CN101659992B - 食品中5种新出现致病菌的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种用于食品中5种新出现致病菌的检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括5种检测溶液，其中均含有10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl2、dNTP各2.5mM及Taq DNA聚合酶5U/μL；此外，检测溶液A、B、C、D或E中还分别含有香港海鸥型菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、类志贺邻单胞菌或梅氏弧菌特异性引物对各10μM。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测食品中的香港海鸥型菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、类志贺邻单胞菌及梅氏弧菌，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。

Description

食品中5种新出现致病菌的检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及用于食品中5种新出现致病菌，即香港海鸥型菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、类志贺邻单胞菌及梅氏弧菌检测的试剂盒及检测方法，尤其涉及基于PCR-DHPLC的快速检测试剂盒和检测方法。

背景技术

食品微生物存在水产品、肉制品、乳制品等各种食品中广泛存在，对于微生物的快速检测技术的研究，是食品安全工作者们一直努力的方向。从文献报道来看，人们的研究主要集中在几种常见的微生物项目上，如沙门氏菌、单增李氏菌等，但对于梅氏弧菌、河流弧菌、类志贺邻单胞菌、香港海鸥型菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌等的研究相对较少，对其在食品中的存在方式及其对人类造成的疾病危害也知之甚少。但它们对人类健康的危害是不可小觑的：Elhadi等对马来西亚市售海产品进行致病性弧菌的研究，发现梅氏弧菌占检出致病弧菌总量的9.9％。刘秀梅等报告了青岛黄岛区1990年5～10月间，从腹泻病人、海水、海产品等299份标本中分离出30株梅氏弧菌；其研究表明，梅氏弧菌是一类动物传染性微生物，可通过食物链传染给人类。因此应对该类菌进行广泛而深入地快速检测技术研究。

梅氏弧菌(Vibrio Metschnikovii)又称麦氏弧菌，是一种致病性弧菌，广泛存在于河流、海湾和下水道中，同时在人群和动物肠道中可分离到。国内关于梅氏弧菌引起食物中毒的报道较少。近年来，张铭汉等和曲飞等报道一起因食用梅氏弧菌污染的食品引起的中毒，周智凯等报道2000年4月一起因进食被梅氏弧菌污染的肉丸而引起的某小学集体食物中毒，沈强对该小学发生集体食物中毒的样品检出梅氏弧菌。梅氏弧菌引起的食物中毒症状主要表现为腹部不适、腹痛(主要出现在肚脐周围)、恶心、呕吐、腹泻，个别人还会发烧。目前国内外对于梅氏弧菌的检测研究报道很少，采用的研究方法包括经典的培养生化鉴定方法及基于生化原理的ATB细菌鉴定仪法，但未见开展PCR及相关技术快速检测梅氏弧菌的研究报道。传统的培养生化鉴定方法存在着检测周期长、步骤繁琐、生化反应不稳定等缺点，食品微生物学检测工作者们都致力于研究建立快速、简便的检测方法，以确保食品安全。

香港海鸥菌(Laribacter hongkongensis，LH)是一种新的食源性致病菌。该菌最先于2001年由香港大学医学院微生物学系袁国勇教授和胡钊逸副教授等在从入院的肝硬化病人的血液和胸腔脓液中分离得到。LH为变形菌门(Proteobacteria)、变形菌纲(Betaproteobacteria)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)的一个新属，最初命名为HKU1。之后又相继在多名香港腹泻病人的粪便中分离到该菌，将其命名为香港海鸥菌。经鉴定该菌为兼性厌氧，不产芽孢，革兰染色阴性，海鸥型或螺旋型杆状，在绵羊血琼脂培养基上不发生溶血反应。典型的菌落特征在CMA(头孢哌酮麦康凯)培养基上呈无色、透明、扁平状，边缘光滑整齐，直径在0.5mm～1mm之间的微小菌落。菌落挑取时与琼脂面无粘连。香港海鸥菌只存在淡水鱼中，在其他肉类食品中未发现有该菌的存在。中国四大著名的淡水鱼种，草、青、鲢、鳙，均有报道检出。其中最多的是草鱼和鳙鱼。食用了未经煮熟的被该菌污染的鱼肉或是被交叉污染的食物，可引起人们腹泻。临床表现与沙门氏菌和空肠弯曲菌引起的病症相似，大部分病人出现水样腹泻，偶有血便，是近20年来医学界发现的首种可引起致病人腹泻，甚至严重肠胃炎的新的致病菌。目前该菌的感染病例在香港、中国大陆、日本、瑞士、非洲及中美洲相继被发现，已显示在全球广泛存在。调查得知，约有25％的淡水鱼中存在香港海鸥菌。

