CN101561438A

CN101561438A - 一种相思子毒素的胶体金检测试纸及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101561438A
Application number: CNA2009100849614A
Authority: CN
Inventors: 王静; 王景林; 聂聪; 杨宇; 孙肖红; 高姗; 胡孔新; 张晓龙
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2009-10-21

Abstract

本发明公开了一种检测试纸，该试纸包含：(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组相思子毒素A链抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链抗体。本发明试纸可以配合小型仪器进行半定量检测，不需专业培训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对相思子毒素的感染诊断起到辅助作用。

Description

一种相思子毒素的胶体金检测试纸及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及相思子毒素的检测试纸及其制备方法和在检测相思子毒素中的应用。

背景技术

相思子毒素是从豆科藤本植物相思子(Abrusprecatorius)的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋白毒素，其含量约占种子2.8％～3.0％。相思子毒素存在4种同族毒素(isoabrins)，即abrin-a、abrin-b、abrin-c、和abrin-d，相对分子质量介于63kDa～67kDa之间，它们由不同的基因所编码，但同属于一个多基因家族；其中abrin-b、abrin-c由于其B链凝集活性低而只有较弱的细胞毒性作用；而abrin-a、abrin-d则有极强的细胞毒性，小鼠的LD50为0.04μg/kg，成年人摄入的致死剂量为5.0μg/kg～7.0μg/kg，其毒性强度是蓖麻毒素(小鼠LD503.0μg/kg)的70多倍，已被列为潜在的重要毒素战剂和生物恐怖病原物质之一。

针对相思子毒素中毒，目前国内外还没有适用于人的解毒药和特异抗毒素等专用特效药。针对这一现状，对相思子类毒素等生物战剂医学防护领域的研究，重点应集中在侦检、治疗和疫苗预防等方面。目前免疫技术是检测相思子毒素中毒的最常用技术手段，主要有放射性免疫法(Radioimmunoassay，RIA)和酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)。

RIA技术主要是通过使用放射性元素125I对毒素进行标记，实现对蓖麻毒素中毒的检测和监控。这一方法非常适宜应用于对中毒患者血液中蓖麻毒素的含量检查以及法医学鉴定，最低检测线可达50～100pg/ml。其缺点是放射性元素的处理比较麻烦，且耗时较长。ELISA技术现已被广泛的应用于生物样本中蓖麻毒素的检测，最低检测线可以达到100pg/ml。基于免疫技术的生物传感器也被应用于检测毒素和生物战剂，利用毒素不同的响应元件作为传感器的敏感组件，可以同时测定多种毒素毒剂，小巧轻便，适于野外及现场的使用。

上述方法虽然灵敏度高，但对于样品的检测有很大的局限性：首先，剧毒毒素的抗体获得比较困难，放射性免疫测定还要求至少知道分析物的部分一级结构；另外，ELISA法孵育时间长，不适合作为现场检测。上述方法已经满足不了当代防恐需要，迫切需要可以现场、快速、定量检测相思子毒素的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种方便、快捷地检测相思子毒素的试纸，同利用金标免疫分析仪进行的半定量检测方法。该试纸的工作原理是利用特异性抗原-抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合后，使与试纸上结合的捕获抗体显色。本发明还涉及制备上述检测试纸的制备方法。

本发明能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的相思子毒素，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。

本发明涉及一种方便、快捷地检测相思子毒素的检测试纸，它包含：

(1)反应支持物；

(2)吸水垫；

(3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体检测条带和质控羊抗鼠IgG的质控条带；所述的羊抗鼠IgG可购自鼎国生物技术有限公司，另外，金标抗体保护膜标记的是鼠抗的重组抗体，所以质控用的是羊抗鼠IgG，这是一种很普遍的抗体。本实验采用高纯度的重组相思子A链抗原蛋白，免疫兔制备大量多克隆抗体，获得高纯度高特异性的抗体。在抗体纯化方面，除采用辛酸-硫酸铵分级沉淀方法获得抗体外；还利用抗体与蛋白A的高亲和作用，采用重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF亲和层析纯化抗体。

(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体。

本发明涉及的上述相思子毒素的检测试纸，它还包含样品垫，该样品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。

