CN103134933A - 用于检测副溶血性弧菌的试纸条及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其包括：片状基材，所述片状基材具有第一端和第二端，并且在所述片状基材的上表面，沿第一端至第二端的方向依次形成有样品垫、炭黑垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；检测线，所述检测线形成在所述硝酸纤维素膜上接近所述片状基材第一端的一侧；质控线，所述质控线形成在所述硝酸纤维素膜上接近所述片状基材第二端的一侧，其中，所述炭黑垫由炭黑颗粒形成，其中所述炭黑颗粒的至少一部分包被有抗副溶血性弧菌单克隆抗体；所述检测线由附着于所述硝酸纤维素膜上的抗副溶血性弧菌多克隆抗体形成；以及所述质控线由附着于所述硝酸纤维素膜上的羊抗鼠抗体形成。利用该试纸条，能够有效地检测副溶血性弧菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及用于检测副溶血性弧菌的试纸条及其用途，尤其是涉及海产品中副溶血性弧菌的快速检测。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)是一种常见的食源性致病菌，主要存在于墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇等海产品中，其引起的食物中毒临床上以腹痛、呕吐、腹泻等为主要症状。该病多在夏秋季发生于沿海地区，造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多，特别是在沿海地区，发病起数和涉及的人数较我国其他地区更为严重，必须建立可靠的快速检测方法，长期监控水产品中副溶血性弧菌的污染状况。传统的微生物培养鉴定方法是实验室常用的检测方法，但耗时长，操作繁琐等缺点不能满足快速检测副溶血性弧菌的要求。尽管PCR、DNA探针等技术已经广泛应用于副溶血性弧菌的检测中，但基质效应对检测结果干扰较大。近年来，以免疫学反应为基础的酶联免疫分析方法在微生物检测方面发展迅速，尤其是免疫层析方法更体现了方法的快速性。然而，目前用于检测副溶血性弧菌的手段仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速、简便、灵敏、特异、价格低廉的试纸条。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于检测副溶血性弧菌的试纸条。包括：片状基材，所述片状基材具有第一端和第二端，并且在所述片状基材的上表面，沿第一端至第二端的方向依次形成有样品垫、炭黑垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；检测线，所述检测线形成在所述硝酸纤维素膜上接近所述片状基材第一端的一侧；质控线，所述质控线形成在所述硝酸纤维素膜上接近所述片状基材第二端的一侧，其中，所述炭黑垫由炭黑颗粒形成，其中所述炭黑颗粒的至少一部分包被有抗副溶血性弧菌单克隆抗体；所述检测线由附着于所述硝酸纤维素膜上的抗副溶血性弧菌多克隆抗体形成；以及所述质控线由附着于所述硝酸纤维素膜上的羊抗鼠抗体形成。发明人发现，通过采用炭黑颗粒能够显著提高试纸条的灵敏度碳黑试纸条，使用方便、便于携带、结果直观、保存简单，检测结果只需10分钟，检测下限为1×103cfu/mL。这为基层检测副溶血性弧菌提供了方便，相比较传统方法检测而言，该试纸条节省了大量的人力和财力，具有极大的推广和使用价值。在研究过程中，发明人发现，采用碳黑颗粒作为抗副溶血性弧菌单克隆抗体标记物时，试纸条的灵敏度达到1×103cfu/mL，而采用传统的胶体金颗粒作为抗副溶血性弧菌单克隆抗体的标记物时，试纸条的灵敏度只有1×104cfu/mL。相比之下，采用炭黑颗粒比采用胶体金作为标记物，试纸条的灵敏度高出一个数量级。另外，根据本发明的实施例的用于检测副溶血性弧菌的试纸条还可以具有下列有益效果至少之一：(1)灵敏度高，少量的菌就能检测；(2)特异性强；(3)稳定性好；(4)操作简单，无需仪器设备；(5)易于运输储存。