类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。经常存在于水中，也存在于人和动物的肠道中。本菌与宋内氏志贺氏菌有共同抗原，能被宋内氏志贺氏菌的抗血清所凝集。可引起急性胃肠炎、也可引起骨髓炎、脑膜炎、蜂窝组织炎及菌血症。经鉴定该菌为圆端的直杆菌，0.8～1.0μm×3.0μm。革兰氏阴性。通常以极生鞭毛运动。兼性厌氧，化能异养菌。具有呼吸和发酵代谢类型，最适生长温度37℃。对葡萄糖和其他糖类能产酸但不产气。氧化酶和接触酶皆阳性。产吲哚。V-P阴性。赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶皆阳性。脂酶阴性。还原硝酸盐。大多数菌株对弧菌抑制剂2，4-二氨基-6，7-异丙基喋啶(O/129)敏感。具有肠杆菌科的共同抗原。出现于鱼和其他水生动物和各种哺乳动物。与腹泻有关，偶尔也是人的条件致病菌。

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。粘质沙雷氏菌又称灵杆菌，为细菌中最小者，约0.5×(0.5～1.0)微米。周身鞭毛，能运动。无荚膜，无芽胞，在普通琼脂平板上25～30℃培养1～2天出现粘性、中心颗粒状、有恶臭的菌落。约半数菌株能产生红色的灵菌素(prodigiosin)，在室温条件下易促进色素的生成。有46个血清型，血清型与色素产生无关。粘质沙雷氏菌是临床上常见的条件致病菌，在机体免疫功能降低时可引起肺部和尿道感染以及败血症。尤其在类固醇类激素，免疫抑制药造成机体免疫力降低时，容易发病。

气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中，能产生非水溶性黄、紫和红色素的革兰氏染色阴性小杆菌。细胞直杆状，直径0.5-0.8微米，长0.9-2.0微米，端圆。符合肠杆菌科的一般描述。通常周生鞭毛运动。兼性厌氧。菌落大多数不透明，有些虹彩；白色、粉红或红色。几乎所有的菌株能在10-36℃、pH5-9、含有0-4％(W/V)的NaCl中生长。这些菌分布在自然界(土壤、水、植物表面)中或作为人的条件致病菌。

目前，针对食品微生物的快速检测技术主要包括：基于PCR基础的凝胶电泳法、实时荧光PCR法、荧光免疫检测法(VIDAS)、胶体金免疫测试条和基因芯片测试法等，这些技术方法都存在的各自的优缺点和应用范围的局限性。PCR电泳技术存在着操作步骤繁琐、极易引发污染的问题，且目前未见采用基于PCR技术检测食品中梅氏弧菌、类志贺邻单胞菌、香港海鸥型菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌等8种微生物的文献报道；实时荧光PCR技术存在着测试成本高、能够检测的目标菌范围小的问题；荧光免疫检测技术(VIDAS)技术存在着测试成本高、能够检测的目标菌范围很小的问题；胶体金免疫测试技术存在着假阳性率高、能够检测的目标菌范围更小的问题；基因芯片技术检测技术能够检测的范围也很有限，并且测试成本高、距离实际应用仍存在着尚未解决的技术瓶颈问题。使用传统的微生物检测方法耗时长、操作复杂，不宜做大批量样本的检测，在类似食品和化妆品等其他需大批量检测的方面，传统的检测方法暴露出其种种弊端。而在临床上由于检测的时间长更可能会导致延迟诊断和治疗。

基于上述事实，急需建立针对食品中5种新出现致病菌，即香港海鸥型菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、类志贺邻单胞菌及梅氏弧菌的高效、快捷、简便的检测方法。

发明内容

本发明首先提供用于快速检测食品中香港海鸥型菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、类志贺邻单胞菌及梅氏弧菌的基于PCR-DHPLC检测的试剂盒。

食品中5种新出现致病菌的检测试剂盒，该试剂盒包括5种检测溶液，这5种检测溶液中均含有10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM及Taq DNA聚合酶5U/μL；

