CN107688090A - 一种NTx检测试纸、试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NTx检测试纸条，包括层析膜和结合垫；结合垫上担载免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，层析膜上沿液体层析方向设有包被NTx蛋白的检测线和包被第二抗体的比色线。样品检测时，第二抗体特异性结合第一抗体后，比色线对应显示特定蛋白浓度的色度，检测线上NTx蛋白与样品中NTx蛋白竞争性结合免疫标记的NTx抗体，通过直观比较检测线与比色线显色的深浅，实现对NTx蛋白的半定量检测。本发明公开了NTx检测试纸条的制备方法，用于制备检测快速、灵敏、不依赖仪器的NTx蛋白半定量检测试纸条。本发明公开了NTx检测试剂盒，包括上述的NTx检测试纸条，能够为骨质疏松症的早期诊断、治疗提供有效信息。

Description

一种NTx检测试纸、试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种NTx检测试纸、试剂盒及其制备方法。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨量减少，骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病。随着人口寿命的不断增长及老年人口不断增加，骨质疏松症的发病率已在世界常见多发病中跃居继心脑血管病、癌症之后的第七位，是继心血管疾病后第二大医疗问题。我国是骨质疏松症患者最多的国家，发病人数约l亿人，骨质疏松症成为影响老年人健康的一个主要问题，50岁以上的人群中大约有一半的女性和四分之一的男性患有骨质疏松症。当前对于骨质疏松症研究的重点是如何早期作出诊断，最终通过有效的干预，防止症状的出现和骨折的发生。
人体的骨组织在不断进行着新陈代谢，骨形成、骨吸收和静止3个阶段构成了骨转换的过程，在骨转换过程中产生的一些代谢物，叫做骨转换生化标志物(biochemicalmarkers of bone turnover)，简称骨标志物(bone markers)。骨转换生化标志物反映了骨转换的总体速率，代表了全身骨骼的动态状况，许多非骨骼性疾病也会影响骨代谢而改变骨转换的速率，这些标志物已经成为诊断代谢性骨病、评估抗骨吸收和促骨形成药物疗效的重要指标。由于骨转换标志物检测具有无创、快速、灵敏的优点，对于其应用于骨质疏松症的早期发现、骨折危险性预测、骨转换类型判断、骨丢失速率判断，以及了解病情进展、选择干预措施和疗效监测等方面都有着重要的价值。
骨标志物分为骨形成标志物和骨吸收标志物，骨形成标志物代表成骨细胞活动和骨形成时的骨代谢产物，骨吸收标志物代表破骨细胞活动和骨吸收时的代谢产物，特别是骨基质降解产物。其中骨形成的标志物有：血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨源性碱性磷酸酶(BALP)、I型原胶原C-端前肽(PICP)、I型原胶原N-端前肽(CINP)；骨吸收的标志物有：空腹2小时尿钙/肌酐比值、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TPACP)、Ⅰ型胶原C末端肽(S-CTX)、尿吡啶啉(Pyr)、尿脱氧吡啶啉(D-Pyr)、尿Ⅰ型胶原交联C-末端肽(U-CTX)、尿Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(U-NTx)。
胶原又称胶原蛋白，是一种糖蛋白，在人体中主要分布于结缔组织。胶原共有4型，骨有机质中的胶原90％为I型胶原。胶原蛋白的基本单位称为原胶原蛋白，原胶原蛋白由三条相互缠绕的α-肽链构成，两端的非螺旋部分，称为末端肽，分别由16个氨基和26个羧基构成，称为氨基末端肽(NTx)和羧基末端肽(CTx)。大量临床试验和研究证明NTx与骨转移的累积范围及活动程度之间存在较强的相关性，其中尿液中I型胶原交联氨基末端肽(amino-terminal telopeptide of type I collagen，U-NTx)是骨吸收的一个敏感的和特异的指标，在预测骨量丢失趋势及疗效监测方面具有重要的价值。
临床上一般使用电化学免疫法和ELISA法检测骨代谢标志物，这两种方法的检测时间过长，电化学免疫法的检测时间一般在45分钟以上，ELISA法的检测时间一般在1小时30分钟以上。并且，以上两种方法的操作较为复杂，需要特殊的设备，以及专业的检验人员操作才能完成。
