CN103954759B

CN103954759B - 金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条

Info

Publication number: CN103954759B
Application number: CN201410131610.5A
Authority: CN
Inventors: 刘箐; 李建武
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CN103954759A

Abstract

本发明提供一种金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于：其中，由保藏号为CGMCC？No.8764的杂交瘤细胞株5D6D9G3B4产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，以及由保藏号为CGMCC？No.8763的杂交瘤细胞株5D2G2D9C1产生的单克隆抗体作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。本发明对金黄色葡萄球菌的检测特异性和灵敏性均较高。

Description

金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条

技术领域

本发明属于微生物检测领域。具体而言，本发明涉及一种金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是最常见的食源性致病菌，广泛存在于自然环境中。金黄色葡萄球菌主要污染奶、肉、蛋、鱼及其制品等动物性产品，包括奶制作的饮料、冷饮、糕点，熟肉、肉制品罐头，剩饭、油煎蛋、糯米糕、凉粉、剩大米和米酒等，俗名“嗜肉菌”。金黄色葡萄球菌侵染人体后主要会引起一些人体疾患，其一是侵袭性疾病如引起化脓性感染，如伤口化脓、蜂窝织炎，肺炎、脑膜炎、心包炎，败血症等；其二是由金黄色葡萄球菌产生的毒素性疾病，人食用后引起头晕、恶心、腹泻、呕吐等急性胃肠炎等食物中毒症状，而由毒素引起的休克综合症表现为高热、低血压、腹泻、皮疹、休克。

目前金黄色葡萄球菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以金黄色葡萄球菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及金黄色葡萄球菌快速检测产品。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条。

一种金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于：

其中，由保藏号为CGMCCNo.8764的杂交瘤细胞株5D6D9G3B4产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，以及由保藏号为CGMCCNo.8763的杂交瘤细胞株5D2G2D9C1产生的单克隆抗体作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。

另外，本发明还提供了金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品中的金黄色葡萄球菌中的应用。

发明作用与效果

根据本发明的金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，由于采用了配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对金黄色葡萄球菌的检测特异性和灵敏性均较高。

附图说明

图1是本发明实施例中单克隆抗体纯度测定的结果；

图2是本发明实施例中金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金的最佳pH的检测结果；

图3是本发明实施例中金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金的最佳结合量的检测结果；

图4是本发明金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图；

图5是本发明金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体组合配对结果；

图6是本发明金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的灵敏度测定结果；

图7是本发明金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的交叉反应结果；以及

图8是本发明实施例中金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的模拟带菌实验结果。

保藏信息

1.产生抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，5D2G2D9C1，于2014年01月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)No.8763。

2.抗金黄色葡萄球菌杂交瘤细胞，5D6D9G3B4，于2014年01月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)No.8764。

具体实施方式

本发明人的研究表明，以金黄色葡萄球菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体5D2G2D9C1和5D6D9G3B4，其抗体效价可达到1:100000，其能够特异性、高效地与金黄色葡萄球菌结合，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等均无交叉反应。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所使用的菌株，除提供保藏编号的两株外，其它菌株均可以通过商业渠道获得。

一、抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体的制备及鉴定

1.免疫原和阳性标准品的准备

金黄色葡萄球菌（ATCC27660）接种在脑心浸出液肉汤(BHI)平板上：胰蛋白质胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.5g，葡萄糖2.0g，牛心浸出液500mL，pH7.4±0.2，37℃培养24h，挑取单菌落于BHI肉汤，37℃、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3%甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整金黄色葡萄球菌（ATCC27660）浓度至5×10⁹cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为10⁸cfu/ml作为阳性对照标准品，改良E.C新生霉素增菌肉汤为阴性对照标准品。

2.单克隆抗体的制备过程

（1）实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。

（2）免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。

（3）采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。

（4）细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。

（5）杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。

（6）克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3－4次，直至阳性率达到100%。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2×10⁶个杂交瘤细胞，7～10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。

3.单克隆抗体纯化及鉴定

腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用ProteinGSepharose亲和层析法纯化；纯化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价，结果见表1；再用SDS-PAGE分析纯度，5%积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察结果，结果如图1所示。图1中第1泳道是5D2G2D9C1，第二泳道是:5D6D9G3B4。

表1.单克隆抗体效价测定结果

4.单克隆抗体亚类鉴定

（1）抗原包被:用0.01MPBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50μl，4℃包被过夜，次日弃去孔内液体，洗板3遍。

（2）封闭:每孔加入1%BSA200μl，4℃封闭过夜。次日拍干板子不洗板。

（3）加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50μl。37℃，孵育1h。

（4）洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM，κ，λ，37℃孵育1h。

（5）洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG（H+L），37℃，孵育30min。

（6）洗板4遍后，加入100μl底物显色液，37℃，避光显色10min。于450nm波长下读取结果。由表2可得，5D2G2D9C1亚类为IgG1，轻链亚型为κ；5D6D9G3B4亚类为IgG1，轻链亚型为κ；

