CN105116146A

CN105116146A - 纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌

Info

Publication number: CN105116146A
Application number: CN201510315842.0A
Authority: CN
Inventors: 张红星; 齐颖颖; 段慧霞; 谢远红; 刘慧�; 张帅
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2035-06-10
Also published as: CN105116146B

Abstract

本发明提出的纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌方法如下：应用链霉亲和素-生物素介导偶联的纳米磁珠标记经杂交瘤技术制备筛选所得单抗1B12？CGMCC？No.10312制备成免疫磁珠；以胶体金标记的另一配对单抗3B10？CGMCC？No.10311为标记抗体，将多抗血清和羊抗鼠IgG分别作为检测线T和质控线C，经过胶体金标记抗体的结合垫、检测线T和质控线C的层析膜、吸水垫组建成胶体金免疫层析试纸条；检测样品时，将免疫磁珠与样品中菌体进行特异性的捕获富集，再将其富集液体加入试纸条的样品垫上，依据胶体金的颜色在检测线T和质控线C处形成肉眼可见显色条带的判读，从而实现单增李斯特菌的快速半定量检测。

Description

纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体公开了一种纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌的方法，适用于食品中致病菌单增李斯特菌的检测。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes,简称为单增李斯特菌），是一种人畜共患病致病菌，也是常见的食源性致病菌之一，广泛存在于肉、蛋、海产品、乳制品、蔬菜等食物中，该菌在4℃仍可生长，多次发生单增李斯特菌污染中毒的事件，它能引起脑膜炎、肠胃炎症、败血病、流产等临床症状，尤其对新生儿、孕妇、老年人及免疫力低下人群的危害很大，有很高的致死率，成为食品安全的一大隐患。

目前，检测单核增生李斯特氏菌的方法有三种：传统的生物学分离培养法、分子生物学检测法、免疫检测法。其中传统培养法即国标方法耗时耗力，分子检测方法价格昂贵，免疫检测法一般灵敏度达不到要求，均不适合现场大量样品的快速筛查。

本研究主要利用多种免疫检测法相结合来检测食品中单核增生李斯特氏菌，这种新型的快速检测方法结合了纳米免疫磁珠分离技术和胶体金层析技术，其方法具有快速、灵敏度高，准确率高，低成本、高通量、便携带等优点，为致病菌检测指出了新的方向。

发明内容

本发明主要针对现有的生物检测方法费时费力、操作过程复杂以及灵敏度不高的缺陷，而提供一种以纳米免疫磁珠分离技术联合胶体金免疫层析快速检测单增李斯特菌试纸条制备的方法。从而实现简便、快速、准确的检测单增李斯特菌的目的。

本发明提出的纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌方法，其特征在于：应用链霉亲和素-生物素介导偶联的纳米磁珠标记经杂交瘤技术制备筛选所得的单增李斯特菌特异性反应鼠系单抗制备成免疫磁珠；同时以胶体金标记的另一抗单增李斯特菌的配对单克隆抗体为标记抗体，选自新西兰大白兔的抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠IgG二抗分别作为检测线T区和质控线C区，经过胶体金标记抗体的结合垫、检测线T区和质控线C区的层析膜、吸水垫组建成一种基于双抗体夹心检测原理的单增李斯特菌胶体金免疫层析试纸条。检测样品时，将免疫磁珠与样品中的菌体进行特异性的捕获进富集，再在胶体金免疫层析试纸条的样品垫上加入其富集液体，依据胶体金的颜色在检测线T区域和质控线C区域处形成肉眼可见的显色条带的判读，从而实现单增李斯特菌的快速半定量检测。

其中所述的抗单增李斯特菌特异性两株单抗是采用杂交瘤技术制备筛选所得，并且经双抗体夹心ELISA筛选出的配对抗体，所述的抗单增李斯特菌特异性多抗是通过免疫新西兰大白兔制备所得，两种抗体具有很高的特异性。

本发明所述的纳米免疫磁珠的制备步骤如下：

1、抗体的制备与纯化：

以高压灭菌处理单增李斯特菌体作为抗原免疫8周龄健康BALB/c雌性小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单克隆抗体细胞株，进而将抗单增李斯特菌的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到小鼠体内制备腹水，所得腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法进行抗体纯化；

以高压灭菌处理单增李斯特菌体作为抗原免疫新西兰大白兔，所得抗单增李斯特菌血清经硫酸铵沉淀法进行纯化，所得多克隆抗体保存于-80度待用；

2、纳米磁珠与抗体的偶联：

将180nm磁珠洗涤，采用活泼酯的方法，依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）、二氯乙烷（EDC），置于混匀仪上保持磁珠悬浮状态，37℃活化2h，将活化磁珠与链霉亲和素偶联，获得的链霉亲和素磁珠；再将其与生物素化的单增李斯特菌单克隆抗体1B12，置于混匀仪上偶联，制成链霉亲和素免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

