CN107083370A - 抗树鼩干扰素γ单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗树鼩干扰素γ单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，属于分子生物学技术领域。该杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS‑IFNγ‑13，保藏号为CCTCC NO:C2016222，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩干扰素γ，具有较好的灵敏度和特异性。

Description

抗树鼩干扰素γ单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与 应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种单克隆抗体，具体涉及产生特异性抗树鼩干扰素γ抗体的杂交瘤细胞株和抗树鼩干扰素γ单克隆抗体，以及所述抗体的应用。

背景技术

树鼩（tree shrew, Tupaia belangeri）是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物，形态酷似松鼠，是灵长类动物的近亲。由于树鼩具有体型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，饲养管理成本低、对人类病毒易感等优点，常常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，所以很早就被用作灵长类目（包括人类）的疾病动物模型。近年来研究发现，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、肿瘤等疾病的研究中得到广泛的应用。

干扰素γ（IFNγ）主要由免疫细胞分泌产生，在免疫反应过程中发挥重要作用。在适应性免疫反应中，IFNγ由CD4+辅助T细胞（Th1）和CD8+细胞毒性T细胞（CTL）在受到主要组织相容性抗原复合物（MHC）呈递的抗原刺激时产生；在先天性免疫反应中，IFNγ由自然杀伤细胞（NKcell）受到白细胞介素12（IL-12）和白细胞介素18（IL-18）刺激时产生，干扰素γ是一种多效能的具有免疫调节功能的细胞因子，具有光谱的广谱抗病毒作用，通过与细胞表面受体的结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。其免疫调节功能还包括：促进MHCⅠ类及Ⅱ类抗原的加工提呈增加细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lym－phocyte，CTL）对病原体的敏感性，使CTL更有效地将病原体清除；促进免疫反应向th1表型转化；活化巨噬细胞，并促进其产生炎性细胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-6），促进机体对病原体的清除。干扰素γ是衡量机体细胞免疫反应情况的重要指标。

但目前对树鼩干扰素γ方面的研究鲜有报道，且无可用的抗体来检测树鼩的干扰素γ水平，对树鼩动物模型通过淋巴细胞表面分子检测分析其细胞免疫情况的评价尚属空白，严重阻碍了对树鼩这一动物模型的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗树鼩干扰素γ单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，可用于检测天然树鼩干扰素γ。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种分泌抗树鼩干扰素γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS-IFNγ-13，保藏号为CCTCC NO:C2016222，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

进一步，本发明提供一种由上述的杂交瘤细胞分泌的抗树鼩干扰素γ单克隆抗体。

进一步，本发明提供上述抗树鼩干扰素γ单克隆抗体在制备树鼩干扰素γ检测试剂或试剂盒中的应用。

进一步，本发明提供一种树鼩干扰素γ的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，所述的试剂盒包括抗树鼩干扰素γ单克隆抗体。

进一步，本发明提供一种树鼩干扰素γ的蛋白免疫印迹法（western-blot）检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括辣根过氧化物酶HRP标记的抗树鼩干扰素γ单克隆抗体。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势。

基于此建立的树鼩IFNγ双抗体夹心ELISA检测试剂盒，既可以有效检测出大肠杆菌系统表达的重组树鼩IFNγ，也可用于分析树鼩外周血单核细胞培养上清和树鼩血清中分泌的天然树鼩IFNγ，具有较好的灵敏度和特异性。用于检测重组蛋白时，此ELISA检测试剂盒最低可检测到0.156μg/100μl的GST-TSIFNγ重组蛋白。用于检测树鼩外周血IFNγ含量时，分析了50只健康树鼩的外周血检测结果可知，健康树鼩的外周血IFNγ含量在0.1-0.9ug/ml之间（以GST-TSIFNγ重组蛋白作为标准品）。

基于此建立的树鼩IFNγ的western-blot检测试剂，既可以定性分析大肠杆菌系统表达的重组树鼩IFNγ的表达情况，也可用于分析树鼩外周血单核细胞培养上清和树鼩血清中分泌的天然树鼩IFNγ的表达情况。应用HRP标记的上述抗体，用于检测重组蛋白表达情况时，最低50ng的重组蛋白GST-TS-IFNγ可检测到清晰的免疫印迹条带。用于检测树鼩外周血IFNγ表达情况时，最低0.5ug的树鼩淋巴细胞裂解蛋白样品可见清晰的IFNγ免疫印迹条带。

