CN101393216A - 快速诊断日本血吸虫病的胶体碳试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及寄生虫病诊断领域。应用能通过灰度扫描实现半定量分析的胶体碳作为标记物，利用能对多种动物进行检测的双抗原夹心法，以SEA作标记蛋白和包被硝酸纤维素膜的捕获蛋白，建立一种基于双抗原夹心法的日本血吸虫病胶体碳快速检测试纸条，弥补了目前快速诊断试纸条检测生物的单一性和不能半定量或定量分析的缺陷。检测137份血清，与间接血凝法比较，检测结果一致性为98.54％，如以间接血凝法检测结果为标准，则试纸条的敏感性为98.99％，特异性为97.37％。应用胶体碳试纸条检测血吸虫病操作简便，快速，具有较高的敏感性和特异性，适合作现场各种生物血吸虫病的检测，也为下一步血吸虫病的定量分析奠定了基础。

Description

快速诊断日本血吸虫病的胶体碳试纸条

技术领域：

本发明涉及寄生虫病诊断领域，具体涉及快速诊断日本血吸虫病的胶体碳层析试纸条的建立。

背景资料：

血吸虫病是一种严重危害人类身体健康和生命安全、阻碍疫区经济发展和社会进步的人兽共患病。全世界74个国家，6亿人受感染威胁，2亿人被感染，其中1.2亿人出现症状，2000万人被严重感染。血吸虫病病情的控制至今仍然是急待解决的一个严重的公共卫生问题。迄今，在我国湖南、湖北、安徽、江西、江苏、云南、四川7个省市流行仍较严重。血吸虫病快速诊断的研究对于传染源的监测、疫情的控制将起到积极作用。因此，研究简便快速、准确灵敏、能诊断多种动物，并能对感染程度进行定量或半定量检测的新型诊断技术和方法，已成为当前血吸虫病诊断迫切需要解决的问题。

快速诊断试纸条(dipstick)是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术，因其操作简便、快速，更适用于门诊使用和现场普查及轻度流行区的筛查，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。在目前的快速诊断试纸条中，应用标记物一般为胶体金和胶体染料，标记的蛋白有抗原、葡萄球菌蛋白A(SPA)、二抗等，皆能达到一定的敏感性和特异性，但一般只针对一种生物进行检测，且无法定量或者半定量检测血吸虫病的感染程度，不能满足日本血吸虫病诊断的需要。

朱荫昌(朱荫昌，何伟，华万全，等.血吸虫病快速诊断——胶体染料试纸条法的研究[J].中国血吸虫病防治杂志，2000，12(1):18-20.)用胶体染料标记日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)，再用羊抗人IgG包被硝酸纤维素膜(NC膜)捕获标记抗原与抗体的复合物；曾小军(曾小军，陈红根，袁建华.快速胶体金免疫层析法的建立及其对血吸虫病的诊断效果[J].中国血吸虫病防治杂志，2005，17(1):24-27.)用胶体金标记羊抗人多克隆抗体，以此检测患者血清中的抗血吸虫抗体。但标记蛋白和检测线捕获蛋白用相应的抗体只能应用于某种动物的检测，上述方法只能完成人的血吸虫病诊断，不能对其它动物进行诊断，且不能进行定量或半定量检测。

雷家慧(应用胶体金SEA-Dipstick法检测日本血吸虫病血清抗体的研究[J].中国人兽共患病杂志，2001，17(2):22-24.)和喻鑫玲(喻鑫玲，何永康，杨瑞清.胶体金SPA双联抗体检测试纸条法诊断日本血吸虫病的初步研究[J].实用预防医学，2006，13，(3):521-523)应用金标SPA作为显色剂，分别以SEA和SEA、童虫抗原(SSA)双联抗原包被NC膜检测日本血吸虫抗体。何伟等(何伟，朱荫昌，曹国群.胶体染料试纸条法检测牛血吸虫病的进一步研究[J].中国血吸虫病防治杂志，2006，18，(4):270-274.)采用胶体染料标记SEA，以葡萄球菌A蛋白(SPA)包被NC膜作为捕捉蛋白，实现多种动物的血吸虫病检测。上述方法中应用了能与人及多种哺乳动物IgG的Fc段结合的SPA，可对多种动物的血吸虫病进行检测。但SPA与IgG的结合不属于抗原抗体反应，其结合能力主要决定于IgG的来源及其亚类。不同来源IgG与SPA亲合力的顺序为猪>狗>人>猴>豚鼠>小鼠>牛。其对绵羊、大鼠来源IgG的亲和力较差，与犊牛、马、山羊的IgG则不能结合，因而标记SPA同样存在其自身的局限性。同样，仍无法做到血吸虫病的定量或半定量检测。