表2.两株单克隆抗体亚类鉴定结果

5.单克隆抗体交叉反应测试

（1）抗原包被：将14种10⁸cfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌加3各孔，每孔100μl，4℃，包被过夜。

（2）封闭：洗板3遍后，每孔加入3%BSA200μl，37℃孵育2h。

（3）洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100μl，37摄氏度孵育1h。

（4）洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μl，37摄氏度孵育1h。

（5）洗板4遍。加入底物显色液，37℃，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。结果如表3所示。

表3单克隆抗体的交叉反应实验

由表3可知单克隆抗体5D2G2D9C1和5D6D9G3B4对表中除了金黄色葡萄球菌之外的细菌均无交叉反应。

二、金黄色葡萄球菌胶体金快速检测试纸条抗体最优组合的确定

1.各抗体偶联胶体金的最佳pH的确定

分别取100μL胶体金溶液于96孔板8个孔中，并调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每孔加入10μL浓度为1mg/mL的单克隆抗体。反应5min，各孔加入10μL10%NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。图2中各组从左到右的孔中pH值依次为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。由图2得知，A组为不同pH值下单克隆抗体5D6D9G3B4胶体金标记的结果，当pH为7.5-8.0时，孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即5D6D9G3B4单抗偶联胶体金最佳pH范围为7.5-8.0；B组为不同Ph值下单克隆抗体5D2G2D9C1胶体金标记结果，当pH为7.5时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即5D2G2D9C1偶联胶体金最佳pH为7.5。

2.各抗体偶联胶体金的最佳结合量的确定

调节胶体金溶液pH至上文得到的各抗体偶联的最佳pH值，各取100μL于96孔板中，按表5加入各抗体，反应5min，各孔加入10μL10%NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，结果如图3所示。取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/mL，为保证胶体金完全与抗体结合，则以x+x×20%为最佳结合量。

表4抗体与胶体金偶联最佳结合量

编号	1	2	3	4	5	6	7
								胶体金溶液(μL)	100	50	100	100	100	100	100
抗体质量/金溶液体积(μg/mL)	0	0	5	10	15	20	25
								10%NaCl(μL)	10	0	10	10	10	10	10

由图3得知，抗体质量/金溶液体积为0μg/mL时，加入10%NaCl后各组孔1中胶体金均出现聚沉，颜色由红色变灰，最后变为无色；各组孔2为50μL胶体金原液作对照。当抗体质量/金溶液体积由5μg/mL增加至25μg/mL时，各组孔中胶体金颜色依次变红变深，其中，A组单克隆抗体5D6D9G3B4的添加量≥10μg/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3，即单克隆抗体5D6D9G3B4的最小结合量为10μg/mL，则其最佳结合量为12μg/mL；B组单克隆抗体5D2G2D9C1的添加量≥20μg/mL时，颜色变化较小，且均红于孔3、4、5，即F10最佳结合量为24μg/mL。

3.抗体的纳米金标记

将胶体金的pH调节至最佳pH值，按上文中确定的最佳结合量吸取抗体以40μL/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌30min，加入金溶液1/10体积的含10%BSA的PBS溶液，搅拌1h，移入离心管4000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清13000rpm离心25min，弃上清，沉淀用重悬液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4℃保存备用，如需保存较长时间，可加入0.3%叠氮化钠。

4.免疫胶体金检测试纸条的组装及测定

图4是本发明金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图。如图4所示，金黄色葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条10包括：样品垫14、金标垫13、检测线16，质控线15以及吸水垫11，在吸水垫11与样品垫14的中间采用硝酸纤维素膜12，硝酸纤维素膜也称NC膜。硝酸纤维素膜12上具有质控线15和检测线16，检测线16靠近样品垫一侧。另外金黄色葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条10还具有背衬17，用于承载上述的样品垫14等结构。

将制备好的金标抗体分别喷涂于多个检测试纸条的金标垫上，记为5D6D9G3B4-Au-pad、5D2G2D9C1-Au-pad，将各抗体均稀释至1mg/mL，分别包被硝酸纤维素膜12上作为Testline，即检测线，也称T线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠作为金标单抗试纸条的Controlline，即控制线，也称C线。以羊抗兔作为金标多抗试纸条的Controlline。按表5中的组合方式对金标垫和检测线喷涂抗体，组装试纸条，将培养好的菌液用生理盐水稀释至10⁸、10⁷、10⁶CFU/mL进行测定，无菌生理盐水作阴性对照，选择最优的抗体组合。表5中的5D6D9G3B4-Au-pad一列代表将杂交瘤5D6D9G3B4产生的单克隆抗体作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，将杂交瘤5D2G2D9C1产生的单克隆抗体喷涂于NC膜上形成检测线。5D2G2D9C1-Au-pad一列代表将杂交瘤5D2G2D9C1产生的单克隆抗体作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上，将杂交瘤5D6D9G3B4产生的单克隆抗体喷涂于NC膜上作为检测线。

