CN104357565A

CN104357565A - 副溶血性弧菌免疫pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN104357565A
Application number: CN201410610335.5A
Authority: CN
Inventors: 刘箐; 翟绪昭
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2034-11-03
Also published as: CN104357565B

Abstract

本发明公开了一种用于检测副溶血性弧菌的经过特异性抗体包被的PCR反应管及免疫PCR检测试剂盒。所述的PCR反应管上预包被了能特异性富集样品中副溶血性弧菌的单克隆抗体。本发明的检测试剂盒能够快速、准确、灵敏地从食品等样品中检测出副溶血性弧菌，其灵敏度可达到10³～10⁴cfu/ml，比常规PCR灵敏度提高10～100倍。本发明将免疫学和分子生物学方法有机结合于一体，可在一个PCR管中实现样品中副溶血性弧菌的富集和检测，操作简便，成本低廉，检测快速，结果准确。

Description

副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域，具体涉及一种检测副溶血性弧菌的免疫PCR检测试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌(Bibrio parahemolyticus)又称为副溶血弧菌，属于弧菌属，是一种常见的病原菌。副溶血性弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，主要的栖息地在海水中。如果食用了遭此菌污染的海鲜，会引发食物中毒；临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。目前副溶血性弧菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。

免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以副溶血性弧菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及金黄色葡萄球菌快速检测产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测副溶血性弧菌的免疫PCR检测试剂盒。

本发明的第一方面是提供了一种用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管，所述的PCR反应管包括：

免疫PCR管；和

包被于所述的免疫PCR管管体内壁的抗副溶血性弧菌单克隆抗体，所述的抗副溶血性弧菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCC No.8003或3G9F7D5C9，CGMCC No.9010产生。

本发明的第二方面是提供了一种检测试剂盒，所述的试剂盒含有所述的PCR反应管。

在一优选例中，所述的试剂盒还含有容器a，所述的容器a中装有所述的PCR反应管。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH₂O、引物、阳性对照和阴性对照。

在另一优选例中，所述的引物包括正向引物和反向引物。

在另一优选例中，所述的阳性对照为灭活的副溶血性弧菌菌液，所述的阴性对照为灭菌的3％氯化钠碱性蛋白胨水。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明

图1是本发明的试剂盒的使用流程和原理图。

图2是副溶血性弧菌直接PCR梯度稀释检测限研究结果。

其中，M：1000bp DNA ladder；N：阴性对照；1-8号泳道对应的细菌浓度为：1.14×10⁸～1.14×10cfu/mL。

图3是副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒检测出血性大肠杆菌梯度稀释检测限研究结果。

图4是检测试剂盒特异性的结果。

其中，M：1000bp DNA ladder；N：阴性对照；1-12号泳道为：副溶血性弧菌ATCC 82346，副溶血性弧菌ATCC 82346，金黄色葡萄球菌ATCC 27660，鼠氏伤寒沙门氏菌ATCC 22956，肠炎沙门氏菌ATCC 13076，单增李斯特菌ATCC 43251，小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715，福氏志贺氏菌ATCC 12022，宋内氏志贺氏菌ATCC 25931，痢疾志贺氏菌ATCC 51329，乙型溶血性链球菌ATCC 10373，阪崎肠杆菌ATCC 29004。

图5是模拟带菌蛤蜊样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。

A(1)模拟带菌蛤蜊样品直接PCR检测限研究结果；

A(2)模拟带菌蛤蜊样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；

其中，M：1000bp DNA ladder；N：阴性对照；1号泳道为蛤蜊样品(不加菌液)；2-8号泳道对应的细菌浓度为：1.14×10²～1.14×10⁸cfu/mL。

图6是模拟带菌螃蟹样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。

B(1)模拟带菌螃蟹样品直接PCR检测限研究结果；

B(2)模拟带菌螃蟹免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；

其中，M：1000bp DNA ladder；N：阴性对照；1号泳道为螃蟹(不加菌液)；2-8号泳道对应的细菌浓度为：1.14×10²～1.14×10⁸cfu/mL。

图7是模拟带菌香肠样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果；

C(1)模拟带菌香肠样品直接PCR检测限研究结果；

C(2)模拟带菌香肠样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；

其中，M：1000bp DNA ladder；N：阴性对照；1号泳道为香肠样品(不加菌液)；2-8号泳道对应的细菌浓度为：1.14×10²～1.14×10⁸cfu/mL。