根据本发明的实施例，用于形成片状基材的材料并不受特别限制，优选，所述片状基材由PVC形成。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，所述炭黑颗粒是通过下列步骤制备的：将甲苯在空气中燃烧后，残渣收集在玻璃烧瓶中，加入甲苯并加热煮沸冷却至常温后过滤，得到滤渣；以及将所述滤渣在260摄氏度下进行热处理12小时，以便获得所述炭黑颗粒。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，将所述滤渣在260摄氏度下进行热处理12小时。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，在对所述滤渣进行热处理之前，利用有机溶剂对所述滤渣进行洗涤并真空干燥，其中，所述有机溶剂为选自甲苯、二甲基甲酰胺和己烷的至少一种。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，所述抗副溶血性弧菌单克隆抗体是通过下列步骤包被于所述炭黑颗粒上的：将所述炭黑颗粒与所述抗副溶血性单克隆抗体混合，以便获得第一混合物；以及向所述第一混合物中添加戊二醛，以便使得所述抗副溶血性单克隆抗体与所述炭黑颗粒发生耦联。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，所述抗副溶血性弧菌单克隆抗体是通过下列步骤包被于所述炭黑颗粒上的：将5.0mg炭黑加入50mL0.01M pH7.2的PBS中，缓慢加入250μg抗副溶血性单克隆抗体进行反应，常温下搅拌反应24h；加入50mL25重量%pH7.2的戊二醛，搅拌反应120min，6000×g，离心10min；弃上清，沉淀用0.01M pH7.2的PBS重悬，经Sepharose6B-CL过柱，除去未偶联的炭黑和戊二醛，以便获得表面包被抗副溶血性弧菌单克隆抗体的炭黑颗粒。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
在本发明的第二方面，本发明还提出了前面所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条在检测副溶血性弧菌中的用途。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明一个实施例的用于检测副溶血性弧菌的试纸条的平面结构示意图；
图2为根据本发明一个实施例的用于检测副溶血性弧菌的试纸条的侧面结构示意图；
图3为根据本发明一个实施例的用于检测副溶血性弧菌的试纸条的阴性结果图；
图4为根据本发明一个实施例的用于检测副溶血性弧菌的试纸条的阳性结果图；
图5为根据本发明一个实施例的用于检测副溶血性弧菌的试纸条的无效结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
下面，首先参考图1和图2对用于检测副溶血性弧菌的试纸条进行描述。参考图1和图2，该用于检测副溶血性弧菌的试纸条包括片状基材7，该片状基材7具有第一端和第二端，并且在该片状基材7的上表面，沿第一端至第二端的方向依次形成有样品垫1、炭黑垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫6。
根据本发明的实施例，在硝酸纤维素膜3上还形成有检测线4和质控线5。其中，检测线4形成在硝酸纤维素膜3上接近片状基材7第一端的一侧。质控线5形成在硝酸纤维素膜3上接近片状基材7第二端的一侧。
根据本发明的实施例，炭黑垫2由炭黑颗粒形成，其中炭黑颗粒的至少一部分包被有抗副溶血性弧菌单克隆抗体。检测线4由附着于硝酸纤维素膜3上的抗副溶血性弧菌多克隆抗体形成。质控线5由附着于硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠抗体形成。
根据本发明的实施例，所述的抗副溶血性弧菌单克隆抗体是作为炭黑标记抗体，抗副溶血性弧菌多克隆抗体是喷涂在检测线4处，两个抗体只能通过副溶血性弧菌作为中间物而形成夹心复合物，即双抗夹心。
根据本发明的实施例，试纸条的检测原理是当试纸条检测孔中加入待检液后，如果待检液中含有副溶血性弧菌，那么炭黑标记的单克隆抗体能与检测线4处的多克隆抗体形成双抗夹心，随着捕获数量增加，即在检测线4处显黑色，剩余的菌体-单克隆抗体复合物继续迁移至质控线5处时，复合物能被质控线5处的羊抗鼠抗体特异性捕获，随着捕获数量增加，即质控线显黑色。如果待检液中未含有副溶血性弧菌，那么炭黑标记的单克隆抗体不能与检测线4处的多克隆抗体相结合，即在检测线4处不显黑色，当菌体-单克隆抗体复合物继续迁移至质控线5处时，该抗体能被质控线5处的羊抗鼠抗体特异性捕获，随着捕获数量增加，即质控线5处显黑色。