中国专利文献CN106370844A公开了一种人骨代谢标志物检测双胶体金试纸条及应用其的检测装置，其中试纸条包括样品垫、第一结合垫、第二结合垫和硝酸纤维素膜，第一结合垫涂覆有金标链霉亲和素，第二结合垫涂覆有金标生物素化抗体，金标链霉亲和素与金标生物素化抗体可以特异性地结合。在样品检测时，样本中的骨代谢标志物结合金标生物素化抗体，通过金标链霉亲和素与金标生物素化抗体放大胶体金产生的信号，实现了对血清骨钙素(OC)的高灵敏度检测。利用上述试纸条能够提高骨代谢标志物检测的效率与灵敏度，但其检测结果必须依靠金标定量阅读仪读取，需要专业人员使用，增加了骨代谢标志物的检测成本和检测步骤，不利于检测试纸的大规模普及应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的骨代谢标志物检测的胶体金试纸条必须依赖检测仪器确定检测结果，导致检测成本高、检测过程复杂；从而提供一种检测成本低、操作简单、不需要依赖设备，能够通过肉眼观测完成对NTX1半定量检测的试纸条。
本发明提供了一种NTx检测试纸条，包括层析膜，所述层析膜的一端连接结合垫；所述结合垫上担载免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，所述层析膜上沿液体层析方向依次设有检测线和比色线，所述检测线上包被NTx蛋白，所述比色线上包被第二抗体，所述第二抗体特异性结合所述第一抗体。
优选地，上述的NTx检测试纸条，所述检测线由0.6-0.8mg/ml的NTx蛋白以1.1μl/cm的液体量包被在所述检测线位置处形成，所述比色线由0.2-0.3mg/ml的第二抗体以1.0μl/cm的液体量包被在所述比色线位置处形成；
所述结合垫上担载有点样量为16.7mg/cm2的免疫标记的NTx抗体溶液，以及点样量为16.7mg/cm2的免疫标记的第一抗体溶液，所述免疫标记的NTx抗体溶液和所述免疫标记的第一抗体溶液OD520nm大于0.8。
优选地，上述的NTx检测试纸条，所述结合垫包括沿所述液体层析方向依次连接的第一结合垫和第二结合垫，所述第一结合垫上担载所述免疫标记的NTx抗体，所述第二结合垫上担载免疫标记的第一抗体。
优选地，上述的NTx检测试纸条，所述免疫标记为胶体金标记、胶体砷标记、胶体碳标记、有色乳胶标记或荧光乳胶标记。
进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述免疫标记的第一抗体为胶体金标记的IgG抗体，所述第二抗体是以所述胶体金标记的IgG抗体为免疫原的IgG多克隆抗体。
进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述免疫标记的NTx抗体为胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体，所述免疫标记的第一抗体为胶体金标记的兔IgG多克隆抗体，所述第二抗体为羊抗兔IgG多克隆抗体。
优选地，上述的NTx检测试纸条，所述层析膜上还设有质控线，沿所述液体层析方向上所述质控线位于所述比色线之后，所述质控线上包被第三抗体，所述第三抗体特异性结合所述NTx抗体。
进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述第三抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体。
进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述质控线由0.5-0.7mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体以1.0μl/cm的液体量包被在所处质控线位置处形成。
优选地，上述的NTx检测试纸条，所述NTx检测试纸条还包括样品垫、调速垫、吸收垫和底板；所述底板上沿所述液体层析方向依次黏贴所述样品垫、所述第一结合垫、所述第二结合垫、所述调速垫、所述吸收垫和所述底板。
进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述调速垫由无纺布、玻璃纤维或聚酯膜制成，所述结合垫由玻璃纤维、聚酯膜或无纺布制成，所述层析膜由硝酸纤维素膜制成。
本发明提供了一种NTx检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
a.向胶体金溶液中加入比例为8μg/g的鼠抗人NTx单克隆抗体，搅拌混匀后继续加入NTx稳定剂，搅拌混匀后离心，得到胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体；