图8是模拟带菌鱼肉样品免疫PCR试剂盒检测限研究结果。

D(1)模拟带菌鱼肉样品直接PCR检测限研究结果；

D(2)模拟带菌鱼肉样品免疫捕获PCR检测试剂盒检测限研究结果；

其中，M：1000bp DNA ladder；N：阴性对照；1号泳道为鱼肉样品(不加菌液)；2-8号泳道对应的鱼肉浓度为：1.14×10²～1.14×10⁸cfu/mL。

具体实施方式

本发明人的研究表明，以副溶血性弧菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9，其抗体效价可达到1:100000，其能够特异性、高效地与副溶血性弧菌结合，检测灵敏度达到10⁵cfu/ml。与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应。

在此基础上，本发明人进而将致病菌免疫富集技术和基因水平检测技术有效结合，即先用本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体将待测样品中的病原菌特异性免疫富集，然后再进行PCR扩增，从而提供了一种可快速、高效检测食源性副溶血性弧菌的检测试剂盒。

抗体

本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体可以利用小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7(CGMCC No.8003)或3G9F7D5C9(CGMCC No.9010)分泌产生。本发明包括具有抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7或3G9F7D5C9的相应氨基酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗副溶血性弧菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗副溶血性弧菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

对于本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。抗副溶血性弧菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region,CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗副溶血性弧菌单克隆抗体CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab‘)₂片段；抗体重链；抗体轻链。

本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，利用杂交瘤细胞系3G9E9G3H7(CGMCC No.8003)或3G9F7D5C9(CGMCC No.9010)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC1₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgC1₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9，其效价高(可以达到1:100000)，能够特异性地、高效地检测副溶血性弧菌，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应，此为本发明的最大创新点。

检测试剂盒

本发明人根据免疫PCR的原理，制备了一种可用于检测样品中副溶血性弧菌的试剂盒，即先用本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7或3G9F7D5C9将待测样品中的病原菌特异性地免疫富集，然后再进行PCR扩增，以提高检测的灵敏度和特异性。

具体而言，本发明首先是提供了一种用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管，它包括免疫PCR管和包被于所述免疫PCR管管体内壁的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7或3G9F7D5C9，所述的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9分别由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCC No.8003或3G9F7D5C9，CGMCC No.9010分泌产生。

在此基础上，本发明进而提供了一种副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒，它含有上述用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管；

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还装载有容器a，所述的容器a可以是自封袋或者其他形式的容器，其中装有本发明的包被有抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7或3G9F7D5C9的PCR反应管。

此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的本发明的试剂盒中优选地还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是免疫PCR检测试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：缓冲液(10×PCR Buffer)、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH₂O(灭菌双蒸水)、引物等常规PCR反应试剂。10×PCR Buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH₂O与常规的免疫PCR检测试剂盒中的所用的试剂相同。同时，为了消除假阳性和假阴性，还可在PCR检测过程中设置质控(对照)，即在本发明的试剂盒中还包含有阴性对照和阳性对照等。较佳地，所述的阳性对照溶液为灭活的副溶血性弧菌菌液，阴性对照溶液为灭菌的3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)。如本领域技术人员所熟知，上述试剂和溶液可分别装载于EP管或试剂瓶中。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

本发明的有益效果：本发明的副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒集病原菌浓缩、特异性抗体识别以及PCR扩增为一体，具有检测结果准确性高、特异性强、灵敏度高以及检测快速、使用方便等优点，弥补了现有食源性致病菌检测技术费时耗力、灵敏度低的不足。

本发明的副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒适用于菌株快速鉴定、食品中食源性致病菌检测等诸多领域，尤其适用于样品中微量病原体的快速检测。可供质监部门、进出口检疫部门等用于检测食样中的副溶血性弧菌。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的制备

一、免疫原和阳性标准品的准备

副溶血性弧菌(ATCC No.17802)接种于3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)，37℃、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3％甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整副溶血性弧菌(ATCC No.17802)浓度至5×10⁹cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为10⁸cfu/ml作为阳性对照标准品，3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)为阴性对照标准品。

