10均为1μg纯化后的抗CEA抗体的条带，泳道4为0.1μg纯化后的抗CEA抗体的条带，泳道5为0.1μg纯化后的抗CEA抗体的条带。

实施例10

CEA检测试纸的制备

1、本实施例的纳米酶标记抗CEA抗体的制备

(1)采用50mM、pH5的MES缓冲液将纳米酶清洗1次。

(2)将50mM、pH7的MES缓冲液与纳米酶混匀，得到纳米酶混合液，纳米酶混合液中纳米酶的浓度为1mg/mL；加入终浓度为3mg/mL的碳二亚胺和终浓度为2.5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温孵育30min，孵育过程中进行搅拌以使纳米酶呈悬浮状态；固液分离，收集沉淀。

(3)按照纳米酶与抗CEA抗体的质量比为1：10，向沉淀中加入实施例9纯化得到的抗CEA抗体于室温下反应2h，固液分离，弃去上清，收集沉淀；采用50mM、pH7的MES缓冲液清洗沉淀三次，采用50mM、pH7的MES缓冲液将沉淀复溶后，加入封闭液进行反应1h，固液分离，收集反应沉淀。封闭液包括0.05M的Tris-HCl缓冲液、质量百分含量为0.5％的PEG2000及质量百分含量为0.05％的Tween20。采用封闭液清洗反应沉淀1次，固液分离，收集沉淀，即为纳米酶标记抗CEA抗体。

(4)向纳米酶标记抗CEA抗体中加入保存液，得到终浓度为0.6mg/mL的抗体储备液。保存液包括0.05M的PBS缓冲液、质量百分含量为0.5％的牛血清白蛋白、质量百分含量为0.06％的Triton X-100及质量百分含量为3％的海藻糖。

2、本实施例的纳米酶标记兔IgG的制备过程包括：

取纳米酶，用60mM、pH7的MES缓冲液清洗2次(每次清洗混悬1～2次)，磁性分离，取出上清；用60mM、pH7的MES缓冲液调节兔IgG的蛋白浓度至1mg/mL，按照纳米酶与兔IgG的质量比为1：10加入到纳米酶中，然后在室温状态下反应3h，加入终止液(即质量百分含量为50％的乙醇胺的水溶液)，轻微振荡，反应30min；反应结束后，加入保存液(保存液包括0.05M的PBS缓冲液、质量百分含量为0.5％的牛血清白蛋白、质量百分含量为0.06％的Triton X-100及质量百分含量为3％的海藻糖)定容，得到终浓度为0.6mg/mL的质控液，4℃保存。

3、本实施例的CEA检测试纸的制备过程如下：

(1)结合垫的制备：将纳米酶标记抗CEA抗体与处理液混合，得到抗体喷涂液；将抗体喷涂液喷涂至聚酯纤维素膜上。处理液包括质量百分含量为0.5％的牛血清白蛋白、质量百分含量为12.5％的海藻糖、质量百分含量为0.6％的酪蛋白、质量百分含量为0.55％的Brj35、0.1M的pH8的Tris-HCl缓冲液。抗体喷涂液中纳米酶标记抗CEA抗体的质量百分含量为15％。抗体喷涂液的喷量为6μL/cm。将纳米酶标记兔IgG上述处理液混合，得到兔IgG喷涂液；将兔IgG喷涂液喷涂至聚酯纤维素膜上。兔IgG喷涂液中纳米酶标记兔IgG的质量百分含量为15％。兔IgG喷涂液的喷量为6μL/cm。将喷涂后的聚酯纤维素膜至于湿度小于15％、50℃下干燥12h，得到结合垫。