据报道，双抗原夹心法其敏感性和特异性比其他方法要高(彭运潮，胡述光，刘增再，等.免疫胶体金技术诊断日本血吸虫病的研究进展[J].动物医学进展，2005，26(10):23-27.)。金颜辉等(金颜辉，张长弓，方莹，等.口蹄疫抗体免疫金标快速检测试纸法的建立[J].福建畜牧兽医，2004，26(1):4-5.)采用双抗原夹心法建立了检测口蹄疫O型抗体的免疫胶体金快速检测试纸条法，并与ELISA法进行了比较，其符合率达100％。彭运潮等(彭运潮，刘金明，孙安国，等.快速诊断家畜日本血吸虫病免疫层析试纸条的研制与初步应用[J].中国血吸虫病防治杂志，2006，18(3):197-200.)利用双抗原夹心的原理建立了GICA法用于多种动物血吸虫病的检测，其阳性率达91.6％，阴性符合率达87.5％，具有较高的灵感性和特异性。但在诊断日本血吸虫病的快速诊断试纸条中无论是应用胶体金还是胶体染料作标记物，都没能完成血吸虫病的定量或半定量检测。

发明内容：

本发明目的是利用胶体碳，建立一种快速检测日本血吸虫抗体、并能实现半定量分析的血吸虫病免疫诊断方法。为克服目前的快速诊断试纸条的缺陷，本发明中应用能通过CCD灰度扫描实现半定量检测的胶体碳作为标记物，利用能对多种动物进行检测的双抗原夹心法，以SEA作标记蛋白和包被硝酸纤维素膜的捕获蛋白，建立一种基于双抗原夹心法的日本血吸虫病胶体碳快速检测试纸条。

在疏水支撑衬垫上，从上至下依次贴附吸水垫、硝酸纤维素膜、聚酯膜、样品垫；聚酯膜上包被胶体碳标记SEA；硝酸纤维素膜(NC膜)上用SEA划上检测线(T线)，用兔抗SEA IgG划上对照线(C线)。胶体碳标记的SEA可与待测血清中日本血吸虫抗体结合，被NC膜上T线的SEA捕获并富集显色。该方法可对人畜的日本血吸虫病进行检测，且可通过扫描检测带的灰度对日本血吸虫抗体进行半定量检测。

步骤如下：

1)胶体碳的制备；

2)胶体碳标记SEA的制备；

3)胶体碳试纸条的制备；

4)胶体碳试纸条的半定量检测。

本发明检测日本血吸虫病具有以下优势：

1.本发明应用的标记物是胶体碳，黑色的胶体碳颗粒在白色的NC膜上颜色对比更为明显，作为标记物检测灵敏度高；胶体碳的生产简单方便，将碳粉超声处理即可，可以大量制备以避免批间差异；碳粉相对便宜，制作的胶体碳试纸条成本低；

2.本发明基于双抗原夹心法，胶体碳标记的蛋白是SEA，检测线上的捕获蛋白也是SEA，可以对人畜的日本血吸虫病进行检测，避免了检测的单一性；

3.可以通过测定检测线颜色的灰度对日本血吸虫病感染程度作半定量的判定。

附图说明：

图1：胶体碳试纸条模式示意图

1为被检血清，2为样品垫，3为胶体碳结合SEA的聚酯膜，4为硝酸纤维素膜，4为滤纸，5为底衬，6为包被SEA的检测线(T线)，7为包被抗SEA抗体的对照线(C线)。

