CN112877449A - 动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法 - Google Patents

动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法 Download PDF

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CN112877449A CN202110299219.6A CN202110299219A CN112877449A CN 112877449 A CN112877449 A CN 112877449A CN 202110299219 A CN202110299219 A CN 202110299219A CN 112877449 A CN112877449 A CN 112877449A
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pcr
pcr amplification
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food
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邓景致
潘百玲
李志江
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Heilongjiang Bayi Agricultural University
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    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本发明涉及的是动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法，它在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的四种致病菌，四种致病菌为大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌；具体包括：步骤一、待检食品样品处理；步骤二、设计PCR引物，建立多重PCR扩增的PCR反应体系；步骤三、多重PCR检测，将多重PCR扩增的PCR反应体系进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物，进行检测是否存在大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌。本发明四种细菌多重PCR检测灵敏度在103~106 cfu/mL。

Description

动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
一、技术领域：
本发明涉及食品检测领域，具体涉及的是动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法。
二、背景技术：
细菌性食物中毒占我国食物中毒总数的首位，动物性食品是引起细菌性食物中毒的主要原因。目前对食品中致病菌检测的方法以微生物常规培养法为主，需要3~7天，操作繁琐，所用试剂复杂多样，费用很高，不能满足实际商品流通需要。PCR（聚合酶链式反应）技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速的特点，使用PCR技术检测食品中致病菌的研究方兴未艾。大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌是污染动物性食品的四种重要的致病菌。
三、发明内容：
本发明的目的是提供一种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法，这种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法用于解决现有技术中食品中致病菌检测的方法操作繁琐，所用试剂复杂多样，费用很高的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法是在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的四种致病菌，四种致病菌为大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌；具体包括如下步骤：
步骤一、样品处理：
取待检食品样品1g(mL)加入到9 mL灭菌LB液体培养基中37℃，120r/min振荡培养， 6 h后，取1mL培养液用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，作为多重PCR检测模板；
步骤二、建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：
2.1 PCR引物设计：PCR扩增菌特异靶基因的选用：大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly，小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail，荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX；
根据大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA的特异位点设计两条特异引物，并组成第一对引物：
上游引物eaeA-s2：CACCAGAGGAATCGGAGTA （SEQ ID NO:1）
下游引物eaeA-a2：CTGAAAGCGAAATGATGAAG （SEQ ID NO:2）
根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly的特异位点设计两条特异引物，并组成第二对引物：
上游引物hly-s1：TTCGGCAAAGCTGTTACTA （SEQ ID NO:3）
下游引物hly-a1：GGCAAATAGATGGACGATG （SEQ ID NO:4）
根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引物，并组成第三对引物：
上游引物ail-s1：TGAAGTACCGTTATGAACTCG （SEQ ID NO:5）
下游引物ail-a1：TGACTTAACCTTTCCGTGAG （SEQ ID NO:6）
根据荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX的特异位点设计两条特异引物，并组成第四对引物：
上游引物htpX-s1：TTCTGTGCGGTCTTTGGT （SEQ ID NO:7）
下游引物htpX-a1：AGGTAGTAGGCGATGC （SEQ ID NO:8）
2.2建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：
多重PCR扩增PCR反应体系包括: 以50μL溶液计,5 μL 10×PCR反应缓冲液, 5µl浓度为2mM 的dNTP， 5u/μL Taq酶1μL， 4μL多重PCR检测模板，3 μL浓度为25mM 的MgCl2，浓度为25uM的第一对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第二对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第三对上、下引物各为2μL，浓度为25uM的第一对上、下引物各为2μL，余量为超纯水；
步骤三、多重PCR检测：
将多重 PCR扩增的PCR反应体系进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物，若PCR扩增产物中存在866bp的DNA片段，表明所述待检食品中有大肠埃希氏菌；若PCR扩增产物中存在605bp的DNA片段，表明所述待检食品中有单核细胞增生李斯特氏菌；若PCR扩增产物中存在461bp的DNA片段，表明所述待检食品中有荧光假单胞菌；若PCR扩增产物中存在209bp的DNA片段，表明所述待检食品中有小肠结肠炎耶尔森氏菌。
上述方案中PCR扩增反应的条件为：在PCR仪上进行扩增反应，反应热循环参数为：94℃预变性4 min，94℃变性45 s，56℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸4min。
有益效果：
1、本发明结合通用前增菌技术研究，建立了一种多重PCR检测新方法，可以在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的这四种致病菌。该方法具有特异性良好、简便快速、经济实用的优点。
2、本发明建立了大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌的单重和多重PCR检测方法，并确定了多重PCR体系和热循环参数。经实验证实了所建立的方法特异性很强。
3、本发明四种细菌多重PCR检测灵敏度在103 ~106 cfu/mL。
四、附图说明：
图1为模拟食品样品的多重PCR检测结果。
五、具体实施方式：
下面对本发明做进一步的说明：
这种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法是在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的四种致病菌，四种致病菌为大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌；具体包括如下步骤：