(2)包被膜的制备：采用包被液调节实施例9纯化得到的抗CEA抗体的浓度至1mg/mL后，再划到硝酸纤维素膜上。含有抗CEA抗体的包被液在划线过程中的用量为0.13μL/mm。包被液包括0.03M的PBS缓冲液、质量百分含量为13％的海藻糖、质量百分含量为2％的甲醇。采用包被液调节羊抗兔IgG的浓度至1mg/mL后，再划到硝酸纤维素膜上。含有羊抗兔IgG的包被液的用量为0.13μL/mm。将划线后的硝酸纤维素膜至于湿度小于15％、50℃下干燥12h，得到包被膜。包被膜具有间隔的检测线和质控线。其中，检测线由抗CEA抗体干燥形成，质控线由羊抗兔IgG干燥形成。

(3)上样垫的制备：将聚酯纤维素膜用封闭液浸泡后，置于湿度为<15％、25℃下干燥24h，得到上样垫。封闭液包括0.1M的Tris、质量百分含量为1％的Tween20、质量百分含量为0.6％的水解酪蛋白及质量百分含量为1％的PEG8000。

(4)在底板上顺次相互搭接地黏贴上样垫、结合垫、包被膜和吸水垫得到试纸板，按照切割要求切割成4mm宽度的试纸条，得到CEA检测试纸。上样垫部分位于结合垫远离底板的一侧上，重叠的长度为2mm。结合垫部分位于包被膜远离底板的一侧，重叠的长度为2mm。吸收垫部分位于包被膜远离底板的一侧上，重叠的长度为2mm。

实施例11

本实施例的CEA检测试纸的制备过程与实施例10大致相同，不同之处在于：纳米酶标记抗CEA抗体的制备中，采用实施例1得到的1#单抗替代实施例10的抗CEA抗体。

实施例12

本实施例的CEA检测试纸的制备过程与实施例10大致相同，不同之处在于：纳米酶标记抗CEA抗体的制备中，采用实施例2得到的1#单抗替代实施例10的抗CEA抗体。

实施例13

本实施例的CEA检测试纸的制备过程与实施例10大致相同，不同之处在于：包被膜的制备过程中，采用1#抗体替代实施例10的抗CEA抗体，以制备得到检测线。

实施例14

本实施例的CEA检测试纸的制备过程与实施例10大致相同，不同之处在于：包被膜的制备过程中，采用2#抗体替代实施例10的抗CEA抗体，以制备得到检测线。

对比例1

本对比例的CEA检测试纸的制备过程与实施例10大致相同，不同之处在于：纳米酶标记抗CEA抗体的制备中，采用实施例1得到的1#单抗替代实施例10的抗CEA抗体；包被膜的制备过程中，采用2#抗体替代实施例10的抗CEA抗体，以制备得到检测线。

对比例2

本对比例的CEA检测试纸的制备过程与实施例10大致相同，不同之处在于：纳米酶标记抗CEA抗体的制备中，采用实施例1得到的2#单抗替代实施例10的抗CEA抗体；包被膜的制备过程中，采用1#抗体替代实施例10的抗CEA抗体，以制备得到检测线。

测试：

测试例1

采用实施例10～14及对比例1～2的CEA检测试纸测定20个已知CEA浓度的样本中CEA的浓度。测定结果详见表4。表4表示的是采用实施例10～14及对比例1～2的CEA检测试纸测定20个已知CEA浓度的样本中CEA的浓度的检测结果。表4中浓度的单位均为ng/mL。

具体地，CEA检测试纸定量检测待测样品中CEA的浓度的步骤如下：

(1)标准曲线绘制：

将CEA抗原配制成1000ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL用测试卡，用同一批次的试剂，每个浓度点测试10次。以检测线(T带)、质控线(C带)的信号值的比值为纵坐标，CEA参考品浓度为横坐标，建立方程并拟合成标准曲线，将标曲信息用烧录软件写到ID芯片中。

(2)样品的检测：

从试剂盒中取出检测条，撕开铝箔袋包装后，平放检测条，平衡5分钟。采用95μL的稀释液将5μL的待测样品稀释16倍，然后取80μL的稀释后的待测样本加入加样孔中，室温反应10分钟。反应结束后，加入20μL的TMB显色液至加样孔中，反应5分钟。将ID芯片插入免疫分析仪，将检测卡插入免疫分析仪插卡口，点击“测试”，仪器通过分析软件自动计算出待测样本中CEA的浓度。