附图说明

图1 a）为GST标签和树鼩IFNγ融合蛋白GST-TSIFNγ表达纯化SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量Marker，2为亲和纯化重组蛋白GST-TSIFN-γ； b）为HIS标签和树鼩IFNγ融合蛋白HIS-TSIFNγ表达纯化SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量Marker，2为亲和纯化重组蛋白HIS-TSIFN-γ；

图2为纯化的单克隆抗体MAb-TSIFNγ-13的SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白分子量Marker，2为纯化前的单克隆抗体腹水样品，3为ProteinA纯化洗脱的MAb-TSIFNγ-13，4为超滤浓缩后的MAb-TSIFNγ-13；

图3为单克隆抗体MAb-IFNγ-13识别树鼩淋巴细胞内的IFNγwestern-blot图，其中1为树鼩淋巴细胞裂解蛋白（未培养），2为树鼩淋巴细胞37℃培养12小时上清，3为树鼩淋巴细胞37℃培养12小时后的裂解蛋白，4为树鼩淋巴细胞37℃加ConA培养12小时上清，5为树鼩淋巴细胞37℃加刀豆蛋白（ConA）培养12小时后的裂解蛋白；

图4为单克隆抗体MAb-IFNγ-13识别重组蛋白GST-TSIFNγ的western-blot图，其中，1为25ng的重组蛋白样品，2为50ng重组蛋白样品；3为100ng重组蛋白样品；4为200ng重组蛋白样品；

图5为所述检测试剂盒标准品曲线；X值为标准品（重组蛋白GST-TS IFNγ）的蛋白含量（μg/ml），Y值为波长450的OD反应值。

本发明杂交瘤细胞株TS-IFNγ-13，已于2016年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO:C2016222，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

一、杂交瘤细胞株的建立：

（1.1）原核表达载体pGEX-5X-TSIFNγ和Pet3.0-TS IFNγ的构建

为了在大肠杆菌表达系统中表达树鼩的IFNγ蛋白，从树鼩尾静脉采外周血后用淋巴细胞分离液（购买自AXIS-SHIELD）分离得到的淋巴细胞，经TRIZOL(天更)提取RNA经逆转录PCR（购买自宝生物）得到树鼩IFNγ的编码基因片段，用T4连接酶（购买自宝生物）连接到表达载体pGEX-5X-1后，得到GST标签重组蛋白表达质粒pGEX-5X-TSIFNγ，将树鼩IFNγ基因连接到表达载体pet3.0后得到HIS标签的重组蛋白表达质粒Pet3.0-TS IFNγ。其中，树鼩IFNγ基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

（1.2）重组蛋白GST-TS IFNγ和HIS-TS IFNγ的表达

将质粒pGEX-5X-TSIFNγ和Pet3.0-TSIFNγ转化入原核表达宿主菌BL21中，37℃诱导表达3小时后，8000转，离心10分钟收集菌体，用亲和纯化的结合缓冲液悬起后经超声破碎菌体，再次离心，离心条件同上，取上清液做亲和纯化，得到免疫动物用重组蛋白GST-TSIFNγ（结果见图1a）和筛选检测用重组蛋白HIS-TS IFNγ（结果见图1b）。

（1.3）动物免疫：选择8周龄左右的Balb/C健康小鼠（由中国医学科学院医学生物学研究所小动物中心提供），原核表达的带GST标签的融合蛋白GST-TSIFNγ与等体积弗氏完全佐剂（第1次免疫）或弗氏不完全佐剂（第2、3次免疫）完全乳化后（所用佐剂均购买自sigma），经背部皮下多点免疫，每只小鼠免疫蛋白量为100μg。免疫程序为分别于第1天，28天、56天进行免疫，第59天取小鼠脾脏研磨至只剩白色组织后经70目的细胞筛网过滤得到小鼠脾细胞。