根据本发明的实施例，用于形成片状基材的材料并不受特别限制，优选，所述片状基材由PVC形成。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，所述炭黑颗粒是通过下列步骤制备的：将甲苯在空气中燃烧后，残渣收集在玻璃烧瓶中，加入甲苯并加热煮沸冷却至常温后过滤，得到滤渣；以及将所述滤渣在260摄氏度下进行热处理12小时，以便获得所述炭黑颗粒。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，将所述滤渣在260摄氏度下进行热处理12小时。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，在对所述滤渣进行热处理之前，利用有机溶剂对所述滤渣进行洗涤并真空干燥，其中，所述有机溶剂为选自甲苯、二甲基甲酰胺和己烷的至少一种。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，所述抗副溶血性弧菌单克隆抗体是通过下列步骤包被于所述炭黑颗粒上的：将所述炭黑颗粒与所述抗副溶血性单克隆抗体混合，以便获得第一混合物；以及向所述第一混合物中添加戊二醛，以便使得所述抗副溶血性单克隆抗体与所述炭黑颗粒发生耦联。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，所述抗副溶血性弧菌单克隆抗体是通过下列步骤包被于所述炭黑颗粒上的：将5.0mg炭黑加入50mL0.01M pH7.2的PBS中，缓慢加入250μg抗副溶血性单克隆抗体进行反应，常温下搅拌反应24h；加入50mL25重量%pH7.2的戊二醛，搅拌反应120min，6000×g，离心10min；弃上清，沉淀用0.01M pH7.2的PBS重悬，经Sepharose6B-CL过柱，除去未偶联的炭黑和戊二醛，以便获得表面包被抗副溶血性弧菌单克隆抗体的炭黑颗粒。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，所述抗副溶血性单克隆抗体特异性识别副溶血性弧菌的主要溶血毒素TLH。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
根据本发明的实施例，所述抗副溶血性弧菌多克隆抗体识别副溶血性弧菌的主要溶血毒素TDH。由此，可以进一步提高用于检测副溶血性弧菌的试纸条的检测效率。
在本发明的第二方面，本发明还提出了前面所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条在检测副溶血性弧菌中的用途。
下面通过具体的实施例对本发明的用于检测副溶血性弧菌的试纸条进行描述。下面的实施例仅仅是说明性的，不以任何方式限制本发明。
实施例1制备用于检测副溶血性弧菌的试纸条以及性能检测
(1)副溶血性弧菌单克隆抗体的制备
通过克隆重组构建了副溶血性弧菌的主要溶血毒素TLH和原核表达载体pET30a/tlh，
将它转入E.coli Bl21中诱导表达重组蛋白His-TLH，采用镍柱亲和层析法纯化。灭活菌体，制备免疫原，每只BALB/c小鼠注射TLH的量为100μg，免疫四次，每次间隔两周，采用ELISA方法测定小鼠效价，当效价达到要求后，取小鼠脾细胞和提前复苏的骨髓瘤细胞进行混合(10:1~5:1)，离心后，逐滴预热37℃的PEG进行融合，静止90s后加入预热37℃的不完全培养基，离心后用HAT培养基重悬，加入到预先含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，5%CO2培养箱培养。3天后观察细胞融合情况，5~6天后更换一半培养液，7~10天吸出细胞上清液进行ELISA检测，经过反复检测和克隆，筛选出能够稳定分泌副溶血性弧菌单克隆抗体的细胞株。通过扩大培养，采用液体石蜡对小鼠腹腔注射，7~10天后腹腔注射无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，数天后观察小鼠腹部，当小鼠腹部明显隆起且小鼠状态较差时，用无菌注射器从小鼠腹腔吸取腹水，将腹水采用辛酸-硫酸铵纯化后得到副溶血性弧菌的单克隆抗体。