表4

从表4可以看出，实施例11在测试健康人样本中，得到了两例假阳性结果，同时在阳性样本中，存在一例漏检；实施例12测试健康人样本，存在两例假阳性结果，但阳性可全部检出；实施例13测试健康人样本，存在一例假阳性样本以及阳性样本检测中存在1例漏检；实施例14测试健康人样本，存在2例假阳；对比例1测试健康人样本，存在3例假阳性以及2例漏检；对比例2存在2例假阳样本；而实施例10测试健康人样本都为阴性，且不存在漏检；因此，双特异性抗体能够很好的保证特异性的同时，能够保证阳性检出，检测结果与对照完全一致。

测试例2

采用1#单抗、2号单抗以及实施例10中的制备方法，将单抗、2号单抗以及实施例10的双特异性抗体制备成试纸条，分别测试20例已知CEA浓度的血清样本中CEA的浓度，测定结果详见表5。表5表示的是采用实施例10及对比例1～2的CEA检测试纸条对已知CEA浓度的样本的检测结果。

(1)标准曲线绘制

(2)样品的检测：

表5

从表5可以看出，在CEA浓度为0.1ng/mL～100ng/mL范围内，与对比例1～2相比，实施例10的CEA检测试纸条检测得到的CEA浓度与已知浓度更接近，说明实施例10的CEA检测试纸条的检测准确性更高，并且采用实施例10的CEA检测试纸条能够准确检测CEA浓度低至0.1ng/mL的样本，检测灵敏度较高，对CEA含量较少的待测样品也能够准确检测，有利于癌症的早期筛查。

测试例3

用实施例10的CEA检测试纸分别测定待测样品1和待测样品2中CEA的含量，并采用罗氏公司的CEA电化学发光检测试剂盒测定待测样品1和待测样本2中CEA的含量(即为对比例)，重复测定10次，求平均值，测定的结果用平均值±方差表示，测定结果详见表6。表6表示的实施例10的CEA检测试纸、罗氏公司的CEA检测试剂盒测定的待测样品1和待测样本2中CEA的含量。其中，待测样品1为含有50.2ng/mL的CEA的血清样品。待测样品2为含有100ng/mL的CEA的血清样品。按照测试例1的操作采用实施例10的CEA检测试纸检测待测样品中CEA的浓度。

表6

从表6可以看出，采用实施例10的CEA检测试纸条对含有不同浓度的CAE的血清样本进行检测的结果与罗氏公司的CEA电化学发光检查试剂盒的检测结果一致，说明上述实施方式的CEA检测试纸能够用于检测血清中的CEA含量具有较高的准确性，能够用于通过准确检测血清中CEA含量以判定是否有癌变的可能。

测试例4

采用实施例10的试纸条分别对40例病人的乳头溢液样本和40例血清样本进行测定。按照测试例1的操作采用实施例10的CEA检测试纸检测待测样本中CEA的浓度。测定结果详见表7。其中，结合病理学测定，临床诊断得出是否为乳腺癌、结肠癌、肺癌、直肠癌、食管癌或者肺癌等癌症。其中，血清样本的参考值小于5ng/mL表示的是血清样本中的CEA浓度小于5ng/mL则说明为健康人，否则说明可能存在癌变。乳头溢液的参考值小于100ng/mL表示的是乳头溢液中的CEA浓度小于100ng/mL则说明为健康人，否则说明可能存在癌变。

表7实施例10的试纸条对乳头溢液样本和血清样本的检测结果

从表7可以看出，采用实施例10的试纸条对病人的乳头溢液进行检测，与病理学诊断得出的检测结果一致，说明上述实施方式的CEA检测试纸能够用于检测乳头溢液中的CEA含量，从而判定是否患有乳腺癌、结肠癌、肺癌、直肠癌、食管癌或者肺癌等癌症。并且，实施例10的试纸条对血清样本和乳头溢液样本均具有较高的特异性。