检测溶液A中还含有香港海鸥型菌引物对10μM；

检测溶液B中还含有粘质沙雷氏菌引物对10μM；

检测溶液C中还含有气味沙雷氏菌引物对10μM；

检测溶液D中还含有类志贺邻单胞菌引物对10μM；

检测溶液E中还含有梅氏弧菌引物对10μM；

其中，各个菌株的引物对序列如下：

本发明还提供了利用上述试剂盒检测食品中5种新出现致病菌的方法，包括如下步骤：

①PCR反应：取1μl待测样品DNA溶液，根据检测目标菌加入相应的检测溶液10μl和14μl灭菌超纯水，总体积25μl；将以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR循环：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

②将PCR扩增产物进行DHPLC分析：

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，48.0％缓冲溶液A，52.0％缓冲溶液B；

                0.5min，42.9％缓冲溶液A，57.1％缓冲溶液B；

                2.4min，40.1％缓冲溶液A，59.9％缓冲溶液B；

                4.3min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B；

                6.1min，36.9％缓冲溶液A，63.1％缓冲溶液B；

                8.0min，36.0％缓冲溶液A，64.0％缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。

检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定样品的染菌情况。

本发明采用PCR-DHPLC技术，针对食品中5种新出现致病菌建立灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测食品中的香港海鸥型菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、类志贺邻单胞菌及梅氏弧菌，并且检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。

附图说明

本发明附图5幅，

图1是梅氏弧菌特异性检测的DHPLC图谱，其中，1是梅氏弧菌；2～8.分别为副溶血性弧菌，霍乱弧菌，溶藻性弧菌，创伤弧菌，河流弧菌，拟态弧菌，解蛋白弧菌和嗜水气单胞菌

图2是粘质沙雷氏菌特异性检测的DHPLC图谱，其中，1是粘质沙雷氏菌ATCC 14040，2是粘质沙雷氏菌分离株，3是气质沙雷氏菌ATCC 33077；

图3是气质沙雷氏菌特异性检测的DHPLC图谱，其中，1是气质沙雷氏菌ATCC 33077，2是气质沙雷氏菌分离株，3～7分别为粘质沙雷氏菌、液质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌和沙门氏菌；

图4是香港海鸥型菌特异性检测的DHPLC图谱，其中，1～3是香港海鸥型菌；4～8分别是金黄色葡萄球菌，嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌，河流弧菌和梅氏弧菌；

图5是类志贺邻单胞菌特异性检测的DHPLC图谱。

上述附图中，横坐标均为保留时间(单位：分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位：毫伏mV)。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。

若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为：营养肉汤培养液，普通琼脂培养平板，以及本部分所使用的各菌株的增菌、分离和生化鉴定培养基等均按照相关的国家标准(GB)、检验检疫行业标准(SN)或国际权威标准方法中的配方，购于美国BD公司。

细菌基因组DNA提取试剂(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNAExtraction kit)及Ex Taq等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司。

本部分所使用的标准菌株分分别购自美国ATCC标准生物品收藏中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。

实施例1、食品中5种新出现致病菌的检测试剂盒及检测方法的建立

(1)引物的设计、合成与试剂盒的组装，如表1所述：

表1

在此基础上，设计用于PCR-DHPLC检测的试剂盒：

该试剂盒中包括5种检测溶液，分别针对香港海鸥型菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、类志贺邻单胞菌、梅氏弧菌进行检测，依次标注为检测溶液A、B、C、D、E，其中：

检测溶液A中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5000U(5U/μL)及表1中所述的香港海鸥型菌引物对10μM；

检测溶液B中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5000U(5U/μL)及表1中所述的粘质沙雷氏菌引物对10μM；

检测溶液C中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5000U(5U/μL)及表1中所述的气味沙雷氏菌引物对10μM；

检测溶液D中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5000U(5U/μL)及表1中所述的类志贺邻单胞菌引物对10μM；

检测溶液E中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5000U(5U/μL)及表1中所述的梅氏弧菌引物对10μM；

(2)PCR-DHPLC检测方法的建立

本检测方法使用本实施例建立的PCR-DHPLC检测的试剂盒，包括如下步骤：

①待检样品的制备：

a.食品样品：无菌方法称取25克样品于225mL胰蛋白胨大豆肉汤中培养18～24h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。

b.标准菌株：弧菌菌株挑取单个菌落于3％NaCl营养肉汤中培养18～24h；其他菌株于普通营养肉汤中培养18～24h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。

②PCR扩增：

取1μl待测样品DNA溶液，根据检测目标菌加入相应的检测溶液10μl和14μl灭菌超纯水，总体积25μl；将以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR循环：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min。

