CN103941006B - 猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有：依次连接的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其中，由保藏号为CGMCCNo.7710的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-D10作为金标抗体偶联胶体金并喷涂于金标垫上，由保藏号为CGMCCNo.7712的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-F10作为检测抗体并喷涂于NC膜上形成检测线。另外，本发明还提供了猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品猪霍乱沙门氏菌中的应用。实验结果显示本发明的试纸条对猪霍乱沙门氏菌的检测特异性和灵敏性均较高。

Description

猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条
技术领域
本发明涉及一种免疫胶体金检测试纸条，属于生物检测领域。
背景技术
猪霍乱沙门氏菌（Shigellaboydii）属于志贺氏菌C群，是一种重要的食源性致病菌，可通过受污染的肉、蛋、鱼及其制品等动物性产品，瓜子仁等进入人体，引起发热、腹痛、里急后重，有时表现为全身中毒症状为中毒性痢疾，治疗不彻底转为慢性。
目前猪霍乱沙门氏菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但国内外目前尚无可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以猪霍乱沙门氏菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有：依次连接的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其中，由保藏号为CGMCCNo.7710的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-D10作为金标抗体偶联胶体金并喷涂于金标垫上，由保藏号为CGMCCNo.7712的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-F10作为检测抗体并喷涂于NC膜上形成检测线。
另外，本发明还提供了猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品猪霍乱沙门氏菌中的应用。
发明作用与效果
根据本发明的猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条，由于采用了新筛选的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果显示本发明的试纸条对猪霍乱沙门氏菌的检测特异性和灵敏性均较高。
附图说明
图1是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图；
图2是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金pH结果；
图3是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体金结合量结果；
图4是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体组合配对结果；
图5是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条灵敏度结果；
图6是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果；
图7是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条模拟带菌实验结果；
图8是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。
保藏信息：
1.分泌猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体Mab05-D10的杂交瘤细胞株抗猪霍乱沙门氏菌（Salmonellacholeraesuis）杂交瘤细胞株，于2013年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101。
保藏号：CGMCCNo.7710。
2.分泌猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体Mab05-F10的杂交瘤细胞株抗猪霍乱沙门氏菌（Salmonellacholeraesuis）杂交瘤细胞株，于2013年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101
保藏号：CGMCCNo.7712。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明的具体实施方式：
首先介绍本发明实施例中所使用的试剂与仪器：
主要试剂
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG、TWEEN-20Sigma；BSA购于上海世泽生物科技有限公司；胶体金溶液购于上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135SMillipore；羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔购于上海生工生物工程股份有限公司；单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购于ZYMEDCat：90-6550;Lot.60907259。本发明中用于做交叉反应实验的菌株均可通过商业途径获得。
主要仪器
酶标仪SpectraMaxM2购自MolecularDevices；Nanodrop2000C购自ThermoScientific；点样仪AD6010购自BIO-DOT；扫描仪PhantomV9购自MICROTEK；恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogicTMLP358BR5057购自BIO-RAD；单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
一、猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体制备
1.免疫原和阳性标准品的准备
猪霍乱沙门氏菌（CICC21493）接种于蛋白胨水（BPW），37℃、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3%甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整猪霍乱沙门氏菌（CICC21493）浓度至5×109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为108cfu/ml作为阳性对照标准品，蛋白胨水（BPW）为阴性对照标准品。
2.单克隆抗体的制备过程
1）实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
2）免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
3）采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
4）细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱培养。
5）杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
