CN102914649A

CN102914649A - 一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN102914649A
Application number: CN2012104109841A
Authority: CN
Inventors: 林礼锟; 卢新
Original assignee: GUANGZHOU OASIS BIOCHEMISTRY TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: GUANGDONG DAYUAN OASIS FOOD SAFETY TECHNOLOGY CO., LTD.; Guangdong Zhong Da Da Detection Technology Co., Ltd.
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2032-10-24
Also published as: CN102914649B

Abstract

本发明公开了一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括增菌剂、免疫层析试纸及裂解剂；所述增菌剂由组份组成：胰蛋白胨、牛肉浸出粉、酵母浸粉、葡萄糖、氯化钠、氯化锂、磷酸氢二钠、纯化水；所述裂解剂是由TritonX-100、Tween-80组成的水溶液。本发明的快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，灵敏度高达6×10⁵cfu/ml、特异性好、成本低、安全环保、检测结果准确，操作简便，省时省力，易于观察判读，无需专业人员和任何特殊辅助仪器设备，适合现场检测和基层人员使用。本试剂盒无毒无害，不会对环境造成污染。

Description

一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及其检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus ) 是普遍存在于自然界（空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中）、对人类可产生致病性的重要食源性病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸；无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长PH7.4，干燥环境下可存活数周。金黄色葡萄球菌在血平板生长形成的菌落周围有透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10～15%NaCl肉汤中生长，可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。根据对食源性疾病的统计分析显示20～25%系由金黄色葡萄球菌的肠毒素引起的。据报道新鲜食品中含有大于5×10⁴cfu/g就可以引起食品中毒。

每年因病原微生物引起的疾病近数10亿例，约有170万名儿童因食用病原微生物污染的食物引起腹泻而死亡。近年来，我国每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已上升第4位。因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒已成为世界性的公共卫生问题。鉴于对金黄色葡萄球菌的危害认识，检测、监控食品是否含有金黄色葡萄球菌的是至关重要的。现在检测金黄色葡萄球菌的国标方法是GB 4789.10—2010，该方法的检测时间长，操作繁琐，要求专业技术人员，不适合大批量样本的快速检测。

目前金黄色葡萄球菌的检测方法有微生物学方法（传统培养法和纸片法），生物化学方法，血清学方法，免疫学方法（ELISA、免疫荧光技术），分子生物学方法（实时荧光定量PCR技术、基因测序技术、生物芯片技术）。这些方法都存在着一些限制：①检测所需的时间长；②特异性不好；③灵敏度较差；④需要配制一定的仪器设备；⑤需要具备比较专业的人操作；⑥检测费用高，这些检测技术都难于在基层单位广泛应用。对于国内外对食品安全要求不断提高的现状，需要开发一种快速简单，在基层单位容易推广的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及其检测方法。

本发明采用的解决方案为：

一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括增菌剂、免疫层析试纸及裂解剂；

所述增菌剂由如下重量份组份组成：胰蛋白胨16～24份、牛肉浸出粉8～12份、酵母浸粉6.5～9.5份、葡萄糖0.4～0.6份、氯化钠2.5～3.5份、氯化锂1.5～2.5份、磷酸氢二钠0.65～0.95份、纯化水1000份；

所述裂解剂是由Triton X-100、Tween-80组成的水溶液；

所述免疫层析试纸包括面板及与其紧密扣合的底板，面板包括吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，金标垫与吸水垫分别紧密连接于硝酸纤维素膜的两端，样品垫紧密连接于金标垫；所述金标垫上含有金黄色葡萄球菌蛋白A抗体标记胶体金探针，所述硝酸纤维素膜上载有相互分离的检测线和质控线。

优选的，所述裂解剂，按体积百分含量计算，由如下组分组成：Triton X-100 30～50%、Tween-80 7.5～15%，余量为水。

优选的，所述增菌剂由如下重量份组份组成：胰蛋白胨20份、牛肉浸出粉10份、酵母浸粉8份、葡萄糖0.5份、氯化钠3份、氯化锂2份、磷酸氢二钠0.8份、纯化水1000份。

优选的，免疫层析试纸的底板采用PVC板材料。

优选的，免疫层析试纸的吸水垫采用纯植物纤维的纯白滤纸材料。

优选的，免疫层析试纸的硝酸纤维素膜采用进口的135NC膜材料。

优选的，免疫层析试纸的金标垫和样品垫采用亲水的玻璃纤维材料。

优选的，检测线由兔IgG抗体喷涂而成，质控线由羊抗鸡IgG抗体喷涂而成。

一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的方法，使用权利要求1～8任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