本发明所述的胶体金试纸条制备步骤如下：

1、胶体金的制备：取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于烧杯内，加热煮沸时加入2mL1%柠檬酸三钠，继续加热煮沸5min,冷却后加超纯水至100mL，制得40nm的胶体金溶液；

2、结合垫的处理：将制备出的另一株与磁珠偶联单抗1B12配对的抗单增李斯特菌的单克隆抗体3B10标记于胶体金颗粒上，使其终浓度为25μg/mL，使之标记液体喷点在结合垫上以备用；

3、层析膜的包被：用自动喷膜仪，以0.9μL/cm的速度，将特定浓度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0.8cm，包被后的层析膜于37℃干燥箱中烘干8小时，置于干燥器中保存备用；

4、试纸条的组装与制备：将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次相互交错约1mm粘贴在衬板上，然后在上层覆盖密封膜;根据要求宽度切割即可得到胶体金免疫层析试纸条。

本发明所述的纳米免疫磁珠捕获富集菌体方法步骤如下：

取样品与自制的免疫磁珠在旋转混合仪上室温反应，反应后进入磁场分离，经重悬、水浴即可得到菌体富集液用于下一步胶体金试纸条的检测。

有益效果：

本发明将纳米免疫磁珠分离技术与胶体金免疫层析技术相结合，通过纳米磁珠偶联抗体，形成免疫磁珠进而来富集捕获菌体，再将捕获的菌体进行基于双抗体夹心原理的胶体金免疫层析试纸条检测，这种方法具有用时少、准确率高、检测费用低、不需要专业操作人员，且灵敏度高，可达50CFU/mL。因此，本方法特别很适于快速筛查单增李斯特菌。

附图说明

图1为本发明纳米免疫磁珠富集捕获菌体过程示意图；

图2为胶体金免疫层析试纸条原理示意图；

图3为采用纳米免疫磁珠技术联合胶体金免疫层析快速检测试纸条对单增李斯特菌样品检测阳性、阴性、无效的结果是意图；

图4为单增李斯特菌培养样品检测的结果是示意图；

图5为单增李斯特菌模拟污染样品检测的结果是示意图；

图6为试纸条特异性检测结果示意图：

具体实施方式

实施案例1免疫磁珠的制备及捕获单增李斯特菌检测

1、纳米免疫磁珠的制备

（1）抗体的制备与纯化：以高压灭菌处理单增李斯特菌体作为抗原免疫8周龄健康BALB/c雌性小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单克隆抗体细胞株，进而将抗单增李斯特菌的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到小鼠体内制备腹水，所得腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法进行抗体纯化；以高压灭菌处理单增李斯特菌体作为抗原免疫新西兰大白兔，所得抗单增李斯特菌血清经硫酸铵沉淀法进行纯化，所得多克隆抗体保存于-80度待用。

（2）纳米磁珠与抗体的偶联：采用活泼酯的方法，将链霉亲和素与180nm磁珠偶联获得链霉亲和素磁珠，采用生物素化抗体与链霉亲和素磁珠连接制成链霉亲和素免疫磁珠。取10mg磁珠依次用无水乙醇，依次用1mol/LNaOH，1mol/LHCl各洗涤1次，用PB(0.02mol/L，pH4.0)洗5次MES(0.05mol/L，pH6.0)重悬。依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHSS）0.4mg，二氯乙烷（EDC）0.35mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮状态，37℃活化2h。将每mg活化磁珠与200μg链霉亲和素偶联；获得的链霉亲和素磁珠,按每mg磁珠加入80mg生物素化LM单克隆抗体1B12，置于混匀仪上37℃偶联30min。磁力架回收磁珠，PB洗涤3次，10mLPBS(含0.05g/100mLNaN3，0.5g/100mLBSA，pH7.4)重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

2、纳米免疫磁珠捕获富集菌体

（1）免疫磁珠捕获ＬＭ菌液

取1mL10⁵CFU/mL的LM菌液于2mL的离心管中，取60mg/g单克隆抗体/磁珠偶联比制备的免疫磁珠0.1mg于上述离心管，另设对照组。室温下在Dynal-MIX1旋转混合仪上反应30min(10r/min)后取下，将离心管插入磁力架分离2min，吸出上清液。加1mLPB（-0.02%吐温20）洗涤2遍，分离后吸出洗涤液，最后用1mLPB重悬磁珠，将上清液、洗涤液、磁珠重悬液及对照组作合适倍数稀释，取100μL涂布于LM选择性培养基，平行3个样品。37℃培养12h，选择菌落数在20～200范围内的进行计数，按公式计算其捕获效率(CE):