测试例5

采用实施例10的CEA检测试纸和日本化药公司的CEA检测试剂盒对60例乳腺癌病人的乳头溢液进行检测，并对60例健康人的乳头溢液样本进行检测。按照测试例1的操作采用实施例10的CEA检测试纸检测待测样本中CEA的浓度。检测到的CEA浓度小于100ng/mL，则检测结果为阴性；检测到的CEA浓度在100ng/mL以上，则检测结果为阳性。按照如下公式计算特异性：特异性＝检测结果为阴性的乳腺癌样本数/总的正常样本数。检测结果详见表8。

表8乳腺癌病人与健康人的测试结果

从表8可以看出，采用实施例10的CEA检测试纸条对乳头溢液样本进行检测的特异性为98.3％，优于对比例，说明采用上述实施方式的抗CEA抗体对CEA的亲和力较高，对CEA检测的特异性较高，能够制成得到特异性较高的CEA检测装置和CEA检测试剂。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司

深圳市第二人民医院

中国科学院生物物理研究所

<120> 抗CEA抗体及其应用、可分泌抗CEA抗体的细胞及其制备方法

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly

1 5 10 15

Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

35 40 45

Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gly Thr Val Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn

85 90 95

Leu Asp Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Met

100 105 110

Phe Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120

<210> 2

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Trp Val Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Ala Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr

85 90 95

Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ala Ser

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Trp Val Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 3

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly

1 5 10 15

Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

35 40 45

Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gly Thr Val Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn

85 90 95

Leu Asp Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Met

100 105 110

Phe Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120

<210> 4

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

35 40 45

Gly Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Arg Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro

65 70 75 80

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr

85 90 95

Met Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ile Arg Leu Gly Tyr Tyr Gly Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 5

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcccctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattagcaat tatttaaact ggtatcagca gaaatcagat 180

ggaactgtta aactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggacccagaa 300

gatgttgcca cttacttttg ccaacagggt gatatgttta tgttcggtgg aggcaccaag 360

ctggaaatc 369

<210> 6

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgggttggg tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60

atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120

tgcaagactt ctgggtatac cttcacaaac tatgcaatga actgggtgaa gcaggctcca 180

ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacaccaaca ctggagagcc aacatacgct 240

gaagagttca agggacgttt tgccttctct ttggagacct ctgccaccgc tgcctatttg 300

cagatcaaca acctcaaaaa tgatgacacg gcttcatatt tctgtgcaag aggctgggtc 360

ctttatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 411

<210> 7

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcccctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattagcaat tatttaaact ggtatcagca gaaatcagat 180

ggaactgtta aactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggacccagaa 300

gatgttgcca cttacttttg ccaacagggt gatatgttta tgttcggtgg aggcaccaag 360

ctggaaatca aa 372

<210> 8

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg 60

aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt 120

gcagcctcag gattcgattt tagtggctac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg 180

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccacgtagca gtacgataaa ctatacgcca 240

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaactacgat gtatctgcaa 300

atgagcaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtataagact gggatactac 360

ggcttctttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 408

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 11

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324

<210> 12

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa taa 993

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggagacac actacagtga cctgctat 28

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtcgacttac cagtgtttga tttccagctt 30

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggcatgaag ctgagtgatc ctctt 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgtcgtgcta gctggggaga cagtga 26