1) 将固体样品加入到生理盐水中，制成样品质量浓度为10%的样品匀液，或将液体样品加入到生理盐水中，制成样品体积浓度为10%的样品匀液；

2) 按1：20的质量比将增菌剂溶于水中，得增菌液；

3) 将样品匀液与增菌液按1：4的体积比混匀，37℃震荡培养6h，得样品增菌液；

4) 按50：1的体积比向样品增菌液中加入裂解剂，混匀，静置5min，得检测液；

5) 将检测液加到免疫层析试纸的样品垫上，静置，根据检测线和质控线的颜色变化判断结果，检测线和质控线同时出现红色带说明检测结果为阳性，颜色越质控线出现红色带、检测线不出现红色带说明检测结果为阴性，质控线不出现红色带说明检测结果无效。

本发明金黄色葡萄球菌蛋白A抗体标记胶体金探针是金黄色葡萄球菌蛋白A抗体与柠檬酸三钠还原氯金酸的胶体金颗粒发生交联反应结合生成的。

本发明金标垫是采用XYZ三维划膜喷金仪 HM3030将金黄色葡萄球菌蛋白A抗体标记胶体金探针喷到玻璃纤维上，40℃恒温干燥制备的。

本发明硝酸纤维素膜上载有的检测线、质控线分别是采用XYZ三维划膜喷金仪 HM3030分别将兔IgG抗体、羊抗鸡IgG抗体分别喷到硝酸纤维素膜上，40℃恒温干燥形成的。

本发明的内容是结合增菌技术和胶体金免疫层析检测技术开发一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒。胶体金免疫层析检测技术的基本原理是将高特异性高灵敏的抗体与胶体金颗粒交联形成标记结合物，并与固化在硝酸纤维素膜载体上的抗体形成双抗体夹心法检测抗原。

本发明的有益效果是：

本发明的快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，灵敏度高达6×10⁵cfu/ml、特异性好、成本低、安全环保、检测结果准确，操作简便，省时省力，易于观察判读，无需专业人员和任何特殊辅助仪器设备，适合现场检测和基层人员使用。本试剂盒无毒无害，不会对环境造成污染。因此，本发明的试剂盒在基层的快速检测速冻食品中有着广泛的市场潜力。

附图说明

图1是本发明试剂盒中金黄色葡萄球菌免疫层析试纸结构示意图；

图2是本发明试剂盒灵敏度试验检测结果；

图3是本发明试剂盒特异性试验检测结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。

实施例1（金黄色葡萄球菌免疫层析试纸）

金黄色葡萄球菌免疫层析试纸的制备

1、生物材料

金黄色葡萄球菌蛋白A抗体、兔IgG、羊抗鸡IgG（均购自SIGMA）

2、免疫层析试剂耗材

硝酸纤维素膜（NC膜，135S）购自Minipore，玻璃纤维、吸水纸、PVC板购自上海金标生物科技有限公司。

3、仪器设备

胶体金标记设备， XYZ三维划膜喷金仪 HM3030 ，微电脑自动斩切机ZQ2000，自动裁条机CT300购自上海金标生物科技有限公司。

4、金黄色葡萄球菌免疫层析试纸条的制备

4.1硝酸纤维素膜上的检测线和质控线固化

检测线：兔IgG抗体2.0mg/ml；质控线：羊抗鸡IgG抗体2.0 mg/ml；用XYZ三维划膜喷金仪 HM3030喷到NC膜上，40℃恒温干燥35min固化。

喷膜参数：泵压100 pa；喷量0.11μl/mm；速度60mm/S。

4.2金标垫制备

将金黄色葡萄球菌蛋白A抗体与PH7.0-7.5柠檬酸三钠法制备的40nm胶体金颗粒按20ng：1ml交联结合成探针；用XYZ三维划膜喷金仪 HM3030喷到玻璃纤维上，40℃恒温干燥。

喷金参数：泵压 200pa；喷量 0.2μl /mm；速度 40 mm/S。

4.3样品垫制备

按5×6cm玻璃纤维用1ml样品缓冲液处理的用量计算其所需量，将样品缓冲液均匀涂布在玻璃纤维上，40℃恒温干燥。

4.4组装

将吸水垫、金标垫、样品垫按顺序贴在有NC膜的PVC板上，切成4mm的条，装卡、包装；常温干燥保存，得免疫层析试纸，结构如图1所示。

实施例2

金黄色葡萄球菌增菌剂由如下重量份组份组成：胰蛋白胨20份、牛肉浸出粉10份、酵母浸粉8份、葡萄糖0.5份、氯化钠3份、氯化锂2份、磷酸氢二钠0.8份、纯化水1000份。

实施例3

金黄色葡萄球菌增菌剂由如下重量份组份组成：胰蛋白胨24份、牛肉浸出粉8份、酵母浸粉6.5份、葡萄糖0.4份、氯化钠3.5份、氯化锂1.5份、磷酸氢二钠0.65份、纯化水1000份。