图2：不同浓度碳标记SEA包被聚酯膜

1为碳标记SEA原液1:4稀释包被聚酯膜，2为1:8稀释，3为1:12稀释，4为1:16稀释，5为1:20稀释。

图3：不同浓度SEA包被T线图

以不同浓度SEA包被T线，速度为1.5μL/cm，1中T线包被SEA浓度为0.4mg/mL，2中SEA浓度为0.8mg/mL，3中SEA浓度为1.2mg/mL，4中SEA浓度为1.6mg/mL，5中SEA浓度为2.0mg/mL，6中SEA浓度为2.4mg/mL SEA。

图4：胶体碳试纸条判定方法

NC膜上C、T线皆出现，判为阳性；只出现C线，无T线，判为阴性；C、T线皆无时试纸条判定无效。

图5：胶体碳试纸条检测健康人和血吸虫病人血清结果

图中1-6为正常人血清检测，只有C线，无T线；7-12为阳性血清检测，C、T线皆出现。

图6：同一血清不同稀释度检测图

将待测血清作1:10稀释，再用1:10稀释的阴性血清稀释成不同倍数。1、2为正常血清1:10稀释作对照，检测只有C线出现；3-7为同一血清稀释不同倍数检测，3为1:160稀释；4为1:80稀释；5为1:40稀释；6为1:20稀释；7为1:10稀释。

图7：ELISA法OD值与试纸条法T带灰度值关系图

ELISA检测出的OD值越高，用胶体碳试纸条检测带T线灰度值越低，即血清中血吸虫抗体效价越高，T线颜色越深。

实施案例一：胶体碳试纸条的制作

1.胶体碳试纸条模式

在本发明中，用胶体碳标记SEA，包被在聚酯膜上，用SEA包被NC膜的检测带(T带)，抗SEA兔血清IgG包被NC膜的对照带(C带)。如果血清中含抗SEA抗体，经过样品垫至聚酯膜时与碳标SEA结合，至检测带时被固定的SEA捕获而显色，样品继续向前泳动至对照线时碳标SEA与固定的抗SEA抗体结合而使对照带显色。如果血清中不含抗SEA抗体，则碳标SEA上行至对照线时才与上面包被的抗SEA抗体结合，而不会在检测带(T带)显色。如图1所示。

用玻璃纤维素膜作为样品垫，聚酯膜作为胶标记SEA结合垫，将已处理好的各种材料如图1所示进行粘贴、组装，材料之间必须密切接触，不能留有缝隙，相接处以重叠1.0-1.5mm为宜，并在横向两端加封。用切条机将已制好的条板切成宽为3mm的小条，装入袋中干燥密封，4℃保存备用。

2.日本血吸虫成熟虫卵可溶性抗原(SEA)的制备

每只家兔感染日本血吸虫尾蚴2500～3000条，45天后剖杀，收集其肝脏，从肝脏中分离纯净的成熟虫卵，用液氮研磨至显微镜下无完整虫卵后，加入适量PBS收集至EP管中置4℃震荡12h使可溶性蛋白(SEA)溶出。12000rpm，30min离心收集上清，测定SEA含量。分装于-20℃保存备用。

3.抗SEA抗体的制备

(1)免疫家兔

以SEA为抗原，免疫家兔。取纯化SEA 1mg用生理盐水稀释，加等体积完全福氏佐剂(CFA)充分乳化后，于家兔背部及后腿肌肉、皮下多点注射。第一次免疫后间隔1-2周再以SEA 1mg加等体积不完全福氏佐剂(IFA)乳化，注入后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。尔后每隔2-3周按第二次免疫法重复加强免疫。于第4次免疫后5-7天，ELISA测效价达到1:12800后颈动脉放血。37℃放置1h后4000rpm离心10min取上清即为免疫血清。

(2)饱和硫酸铵法纯化抗体

①取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH₄)₂SO₄饱和溶液10ml，至(NH₄)₂SO₄终浓度为20％，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。

②3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

③在上清液中再加(NH₄)₂SO₄饱和溶液30ml，使(NH₄)₂SO₄浓度为50％，充分混合，静置30min。

④3000r/min离心20min，弃上清。于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH₄)₂SO₄饱和溶液10ml，使(NH₄)₂SO₄浓度为33％，充分混合后，静置30min。

⑤3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤4、5，2～3次。

⑥用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。透析除盐，在20-50倍体积的生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。