(2)副溶血性多克隆抗体的制备
通过克隆重组构建了副溶血性弧菌的主要溶血毒素TDH和原核表达载体pET30a/tdh，将它转入E.coli Bl21中诱导表达重组蛋白His-TDH，采用镍柱亲和层析法纯化。灭活菌体制备免疫原，每只新西兰白兔免疫剂量为1mg，免疫四次，每次间隔两周，期间采用ELISA测定抗血清效价，最后一次免疫后一周，股动脉采血，待血液凝集析出血清后取出，-20℃保存备用。采用辛酸-硫酸铵法对血清进行纯化，即得抗副溶血性弧菌多克隆抗体。
(3)炭黑颗粒的制备
将500mL甲苯在空中燃烧后，炭黑收集在玻璃烧瓶中，加入50mL甲苯加热煮沸20min，冷却至常温，过滤。加入50mL甲苯重复洗涤残留物5次，然后分别用二甲基甲酰胺和己烷各洗涤5次，过滤，真空干燥。然后将反应产物在260℃的高温作用12h，即得到哑黑色的粉末状炭黑。
(4)炭黑标记单克隆抗体
将5.0mg炭黑加入50mL0.01M PBS(pH7.2)中，缓慢加入250μg抗副溶血性单克隆抗体进行反应，常温下搅拌反应24h。加入50mL25%的戊二醛(pH7.2)，搅拌反应120min，6000×g，离心10min。弃上清，沉淀用0.01M PBS(pH7.2)重悬，经Sepharose6B-CL过柱，除去未偶联的炭黑和戊二醛，用1%BSA、25%甘油和0.05%叠氮钠的磷酸缓冲液保存备用。
(5)炭黑垫的制备
用预处理液(pH7.4PBS+1%Tween20+0.1%PVA+7%蔗糖+1%BSA)对空白结合垫(玻璃纤维)进行预处理后，将炭黑标记物喷涂于40cm×6cm的结合垫上，37℃干燥2h。
(6)硝酸纤维素膜上检测线和质控线的处理
在距硝酸纤维素膜CN140下端0.8~0.9cm处喷上抗副溶血性弧菌多克隆抗体作为检测线，距硝酸纤维素膜上端0.9~1.0cm处喷上羊抗鼠抗体作为质控线，37℃干燥2h。
(7)炭黑试纸条的组装
试纸条由样本垫、炭黑垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬组成。总共分为4个部分：加样区、标记物结合区、显色区、吸水区。试纸条的左端为加样区，上样体积为100μL。标记结合区为炭黑标记单克隆抗体，显色区为硝酸纤维素膜依次包被上副溶血性弧菌多克隆抗体和羊抗鼠抗体分别作为检测线和质控线。吸水区为吸水纸粘贴在部分硝酸纤维素膜上。该试纸条利用免疫层析技术和双抗夹心法原理，通过观察检测线和质控线上的显色来判断样品的阴性和阳性。当检测线不显色，质控线显色，判定样本为阴性；当检测线显色，质控线显色，判定样本为阳性；当质控线不显色，判定试纸条失效。整个试纸条装在PVC朔料卡壳中，试纸条装于铝箔袋中密封，加入硅胶颗粒干燥剂，室温中可长期保存备用。
(8)试纸条特异性的测定
选择副溶血性弧菌和其他5种常见的致病菌：大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、志贺氏菌均稀释至1×106cfu/mL菌悬液，分别取100μL滴加到试纸条的加样区，10min内观察结果。仅有测定副溶血性弧菌的速测卡上检测线显色，质控线显色，即阳性，其他的5种常见致病菌速测卡上检测线无色，仅质控线显色，说明该试纸条对副溶血性弧菌有很强的特异性。
（9）试纸条的灵敏度测定
将副溶血性弧菌从1×107cfu/mL稀释到1×101cfu/mL，分别取100μL到加样孔中，10min后判定结果。根据试纸条的显色结果，可以判定试纸条能够检测到1×103cfu/mL的菌液，当菌液浓度为1×102cfu/mL时，试纸条的检测限显色较低，因此，该试纸条的灵敏度为1×103cfu/mL的副溶血性弧菌。
实施例2墨鱼样品检测
(1)样品制备
将疑似墨鱼捣碎放入离心管中，加入无菌水浸泡30min，然后震荡3min,吸取上清液。
(2)预增菌
将上清液加入副溶血性弧菌选择性培养基中，培养基为混合蛋白胨2%(胰蛋白胨1%、鱼蛋白胨1%)、酵母浸膏0.2%、NaCl 3.5%、pH 8.6;37℃摇床(100r/min)培养8h，双层牛皮纸封口。
(3)样品检测
在检测前撕开铝箔袋，取出试纸条，平放于操作台上，放置3分钟，将待测上清液直接加入加样孔，10min后观察检测结果。
(4)结果判定