步骤一、样品处理：
取待检食品样品1g(mL)加入到9 mL灭菌LB液体培养基中37℃，120r/min振荡培养， 6 h后，取1mL培养液用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，作为多重PCR检测模板。LB肉汤培养基(1L)的制备：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。用玻璃棒搅拌均匀，完全溶解后，用10mol•L-1 NaOH调pH至7.0，加入蒸馏水至总体积为1L，分装后0.1~0.15MPa灭菌20min。
步骤二、建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：
2.1 PCR引物设计：PCR扩增菌特异靶基因的选用：大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly，小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail，荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX；
根据大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA的特异位点设计两条特异引物，并组成第一对引物：
上游引物eaeA-s2：CACCAGAGGAATCGGAGTA
下游引物eaeA-a2：CTGAAAGCGAAATGATGAAG
根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly的特异位点设计两条特异引物，并组成第二对引物：
上游引物hly-s1：TTCGGCAAAGCTGTTACTA
下游引物hly-a1：GGCAAATAGATGGACGATG
根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引物，并组成第三对引物：
上游引物ail-s1：TGAAGTACCGTTATGAACTCG
下游引物ail-a1：TGACTTAACCTTTCCGTGAG
根据荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX的特异位点设计两条特异引物，并组成第四对引物：
上游引物htpX-s1：TTCTGTGCGGTCTTTGGT
下游引物htpX-a1：AGGTAGTAGGCGATGC
2.2建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：
多重PCR扩增PCR反应体系包括: 以50μL溶液计,5 μL 10×PCR反应缓冲液, 5µl浓度为2mM 的dNTP， 5u/μL Taq酶1μL， 4μL多重PCR检测模板，3 μL浓度为25mM 的MgCl2，浓度为25uM的第一对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第二对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第三对上、下引物各为2μL，浓度为25uM的第一对上、下引物各为2μL，余量为超纯水；
步骤三、多重PCR检测：
将多重 PCR扩增的PCR反应体系进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物，若PCR扩增产物中存在866bp的DNA片段，表明所述待检食品中有大肠埃希氏菌；若PCR扩增产物中存在605bp的DNA片段，表明所述待检食品中有单核细胞增生李斯特氏菌；若PCR扩增产物中存在461bp的DNA片段，表明所述待检食品中有荧光假单胞菌；若PCR扩增产物中存在209bp的DNA片段，表明所述待检食品中有小肠结肠炎耶尔森氏菌。
PCR扩增反应的条件为：在PCR仪上进行扩增反应，反应热循环参数为：94℃预变性4 min，94℃变性45 s，56℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸4 min。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测：
配制成1%浓度的琼脂糖凝胶溶液25mL，制备凝胶。取待电泳的PCR扩增产物5 uL与1uL的6×DNA电泳Loading buffer混匀，将混合液缓缓加到上样孔中，加6uL的MarkerD2000做参照。5V/cm的恒定电压进行电泳。
实施例1：
模拟动物性食品样品猪肉和奶，染菌后作为实验检测样品。采集市售生猪肉和牛奶，按《GB/T 4789.02-2003 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》检测合格后，取1g(mL)放入1.5mL无菌离心管中（固体样品须研磨成碎浆）人工污染实验菌：分别接种108cfu/mL浓度的实验菌EC062H，LM077X，YE070X和PF092Q各10μL，4℃保存24 h，得到实验检测样品。
首先进行样品处理：
取实验检测样品1g(mL)加入到9 mL灭菌LB液体培养基中37℃，120r/min振荡培养，在0，2，4，6 h，分别取1mL培养液用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，分别制备模板多重PCR检测模板。
分别组成多重PCR扩增PCR反应体系，包括: 以50μL溶液计,5 μL 10×PCR反应缓冲液, 5µl 浓度为2mM 的dNTP， 5u/μL Taq酶1μL， 4μL多重PCR检测模板，3 μL浓度为25mM的MgCl2，浓度为25uM的第一对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第二对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第三对上、下引物各为2μL，浓度为25uM的第一对上、下引物各为2μL，余量为超纯水。
将各多重 PCR扩增的PCR反应体系进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物，多重PCR检测结果如下：
图1中左图为猪肉，右图为牛奶。从左起分别为: 1，Marker，2~6道依次为阳性对照带，增菌6，4，2，0 h，结果在通用前增菌4 h后可见四条目标条带，与对照条带位置相当。表明此多重PCR方法可以检测模拟动物性食品样品中的大肠埃希氏菌O157：H7，单核细胞增生李斯特氏菌，荧光假单胞菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。
序列表1：
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CACCAGAGGAATCGGAGTA 19
序列表2：
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CTGAAAGCGAAATGATGAAG 20
序列表3：
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
TTCGGCAAAGCTGTTACTA 19
序列表4：
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GGCAAATAGATGGACGATG 19
序列表5：
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TGAAGTACCGTTATGAACTCG 21
序列表6：
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
TGACTTAACCTTTCCGTGAG 20
序列表7：
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
TTCTGTGCGGTCTTTGGT 18
序列表8：
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
AGGTAGTAGGCGATGC 16
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
caccagagga atcggagta 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
ctgaaagcga aatgatgaag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ttcggcaaag ctgttacta 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ggcaaataga tggacgatg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
tgaagtaccg ttatgaactc g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
tgacttaacc tttccgtgag 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
ttctgtgcgg tctttggt 18
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
aggtagtagg cgatgc 16