⑦离心去沉淀(去除杂蛋白)，上清液即为粗提IgG。

4 胶体碳标记SEA制备

(1)胶体碳pH调整及标记最小蛋白浓度的确定

配制一系列不同pH值的硼酸盐缓冲液，加入纳米碳配成0.1％的悬液，再加入0.1％TritonX-100，300w超声处理，工作6S，停4S，80个循环后，200rpm离心10min，弃沉淀，上清静置24h后取无沉淀产生者为最适标记pH值。在pH9时，胶体碳处于稳定状态，无沉淀，故取pH9为标记pH值。

NaCl沉淀法确定标记的SEA最佳量：将待标记的SEA作系列稀释后，分别取0.2mL(20μg～200μg)加至1mL0.1％胶体碳溶液中，另设一不加SEA的对照管，3h后各加入0.1mL100mg/mL氯化钠溶液，混匀后静置24h。不稳定的胶体碳将发生沉聚，能使胶体碳稳定的最小SEA量再加10％即为最佳标记蛋白量。

当1mL0.1％碳中加入SEA量大于90μg时，加入100μL 10％ NaCl不发生沉淀，故确定1mL 0.1％碳SEA最适量为100μg。

(2)聚酯膜处理

用含0.2％PVA的0.01M pH7.6PB浸泡聚酯膜，10分钟后取出置37℃烤干，干燥保存备用。

(3)制备胶体碳SEA标记物

将1000μg SEA加入到10mL 0.1％处理好的胶体碳中，室温摇床来回摇3h，加入10％ BSA使终浓度至1％，加入10％聚乙二醇(PEG 6 000)至终浓度为0.2％，室温摇床来回摇3h，13 000g，4℃离心30min，弃上清，沉淀用含0.4％BSA、0.2％PEG的0.01M pH7.6磷酸盐缓冲液(PB)悬浮，重复离心两次。沉淀以原体积1/10(1mL)的碳标稀释液0.01M pH7.6 PB(含1％BSA、0.2％PEG、3％蔗糖、0.5％Triton-100、0.5％PVP)悬浮，加入0.01％硫柳汞防腐作为胶体碳标记物原液4℃保存备用。

5 实验条件优化

(1)碳标SEA最佳包被量的确定

分别用不同浓度的胶体碳标记物(已纯化胶体碳标记物原液1:4、1:8、1:12、1:16、1:20稀释)包被聚酯膜，即将已处理聚酯膜浸泡于碳标SEA，10分钟后取出置37℃烘干，经检测确定最佳包被量。

检测发现将原备用的碳标记SEA经1:8稀释后包被聚酯膜，背景略深，而1:12稀释时背景清楚，但检测带略淡，故取碳标记SEA1:10稀释来包被聚酯膜(图2)。

(2)检测线最佳包被量确定

不同浓度(0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mg/mL)的纯化SEA用5微升微量进样器在NC膜上划上检测线，经检测确定最佳包被量。对照线用抗SEA抗体，划膜浓度为1mg/mL，划膜速度为1.5μL/cm。

实验结果显示，以1.5μL/cm速度划线时，检测线SEA包被量为2mg/mL同2.4mg/mL的检测线灰度相差不大，因此，确定硝酸纤维素膜检测线划线时使用的浓度为2mg/mL(图3)，用量1.5μL/cm。

6 检测方法

将待测血清用0.01M pH 7.2PBS 1:10稀释混匀，室温下将试纸条样品垫一端插入待测液中，液面不得超过聚酯膜，8秒后取出平放，读取结果。判定方法如图4。

实施案例2 试纸条性能检测

1 特异性检测及敏感性检测

将已确诊的血吸虫病阳性血清和阴性血清用0.01M pH7.2 PBS 1:10稀释，用以上阳性血清、阴性血清来评价试纸条的特异性和敏感性(图5)。

2 储存期检测和批间检测

三批试纸条干燥密封保存于4℃和室温，分别于1、2、4个月后取出检测观察，结果无改变。观察三批试条，批间无显著差别。

3 胶体碳试纸条法与IHA试剂盒检测137份人血清样品结果比较

用胶体碳试纸条法与IHA试剂盒检测分别检测137份采自疫区的人血清样品，结果如表1。

表1 胶体碳试纸条法与IHA检测结果比较

对137份疫区收集血清进行检测，IHA检出阳性率为72.26％(99/137)，胶体碳试纸条法检出阳性率为72.26％(99/137)。

胶体碳试纸条法与IHA法检测一致性：(A+D)/(A+B+C+D)