二、单克隆抗体的制备

1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。

2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。

3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。

4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。

5)杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。

6)克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3－4次，直至阳性率达到100％。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2×10⁶个杂交瘤细胞，7～10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体。

三、单克隆抗体的效价测定

副溶血性弧菌培养基如下：国标：GB/T 4789.7-2008

3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)

成分：蛋白胨10.0g，氯化钠30.0g，蒸馏水1000.0mL

制法：将上述成分混合，调节pH8.5±0.2，121℃高压灭菌10min。

单克隆抗体效价测定的步骤如下：

(1)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μl，4℃过夜(约包板36h)。

(2)倒空液体并拍干残留液体，用250μl洗涤液清洗3次。

(3)每个孔中加100μl1％BSA，37℃封闭1h。

(4)倒空液体并拍干残留液体，用250μl洗涤液清洗3次。

(5)每个孔中加100μl血清，37℃孵育1h。

(6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μlPBST洗涤液洗涤3次。

(7)每个孔中50μl的HRP标记的二抗(sigma)，室温孵育1h。

(8)用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μlPBST洗涤液洗涤3次。

(9)每个孔中加100μl底物，显色30min，加终止液100μl并立即在OD₄₅₀读数。

表1.两株单克隆抗体效价测定结果(OD₄₅₀)

实施例2.单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的特性鉴定

一、单克隆抗体亚类鉴定

1、抗原包被：用0.01M PBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50μl，4℃包被过夜，次日弃去孔内液体，洗板3遍。

2、封闭：每孔加入1％BSA 200μl，4℃封闭过夜。次日拍干板子不洗板。

3、加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50μl。37℃，孵育1h。

4、洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM，κ，λ，37℃孵育1h。

5、洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG(H+L)，37℃，孵育30min。

洗板4遍后，加入100μl底物显色液，37℃，避光显色10min。于450nm波长下读取结果。

表2.两株单克隆抗体亚类鉴定结果

二、单克隆抗体交叉反应测试

1、抗原包被：将78种10⁸cfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌加3各孔，每孔100μl，4℃，包被过夜。

2、封闭：洗板3遍后，每孔加入3％BSA 200μl，37℃孵育2h。

3、洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100μl，37摄氏度孵育1h。

4、洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μl，37摄氏度孵育1h。

5、洗板4遍。加入底物显色液，37℃，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。

表3.两株单克隆抗体交叉反应检测结果

实施例3.单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9和副溶血性弧菌鞭毛蛋白的反应特性鉴定

1、副溶血性弧菌鞭毛蛋白提取：

(1)副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)(ATCC 17802)接种于3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)，37℃、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3％甲醛溶液室温灭活24h。

(2)次日用收集细菌离心重悬于预冷的0.15M NaCl溶液中，冰浴15～30min，1000rpm匀浆45秒，立即置于冰上10min。

(3)匀浆液4℃条件下10000rpm离心10min；取上清液4℃条件下16000rpm离心2h，弃上清，沉淀重悬于TET(10mM Tris，2mM EDTA，pH8.0，1％Triton X-100)缓冲液中。离心过程重复3次。操作过程保持低温下进行。最后留取沉淀，溶于少量Tris-EDTA(0.1M Tris，0.1mM EDTA，pH7.8)buffer中，4℃保存备用。

2、间接ELISA测定3G9E9G3H7和3G9F7D5C9和鞭毛蛋白的结合特性

(1)鞭毛蛋白包被：将鞭毛蛋白加入到酶标板中，每个致病菌加3各孔，每孔100μl，4℃，包被过夜。

(2)封闭:洗板3遍后，每孔加入3％BSA 200μl，37℃孵育2h。

(3)洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9各100μl，37摄氏度孵育1h。

(4)洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μl，37摄氏度孵育1h。

(5)洗板4遍。加入底物显色液，37℃，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。

结果见表4。研究证实：3G9E9G3H7和3G9F7D5C9两株抗体和副溶血性弧菌鞭毛蛋白无交叉反应。

表4 单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9和副溶血性弧菌鞭毛蛋白的反应特性

实施例4PCR反应管的制备

本发明的用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管的具体包被方法如下：

1、用包被缓冲液稀释本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7或3G9F7D5C9至1:300倍，抗体浓度为10μg/mL，将稀释好的单克隆抗体每管50uL加入免疫PCR管中，4℃过夜包被；