本发明涉及的上述相思子毒素的检测试纸，其中反应支持物选用PVC板。

本发明涉及的上述相思子毒素的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸。

本发明涉及的上述相思子毒素的检测试纸，其中金标抗体保护膜选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均匀涂布有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体。本实验采用高纯度的重组相思子A链抗原蛋白，以重组相思子A链作为抗原免疫KM小鼠，然后腹腔注射S180细胞，刺激KM小鼠产生腹水，腹水量大，抗体效价高，获得高纯度高特异性的抗体。在抗体纯化方面，除采用辛酸-硫酸铵分级沉淀方法获得抗体外；还利用抗体与蛋白A的高亲和作用，采用重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF亲和层析纯化抗体。

另一方面，本发明涉及的上述相思子毒素的检测试纸，其中吸水垫、硝酸纤维膜、金标抗体保护膜、样品垫和反应支持物按照附图1所示方式构成；反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗鼠IgG包被的质控条带；金标抗体保护膜3位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于3而言的另一侧并与2部分重叠。样品垫4位于2上与1相反的一侧并与3部分重叠。

又一方面，本发明涉及的上述相思子毒素的检测试纸，以吸水垫一侧为起始端，样品垫一侧为末端，兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体的检测条带位于接近末端，羊抗鼠IgG包被的质控条带接近于起始端。

本发明再一个目的是提供制备所述检测相思子毒素的试纸的方法一种制备所述的相思子毒素的检测试纸的制备方法，该方法包括：

(1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗相思子毒素抗体和质控抗体两个条带的硝酸纤维膜；(2)制备一种含有胶体金标记的抗重组相思子毒素抗体的金标抗体保护膜，将胶体金标记的抗重组相思子毒素抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥后，制成金标抗体保护膜。

在上述的制备方法，该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度是10-100mm/s。在上述的制备方法，其特征在于所述兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体，其加入量为1-5mg/ml，该多克隆抗体的稀释液可以为5mM PBS。质控羊抗鼠IgG的浓度为0.1-5mg/ml。该方法将胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，其中pH为7-9。

本发明还提供所述的试纸在检测相思子毒素中的应用，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。

本发明再一个目的是提供制备所述检测相思子毒素的试纸的方法，该方法包括以下步骤：胶体金探针的制备，金标垫的制备，硝酸纤维膜的喷涂包被。

1、胶体金探针的制备

(1)将HAuCl₄先配制为0.01％水溶液。磁力搅拌下准确加入1ml 1％的HAuCl₄，同时加入1.5-3ml 1％的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定后继续加热，冷却至室温后加纯水补足至100ml，4℃避光保存。

(2)用K₂CO₃调PH值为约7-9，优选为约7.8-8.9，更优选约8.0-8.2。

(3)将胶体金调至pH 8.0-8.2，，用5mM PBS(pH 7.2)稀释抗体至0.2mg/ml。

(4)保持胶体金稳定。

本发明还在于提供一种获得维持胶体金稳定的抗体最佳标记剂量的方法，该方法包括：

a.取10支洁净的1.5ml离心管，分别加入胶体金溶液1ml。

b.在1-10号管内分别加入10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl的5mM PBS，再依次加入稀释好的0.2mg/ml的待标记抗体90μl、80μl、70μl、60μl、50μl、40μl、30μl、20μl、10μl、0μl，混匀，静置2分钟。

c.在10个管内分别加入10％NaCl溶液100μl，混匀后室温静置2小时，观察颜色变化。

未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化，而加入抗体量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管(1号管)相比，颜色最接近、含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为1ml胶体金所必须的抗体稳定剂量，在此基础上再加20％抗体，即为抗体最佳标记剂量。本发明经过反复试验和分析，得出的结果表明：维持胶体金溶液适宜抗体量为8-15ug，优选抗体量10-12ug，更优选10.5-12.0ug，最优选为12ug。

2、金标垫的制备

取上述pH的胶体金以1ml/管分装于1.5ml的离心管中。每支管中加入12ug的抗体，轻摇混匀后放置。每管中加入10％的BSA100μl，混匀放置。将上面初步制得的胶体金探针在12000rpm、4℃下离心30分钟，弃上清液。每支离心管中加入1ml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上清液，管底得到暗红色的疏松状沉淀，加入500μl重悬液重悬后于4℃，1000rpm，离心10分钟；取上清液，均匀滴加在1cm宽的玻璃纤维上，37℃干燥。