③DHPLC分析：

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，48.0％缓冲溶液A，52.0％缓冲溶液B；

                0.5min，42.9％缓冲溶液A，57.1％缓冲溶液B；

                2.4min，40.1％缓冲溶液A，59.9％缓冲溶液B；

                4.3min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B；

                6.1min，36.9％缓冲溶液A，63.1％缓冲溶液B；

                8.0min，36.0％缓冲溶液A，64.0％缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。

实施例2、检测方法特异性试验

按照实施例1所建立的分析条件，分别对35种微生物进行PCR-DHPLC特异性试验。

(1)梅氏流弧菌的特异性试验结果

选取梅氏弧菌的近源种菌株28株和非近源种菌株24株，按照实施例1所建立的方法和条件进行PCR-DHPLC检测。

所选取的近源种菌株包括：副溶血性弧菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、解蛋白弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌等菌株的标准株及分离株共28株。

所选取的非近源种菌株包括：单核细胞增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶血性链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗劳地柠檬酸杆菌、腊样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌、绵羊李斯特氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。

试验结果显示：只有梅氏弧菌出现阳性吸收峰。附图1显示了部分菌种的检测结果图谱，其中保留时间为3.6min的吸收峰为梅氏弧菌的阳性吸收峰。为了证实该阳性吸收峰为梅氏弧菌基因的片段，我们将DHPLC的阳性吸收峰产物回收后进行了克隆和测序，结果与梅氏弧菌DNA比对，证明了DHPLC阳性吸收峰为梅氏弧菌基因的片段。

上述结果说明，实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法对梅氏弧菌有很高的检测特异性。

(2)粘质沙雷氏菌的特异性试验结果

取粘质沙雷氏菌等41株参考菌株的DNA模板库，按照实施例1所述的方法和条件进行PCR-DHPLC检测。所选取的菌株包括粘质沙雷氏菌、气质沙雷氏菌、液质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌，嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌，河流弧菌，梅氏弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、解蛋白弧菌、类志贺邻单胞菌、单核细胞增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、福氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶血性链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗劳地柠檬酸杆菌、腊样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌、绵羊李斯特氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。

试验结果显示：只有粘质沙雷氏菌出现阳性吸收峰，而非粘质沙雷氏菌检测结果均为阴性。附图2显示了部分菌种的检测结果图谱，其中粘质沙雷氏菌的吸收峰如线1和线2所示，而与粘质沙雷氏菌近缘的气质沙雷氏菌则无阳性吸收峰，如线3所示。保留时间为4.8min的吸收峰为粘质沙雷氏菌的阳性吸收峰。

上述结果表明：实施例1所建立的PCR-DHPLC检测方法中对粘质沙雷氏菌有很高的检测特异性。

(3)气质沙雷氏菌的特异性试验结果

取气质沙雷氏菌等41株参考菌株的DNA模板库，按照实施例1所述的方法和条件进行PCR-DHPLC检测。所选取的菌株包括气质沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、液质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌，嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌，河流弧菌，梅氏弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、解蛋白弧菌、类志贺邻单胞菌、单核细胞增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、福氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶血性链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗劳地柠檬酸杆菌、腊样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌、绵羊李斯特氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。

试验结果显示：只有气质沙雷氏菌出现阳性吸收峰，而非气质沙雷氏菌检测结果均为阴性。附图3显示了部分菌种的检测结果图谱，其中气质沙雷氏菌的吸收峰如线1和线2所示。保留时间为4.9min的吸收峰为气质沙雷氏菌的阳性吸收峰。

上述结果表明：实施例1所建立的PCR-DHPLC检测方法中对气质沙雷氏菌有很高的检测特异性。

(4)香港海鸥型菌的特异性试验结果

取香港海鸥型菌等43株参考菌株的DNA模板库，按照实施例1所述的方法和条件进行PCR-DHPLC检测。所选取的菌株包括香港海鸥型菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、福氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶血性链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗劳地柠檬酸杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、腊样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌、绵羊李斯特氏菌、气质沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、液质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌，嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌，河流弧菌，梅氏弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、解蛋白弧菌、类志贺邻单胞菌。

试验结果显示：只有香港海鸥型菌出现阳性吸收峰，而非香港海鸥型菌检测结果均为阴性。附图4显示了部分菌种的检测结果图谱，其中保留时间为4.5min的吸收峰为香港海鸥型菌的阳性吸收峰。