表5抗体不同配对组装试纸条

图5是本发明金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体组合配对结果。如图5所示，其中，A为5D6D9G3B4-5D2G2D9C1组合结果；B为5D2G2D9C1-5D6D9G3B4组合结果。

图5中各组试纸条中从左至右分别为采用10⁸、10⁷、10⁶、10⁵CFU/mL金黄色葡萄球菌的菌液进行测试的结果，由图5可知，A组合灵敏度可达10⁶CFU/mL，且无假阳性，效果较好；B组合灵敏度可达10⁷CFU/mL，且无假阳性，但其T、C线显色均较A组浅，综上，选用抗体组合效果较好的A组，即5D6D9G3B4偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，5D2G2D9C1喷涂于NC膜作T线来制作本发明的金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条。

5.金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的灵敏度测定

将培养好的菌液用生理盐水依次稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵CFU/mL，不同浓度菌液均取35μL分别滴加至使用A组单抗组合制作的试纸条的样品垫上进行检测，使用无菌生理盐水为阴性对照，并重复三次。

结果如图6所示，滴加浓度为10⁸、10⁷、10⁶CFU/mL菌液后，试纸条T线显色，滴加10⁵CFU/mL菌液T线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达10⁶CFU/mL，三次重复结果均为10⁶CFU/mL，灵敏度稳定性较好。

6.试纸条交叉反应实验

利用以下食源性致病菌对制备的试纸条进行交叉反应实验：金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC29213、ATCC27660)、大肠杆菌O157:H7EscherichiacoliO157:H7（ATCC43895、ATCC43889）、单核细胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes（ATCC43251、ATCC13932、ATCC19112、ATCC19114、ATCC19116、ATCC19117、ATCC19115）、猪霍乱沙门氏菌Salmonellacholeraesuis（CICC21493）、鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphiumukriunm（CICC22956、ATCC14028）、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis（ATCC13076）、福氏志贺氏菌Shigellaflexneri（ATCC12022）、宋内氏志贺氏菌Shigellasonnei（ATCC25931）、痢疾志贺氏菌Shigelladysenteriae（野生分离株）、鲍氏志贺氏菌Shigellaboydii（ATCC9207）、小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersiniaenterocolitica（ATCC23715、CMCC52207）、副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus（ATCC17802）、坂崎肠杆菌Enterobactersakazakii（ATCC29004、ATCC29554）、空肠弯曲菌Campylobacterjejunienteritis（CICC22937）、乙型溶血性链球菌StreptococcusHemolyticsβ（ATCC10373）、幽门螺旋杆菌HelicobacterPylor（ATCC43504）。用制备好的试纸条检测27株培养至10⁸CFU/mL的细菌并观察结果。

图7是本发明实施例中金黄色葡萄球菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果。由图可知，35μL浓度为10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌(ATCC29213、ATCC27660)菌液滴加到样品垫后，T线均显色，其他25株细菌相同浓度相同体积加样后，T线均未显色，结果表明，该试纸条可以专一检测金黄色葡萄球菌，而和其它食源性致病菌无交叉反应，且试纸条性能稳定，是一种较好的金黄色葡萄球菌快速检测产品。

三、免疫胶体金试纸条模拟带菌实验

为了进一步验证本发明的金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条的实际检测性能，培养金黄色葡萄球菌浓度至10⁸CFU/mL，用生理盐水梯度稀释至10³CFU/mL后各取100μL分别加入到25g(mL)的市售面包、果冻及牛奶中，按照国标GB4789.10-2010分别向各样品中加入225mLBHI培养基，36℃培养22h，期间每隔1h各取10mL样品待检，分别取各样品各时间段培养物40μL滴加至样品垫进行检测。实验结果在图8中依次左至右排列，用蒸馏水作为阴性对照，每组排列在最后一个。

如图8所示，A组为面包样品组，B组为果冻样品组，C组为牛奶样品组，A组面包样品增菌2-5h时，试纸条T线无显色，增菌6-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU金黄色葡萄球菌的面包样品在增菌液中增菌6h即可被检出；B组牛奶样品增菌2-6h时，T线无显色，增菌7-12h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU金黄色葡萄球菌的牛奶样品在增菌液中增菌7h可被检出；C组果冻样品增菌2-7h时，T线无显色，增菌8-12h，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU金黄色葡萄球菌的果冻样品在增菌液中增菌8h可被检出，三组模拟带菌检测中作为阴性对照的蒸馏水均未显色。以上结果说明本发明的金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条对实际样品具有很好的检测能力。

此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于：

其中，由保藏号为CGMCCNo.8764的杂交瘤细胞株5D6D9G3B4产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，以及由保藏号为CGMCCNo.8763的杂交瘤细胞株5D2G2D9C1产生的单克隆抗体作为检测抗体，所述金标抗体偶联胶体金后喷涂于所述金标垫上，所述检测抗体喷涂于所述NC膜上形成检测线。

2.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品中的金黄色葡萄球菌中的应用。