6）克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3－4次，直至阳性率达到100%。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2×106个杂交瘤细胞，7～10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体。
筛选出2株稳定分泌抗猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为Mab05-D10（CGMCCNo.7710，简称D10）和Mab05-F10（CGMCC)No.7712，简称F10），经过初步抗体配对实验后，对D10和F10进行亚类及亚型鉴定、测定浓度、相对分子质量，并对制备的单克隆抗体通过交叉反应进行特异性验证。
3.单克隆抗体的亚型鉴定
通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定各抗体亚类、亚型，表1结果为显色终止后450nm处OD值，由表2可得，D10、F10亚类均为IgG1，轻链亚型为κ。
表1单克隆抗亚类、亚型结果
4.单克隆抗体的纯化、纯度及效价检测
腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用ProteinGSepharose亲和层析法纯化，将制备纯化所得抗体D10、F10通过Nanodrop2000C测定仪测得浓度如表2，D10浓度为4.5mg/mL，F10浓度为3.5mg/mL，该浓度适于抗体的使用与保存，不需再进行浓缩或稀释。
再用SDS-PAGE分析纯度，5%积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察结果（见图1）。
表2单克隆抗体浓度
抗体编号 D10 F10
浓度（mg/mL） 4.5 3.5
单克隆抗体效价测定的步骤如下：
1)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μl，4℃过夜（约包板36h）。
2）倒空液体并拍干残留液体，用250μl洗涤液清洗3次。
3）每个孔中加100μl1%BSA，37℃封闭1h。
4）倒空液体并拍干残留液体，用250μl洗涤液清洗3次。
5）每个孔中加100μl血清，37℃孵育1h。
6）倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μlPBST洗涤液洗涤3次。
7）每个孔中50μl的HRP标记的二抗（sigma），室温孵育1h。
8）用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250μlPBST洗涤液洗涤3次。
9）每个孔中加100μl底物，显色30min，加终止液100μl并立即在OD450读数。
表3.两株单克隆抗体效价测定结果（OD450）
5单克隆抗体交叉反应的测定
1)抗原包被:将78种108cfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌加3各孔，每孔100μl，4℃，包被过夜。
2)封闭:洗板3遍后，每孔加入3%BSA200μl，37℃孵育2h。
3)洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100μl，37摄氏度孵育1h。
4)洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μl，37摄氏度孵育1h。
5)洗板4遍。加入底物显色液，37℃，避光显色15min。于450nm波长下读取结果，结果见表4。
表4.两株单克隆抗体交叉反应检测结果
二、胶体金试纸条抗体最优组合的确定
1.各抗体偶联胶体金的最佳pH的确定
分别取100μL胶体金溶液于96孔板8个孔中，并调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每孔加入10μL浓度为1mg/mL的单克隆抗体。反应5min，各孔加入10μL10%NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。
图2中各组从左到右的孔中pH值依次为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。由图2得知，A组为不同pH值下单克隆抗体D10胶体金标记的结果，当pH为7.5-8.0时，孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即D10单抗偶联胶体金最佳pH范围为7.5-8.0；B组为不同Ph值下单克隆抗体F10胶体金标记结果，当pH为7.5时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即F10偶联胶体金最佳pH为7.5。
2.各抗体偶联胶体金的最佳结合量的确定
调节胶体金溶液pH至步骤（1）中得到的各抗体偶联的最佳pH值，各取100μL于96孔板中，按表5加入各抗体，反应5min，各孔加入10μL10%NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，结果如图3所示。取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/mL，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+x×20%为最佳结合量。
表5抗体与胶体金偶联最佳结合量
编号 1 2 3 4 5 6 7
胶体金溶液(μL) 100 50 100 100 100 100 100
抗体质量/金溶液体积(μg/mL) 0 0 5 10 15 20 25
10%NaCl(μL) 10 0 10 10 10 10 10
由图3得知，抗体质量/金溶液体积为0μg/mL时，加入10%NaCl后各组孔1中胶体金均出现聚沉，颜色由红色变灰，最后变为无色；各组孔2为50μL胶体金原液作对照。当抗体质量/金溶液体积由5μg/mL增加至25μg/mL时，各组孔中胶体金颜色依次变红变深，其中，A组D10抗体添加量≥10μg/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3，即D10最小结合量为10μg/mL，则其最佳结合量为12μg/mL；B组F10抗体添加量≥20μg/mL时，颜色变化较小，且均红于孔3、4、5，即F10最佳结合量为24μg/mL。
3.抗体的纳米金标记
胶体金pH调节至最佳pH值，按步骤（2）中确定的最佳结合量吸取抗体以40μL/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌30min，加入金溶液1/10体积的含10%BSA的PBS溶液，搅拌1h，移入离心管4000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清13000rpm离心25min，弃上清，沉淀用重悬液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用，如需保存较长时间，可加入0.3%叠氮化钠。
4.猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的组装及测定
图4是本发明猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图。
如图4所示，猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条10包括：样品垫14、金标垫13、检测线16，质控线15以及吸水垫11，在吸水垫11与样品垫14的中间采用硝酸纤维素膜12，硝酸纤维素膜也称NC膜。硝酸纤维素膜12上具有质控线15和检测线16，检测线16靠近样品垫一侧。另外猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条10还具有背衬，用于承载上述的样品垫等结构。