上述结果表明：实施例1所建立的PCR-DHPLC检测方法中对香港海鸥型菌有很高的检测特异性。

(5)类志贺邻单胞菌的特异性试验结果

取类志贺邻单胞菌等41株参考菌株的DNA模板库，按照实施例1所述的方法和条件进行PCR-DHPLC检测。所选取的菌株包括类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌，气质沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、液质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌，荧光假单胞菌，河流弧菌，梅氏弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、解蛋白弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、福氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶血性链球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗劳地柠檬酸杆菌、腊样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌、绵羊李斯特氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。

试验结果显示：只有类志贺邻单胞菌出现阳性吸收峰，而非类志贺邻单胞菌检测结果均为阴性。附图5显示了类志贺邻单胞菌的检测结果图谱，其中保留时间为3.3min的吸收峰为类志贺邻单胞菌的阳性吸收峰。

上述结果表明：实施例1所建立的PCR-DHPLC检测方法中对类志贺邻单胞菌有很高的检测特异性。

实施例3、检测灵敏度试验

(1)梅氏弧菌检测灵敏度试验

取梅氏弧菌标准菌株36℃培养24h，采用以平板计数方式为对比的灵敏度试验方法，对各稀释梯度分别提取制备模板DNA进行PCR-DHPLC检测，结果见表2所示。计数为7600CFU/mL、790CFU/mL和76CFU/mL的梅氏弧菌均检测到了阳性吸收峰，而5CFU/mL浓度则未检测到阳性吸收峰。试验结果表明，本研究所建立的方法可检出梅氏弧菌标准菌株的10^-6浓度梯度，即检测灵敏度可达到76CFU/mL。

表2

a：7个梯度之间的稀释倍数为10倍；

b：平板计数结果为两个平行平板计数结果的平均值。

(2)粘质沙雷氏菌检测灵敏度试验

取粘质沙雷氏菌标准菌株36℃培养24h，采用以平板计数方式为对比的灵敏度试验方法，对各稀释梯度分别提取制备模板DNA进行PCR-DHPLC检测，结果见表3所示。计数为840CFU/mL、84 CFU/mL的粘质沙雷氏菌均检测到了阳性吸收峰，而10CFU/mL浓度则未检测到阳性吸收峰。试验结果表明，本研究所建立的方法可检出粘质沙雷氏菌标准菌株的10^-6浓度梯度，即检测灵敏度可达到80CFU/mL。

a：7个梯度之间的稀释倍数为10倍；

b：平板计数结果为两个平行平板计数结果的平均值。

(3)气质沙雷氏菌检测灵敏度试验

取气质沙雷氏菌标准菌株36℃培养24h，采用以平板计数方式为对比的灵敏度试验方法，对各稀释梯度分别提取制备模板DNA进行PCR-DHPLC检测，结果见表4所示，计数为2400CFU/mL和210CFU/mL的气质沙雷氏菌均检测到了阳性吸收峰，而25CFU/mL浓度则未检测到阳性吸收峰。试验结果表明，本研究所建立的方法可检出气质沙雷氏菌标准菌株的10^-6浓度梯度，即检测灵敏度可达到210CFU/mL。

表4

a：7个梯度之间的稀释倍数为10倍；

b：平板计数结果为两个平行平板计数结果的平均值。

(4)香港海鸥型菌检测灵敏度试验

取香港海鸥型菌标准菌株36℃培养24h，采用以平板计数方式为对比的灵敏度试验方法，对各稀释梯度分别提取制备模板DNA进行PCR-DHPLC检测，结果见表5所示，计数为650CFU/mL和65CFU/mL的香港海鸥型菌均检测到了阳性吸收峰，而10CFU/mL浓度则未检测到阳性吸收峰。试验结果表明，本研究所建立的方法可检出香港海鸥型菌标准菌株的10^-6浓度梯度，即检测灵敏度可达到65CFU/mL。

表5

a：7个梯度之间的稀释倍数为10倍；

b：平板计数结果为两个平行平板计数结果的平均值。

(5)类志贺邻单胞菌检测灵敏度试验

取类志贺邻单胞菌标准菌株36℃培养24h，采用以平板计数方式为对比的灵敏度试验方法，对各稀释梯度分别提取制备模板DNA进行PCR-DHPLC检测，结果见表6所示，计数为3700CFU/mL和370CFU/mL的类志贺邻单胞菌均检测到了阳性吸收峰，而45CFU/mL浓度则未检测到阳性吸收峰。试验结果表明，本研究所建立的方法可检出类志贺邻单胞菌标准菌株的10^-6浓度梯度，即检测灵敏度可达到370CFU/mL。