实施例4

金黄色葡萄球菌增菌剂由如下重量份组份组成：胰蛋白胨16份、牛肉浸出粉12份、酵母浸粉9.5份、葡萄糖0.6份、氯化钠2.5份、氯化锂2.5份、磷酸氢二钠0.95份、纯化水1000份。

实施例5

金黄色葡萄球菌裂解剂，按体积百分含量计算，由如下组分组成：Triton X-100 40%、Tween-80 10%，余量为水。

实施例6

金黄色葡萄球菌裂解剂，按体积百分含量计算，由如下组分组成：Triton X-100 30%、Tween-80 7.5%，余量为水。

实施例7

金黄色葡萄球菌裂解剂，按体积百分含量计算，由如下组分组成：Triton X-100 50%、Tween-80 15%，余量为水。

实施例8

一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括实施例5的金黄色葡萄球菌增菌剂、实施例1的金黄色葡萄球菌免疫层析试纸及实施例2的金黄色葡萄球菌裂解剂。

实施例9

一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括实施例5～7任一例的金黄色葡萄球菌增菌剂、实施例1的金黄色葡萄球菌免疫层析试纸及实施例2～4任一例的金黄色葡萄球菌裂解剂。

不同的金黄色葡萄球菌增菌剂的效果比较：

采用实施例8的快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，分别以不同的金黄色葡萄球菌增菌剂（见表1中的对比例1～6的配方）替代实施例2的金黄色葡萄球菌增菌剂，分别采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌，分析各金黄色葡萄球菌增菌剂的效果，检测步骤如下：

1) 按1：20的质量比将增菌剂溶于无菌的纯化水中，得增菌液；

2) 取250cfu/ml、500 cfu/ml、1000cfu/ml和2000cfu/ml金黄色葡萄球菌的生理盐水溶液1ml，分别加入4ml增菌液中，混匀，置于37℃震荡培养箱中培养6h，震荡速度为250r/min，得样品增菌液；

3) 取2.5ml样品增菌液，加入50μL的金黄色葡萄球菌裂解剂充分混匀后，静置5min，得检测液；

4) 将80μL的检测液加到免疫层析试纸的样品垫上，静置，根据检测线和质控线的颜色变化判断结果，所有检测重复三次。

各金黄色葡萄球菌增菌剂配方对应的检测结果见表1，由表1可知，本发明增菌剂配方最佳，可检出浓度为250 cfu/ml，灵敏度最高，显色背景清晰。

不同的金黄色葡萄球菌裂解剂的效果比较：

不同的金黄色葡萄球菌裂解剂如下，所述百分比为体积百分比，也可见表3：

1) 4%、2%、1%、0.5%的Triton X-100水溶液；

2) 4%、2%、1%、0.5%的Tween 80水溶液；

3) 4%、2%、1%、0.5%的EDTA-2Na水溶液；

4) 2%、1%、0.5%、0.25%的SDS水溶液；

5) 体积比分别1：4、1：1的TritonX-100：Tween 80的水溶液。

采用实施例8的快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，分别以上述不同的金黄色葡萄球菌裂解剂替代实施例5的金黄色葡萄球菌裂解剂，分别采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌，分析各金黄色葡萄球菌增菌剂的效果，检测步骤同灵敏度试验。

检测结果见表2，由表2可知，本发明裂解剂成分TritonX-100、Tween 80具有协同作用，效果优于TritonX-100、Tween 80单独使用，且优于其它的裂解液，且本发明本发明裂解剂成分TritonX-100、Tween 80配比要优于1：4，1：1的配比。

快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒灵敏度试验：

将10⁸cfu/ml金黄色葡萄球菌用生理盐水分别稀释成1:10、1：100、1：1000，1：10000的浓度，得不同浓度的金黄色葡萄球菌液。采用实施例8的试剂盒分别检测上述不同浓度的金黄色葡萄球菌液，检测步骤如下：

2) 取不同浓度的金黄色葡萄球菌液1ml，加入到4ml增菌液中，混匀，置于37℃震荡培养箱中培养6h，震荡速度为250r/min，得样品增菌液；

4) 将80μL的检测液加到免疫层析试纸的样品垫上，静置15min，根据检测线和质控线的颜色变化判断结果，所有检测重复三次。

同时，以阴性对照作为参考，检测结果见图2，图2从左至右，第1、2个试剂盒为阴性样本检测结果，第3、4个试剂盒为10⁷cfu/ml金黄色葡萄球菌液检测结果，第5、6个试剂盒为10⁶cfu/ml金黄色葡萄球菌液，第7、8个试剂盒为10⁵cfu/ml金黄色葡萄球菌液，第9、10个试剂盒为10⁴cfu/ml金黄色葡萄球菌液，检测得到快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒的灵敏度是6×10⁵cfu/ml。