参考图3~5，如果检测线不显色，质控线显色，则表明待测液中不含副溶血性弧菌(样本中副溶血性弧菌的浓度低于1×103cfu/mL)，即为阴性；如果检测线显色，质控线显色，则表明待测液中含副溶血性弧菌，即为阳性(样本中副溶血性弧菌的浓度高于1×103cfu/mL)；如果检测线若隐若现，质控线显色，说明待测液中含副溶血性弧菌低于检测限值(样本中含有副溶血性弧菌，但浓度低于1×103cfu/mL)；如果质控线不显色，说明试纸条无效，检测结果不能作为判定依据。
(5)胶体金试纸条检测副溶血性弧菌
根据本发明原理制作胶体金试纸条，通过实例2步骤进行副溶血性弧菌检测，以此判定胶体金试纸条的灵敏度，结果见表1。根据测定结果，该胶体金试纸条的灵敏度为1×104cfu/mL。
表1胶体金试纸条测定副溶血性弧菌
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，包括：
片状基材，所述片状基材具有第一端和第二端，并且在所述片状基材的上表面，沿第一端至第二端的方向依次形成有样品垫、炭黑垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
检测线，所述检测线形成在所述硝酸纤维素膜上接近所述片状基材第一端的一侧；
质控线，所述质控线形成在所述硝酸纤维素膜上接近所述片状基材第二端的一侧，
其中，
所述炭黑垫由炭黑颗粒形成，其中所述炭黑颗粒的至少一部分包被有抗副溶血性弧菌单克隆抗体；
所述检测线由附着于所述硝酸纤维素膜上的抗副溶血性弧菌多克隆抗体形成；以及
所述质控线由附着于所述硝酸纤维素膜上的羊抗鼠抗体形成。
2.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，所述片状基材由PVC形成。
3.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，所述炭黑颗粒是通过下列步骤制备的：
将甲苯在空气中燃烧后，残渣收集在玻璃烧瓶中，加入甲苯并加热煮沸冷却至常温后过滤，得到滤渣；以及
将所述滤渣在260摄氏度下进行热处理12小时，以便获得所述炭黑颗粒。
4.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，将所述滤渣在260摄氏度下进行热处理12小时。
5.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，在对所述滤渣进行热处理之前，利用有机溶剂对所述滤渣进行洗涤并真空干燥，
其中，所述有机溶剂为选自甲苯、二甲基甲酰胺和己烷的至少一种。
6.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌单克隆抗体是通过下列步骤包被于所述炭黑颗粒上的：
将所述炭黑颗粒与所述抗副溶血性单克隆抗体混合，以便获得第一混合物；以及
向所述第一混合物中添加戊二醛，以便使得所述抗副溶血性单克隆抗体与所述炭黑颗粒发生耦联。
7.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌单克隆抗体是通过下列步骤包被于所述炭黑颗粒上的：
将5.0mg炭黑加入50mL0.01M pH7.2的PBS中，缓慢加入250μg抗副溶血性单克隆抗体进行反应，常温下搅拌反应24h；
加入50mL25重量%pH7.2的戊二醛，搅拌反应120min，6000×g，离心10min；
弃上清，沉淀用0.01M pH7.2的PBS重悬，经Sepharose 6B-CL过柱，除去未偶联的炭黑和戊二醛，以便获得表面包被抗副溶血性弧菌单克隆抗体的炭黑颗粒。
8.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，所述抗副溶血性单克隆抗体特异性识别副溶血性弧菌的主要溶血毒素TLH。
9.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条，其特征在于，所述抗副溶血性弧菌多克隆抗体识别副溶血性弧菌的主要溶血毒素TDH。
10.权利要求1~9任一项所述的用于检测副溶血性弧菌的试纸条在检测副溶血性弧菌中的用途。
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