b.用NTX-A105溶液稀释步骤a得到的胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体，将OD520nm大于0.8稀释液以16.7mg/cm2的量担载在玻璃纤维上，晾干后备用；
c.向胶体金溶液中加入比例为6μg/g的兔IgG多克隆抗体，搅拌10min后继续加入终浓度为1％(V/V)的BSA，搅拌混匀后离心，得到胶体金标记的兔IgG多克隆抗体；
d.用NTX-A105溶液稀释步骤c得到的胶体金标记的兔IgG多克隆抗体，将OD520nm大于0.8稀释液以16.7mg/cm2的量担载在玻璃纤维上，晾干后备用；
e.用第一包被液稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度至0.5-0.7mg/ml，用第一包被液稀释羊抗兔IgG多克隆抗体的浓度至0.2-0.3mg/ml，用第二包被稀释液稀释NTx蛋白的浓度至0.6-0.8mg/ml；然后依次将0.6-0.8mg/ml的NTx蛋白以1.1μl/cm的液体量包被在硝酸纤维素膜上形成检测线，将0.2-0.3mg/ml的兔IgG多克隆抗体以1.0μl/cm的液体量包被在硝酸纤维素膜上形成比色线，将0.5-0.7mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体以1.0μl/cm的液体量包被在硝酸纤维素膜上形成质控线，包被后的硝酸纤维素膜室温晾干后备用；
f.在底板上依次黏贴样品垫、调速垫、结合垫、步骤e制备的硝酸纤维素膜和吸收垫，其中结合垫由步骤b中制备的担载有胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体的玻璃纤维和步骤d中制备的担载有胶体金标记的兔IgG多克隆抗体的玻璃纤维黏贴在所述底板上形成。
优选地，上述的NTx检测试纸条的制备方法，所述NTX-A105溶液是向PH8.0 0.1M的TB溶液中加入如下质量比的组分：0.5％的PEG-2000、0.5％的诺蛋白、20％的海藻糖和0.5％的Tween-20；所述第一包被稀释液是向PH7.4 0.04M的PBS溶液中加入如下质量比的组分：3％的海藻糖；所述第二包被稀释液是向PH8.0 0.05M的TB溶液中加入如下质量比的组分：4％的蔗糖和0.05％的EDTA-NA2；所述样品垫包括如下质量比的组分：2.42％的Tris、1％的TritonX-100、0.5％的Tween-20、1％的碳酸钠、1％的PVP和0.1％的明胶。
本发明提供了一种NTx检测试剂盒，所述NTx检测试剂盒包括上述的NTx检测试纸条，或应用上述的NTx检测试纸条的制备方法所制得的NTx检测试纸条。
优选地，上述的NTx检测试剂盒，所述NTx检测试剂盒还包括NTx蛋白浓度色度卡，所述色度卡对应显示蛋白浓度为2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、40ng/ml、65ng/ml和70ng/ml的色度。
本发明相对现有技术具有如下优点：
1.本发明提供的NTx检测试纸条，包括结合垫和层析膜，其中结合垫上担载免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，层析膜沿液体层析方向设有检测线和比色线，检测线包被NTx蛋白，比色线包被第二抗体。将液态的待测样品滴加到试纸条上后，待测样品在毛细作用下在试纸条上涌动，在沿液体层析方向上，液态的待测样品首先溶解结合垫上包被的免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，当待测样品中包含NTx蛋白时，样品中的NTx蛋白结合免疫标记的NTx抗体，然后继续沿液体层析方向涌动；到达检测线位置处时，检测线上的NTx蛋白与样品中的NTx蛋白竞争性结合免疫标记的NTx抗体，使部分免疫标记的NTx抗体结合在检测线位置，从而使检测线通过结合免疫标记而显色，且检测线显色的色度随样品中NTx蛋白量的增加而变浅；液体继续涌动至比色线位置时，免疫标记的第一抗体与比色线位置处的第二抗体结合，使比色线由于免疫标记显色，由于第一抗体与第二抗体的量为固定值，比色线显色的色度恒定，通过比较检测线显色与比色线显色的色度大小，能够对待测样品中NTx蛋白的含量进行半定量的测定。