表6

a：7个梯度之间的稀释倍数为10倍；

b：平板计数结果为两个平行平板计数结果的平均值。

实施例4、检测试剂盒及检测方法在实际样品检测中应用试验

(1)在梅氏弧菌实际检测中的应用

本实施例从市售的蝶鱼、进口的鱿鱼中分离出的2株可疑梅氏弧菌，该2株菌的主要生理生化特征为革兰氏染色阴性，TCBS上生长呈黄色，在0％N aCl及10％N aCl胨水中均不生长，在3％、6％、8％盐胨水中生长良好。氧化酶阴性，能发酵葡萄糖、甘露糖，甘露醇产酸不产气；B半乳糖苷、鼠李糖阴性；不分解乳糖、水杨苷、肌醇；靛基质、赖氨酸脱羧酶阳性；硝酸盐还原阴性；尿素阴性，有动力。上述反应都符合梅氏弧菌的生化特性。经实施例1的PCR-DHPLC检测均为阳性。

为了证实该分离株的阳性吸收峰确实为梅氏弧菌infC基因的片段，我们将其中的一个DHPLC阳性吸收峰产物回收后进行了克隆和测序(编号080712.1)，结果与Genbank中梅氏弧菌(Genbank编号：AY014398.2)DNA序列(基因位点：1150～1409)比对。结果两者序列的符合率为100％，证明该分离株的DHPLC阳性吸收峰为梅氏弧菌infC基因的片段。

(2)在香港海鸥型菌实际检测中的应用

取1株从实际检测样品中分离出的所留存的香港海鸥型菌分离菌株的DNA进行PCR-DHPLC的验证试验，结果该1株香港海鸥型菌分离株均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，以沙门氏菌为阴性对照的检测结果则为阴性。

结果表明：实施例1所建立的PCR-DHPLC检测香港海鸥型菌的方法，具有很好的符合性和结果重现性。

(3)在粘质沙雷氏菌实际检测中的应用

取3株从实际检测样品中分离出的所留存的粘质沙雷氏菌分离菌株的DNA进行PCR-DHPLC的验证试验，结果该3株粘质沙雷氏菌分离株均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，以沙门氏菌为阴性对照的检测结果则为阴性。

结果表明：实施例1所建立的PCR-DHPLC检测乳酸杆菌的方法，具有很好的符合性和结果重现性。

(4)在气味沙雷氏菌实际检测中的应用

取2株从实际检测样品中分离出的所留存的气味沙雷氏菌分离菌株的DNA进行PCR-DHPLC的验证试验，结果该2株气味沙雷氏菌分离株均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，以沙门氏菌为阴性对照的检测结果则为阴性。

结果表明：实施例1所建立的PCR-DHPLC检测乳酸杆菌的方法，具有很好的符合性和结果重现性。

(5)在类志贺邻单胞菌实际检测中的应用

取1株从实际检测样品中分离出的所留存的类志贺邻单胞菌分离菌株的DNA进行PCR-DHPLC的验证试验，结果该1株类志贺邻单胞菌分离株均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，以沙门氏菌为阴性对照的检测结果则为阴性。

结果表明：本研究建立的PCR-DHPLC检测类志贺邻单胞菌的方法，具有很好的符合性和结果重现性。

Claims (2)

1.食品中5种新出现致病菌的检测试剂盒，其特征在于由5种检测溶液组成，分别为检测溶液A、B、C、D、E，这5种检测溶液中均含有10mM Tris·C1、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM及Taq DNA聚合酶5U/μL；

检测溶液A中还含有香港海鸥型菌引物对10μM；

检测溶液B中还含有粘质沙雷氏菌引物对10μM；

检测溶液C中还含有气味沙雷氏菌引物对10μM；

检测溶液D中还含有类志贺邻单胞菌引物对10μM；

检测溶液E中还含有梅氏弧菌引物对10μM；

其中，各个菌株的引物对序列如下：

2.食品中5种新出现致病菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：：

①PCR反应：取1μl待测样品DNA溶液，根据检测目标菌加入相应的检测溶液10μl和14μl灭菌超纯水，总体积25μl；将以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR循环：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

②将PCR扩增产物进行DHPLC分析：

色谱柱：PS-DVB&C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，48.0％缓冲溶液A，52.0％缓冲溶液B；

0.5min，42.9％缓冲溶液A，57.1％缓冲溶液B；

2.4min，40.1％缓冲溶液A，59.9％缓冲溶液B；

4.3min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B；

6.1min，36.9％缓冲溶液A，63.1％缓冲溶液B；

8.0min，36.0％缓冲溶液A，64.0％缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。

Images