（1.4）饲养细胞的制备：选择12周龄左右的Balb/C健康小鼠（由中国医学科学院医学生物学研究所小动物中心提供）断颈处死以后浸泡于体积浓度为75%乙醇消毒5分钟，用无菌的剪刀剪开腹部皮肤后，缓慢剥离，暴露腹膜，用无菌注射器注射10ml预冷的质量浓度为16%的蔗糖溶液进小鼠腹腔，轻柔按摩小鼠腹部5分钟后再用注射器将腹腔内液体抽取出来，此液体中含有大量的小鼠巨噬细胞，离心1000转10分钟后弃上清用培养液悬起然后计数，调整培养液体积，使细胞浓度在10⁵个/ ml左右，然后100μl每孔加入96孔板中，置于37℃，5％CO₂条件下培养1-2天。

（1.5）小鼠脾细胞和SP2/0细胞的融合：取处于对数生长期的SP2/0细胞(购自ATCC)与步骤（1.3）得到的小鼠脾细胞按照1∶10的细胞数量比例混和，通过聚乙二醇(PEG)(购买自sigma）法以获得杂交瘤细胞。之后将杂交瘤细胞加入步骤（1.4）得到的含有饲养细胞的96 孔板中，使用含有1×HAT（购买自sigma）、20%（V/V）胎牛血清的1640培养基中，在37℃，5％CO₂条件下培养。

（1.6）杂交瘤细胞株的筛选：将步骤（1.5）获得的杂交瘤细胞经含1×HAT、20%（V/V）胎牛血清（购买自Biological Industries，BI）的1640培养基(购买自Corning)培养10天，换含1×HT（购买自sigma）、20%（V/V）胎牛血清的1640培养基培养5天后，换成含20%（V/V）胎牛血清的1640普通培养基扩大培养。取杂交瘤细胞上清用包被了原核表达重组蛋白HIS-TSIFNγ蛋白的ELISA板检测抗体效价。以未融合SP20细胞培养上清为阴性对照，选取检测OD值高于阴性6倍的细胞孔进行下一步的亚克隆。

（1.7）选取步骤（1.6）中96孔板上生长状态良好且检测OD值高于阴性6倍的细胞孔，将每孔的细胞吸取至加样槽，用含20%（V/V）胎牛血清的1640培养基稀释至20ml后，均匀加至一个96孔板，每孔200μl，37℃，5％CO₂条件下培养5天后再次检测，再次选取OD值高于阴性6倍且细胞生长状态良好的细胞孔，分克隆至另一个96孔板，如此重复三至四轮，直至整个96孔板的OD都为高于阴性孔6倍。选取细胞生长状态好的一个孔的细胞逐步扩大培养，并液氮冻存。

二、单克隆抗体腹水的大量制备：

将步骤（1.7）扩大培养得到的阳性（OD值高于阴性孔6倍）克隆细胞腹腔注射入预先用石蜡油致敏过的10周龄Balb/C健康小鼠，每只小鼠注射细胞量为10⁶-10⁷个，10-14天后收取腹水，检测效价>1:3200的腹水样品分装冻存。

三、多克隆抗体的获得：

选择5月龄的健康日本大耳兔，重组蛋白GST-TSIFNγ与等体积弗氏完全佐剂（第1次免疫）或弗氏不完全佐剂（第2、3次免疫）完全乳化后，经背部皮下多点免疫，每只兔子免疫蛋白量为500μg。免疫程序为分别于第1天，28天、56天进行免疫，第59天麻醉后经颈动脉采血后分离血清，分装冻存。

四、抗体的纯化：

将上述步骤二所得的小鼠腹水经proteinA柱（购买自全式金）纯化，得到小鼠抗树鼩IFNγ的单克隆抗体MAb-TSIFNγ-13；上述步骤三所得兔血清用proteinA柱纯化后，得到兔抗树鼩IFNγ的多克隆抗体PAb-TSIFNγ。所得单克隆抗体和多克隆抗体分别用超滤离心管浓缩至1mg/ml，分装冻存备用。（抗体的SDS-PAGE电泳图见图2）

五、抗体的标记：

将上述步骤四得到的纯化浓缩后的兔抗树鼩IFNγ的多克隆抗体按照HRP标记试剂盒的说明书操作，标记上辣根过氧化物酶HRP，反应结束后加入等体积的甘油，混匀后分装-20℃保存。

六、ELISA检测板的制备：

将上述步骤四得到的小鼠抗树鼩IFNγ的单克隆抗体用PBS稀释至0.2ug/ml，每孔加100μl加入96孔高吸附酶标检测板（购买自COSTAR），于4℃静置过夜，用含有0.05%（v/v）Tween-20的PBS洗板三次后，每孔加入100μl含1%（w/v）BSA的PBS，室温封闭2小时后用含有0.05%（v/v）Tween-20的PBS洗板三次，晾干，置于-20℃保存。