2、包被缓冲液(Carbonate Coating buffer(1×))的配方为：无水碳酸钠Na₂CO₃1.59g，碳酸氢钠NaHCO₃2.93g，叠氮化钠NaN₃0.2g，溶于1000ml蒸馏水中，调pH至9.6，4℃保存。

实施例5副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒的制备

制备本发明的副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒，它含有：

实施例4制备的PCR反应管，装入自封袋内；EP管装载的10×PCR Buffer一管、dNTP一管、TaqDNA聚合酶一管、ddH₂O一管、正向引物一管、反向引物一管；试剂瓶装载的阳性对照一瓶、阴性对照一瓶。

10×PCR Buffer装量为300uL；dNTP的浓度为2.5mmol/L，装量为150uL；TaqDNA聚合酶浓度为5U/L，装量为60uL；扩增靶标基因TRH，大小486bp，引物TRH-L 5'TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT 3'，浓度为10umol/L；装量为150uL；TRH-R引物为5'CATAACAAACATATGCCCATTTCC3'，浓度为10umol/L，装量为150uL。

阳性对照为灭活的副溶血性弧菌菌液，阴性对照为灭菌的3％氯化钠碱性蛋白胨水(APW)。

本发明的检测试剂盒的使用流程和原理图参见图1。

实施例6梯度稀释副溶血性弧菌纯菌液直接PCR研究实验(图2)

副溶血性弧菌标准菌株培养18h后，然后用无菌生理盐水依次10倍递减稀释，依次标记为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，用10^-5、10^-6、10^-7梯度的菌液进行平板菌落计数。菌落计数原始菌液浓度为1.04×10⁹cfu/mL，依次稀释原菌液，菌液浓度梯度为：1.04×10⁸～1.04×10cfu/mL。取各个梯度的菌液各5uL加入本发明的检测PCR管中，然后加入本发明的试剂盒内的10×PCR Buffer 5uL，dNTP 2uL，正向引物2uL，反向引物2uL，TaqDNA聚合酶1uL，ddH2O补足体积至50uL。PCR的扩增条件为95℃5min；35个循环(95℃15s；55℃30s；72℃1min)，72℃5min，4℃保存。取10uL的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。

实施结果如图2所示，图中泳道1-4号可见特异性目标条带出现，片段大小为486bp，并且可以看到亮度依次减弱。5-8泳道和阴性对照未见特异性条带。实验结果显示，副溶血性弧菌纯菌液直接PCR检测的灵敏度为1.04×10⁵cfu/mL。

实施例7梯度稀释副溶血性弧菌纯菌液的本试剂盒检测IC-PCR研究实验(图3)

取梯度稀释的副溶血性弧菌菌液(1.04×10⁸～1.04×10cfu/mL)各200uL加入本试剂盒内的检测PCR管中，放置于37℃孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在无菌滤纸上扣干残液，然后在PCR管内加入本发明试剂盒内的10×PCR Buffer 5uL，dNTP 2uL，正向引物2uL，反向引物2uL，TaqDNA聚合酶1uL，ddH2O补足体积至50uL。PCR的扩增条件为95℃5min；35个循环(95℃15s；55℃30s；72℃1min)，72℃5min，4℃保存。取10uL的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。

实施结果如图3所示，图中泳道1-7号可见特异性目标条带出现，片段大小为486bp，并且可以看到亮度依次减弱。8泳道和阴性对照未见特异性条带。实验结果显示，副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒检测副溶血性弧菌纯菌液检测限的灵敏度为1.04×10²cfu/mL。

实施例8本试剂盒对副溶血性弧菌和非副溶血性弧菌交叉反应实验(图4)

供试菌株有：副溶血性弧菌ATCC 82346，金黄色葡萄球菌ATCC 27660，鼠氏伤寒沙门氏菌ATCC 22956，肠炎沙门氏菌ATCC 13076，单增李斯特菌ATCC 43251，小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715，福氏志贺氏菌ATCC 12022，宋内氏志贺氏菌ATCC 25931，痢疾志贺氏菌ATCC 51329，乙型溶血性链球菌ATCC 10373，阪崎肠杆菌ATCC 29004。各取供试菌株200ul加入本试剂盒的检测PCR管中，放置于37℃孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在无菌滤纸上扣干残液，然后在PCR管内加入本发明试剂盒内的10×PCRBuffer5uL，dNTP2uL，正向引物2uL，反向引物2uL，TaqDNA聚合酶1uL，ddH2O补足体积至50uL。PCR的扩增条件为95℃5min；35个循环(95℃15s；55℃30s；72℃1min)，72℃5min，4℃保存。取10uL的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。