Claims (2)

1.一种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法，其特征在于：在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的四种致病菌，四种致病菌为大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌；具体包括如下步骤：
步骤一、样品处理：
取待检食品样品1g或1mL加入到9 mL灭菌LB液体培养基中37℃，120r/min振荡培养， 6h后，取1mL培养液用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，作为多重PCR检测模板；
步骤二、建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：
2.1 PCR引物设计：PCR扩增菌特异靶基因的选用：大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly，小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail，荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX；
根据大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA的特异位点设计两条特异引物，并组成第一对引物：
上游引物eaeA-s2：CACCAGAGGAATCGGAGTA （SEQ ID NO:1）
下游引物eaeA-a2：CTGAAAGCGAAATGATGAAG （SEQ ID NO:2）
根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly的特异位点设计两条特异引物，并组成第二对引物：
上游引物hly-s1：TTCGGCAAAGCTGTTACTA （SEQ ID NO:3）
下游引物hly-a1：GGCAAATAGATGGACGATG （SEQ ID NO:4）
根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引物，并组成第三对引物：
上游引物ail-s1：TGAAGTACCGTTATGAACTCG （SEQ ID NO:5）
下游引物ail-a1：TGACTTAACCTTTCCGTGAG （SEQ ID NO:6）
根据荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX的特异位点设计两条特异引物，并组成第四对引物：
上游引物htpX-s1：TTCTGTGCGGTCTTTGGT （SEQ ID NO:7）
下游引物htpX-a1：AGGTAGTAGGCGATGC （SEQ ID NO:8）
2.2建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：
多重PCR扩增PCR反应体系包括: 以50μL溶液计,5 μL 10×PCR反应缓冲液, 5µl 浓度为2mM 的dNTP， 5u/μL Taq酶1μL， 4μL多重PCR检测模板，3 μL浓度为25mM 的MgCl2，浓度为25uM的第一对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第二对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第三对上、下引物各为2μL，浓度为25uM的第一对上、下引物各为2μL，余量为超纯水；
步骤三、多重PCR检测：
将多重 PCR扩增的PCR反应体系进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物，若PCR扩增产物中存在866bp的DNA片段，表明所述待检食品中有大肠埃希氏菌；若PCR扩增产物中存在605bp的DNA片段，表明所述待检食品中有单核细胞增生李斯特氏菌；若PCR扩增产物中存在461bp的DNA片段，表明所述待检食品中有荧光假单胞菌；若PCR扩增产物中存在209bp的DNA片段，表明所述待检食品中有小肠结肠炎耶尔森氏菌。
2.根据权利要求1所述的动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的条件为：在PCR仪上进行扩增反应，反应热循环参数为：94℃预变性4min，94℃变性45 s，56℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸4 min。
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CN101659992A (zh) * 2009-03-20 2010-03-03 曹际娟 食品中5种新出现致病菌的检测试剂盒及检测方法

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郭洪波: "动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

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