                           ＝(98+37)/137

                           ＝98.54％

如以IHA试剂盒检测结果呈阳性即视为阳性，计算胶体碳试纸条的敏感性和特异性。

敏感性：A/(A+C)＝98/99＝98.99％

特异性：D/(B+D)＝37/38＝97.37％。

4 日本血吸虫病患者血清用胶体碳试纸条的半定量检测

(1)同一血清不同稀释度检测

将待测血清用0.01M pH7.2 PBS作1:10稀释，再用PBS1:10稀释的阴性血清作稀释剂，稀释成不同倍数。检测发现稀释度越低，即血清中抗体效价越高，T线颜色越深(图6)。而作对照的阴性血清无T线。

(2)ELISA法OD₄₅₀值与试纸条法T线灰度值分析

用试纸条检测法检测一批阳性血清，得出试纸条检测线去除背景后的灰度；将该批血清1:10稀释用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay ELISA)方法检测，450nm波长处检测得到OD值。数据如表2。

表2 ELISA法检测OD₄₅₀值与试纸条法T线灰度值数据

根据表2中数值作曲线图，ELISA法OD值与试纸条法T带灰度值关系如图7。

ELISA检测的OD值越高，说明血清中日本血吸虫抗体的效价越高。从图可以看出，ELISA检测出的OD值越高，用胶体碳试纸条检测的T线灰度值越低，即颜色越深；说明胶体碳试纸条检测T线的灰度值与血清中日本血吸虫抗体的效价呈较好的曲线关系。即T线颜色越深，血清中日本血吸虫抗体效价越高。故可以通过检测T线灰度来实现对血吸虫病感染程度的半定量检测。

Claims (7)

1、一种快速诊断日本血吸虫病的胶体碳层析试纸条，其特征是：在疏水支撑衬垫上，从上至下依次贴附吸水垫、硝酸纤维素膜、聚酯膜、样品垫；聚酯膜上包被胶体碳标记的日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)；硝酸纤维素膜(NC膜)上用SEA划上检测线，用兔抗SEAIgG划上对照线。

2、根据权利要求1所述的一种快速诊断日本血吸虫病的胶体碳试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)胶体碳的制备；

2)胶体碳标记SEA的制备；

3)胶体碳试条的制备；

4)胶体碳层析试纸条的半定量检测。

3、根据权利要求1所述的一种快速诊断日本血吸虫病的层析试纸条的使用方法，其特征在于包括以下步骤：待测血清用PBS稀释10倍，将试纸条插入待测血清中，液面不得超过聚酯膜，8min后观察结果，检测线(T)与对照线(C)都出现黑色为阳性，对照线(C)出现黑色而检测线(T)无色则为阴性。

4、根据权利要求2所述的一种快速诊断日本血吸虫病的胶体碳层析试纸条的制备方法，其特征在于：1)步骤中胶体碳的制备方法为：0.01M pH9.0的硼酸盐缓冲液，加入纳米碳配成0.1％的悬液，加入0.1％ Triton-100，300w超声处理，工作6S，停4S，80个循环，200rpm离心10min，取上清为胶体碳。

5、根据权利要求2所述的一种快速诊断日本血吸虫病的胶体碳层析试纸条的制备方法，其特征在于：2)步骤中碳标稀释液的配制方法为：0.01M pH7.6磷酸缓冲液(PB)，加入1％BSA、0.2％PEG、3％蔗糖、0.5％Triton-100、0.5％PVP。

6、根据权利要求2所述的一种快速诊断日本血吸虫病的胶体碳层析试纸条的制备方法，其特征在于：3)步骤中聚酯膜的处理：用含0.2％PVA的0.01M pH7.6PB浸泡10分钟后置37℃烤干，干燥保存备用。

7、根据权利要求2所述的一种快速诊断日本血吸虫病的层析试纸条的制备方法，其特征在于：3)步骤中NC膜划线用的SEA和抗SEAIgG，使用时加入3％酒精。

Images