本发明提供的NTx检测试纸条，通过抗原竞争性结合抗体，实现对NTx蛋白的高灵敏度检测，能够应用于骨质疏松症的早期诊断，为疾病控制、药物疗效的监测评估，以及预后判断提供可靠信息。应用本发明提供的NTx检测试纸条，能够实现对尿液样本的直接检测，试纸条检测稳定性高，不易受检测环境以及待测样品中NTx蛋白之外的物质组分影响，对待测对象的饮食没有特殊要求，检测适用范围广；同时，应用试纸条的检测过程操作简单、不需要专业技术人员使用，结果判读快速、不需要使用仪器、检测成本低，适用于NTx蛋白检测的大规模普及应用。
2、本发明提供的NTx检测试纸条，通过控制免疫标记的NTx抗体、免疫标记的第一抗体、NTx蛋白和第二抗体的含量，能够提高NTx蛋白检测的灵敏度，且使试纸条具有适宜的检测限。试纸条上比色线的显色色度对应浓度为1200nM的NTx蛋白，检测线颜色随待测样品中NTx蛋白浓度的增加，检测线色度逐渐变浅，当样品中NTx蛋白达到5000nM时，检测线不显色，通过直观观测判定样品中NTx蛋白的浓度范围。
3、本发明提供的NTx检测试纸条，用于显色的免疫标记为胶体标记，通过将NTx蛋白和第一抗体与胶体金颗粒结合，使蛋白或抗体沉积处形成肉眼可见的红色，实现对NTx蛋白的半定量检测，检测结果显示快速，胶体金检测可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。并且，检测结果可以长期保存，便于对照分析。
4、本发明提供的NTx检测试纸条，免疫标记的NTx抗体为胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体，免疫标记的第一抗体为胶体金标记的兔IgG多克隆抗体，第二抗体为羊抗兔IgG多克隆抗体。鼠抗人NTx单克隆抗体能够被样本中的NTx蛋白或者检测线上的NTx蛋白竞争性的结合，结合的特异性好、灵敏度高。兔IgG多克隆抗体具有容易获得、敏感性强、稳定性好等优点，胶体金标记的兔IgG多克隆抗体与羊抗兔IgG多克隆抗体能够特异性结合，然后稳定显示特定浓度的色度，作为NTx检测试纸条的显色参比物。
5、本发明提供的NTx检测试纸条，液体层析方向上所述质控线位于所述比色线之后，所述质控线上包被第三抗体，第三抗体特异性结合所述NTx抗体，第三抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体。通过设置质控线能够判断试纸条是否失效，在检测过程中，质控线上的羊抗鼠IgG多克隆抗体与胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体结合后显红色，则试纸条检测结果为有效结果，如果质控线不显色，则试纸条检测结果无效。另一方面，通过比较质控线与检测线的色度值，能够进一步判断待测样品中NTx蛋白的浓度范围，当检测线色度小于比色线色度时，若检测线显色与质控线颜色相当，则样品中NTx蛋白浓度小于400nM；若检测线显色色度小于质控线显色色度，则样品中NTx蛋白浓度介于400nM与1200nM之间。
6、本发明提供的NTx检测试纸条，在结合垫和层析膜之间设有调速垫，可以底板上用于黏贴结合垫的胶黏剂溶解结合垫，使胶体金标记的抗体提前释放，同时调速垫能够在检测过程中将胶体金标记的蛋白或抗体在调速垫位置处暂时聚集，然后继续涌向层析膜，使胶体金标记的蛋白或抗体以更加均匀的浓度和速度与层析膜上设置的各线的位置结合。
7、本发明提供的NTx检测试纸条的制备方法，能够用于制备检测灵敏度高、检测速度快、能够通过肉眼直观判断样品中NTx蛋白的浓度范围的NTx检测试纸条。
8、本发明提供的NTx检测试剂盒，试剂盒中包括色度卡，色度卡显示对应显示蛋白浓度为2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、40ng/ml、65ng/ml和70ng/ml的色度，通过比较检测线色度与色度卡上的色度显示，能够判断样品中NTx蛋白浓度的具体范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中所提供的NTx检测试纸的结构示意图；
图2为本发明实施例1中所提供的NTx检测试纸的主视图；
图3为本发明实施例2中所提供的NTx检测试纸的结构示意图；
图4为本发明检测例1和检测例2中所应用的NTx蛋白浓度比色卡示意图。
附图标记说明：
1-底板；2-样品垫；31-第一结合垫，32-第二结合垫，3-结合垫；4-调速垫；5-层析膜；6-检测线；
7-比色线；8-质控线；9-吸收垫。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
实施例1