CE（%）=（C1-C2-C3）/C1*100%

C1为对照组菌落总数，C2为上清液菌落总数，C3为洗涤液菌落总数

当免疫磁珠添加量达到0.1mg时，1mL10⁵CFU/mLLM菌液捕获效率大于99%。为了保证有效分离，确定在检测中免疫磁珠加入量为0.1mg。图1为本发明纳米免疫磁珠富集捕获菌体过程示意图。

（2）在肉样中的捕获效果

称取25g市售猪肉切碎置于无菌的三角瓶内，添加培养好的LM模拟污染，至目标菌浓度约为10²CFU/g，然后加入250mLEC肉汤，37℃，160r/min摇床培养8h，取1mL上层清液到离心管里，各添加0．1mg自制的免疫磁珠，在旋转混合仪上室温反应30min，结束后放入磁场分离2min。将对照组、分离上清液、洗涤液、磁珠重悬液作合适倍数稀释，取100μL涂布于单增李斯特菌选择性培养基上,(对照组同时涂布琼脂培养基计算菌落总数)，平行制备3个样品。37℃培养12h后，对大单增李斯特菌和杂菌分别计数，计算捕获效率。同时，购买商品磁珠进行同一实验，并计算其捕获效率。在猪肉样中的捕获效果：自制免疫磁珠在猪肉样品中的捕获效率为98.6%，而商品性免疫磁珠在猪肉样品中的捕获效率为96.5%。说明自制的免疫磁珠比商品免疫磁珠在样品中的捕获效率要高，自制的免疫磁珠可达到要求，可以进行检测使用。

实施案例2胶体金免疫层析试纸条的制备及样品检测

1、胶体金试纸条的制备

（1）胶体金的制备：取0.01%HAuCl4水溶液100mL置于烧杯内，加热煮沸时加入2mL1%柠檬酸三钠，继续加热煮沸5min,冷却后加超纯水至100mL，制得40nm的胶体金溶液；

（2）结合垫的处理：将制备出的另一株与磁珠偶联单抗1B12配对的抗单增李斯特菌的单克隆抗体3B10标记于胶体金颗粒上，使之标记液体喷点在结合垫上以备用；

（3）层析膜的包被：用自动喷膜仪，以0.9μL/cm的速度，将特定浓度的多抗血清、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0.8cm，包被后的层析膜于37℃的干燥箱中烘干8小时，置于干燥器中保存备用；

（4）试纸条的组装与制备：将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次相互交错约1mm粘贴在衬板上，然后在上层覆盖密封膜，根据要求宽度切割即可得到胶体金免疫层析试纸条。图2为胶体金免疫层析试纸条原理示意图。

2、胶体金试纸条的样品检测

取1mL样品于离心管中，添加0.1mg自制的免疫磁珠，在旋转混合仪上室温反应30min，再放入磁场分离2min后，用1mLPB（0.01M，pH7.4）重悬，85°C水浴15min,即可得到菌体富集液用于胶体金试纸条的检测。图3为采用纳米免疫磁珠技术联合胶体金免疫层析快速检测试纸条对单增李斯特菌样品检测阳性、阴性、无效的结果是意图。

实施案例3培养样品的检测

将培养12h的LM菌液稀释为0，10,50,10²,10³,10⁴,10⁵CFU/ml,各取1mL加到离心管中，各管均加入0.1mg自制免疫磁珠。室温下，在旋转混合仪上孵育30min，磁分离后用1mLPB重悬，85℃水浴15min，磁分离后吸出上清液，将100μL上清液和对照组菌液分别添加到试纸条加样孔内，5~15min观察试纸条检测线和质控线显色情况。

如图4所示，经过免疫磁珠分离富集反应，浓度为10³CFU/mL和10²CFU/mL菌液的检测结果为强阳性，浓度为50CFU/mL检测结果为弱阳性，表明浓度为50CFU/mL的菌液经过免疫磁珠分离富集后能通过试纸条检出。

实施案例4模拟污染LM肉样的检测

取10g猪肉样切，按每克猪肉加0，10，50，10²，10³，10⁴，10⁵CFU/ml细菌来进行模拟污染，各取出1mL加到两组2mL离心管中。各管均加入0.1mg自制免疫磁珠。室温下，在旋转混合仪上孵育30min，磁分离后用1mLPB重悬，85℃水浴15min，磁分离后吸出上清液，将100μL上清液和对照组菌液分别添加到试纸条加样孔内，5~15min后观察试纸条检测线和质控线显色情况，取100μL磁分离富集组上清液和100μL对照组菌液分别添加到试纸条加样孔内，5~15min后观察试纸条检测线和质控线显色情况。