<210> 17

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgggttggg tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60

atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120

tgcaagactt ctgggtatac cttcacaaac tatgcaatga actgggtgaa gcaggctcca 180

ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacaccaaca ctggagagcc aacatacgct 240

gaagagttca agggacgttt tgccttctct ttggagacct ctgccaccgc tgcctatttg 300

cagatcaaca acctcaaaaa tgatgacacg gcttcatatt tctgtgcaag aggctgggtc 360

ctttatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agccaaaacg 420

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480

accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540

ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600

ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660

gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720

tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780

cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840

agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900

gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960

cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020

gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080

caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140

tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200

ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260

tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320

gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380

aaataa 1386

<210> 18

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atggcccctg ctcagttcct tggtctcctg ttgctctgtt ttcaaggtac cagatgtgat 60

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 120

agttgcaggg caagtcagga cattagcaat tatttaaact ggtatcagca gaaatcagat 180

ggaactgtta aactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggacccagaa 300

gatgttgcca cttacttttg ccaacagggt gatatgttta tgttcggtgg aggcaccaag 360

ctggaaatcc gtacgcgggc tgatgctgca ccaactgtat ccatcttccc accatccagt 420

gagcagttaa catctggagg tgcctcagtc gtgtgcttct tgaacaactt ctaccccaaa 480

gacatcaatg tcaagtggaa gattgatggc agtgaacgac aaaatggcgt cctgaacagt 540

tggactgatc aggacagcaa agacagcacc tacagcatga gcagcaccct cacgttgacc 600

aaggacgagt atgaacgaca taacagctat acctgtgagg ccactcacaa gacatcaact 660

tcacccattg tcaagagctt caacaggaat gagtgctaa 699

<210> 19

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg 60

aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt 120

gcagcctcag gattcgattt tagtggctac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg 180

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccacgtagca gtacgataaa ctatacgcca 240

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaactacgat gtatctgcaa 300

atgagcaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtataagact gggatactac 360

ggcttctttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacgaca 420

cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 480

ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 540

tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 600

agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 660

gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt 720

aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc 780

aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc 840

aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct 900

cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc 960

atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct 1020

ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag 1080

gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc 1140

atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca 1200

gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta cttcgtctac 1260

agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg 1320

ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa 1380

taa 1383

<210> 20

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgtcacagt gtccagagga 60

gaaattgtgc tcactcagtc tccagccatc acagctgcat ctctggggca aaaggtcacc 120

atcacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatacact ggttccagca gaagtcaggc 180

acctccccca gaccatggat ttatgaaatt tccaaactgg cttctggagt cccagctcgc 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagctt ggaggctgaa 300

gatgctgcca tttattactg ccagcagtgg acttatcctc ttatcacgtt cggtgctggg 360

accaagctag agctgaaacg tacgcgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420

ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480

taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540

ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600

acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660

acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgctaa 708

<210> 21

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Met Gly Trp Val Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Ala Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr

85 90 95

Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ala Ser

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Trp Val Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145 150 155 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305 310 315 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355 360 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370 375 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 22

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Met Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly

1 5 10 15

Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

35 40 45

Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gly Thr Val Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn

85 90 95

Leu Asp Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Met

100 105 110

Phe Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Thr Arg Ala Asp

115 120 125

Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys

145 150 155 160

Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly

165 170 175

Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn

195 200 205

Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

<210> 23

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

35 40 45

Gly Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Arg Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro

65 70 75 80

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr

85 90 95

Met Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ile Arg Leu Gly Tyr Tyr Gly Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

130 135 140

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

210 215 220

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys

225 230 235 240

Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val

260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe

275 280 285

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro

290 295 300

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

305 310 315 320

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val

325 330 335

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

340 345 350

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys

355 360 365

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp

370 375 380

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser

405 410 415

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala

420 425 430

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His

435 440 445

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 24

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Val Thr

1 5 10 15

Val Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Arg

50 55 60

Pro Trp Ile Tyr Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Tyr

100 105 110

Pro Leu Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr

115 120 125

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

130 135 140

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

165 170 175

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

195 200 205

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

210 215 220

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

Claims

1.一种抗CEA抗体，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的抗CEA抗体，其特征在于，所述第一结构域还包括连接的第一轻链恒定区和第一重链恒定区，所述第一轻链恒定区和所述第一重链恒定区分别与所述第一轻链可变区和所述第一重链可变区连接，所述第二结构域还包括连接的第二轻链恒定区和第二重链恒定区，所述第二轻链恒定区和所述第二重链恒定区分别与所述第二轻链可变区和所述第二重链可变区连接，所述第二重链恒定区与所述第一重链恒定区连接。