本实施例提供一种NTx检测试纸条，NTx检测试纸条包括底板1和固定在底板1上的样品垫2、第一结合垫31、第二结合垫32、调速垫4和层析膜5。其中调速垫4的一端搭接于第二结合垫32的下方，另一端搭接于层析膜5的上方；第二结合垫32远离调速垫的一端搭接于第一结合垫31的下方，第一结合垫31远离第二结合垫32的一端搭接于样品垫2的下方；层析膜5远离调速垫4的一端搭接吸收垫9的下方，样品垫2、第一结合垫31、第二结合垫32、调速垫4、层析膜5和吸收垫9固定在底板1上。NTx检测试纸条的具体制备方法如下：
1、制备胶体金溶液
1000ml体外诊断试剂用纯化水加热煮沸后，快速加入2％柠檬酸三钠溶液10g，待溶液再次沸腾后，迅速加入1％氯金酸溶液20g，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变灰变黑再变紫，最后变成透明的酒红色后，计时继续加热8分钟即可。待溶液冷却至室温后，加入体外诊断试剂用纯化水补充至1000g。
2、制备胶体金标记的抗体/抗原结合物
(1)制备胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体：取100g步骤1中制备的胶体金溶液，在搅拌状态下，加入质量比为0.5％的PH调节剂(0.2MK2CO3)，搅拌3分钟。随后按照8μg/g的比例将鼠抗人NTx单克隆抗体一次性搅拌加入，继续搅5分钟。最后加入1％的NTx稳定剂，搅拌混匀。其中NTx稳定剂的制备方法为：向0.4M PH7.4的TB中加入质量比为20％的蔗糖和质量比为0.1％的Tween-20。
将上述胶体金反应溶液分别经3次30分钟的离心，离心速度为：3000rpm、6000rpm、9000rpm，合并三次收集的沉淀，得到胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体沉淀，其重量记作G1。
(2)兔IgG多克隆抗体金标反应沉淀的制备：每100g胶体金溶液，在搅拌状态下，加入质量比为0.55％的PH调节剂(0.2M K2CO3)，即加入PH调节剂为0.55g，直接加入胶体金溶液中，加完后搅拌1分钟。在搅拌状态下，按照标记量6μg/ml，加入标记抗体600μg，加入抗体后可适当调整转速，使搅拌状态温和，继续反应至10min(烧杯用保鲜膜封住)；加入4％的BSA使其终体积为胶体金溶液体积的1％，继续搅拌10min。
将上述胶体金反应溶液分别经2次30分钟的离心，离心速度为：5000rpm、10000rpm，分别合并2次收集的沉淀，沉淀分别用重悬液复溶，重悬液按胶体金溶液体积的1/5加入，再次分别离心2次，离心速度为：5000rpm、10000rpm。得到胶体金标记的兔IgG多克隆抗体沉淀，其重量记为G2。
3、制备金标反应膜
将制得金标沉淀量G1、G2经100倍稀释测定OD值(A520nm)，每项标志物的对应的光密度值A520nm为0.9。
(1)鼠抗人NTx单克隆抗体金标溶液制备和涂布
鼠抗人NTx单克隆抗体金标溶液所需重量记为G3，按照下列公式进行计算，G3＝G1×(100×A520nm)/15，最后加入NTx-A105溶液稀释，所加入的重量为：G3－G1，混匀。
每10g上述金标结合物溶液均匀涂布此规格(20cm×30cm)的玻璃纤维1张，涂布面为玻璃纤维光滑面，涂布好后光滑面向下平铺，室温过夜晾干不少于24小时，记做生产中间体组分NTx-S4-1。
(2)兔IgG多克隆抗体金标溶液制备和涂布
兔IgG多克隆抗体金标溶液的重量记作G4，按照下列公式进行计算，G4＝G2×(100×A520nm)/8，最后加入NTx-A105溶液稀释，所加入的重量为：G4－G2，混匀。
每10g上述金标结合物溶液均匀涂布此规格(20cm×30cm)的玻璃纤维1张，涂布面为玻璃纤维光滑面，涂布好后光滑面向下平铺，室温过夜晾干不少于24小时，记做生产中间体组分NTx-S4-2。
其中NTx-A105的制备方法为：向0.1M PH8.0的TB溶液中加入最终质量比为0.5％的PEG-2000、质量比为0.5％的诺蛋白、质量比为20％的海藻糖、质量比为0.5％的Tween-20。
(3)分切
将晾干的金标抗体反应膜按照表1所示的中间体组分对应的裁切宽度进行分切(误差范围控制在±0.5mm)，铝箔袋密封，室温存放，有效期1年。
表1中间体组分对应的裁切宽度
胶体金 裁切宽度 中间体组分
第一结合垫 0.4cm NTx-S4-1
第二结合垫 0.35cm NTx-S4-2
4、硝酸纤维反应膜制备
(1)硝酸纤维素膜分切：选择宽度为2厘米的背衬膜。
(2)包被检测线、比色线和质控线