实施结果如图4所示，图中只有大肠O157菌的泳道出现目的条带(486bp)，其他10株对照菌株均没有目的条带出现，说明该试剂盒有很好的特异性。

实施例9梯度稀释模拟带菌副溶血性弧菌直接PCR研究实验(图5至图8)

按照国标GB/T4789.36-2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》，取食样25g(mL)加入到225mL生理盐水中，在拍击式均质器上均质2～3min，作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染不同浓度梯度的副溶血性弧菌纯菌液，人工污染的食品匀浆液中副溶血性弧菌菌液浓度依次为：1.04×10⁸～1.04×10²cfu/mL。取不同梯度的人工污染的食品匀浆液各5uL加入本试剂盒的检测PCR管中，然后加入本发明试剂盒内的10×PCRBuffer5uL，dNTP2uL，正向引物2uL，反向引物2uL，TaqDNA聚合酶1uL，ddH2O补足体积至50uL。PCR的扩增条件为95℃5min；35个循环(95℃15s；55℃30s；72℃1min)，72℃5min，4℃保存。取10uL的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。

实施结果如图5至图8中的A(1)、B(1)、C(1)、D(1)、E(1)、F(1)所示，从结果中可以看出食品样本模拟带菌副溶血性弧菌直接PCR的灵敏度可达到1.04×10⁵～1.04×10⁶cfu/mL。

实施例10副溶血性弧菌免疫捕捉PCR试剂盒灵敏度实验(图5至图8)

按照国标GB 4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》，取食样25g(mL)加入到225mL生理盐水中，在拍击式均质器上均质2～3min，作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染不同浓度梯度的副溶血性弧菌纯菌液，人工污染的食品匀浆液中副溶血性弧菌菌液浓度依次为：1.04×10⁸～1.04×10²cfu/mL。取不同梯度的人工污染的食品匀浆液各200uL加入本试剂盒的检测PCR管中，放置于37℃孵育2h，然后用移液器小心吸去菌液，用PBST洗三次，在无菌滤纸上扣干残液，然后在PCR管内加入本发明试剂盒内的10×PCR Buffer5uL，dNTP2uL，正向引物2uL，反向引物2uL，TaqDNA聚合酶1uL，ddH2O补足体积至50uL。PCR的扩增条件为95℃5min；35个循环(95℃15s；55℃30s；72℃1min)，72℃5min，4℃保存。取10uL的PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳来检测目标条带并且凝胶成像分析。结果详见图5至图8。

实施结果如图5至图8中的A(2)、B(2)、C(2)、D(2)、E(2)、F(2)所示，从结果中可以看出：副溶血性弧菌免疫PCR检测试剂盒研究食品样本模拟带菌的灵敏度可达到 1.04×10³～1.04×10⁴cfu/mL。

生物材料的保藏

产生经过上述鉴定的副溶血性弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G9E9G3H7于2013年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，分类命名为“产生抗副溶血性弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株”，保藏号为CGMCC No.8003。

产生经过上述鉴定的副溶血性弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G9F7D5C9于2014年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码：100101)，分类命名为“抗副溶血性弧菌(Vi brio parahaemolyticus)杂交瘤细胞”，保藏号为CGMCC No.9010。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种用于检测副溶血性弧菌的PCR反应管，其特征在于，所述的PCR反应管包括：

免疫PCR管；和

包被于所述的免疫PCR管管体内壁的抗副溶血性弧菌单克隆抗体，所述的抗副溶血性弧菌单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3G9E9G3H7，CGMCC No.8003或3G9F7D5C9，CGMCCNo.9010产生。

2.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如权利要求1所述的PCR反应管。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有容器a，所述的容器a中装有如权利要求1所述的PCR反应管。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH₂O、引物、阳性对照和阴性对照。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物包括正向引物和反向引物。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的副溶血性弧菌菌液，所述的阴性对照为灭菌的3％氯化钠碱性蛋白胨水。