快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒特异性试验：

分别将沙门氏菌CMCC（B）50071、阪崎肠杆菌ATCC29544、副溶血弧菌ATCC17802、蜡样芽孢杆菌CMCC（B）63303、大肠杆菌O157NCTC12900、大肠杆菌CMCC（B）44102用生理盐水稀释成1:10（体积比），得不同的菌液。采用实施例8的试剂盒分别检测上述不同菌液，检测方法同灵敏度试验，实验结果见图3，图3从左至右的试剂盒依次为阴性对照、检验沙门氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌的试剂盒，由图3可知，本发明试剂盒与沙门氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌没有交叉反应，本发明快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒特异性良好。

快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒精密度分析试验：

将金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003用生理盐水稀释成1:10（体积比），得金黄色葡萄球菌液。采用实施例8的试剂盒检测上述金黄色葡萄球菌液，检测方法同灵敏度试验，检测重复10次。结果：10次检测中有9次显示阳性，1次信号偏弱，显色深度浅。可见，本发明快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒的精密度良好。

快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒加速稳定性试验：

将实施例8的试剂盒的金黄色葡萄球菌免疫层析试纸放在37℃烘箱中，将金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003用生理盐水稀释成6×10⁷cfu/ml、6×10⁶cfu/ml、6×10⁵cfu/ml三个梯度的金黄色葡萄球菌液每隔5天用三个梯度的菌液分别检测，检测方法同灵敏度试验，观察实施例8的试剂盒的显色效果。

结果：金黄色葡萄球菌免疫层析试纸在37℃烘箱存放45天，其灵敏度没有明显下降，特异性良好。

快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒应用试验：

采用实施例8的试剂盒检测真实样本——速冻食品，步骤如下：

2) 按1：20的质量比将增菌剂溶于水中，得增菌液；

3) 将样品匀液1ml，加入到4ml增菌液中，混匀，置于37℃震荡培养箱中培养6h，震荡速度为250r/min，得样品增菌液；

4) 取2.5ml样品增菌液，加入50μL的金黄色葡萄球菌裂解剂充分混匀后，静置5min，得检测液；

5) 将80μL的检测液加到免疫层析试纸的样品垫上，静置15min，根据检测线和质控线的颜色变化判断结果，所有检测重复三次，在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线同时出现红色带说明检测结果为阳性，质控线出现红色带、检测线不出现红色带说明检测结果为阴性，质控线不出现红色带说明检测结果无效。

6) 用国标法GB 19295-2011验证样品的检测结果。

速度食品有利口福包子、甲天下水饺、欣得糯米鸡、甲天下汤圆，检测实验分两组，一组为正常组，直接购买的食品，另一组为加菌组，在直接购买的食品中加入10⁸cfu/ml金黄色葡萄球菌1ml，试验结果见表3，由表3可知，本发明试剂盒检测结果与国标法吻合。

Claims

1.一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括增菌剂、免疫层析试纸及裂解剂；

所述裂解剂是由Triton X-100、Tween-80组成的水溶液；

所述免疫层析试纸包括面板及与其紧密扣合的底板，面板包括吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述金标垫与吸水垫分别紧密连接于硝酸纤维素膜的两端，样品垫紧密连接于金标垫；所述金标垫上含有金黄色葡萄球菌蛋白A抗体标记胶体金探针，所述硝酸纤维素膜上载有相互分离的检测线和质控线。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述裂解剂，按体积百分含量计算，由如下组分组成：Triton X-100 30～50%、Tween-80 7.5～15%，余量为水。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述增菌剂由如下重量份组份组成：胰蛋白胨20份、牛肉浸出粉10份、酵母浸粉8份、葡萄糖0.5份、氯化钠3份、氯化锂2份、磷酸氢二钠0.8份、纯化水1000份。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：免疫层析试纸的底板采用PVC板材料。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：免疫层析试纸的吸水垫采用纯植物纤维的纯白滤纸材料。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：免疫层析试纸的硝酸纤维素膜采用进口的135NC膜材料。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：免疫层析试纸的金标垫和样品垫采用亲水的玻璃纤维材料。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：检测线由兔IgG抗体喷涂而成，质控线由羊抗鸡IgG抗体喷涂而成。

9.一种快速检测速冻食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：使用权利要求1～8任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

1)将固体样品加入到生理盐水中，制成样品质量浓度为10%的样品匀液，或将液体样品加入到生理盐水中，制成样品体积浓度为10%的样品匀液；

2)按1：20的质量比将增菌剂溶于水中，得增菌液；

3)将样品匀液与增菌液按1：4的体积比混匀，37℃震荡培养6h，得样品增菌液；

4)按50：1的体积比向样品增菌液中加入裂解剂，混匀，静置5min，得检测液；

5)将检测液加到免疫层析试纸的样品垫上，静置，根据检测线和质控线的颜色变化判断结果。