a.包被液配置：相应的稀释配置包被液，分别按照顺序依次加入相应的样品杯。其中质控线包被液NTx-01(质控线)：使用第一包被稀释液(向0.04M PH7.4的PBS溶液中加入质量比为3％的海藻糖)稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度至0.7mg/ml；比色线包被液NTx-02(比色线)：使用第一包被稀释液稀释羊抗兔IgG多克隆抗体浓度至0.3mg/ml；检测线包被液NTx-03(检测线)包被第二包被稀释液(向0.05M PH8.0的TB溶液中加入质量比为4％的蔗糖和0.05％的EDTA-NA2)稀释人I型胶原交联氨基末端肽浓度至0.7mg/ml。
b.包被：调试包被机，检测线喷液量设定为1.1μl/cm，比色线、质控线喷液量为1.0μl/cm，导轨速度6.0cm/sec，喷嘴间隔3.5mm；然后进行喷液或者划膜，包被后的硝酸纤维素膜室温过夜晾干时间为20小时。
c.晾干后的硝酸纤维反应膜记做生产中间体组分NTx-S1。铝箔袋密封，室温存放，效期1年。
(3)制作样品垫，其中样品垫组成成分(质量比)包括2.42％的Tris、1％的TritonX-100、0.5％的Tween-20、1％的碳酸钠、1％的PVP和0.1％的明胶。
(4)根据不同产品的形式，将各中间体组分一次粘贴后，按照要求分切为不同的宽度试纸条。
实施例2
本实施例提供一种NTx检测试纸条，如图3所示，与实施例1中的NTx检测试纸条的区别仅在于：NTx检测试纸条上不设置质控线8。
对比例1
本实施例提供一种NTx检测试纸条，与实施例1中的NTx检测试纸条的区别仅在于：在硝酸纤维素膜上包被比色线、检测线和质控线时，包被液的配制方法为：相应的稀释配置包被液，分别按照顺序依次加入相应的样品杯。其中质控线包被液NTx-01(质控线)：使用第一包被稀释液(向0.04M PH7.4的PBS溶液中加入质量比为3％的海藻糖)稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度至0.5mg/ml；比色线包被液NTx-02(比色线)：使用第一包被稀释液稀释羊抗兔IgG多克隆抗体浓度至0.2mg/ml；检测线包被液NTx-03(检测线)包被第二包被稀释液(向0.05M PH8.0的TB溶液中加入质量比为4％的蔗糖和0.05％的EDTA-NA2)稀释人I型胶原交联氨基末端肽浓度至0.8mg/ml。
对比例2
本实施例提供一种NTx检测试纸条，与实施例1中的NTx检测试纸条的区别仅在于：在硝酸纤维素膜上包被比色线、检测线和质控线时，包被液的配制方法为：相应的稀释配置包被液，分别按照顺序依次加入相应的样品杯。其中质控线包被液NTx-01(质控线)：使用第一包被稀释液(向0.04M PH7.4的PBS溶液中加入质量比为3％的海藻糖)稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度至0.6mg/ml；比色线包被液NTx-02(比色线)：使用第一包被稀释液稀释羊抗兔IgG多克隆抗体浓度至0.25mg/ml；检测线包被液NTx-03(检测线)包被第二包被稀释液(向0.05M PH8.0的TB溶液中加入质量比为4％的蔗糖和0.05％的EDTA-NA2)稀释人I型胶原交联氨基末端肽浓度至0.6mg/ml。
检测例1
应用实施例1中制备的NTx检测试纸条对标准品的NTx蛋白进行检测，具体步骤如下：
1、使用磷酸盐缓冲液(0.02M PH7.4PBS溶液中加入质量比为0.25％的BSA)稀释NTx蛋白至规定浓度，每种蛋白浓度分别使用20条NTx检测试纸条进行检测判定，将有效检出结果进行计数。
2、用塑料滴管直接在试纸条样品垫上方滴加3滴待测样本，开始计时，应在5～10分钟内观察和记录结果，10分钟后结果判定无效。
3、结果判定：首先观测质控线和比色线颜色，若质控线和比色线至少有一条线未出现颜色，说明检测结果无效；当两条线都显示颜色时，进一步比较检测线显色色度与比色线和质控线的大小，浓度若样本中含有NTx蛋白浓度为1200nM时，检测线和比色线的颜色相当，若高于该浓度，比色线的色度深于检测线，样本中NTx蛋白浓度达到5000nM时，检测线不显色。样本中含有NTx蛋白浓度低于400nM时，检测线色度和质控线色度相当，检测结果如表2所示，通过比对检测线与质控线和比色线的色度，可以判断(0,400nM)、(400nM,1200nM)、(1200nM,5000nM)和5000nM以上的浓度范围的NTx蛋白，实现对NTx蛋白的半定量快速检测，且检测结果的可重复性好，NTx蛋白检测的稳定性高。
表2实施例1检测结果统计表
表3不同NTx蛋白浓度对应的色度卡显色色度
将检测线显色结果与NTx蛋白浓度色度卡进行比对，能够进一步得到样品中NTx蛋白的浓度范围，不同浓度的蛋白对应的显色色度的比对结果如表3所示。
检测例2
使用实施例2中制备的NTx检测试纸条与色度卡对标准品的NTx蛋白进行检测，具体步骤如下：