3、硝酸纤维膜的喷涂包被

(1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体和质控羊抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维膜；

在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s，更优选是45-55mm/s，最优选是50mm/s；所述兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体，其加入量为1-5mg/ml，该多克隆抗体的稀释液可以为5mM PBS；质控羊抗鼠IgG可以购自鼎国生物技术公司，其浓度为0.1-5mg/ml，更优选是0.5-2.5mg/ml，最优选为1mg/ml；

(2)制备含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体的金标抗体保护膜，具体为：将胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，其中，抗体用5mM PBS稀释，pH为7-9，优选7.5-9，最适PH值为8.5。

本发明还公开了所述试纸在检测相思子毒素中的应用，参见附图2。

在本发明检测相思子毒素的方法中，先将待测标本放入装有稀释液的小瓶内，再用移液器将样品混合液加入试纸“4”处(即末端)，样品中的液体依靠虹吸作用上行，一般需10-15分钟判读结果：

如标本中含有相思子毒素，则它将与试纸上胶体金标记的兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体形成相应的复合物，液体展开上行并与硝酸纤维膜上的兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体结合，形成红色线条，即在“T”处形成红色条带。

无论是否含有相对应的毒素，胶体金标记多克隆抗体继续随液体继续上行并与该膜上的羊抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸失效。

阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说明试纸失效。还可利用金标免疫分析仪进行定性或定量检测。

本发明的技术方案是：采用纯化的兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体、和羊抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上，结合胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原理检测标本中的相思子毒素。

附图说明

图1A本发明试纸的正面示意图。

图1B本发明试纸的侧面示意图。

其中，图1A和1B：1：吸水垫；2：硝酸纤维膜(T：包被兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体检测条带；C：包被羊抗鼠IgG的质控条带)；3：含有胶体金标记鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体多克隆抗体的玻璃纤维膜；4：样品垫；5：反应支持物。

图2：检测结果示意图；T、C两条线阳性；C一条线阴性；无效。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、检测相思子毒素的胶体金试纸的制备

1、胶体金探针的制备

(1)将HAuCl₄先配制成0.01％水溶液，取100ml纯水加热至沸腾。磁力搅拌下准确加入1ml 1％的HAuCl₄，同时加入1.5ml质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定后继续加热煮沸15分钟，冷却至室温后加纯水补足至100ml，4℃避光保存。

(2)K₂CO₃调PH值为8.0-8.5左右。

(3)将胶体金调至适宜的pH，优选8.0-8.5，更优选8.2，用5mM PBS(pH 7.2)稀释抗体至0.2mg/ml。

2、金标垫的制备

取pH 8.2的胶体金以1ml/管分装于1.5ml的离心管中。每支管中加入最佳标记剂量的抗体，轻摇混匀后放置5分钟或稍长，此步为抗体与胶体金颗粒结合。每管中加入10％的BSA100μl，混匀放置15分钟或稍长，此步为封闭。将上面初步制得的胶体金探针以12000rpm，离心30分钟，4℃，弃上清液。每支离心管中加入1ml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上清液，留下管底暗红色疏松状沉淀，加入500μl重悬液重悬后于4℃，1000rpm，离心10分钟；取上清液，均匀的滴加在1cm宽的玻璃纤维上，37°干燥2.5-3小时。

3、硝酸纤维膜的喷涂包被

(1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体(1mg/ml含有1.5％BSA)和质控羊抗鼠IgG(购自鼎国生物技术公司，1mg/ml)两个条带的硝酸纤维膜；

(2)含有胶体金标记鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体12ug的玻璃纤维膜，5mMPBS稀释；最适PH值为8.5。

实施例2、相思子毒素检测试纸

参见图1，反应支持物为6.2cm×0.4cm PCV板；吸水垫为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被羊抗鼠IgG(购自鼎国生物技术公司，1mg/ml)，兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体1mg/ml(含有1.5％BSA封闭剂)，含有0.4cm×0.4cm胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体(标金浓度：12ug/ml 5mM PBS稀释；最适PH值为8.2)玻璃纤维膜；样品垫为2.7cm×0.4cm的玻璃纤维膜；即形成了相思子毒素检测试纸。