如图5所示，模拟污染单增李斯特菌肉样检测，过免疫磁珠分离富集反应，浓度为10³CFU/mL和10²CFU/mL菌液的检测结果为强阳性，浓度为50CFU/mL检测结果为弱阳性，表明浓度为50CFU/mL的菌液经过免疫磁珠分离富集后能通过试纸条检出。并且实验中观察到，将含有食品基质的培养液直接滴加于试纸条加样孔，由于食品颗粒和脂肪对试纸条的影响，其在试纸条上的移动速度较慢，而经过免疫磁珠分离后无此现象，这是因为免疫磁珠分离消除了食品基质对试纸条的影响，提高了检测准确性。

实施案例5胶体金免疫层析试纸条特异性的检测

以两株单增李斯特菌和绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌及链球菌等菌株进行特异性实验。各取1ml浓度为10⁶CFU/ml的菌液进行纳米免疫磁珠-胶体金方法的检测。如图6所示，1~2号滴加的是本实验室保存的单增李斯特菌，3~9号滴加7株非单增李斯特菌株。试验结果表明，该试纸条特异性很好，能够检测与其它杂菌无交叉反应。

本发明所述的抗单增李斯特菌单克隆抗体保藏编号为1B12CGMCCNo.10312和保藏编号为3B10CGMCCNo.10311，均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏日期为2015年1月15日。

Claims

1.抗单增李斯特菌单克隆抗体1B12CGMCCNo.10312和3B10CGMCCNo.10311，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏日期为2015年1月15日。

2.纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌方法，其特征在于：应用链霉亲和素-生物素介导偶联的纳米磁珠标记经杂交瘤技术制备筛选所得的单增李斯特菌特异性反应鼠系单抗制备成免疫磁珠；同时以胶体金标记的另一抗单增李斯特菌的配对单克隆抗体为标记抗体，选自新西兰大白兔免疫的抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠IgG二抗分别作为检测线T区和质控线C区，经过胶体金标记抗体的结合垫、检测线T区和质控线C区的层析膜、吸水垫组建成一种基于双抗体夹心检测原理的单增李斯特菌胶体金免疫层析试纸条；检测样品时，将免疫磁珠与样品中的菌体进行特异性的捕获进富集，再在胶体金免疫层析试纸条的样品垫上加入富集液体，依据胶体金的颜色在检测线T区域和质控线C区域处形成肉眼可见的显色条带的判读，从而实现单增李斯特菌的快速定性检测。

3.根据权利要求2所述的纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌方法，其特征在于，所述的纳米免疫磁珠的制备方法如下：

（1）抗体的制备与纯化：以高压灭菌处理单增李斯特菌体作为抗原免疫BALB/c雌性小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单克隆抗体细胞株，进而将抗单增李斯特菌的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到小鼠体内制备腹水，所得腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法进行抗体纯化；以高压灭菌处理单增李斯特菌体作为抗原免疫新西兰大白兔，所得抗单增李斯特菌血清经硫酸铵沉淀法进行纯化，所得多克隆抗体保存于-80度待用；

（2）纳米磁珠与抗体的偶联：采用活泼酯的方法，将180nm磁珠与链霉亲和素偶联获得链霉亲和素磁珠，采用生物素化抗体与链霉亲和素磁珠连接制成链霉亲和素免疫磁珠；洗涤磁珠，依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）、二氯乙烷（EDC），置于混匀仪上保持磁珠悬浮状态，37℃活化2h；将活化磁珠与链霉亲和素偶联；获得的链霉亲和素磁珠,再将其与生物素化的单增李斯特菌单克隆抗体1B12，置于混匀仪上偶联，形成免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。

4.根据权利要求2所述的纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌方法，其特征在于，所述的胶体金试纸条制备方法如下：

（2）结合垫的处理：将制备出的另一株与磁珠偶联单抗1B12配对的抗单增李斯特菌的单克隆抗体3B10标记于胶体金颗粒上，使其终浓度为25μg/mL，使之标记液体喷点在结合垫上以备用；

（3）层析膜的包被：用自动喷膜仪，以0.9μL/cm的速度，将特定浓度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分别喷点在层析膜的T线和C线处，喷点时线与线间的间隔距离为0.8cm;包被后的层析膜于37℃的干燥箱中烘干8小时，置于干燥器中保存备用；

（4）试纸条的组装与制备：将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次相互交错约1mm粘贴在衬板上，然后在上层覆盖密封膜;根据要求宽度切割即可得到胶体金免疫层析试纸条。

5.根据权利要求2所述的纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌方法，其特征在于，所述的纳米免疫磁珠捕获富集菌体方法如下：取样品与自制的免疫磁珠在旋转混合仪上室温反应，反应后进入磁场分离，经重悬、水浴即可得到菌体富集液用于下一步胶体金试纸条的检测。

6.纳米免疫磁珠技术联合胶体金层析快速检测单增李斯特菌方法，其特征在于，将待测样品富集液滴入检测卡加样孔，待5~15分钟后读取T、C线的显色，得到结果。