1、使用磷酸盐缓冲液(0.02M PH7.4PBS溶液中加入质量比为0.25％的BSA)稀释NTx蛋白至规定浓度，每种蛋白浓度分别使用20条NTx检测试纸条进行检测判定。
2、用塑料滴管直接在试纸条样品垫上方滴加3滴待测样本，开始计时，应在5～10分钟内观察和记录结果，10分钟后结果判定无效。
3、结果判定：通过比较检测线显色颜色与比色卡上不同浓度显色对应的色度大小，实现对样品中NTx蛋白浓度的半定量测定，确定浓度在(0,1200nM)与(1200nM,5000nM)和大于5000nM三个浓度范围内的NTx蛋白，具体检测结果如表4所示。
表4实施例2检测结果统计表
将检测线显色结果与NTx蛋白浓度色度卡进行比对，能够进一步得到样品中NTx蛋白的浓度范围，不同浓度的蛋白对应的显色色度的比对结果如表3所示。
检测例3
应用实施例1和对比例1-2中所制备的NTx检测试纸条对不同浓度的NTx蛋白进行检测，每种检测浓度各使用四种试纸条进行检测，每种试纸条使用20条，统计20条试纸条的检出结果，将有效检出结果进行计数，检测结果如表5所示，实施例1和对比例1-3中所制备的NTx检测试纸条，检测结果的重复性好，检测结果的准确度高。
表5不同方法制备所得NTx检测试纸条的检测结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (15)

1.一种NTx检测试纸条，其特征在于：包括层析膜(5)，所述层析膜(5)的一端连接结合垫(3)；所述结合垫(3)上担载免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，所述层析膜(5)上沿液体层析方向依次设有检测线(6)和比色线(7)，所述检测线(6)上包被NTx蛋白，所述比色线(7)上包被第二抗体，所述第二抗体特异性结合所述第一抗体。
2.根据权利要求1所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述检测线(6)由0.6-0.8mg/ml的NTx蛋白以1.1μl/cm的液体量包被在所述检测线(6)位置处形成，所述比色线(7)由0.2-0.3mg/ml的第二抗体以1.0μl/cm的液体量包被在所述比色线(7)位置处形成；
所述结合垫(3)上担载有点样量为16.7mg/cm2的免疫标记的NTx抗体溶液，以及点样量为16.7mg/cm2的免疫标记的第一抗体溶液，所述免疫标记的NTx抗体溶液和所述免疫标记的第一抗体溶液的OD520nm均大于0.8。
3.根据权利要求1或2所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述结合垫(3)包括沿所述液体层析方向依次连接的第一结合垫(31)和第二结合垫(32)，所述第一结合垫(31)上担载所述免疫标记的NTx抗体，所述第二结合垫(32)上担载免疫标记的第一抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述免疫标记为胶体金标记、胶体砷标记、胶体碳标记、有色乳胶标记或荧光乳胶标记。
5.根据权利要求4所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述免疫标记的第一抗体为胶体金标记的IgG抗体，所述第二抗体是以所述胶体金标记的IgG抗体为免疫原的IgG多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述免疫标记的NTx抗体为胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体，所述免疫标记的第一抗体为胶体金标记的兔IgG多克隆抗体，所述第二抗体为羊抗兔IgG多克隆抗体。
7.根据权利要求1-6任一项所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述层析膜(5)上还设有质控线(8)，沿所述液体层析方向上所述质控线(8)位于所述比色线(7)之后，所述质控线(8)上包被第三抗体，所述第三抗体特异性结合所述NTx抗体。
8.根据权利要求7所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述第三抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述质控线(8)由0.5-0.7mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体以1.0μl/cm的液体量包被在所处质控线(8)位置处形成。