实施例3、检测方法

参见附图2，将待测标本与样品稀释液混匀，再用移液器将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果：

如含有相思子毒素，则与试纸上胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多抗形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的兔抗重组相思子毒素A链多抗结合，形成红色线条，即在“T”处形成红色条带。

无论是否含有相对应的毒素，胶体金标记多抗继续向上流动与包被在膜上的羊抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸失效。

阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说明试纸失效。

实施例4、采用DJM-3定量金标免疫分析仪的半定量检测

1、可先用检测法检测相思子毒素试纸条20个阴性值，利用金标仪检测试其T/C的比值平均计算出相思子毒素试纸条的定阈值。

2、其次利用定阈值来用金标仪机器检测相思子毒素试纸条能达到的最低浓度。

3、判读结果时大于或等于定阈值为阳性，小于定阈值为阴性。

检测相思子毒素标准品各个浓度下，判定值(CUT-OFF)为0.043的T/C读值(表1)。每个浓度检测两次取平均值。可见15ng/ml、7.5ng/ml结果为阴性；30ng/ml～6000ng/ml结果为阳性；检测灵敏度为30ng/ml。

表1相思子毒素胶体金试纸条各浓度半定量检测结果

本发明所述的试纸可以配合小型仪器进行半定量检测，不需专业培训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对相思子毒素的感染诊断起到辅助作用。

Claims

1、一种检测试纸，其特征在于，它包含：

(1)反应支持物；

(2)吸水垫；

(3)硝酸纤维膜，该膜包被有重组相思子毒素A链抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；

(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链抗体。

2、根据权利要求1所述的试纸，其中，它还包含样品垫，该样品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。

3、根据权利要求1所述的试纸，其中，所述吸水垫选用滤纸，所述反应支持物选用PVC板，所述金标抗体保护膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均匀涂布有胶体金标记的抗体。

4、根据权利要求3所述的试纸，其中，所述金标抗体保护膜由将胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体均匀涂布在聚脂膜、玻璃纤维膜或滤纸纤维膜上来制成。

5、根据权利要求2-4任一项所述的试纸，其中，所述反应支持物(5)位于底层，所述硝酸纤维膜(2)位于反应支持物(5)上的中部，该膜的T处是兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗鼠IgG包被的质控条带；所述金标抗体保护膜(3)位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体；所述吸水垫(1)位于硝酸纤维膜(2)上部的相对于金标抗体保护膜(3)而言的另一侧并与硝酸纤维膜(2)部分重叠；所述样品垫(4)位于硝酸纤维膜(2)上与吸水垫(1)相反的一侧并与金标抗体保护膜(3)部分重叠。

6、根据权利要求5所述的试纸，其中，所述吸水垫一侧为起始端，所述样品垫一侧为末端，所述检测抗体的条带位于接近末端，所述质控条带接近于起始端。

7、根据权利要求5所述的试纸，其中，所述鼠重组相思子毒素A链多克隆抗体的浓度为1-5mg/ml，质控羊抗鼠IgG的浓度为0.1-5mg/ml。

8、根据权利要求5所述的试纸，其中，所述质控羊抗鼠IgG抗体浓度为0.5-2.5mg/ml。

9、根据权利要求5所述的试纸，其中，所述兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体标记1ml胶体金的量为8-15ug。

10、一种制备权利要求1-9任一项所述的相思子毒素的检测试纸的制备方法，该方法包括：

(1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗相思子毒素抗体和质控抗体两个条带的硝酸纤维膜；

(2)制备一种含有胶体金标记的抗重组相思子毒素抗体的金标抗体保护膜，将胶体金标记的抗重组相思子毒素抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥后，制成金标抗体保护膜。

11、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度是10-100mm/s。

12、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体，其加入量为1-5mg/ml，该多克隆抗体的稀释液可以为5mM PBS。

13、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述质控羊抗鼠IgG的浓度为0.1-5mg/ml。

14、根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，将胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，其中pH为7-9。

15、根据权利要求1-10任一项所述的试纸在检测相思子毒素中的应用，其中，包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。

16、由权利要求10-15任一项所述的方法制备的检测相思子毒素的试纸。