将步骤3中制备好的金标抗体分别喷涂于多个检测试纸条的金标垫上，记为D10-Au-pad、F10-Au-pad，将各抗体均稀释至1mg/mL，分别包被硝酸纤维素膜12上作为Testline，即检测线，也称T线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠作为金标单抗试纸条的Controlline，即控制线，也称C线。以羊抗兔作为金标多抗试纸条的Controlline。按表6中的组合方式对金标垫和检测线喷涂抗体，组装试纸条，将培养好的菌液用生理盐水稀释至108、107、106CFU/mL进行测定，无菌生理盐水作阴性对照，选择最优的抗体组合。表5中金标垫一列中的D10-Au-pad代表将单克隆抗体D10作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，F10作为检测线；F10-Au-pad代表将单克隆抗体F10作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，D10作为检测线。
表6抗体不同配对组装试纸条
图5是本发明猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体组合配对结果。如图5所示，其中，A为D10-F10组合结果；B为F10-D10组合结果。
图5中各组试纸条中从左至右分别为采用108、107、106、105CFU/mL以及无菌生理盐水进行测试的结果，由图5可知，A组合灵敏度可达106CFU/mL，且无假阳性，效果较好；B组合灵敏度可达107CFU/mL，且无假阳性，但其T、C线显色均较A组浅，综上，选用抗体组合效果较好的A组，即D10偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，F10喷涂于NC膜作T线来制作本发明的猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条。
5.试纸条灵敏度测定
将培养好的菌液用生理盐水依次稀释至108、107、106、105CFU/mL，不同浓度菌液均以35μL分别滴加至使用A组单抗组合制作的试纸条的样品垫上进行检测，使用无菌生理盐水为阴性对照，并重复三次。
结果如图6所示，滴加浓度为108、107、106CFU/mL菌液后，试纸条T线显色，滴加105CFU/mL菌液T线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达106CFU/mL，三次重复结果均为106CFU/mL，灵敏度稳定性较好。
6.试纸条交叉反应实验
利用以下食源性致病菌对使用A组单抗组合制备的试纸条进行交叉反应实验：金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC29213、ATCC27660)、大肠杆菌O157:H7EscherichiacoliO157:H7（ATCC43895、ATCC43889）、单核细胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes（ATCC43251、ATCC13932、ATCC19112、ATCC19114、ATCC19116、ATCC19117、ATCC19115）、猪霍乱沙门氏菌Salmonellacholeraesuis（CICC21493）、鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphiumukriunm（CICC22956、ATCC14028）、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis（ATCC13076）、福氏志贺氏菌Shigellaflexneri（ATCC12022）、宋内氏志贺氏菌Shigellasonnei（ATCC25931）、痢疾志贺氏菌Shigelladysenteriae（野生分离株）、鲍氏志贺氏菌Shigellaboydii（ATCC9207）、小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersiniaenterocolitica（ATCC23715、CMCC52207）、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus（ATCC17802）、坂崎肠杆菌(Enterobactersakazakii（ATCC29004、ATCC29554）、空肠弯曲菌(Campylobacterjejunienteritis)（CICC22937）、乙型溶血性链球菌(StreptococcusHemolyticsβ)（ATCC10373）、幽门螺旋杆菌(HelicobacterPylor)（ATCC43504）。
用制备好的试纸条检测27株培养至108CFU/mL的细菌并观察结果。不同浓度菌液的用量均为35μL。
图7是本发明实施例中猪霍乱沙门氏菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果。
如图7所示，35μL浓度为108CFU/mL的猪霍乱沙门氏菌（CICC21493）菌液滴加到样品垫后，T线均显色，其他26株细菌相同浓度相同体积加样后，T线均未显色，结果表明，该试纸条可以专一检测猪霍乱沙门氏菌，而和其它食源性致病菌无交叉反应，且试纸条性能稳定，是一种较好的猪霍乱沙门氏菌快速检测产品。
三、免疫胶体金试纸条模拟带菌实验
为了进一步验证本发明的胶体金试纸条的实际检测性能，培养猪霍乱沙门氏菌浓度至108CFU/mL，用生理盐水梯度稀释至103CFU/mL后各取100μL分别加入到25g(mL)的市售面包、果冻及牛奶中，按照国标GB4789.4-2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》分别向各样品中加入225mL缓冲蛋白胨水（BPW），36℃培养22h，期间每隔1h各取10mL样品待检，分别取各样品各时间段培养物40μL滴加至样品垫进行检测。实验结果在图8中依次左至右排列，用PBS作为阴性对照，每组排列在最后一个。
如图8所示，A组为面包样品组，B组为果冻样品组，C组为牛奶样品组，A组面包样品增菌2-5h时，试纸条T线无显色，增菌6-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU猪霍乱沙门氏菌的面包样品在增菌液中增菌6h即可被检出；B组牛奶样品增菌2-6h时，T线无显色，增菌7-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU猪霍乱沙门氏菌的牛奶样品在增菌液中增菌7h可被检出；C组果冻样品增菌2-7h时，T线无显色，增菌8-12h，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU猪霍乱沙门氏菌的果冻样品在增菌液中增菌8h可被检出，三组模拟带菌检测中作为阴性对照的PBS均未显色。以上结果说明本发明的猪霍乱沙门氏菌对实际样品具有很好的检测能力。
具体实施方式作用与效果
本发明筛选出了二株单克隆抗体，其中D10作为金标抗体，F10作为检测抗体，制成免疫胶体金试纸条。实验表明此种试纸条具有无交叉反应和灵敏度高的特点，并且在实际猪霍乱沙门氏菌检测中表现出良好的检测性能和运用价值。

Claims (2)

1.一种猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有：
依次连接的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，
其中，由保藏号为CGMCCNo.7710的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-D10作为金标抗体偶联胶体金并喷涂于所述金标垫上，由保藏号为CGMCCNo.7712的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Mab05-F10作为检测抗体并喷涂于所述NC膜上形成检测线。
2.如权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品猪霍乱沙门氏菌中的应用。
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