3.根据权利要求2所述的抗CEA抗体，其特征在于，所述第一轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，所述第二轻链恒定区的氨基酸序列与所述第一轻链恒定区的氨基酸序列相同，所述第一重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，所述第二重链恒定区的氨基酸序列与所述第一重链恒定区的氨基酸序列相同。

4.根据权利要求3所述的抗CEA抗体，其特征在于，所述第一轻链恒定区的编码序列如SEQ ID No.11所示，所述第二轻链恒定区的编码序列与所述第一轻链恒定区的编码序列相同，所述第一重链恒定区的编码序列如SEQ ID No.12所示，所述第二重链恒定区的编码序列与所述第一重链恒定区的编码序列相同。

5.一种可分泌抗CEA抗体的细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用转染组合物转染动物细胞，培养，得到可分泌抗CEA抗体的细胞，其中，转染组合物包括第一质粒、第二质粒和转染试剂，所述第一质粒含有第一轻链可变区的编码序列和第一重链可变区的编码序列，所述第一轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第一重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述第二质粒含有第二轻链可变区的编码序列和第二重链可变区的编码序列，所述第二轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述第二重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

6.根据权利要求5所述的可分泌抗CEA抗体的细胞，其特征在于，所述采用转染组合物转染动物细胞的步骤之前，还包括制备所述第一质粒的步骤：将所述第一轻链可变区的编码序列和所述第一重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到第一质粒，其中，所述第一轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.5所示，所述第一重链可变区的编码序列如SEQ ID No.6所示；

进一步地，所述将所述第一轻链可变区的编码序列和所述第一重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中的步骤之前，还包括如下步骤：采用序列如SEQ IDNo.13～SEQ ID No.14所示的引物对扩增所述第一轻链可变区的编码序列；及采用序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示的引物对扩增所述第一重链可变区的编码序列。

7.根据权利要求5所述的可分泌抗CEA抗体的细胞，其特征在于，所述采用转染组合物转染动物细胞的步骤之前，还包括制备所述第二质粒的步骤：将所述第二轻链可变区的编码序列和所述第二重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中，得到第二质粒，所述第二轻链可变区的编码序列如SEQ ID No.7所示，所述第二重链可变区的编码序列如SEQ ID No.8所示；

进一步地，所述将所述第二轻链可变区的编码序列和所述第二重链可变区的编码序列克隆至pAc-κ-CH3andpAc-λ-CH3质粒中的步骤之前，还包括如下步骤：采用序列如SEQ IDNo.13～SEQ ID No.14所示的引物对扩增所述第二轻链可变区的编码序列；及采用序列如SEQ ID No.15～SEQ ID No.16所示的引物对扩增所述第二重链可变区的编码序列。

8.根据权利要求5～7任一项所述的可分泌抗CEA抗体的细胞，其特征在于，所述可分泌抗CEA抗体的细胞的保藏号为CCTCC NO：C2019246。

9.权利要求1～4任一项所述的抗CEA抗体或者权利要求5～7任一项所述的可分泌抗CEA抗体的细胞在制备CEA检测试剂或者CEA检测设备中的应用。

10.一种CEA检测试纸，用于检测乳头溢液中的CEA，其特征在于，包括：

纳米酶标记的抗CEA抗体，所述纳米酶标记的抗CEA抗体为纳米酶标记的权利要求1～4任一项所述的抗CEA抗体或者纳米酶标记的权利要求5～7任一项所述的可分泌抗CEA抗体的细胞分泌的抗CEA抗体；及

固相载体，与所述纳米酶标记的抗CEA抗体结合。