10.根据权利要求3所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述NTx检测试纸条还包括样品垫(2)、调速垫(4)、吸收垫(9)和底板(1)；所述底板(1)上沿所述液体层析方向依次黏所述贴样品垫(2)、所述第一结合垫(31)、所述第二结合垫(32)、所述调速垫(4)和所述吸收垫(9)。
11.根据权利要求10所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述调速垫(4)由无纺布、玻璃纤维或聚酯膜制成，所述结合垫(3)由玻璃纤维、聚酯膜或无纺布制成，所述层析膜(5)由硝酸纤维素膜制成。
12.一种NTx检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.向胶体金溶液中加入比例为8μg/g的鼠抗人NTx单克隆抗体，搅拌混匀后继续加入NTx稳定剂，搅拌混匀后离心，得到胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体；
b.用NTX-A105溶液稀释步骤a得到的胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体，将OD520nm大于0.8稀释液以16.7mg/cm2的量担载在玻璃纤维上，晾干后备用；
c.向胶体金溶液中加入比例为6μg/g的兔IgG多克隆抗体，搅拌10min后继续加入终浓度为1％(V/V)的BSA，搅拌混匀后离心，得到胶体金标记的兔IgG多克隆抗体；
d.用NTX-A105溶液稀释步骤c得到的胶体金标记的兔IgG多克隆抗体，将OD520nm大于0.8稀释液以16.7mg/cm2的量担载在玻璃纤维上，晾干后备用；
e.用第一包被液稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度至0.5-0.7mg/ml，用第一包被液稀释羊抗兔IgG多克隆抗体的浓度至0.2-0.3mg/ml，用第二包被稀释液稀释NTx蛋白的浓度至0.6-0.8mg/ml；然后依次将0.6-0.8mg/ml的NTx蛋白以1.1μl/cm的液体量包被在硝酸纤维素膜上形成检测线(6)，将0.2-0.3mg/ml的兔IgG多克隆抗体以1.0μl/cm的液体量包被在硝酸纤维素膜上形成比色线(7)，将0.5-0.7mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体以1.0μl/cm的液体量包被在硝酸纤维素膜上形成质控线(8)，包被后的硝酸纤维素膜室温晾干后备用；
f.在底板(1)上依次黏贴样品垫(2)、调速垫(4)、结合垫(3)、步骤e制备的硝酸纤维素膜和吸收垫(9)，其中结合垫(3)由步骤b中制备的担载有胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体的玻璃纤维和步骤d中制备的担载有胶体金标记的兔IgG多克隆抗体的玻璃纤维黏贴在所述底板(1)上形成。
13.根据权利要求12所述的NTx检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述NTX-A105溶液是向PH8.0 0.1M的TB溶液中加入如下质量比的组分：0.5％的PEG-2000、0.5％的诺蛋白、20％的海藻糖和0.5％的Tween-20；所述第一包被稀释液是向PH7.4 0.04M的PBS溶液中加入如下质量比的组分：3％的海藻糖；所述第二包被稀释液是向PH8.0 0.05M的TB溶液中加入如下质量比的组分：4％的蔗糖和0.05％的EDTA-NA2；所述样品垫(2)包括如下质量比的组分：2.42％的Tris、1％的TritonX-100、0.5％的Tween-20、1％的碳酸钠、1％的PVP和0.1％的明胶。
14.一种NTx检测试剂盒，其特征在于：所述NTx检测试剂盒包括权利要求1-11任一项所述的NTx检测试纸条，或应用权利要求12-13任一项所述的NTx检测试纸条的制备方法所制得的NTx检测试纸条。
15.根据权利要求14所述的NTx检测试剂盒，其特征在于：所述NTx检测试剂盒还包括NTx蛋白浓度色度卡，所述NTx蛋白浓度色度卡对应显示蛋白浓度为2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、40ng/ml、65ng/ml和70ng/ml的色度。
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