七、产品组分及其特征；

以所述抗树鼩干扰素γ单克隆抗体MAb-TSIFNγ-13为捕获抗体包被96孔酶标板，辣根过氧化物酶HRP标记的兔抗树鼩IFNγ多克隆抗体PAb-TSIFNγ为检测抗体，以测定蛋白含量为500μg/mL的原核表达重组蛋白GST-TSIFNγ为标准品。

一种树鼩干扰素γ的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，包括抗树鼩干扰素γ单克隆抗体，具体的所述试剂盒组分包括：96孔检测板、标准品（500μg/mL），HRP标记兔抗树鼩IFNγ多克隆抗体PAb-TSIFNγ，TMB显色液(Solarbio公司的单组分显色液)。

所述抗体应用包括辣根过氧化物酶HRP标记的的单克隆抗体MAb-TSIFNγ-13，主要应用于树鼩IFNγ表达情况的western-blot和免疫组化的检测。

①树鼩干扰素γ的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒的应用方法如下：

1.将500μg/mL标准品用稀释液[含0.5%（w/v）BSA、0.05%(v/v)Tween-20的PBS]稀释至10μg/mL，以此为起始浓度，做2倍系列稀释，一共8个浓度，分别为10μg/mL，5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.156μg/mL、0.078μg/mL。每个稀释度做两个复孔。

2.待测样品的准备：树鼩血清，用PBS 做5倍稀释混匀后上样。

3.将稀释好的标准品和待测样品加于酶标包被板孔底部，每孔100ul，尽量不触及孔壁，轻轻吹吸混匀。

4.将标准品及待测样品加完后，放于湿盒内室温孵育2小时。

5.弃去酶标包被板中液体，甩干，每孔加满洗液，静置30秒后弃去，如此重复3次，拍干；所述的洗液为含有0.05%（v/v）Tween-20的PBS。

6.用稀释液[含0.5%（w/v）BSA、0.05%(v/v)Tween-20的PBS]按1:1500的体积稀释HRP标记的兔抗树鼩IFNγ多克隆抗体PAb-TSIFNγ，在标准品孔、对照孔及待测样品孔中，每孔100μL，加入稀释好的不同浓度的标准品和待测样品，空白孔A1除外。

7.湿盒内室温孵育1小时。

8.弃去酶标包被板中液体，甩干，每孔加满洗液，静置30秒后弃去，如此重复3次，拍干；所述的洗液为含有0.05%（v/v）Tween-20的PBS。

9.显色：每孔加入TMB显色液100μL，37℃避光显色10分钟。注：显色液请避光保存。

10.终止：每孔加终止液（2M硫酸H₂SO₄）100μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。

11.测定：以空白孔A1调零，在450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

12.计算方法：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，计算出标准品的Logistic曲线拟合（四参数）回归方程式，根据样品的OD值代入方程式计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。拟合后的标准曲线和具体的检测值见图5和表1。

13.结果如图5所示，用于检测重组蛋白时，此ELISA检测试剂盒最低可检测到0.156μg/100μl的GST-TSIFNγ重组蛋白。用于检测树鼩外周血IFNγ含量时，分析了50只健康树鼩的外周血检测结果可知，健康树鼩的外周血IFNγ含量在0.1-0.9ug/ml之间（以GST-TSIFNγ重组蛋白作为标准品）。

表1

②树鼩干扰素γ的蛋白免疫印迹法（western-blot）检测试剂的使用方法如下：

1.样品处理 上样与电泳

在收集的淋巴细胞蛋白样品或是重组蛋白样品按比例中加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液[250mM Tris-HCl（pH6.8）、10％（W/V）SDS、0.5％（W/V）BPB、50％（V/V）甘油、5％（W/V）β-巯基乙醇]，95℃加热5分钟，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。80V 25分钟，150V60分钟电泳。

2. 转膜(Transfer)

使用半干转膜装置(BIO-RAD)，设定转膜电流为100mA，转膜时间为45分钟,按照转膜仪的说明书，将电泳后的蛋白转印至PVDF膜（购买自Millipore）上。

3. 封闭(Blocking)

转膜完毕后，立即把转膜完成的PVDF膜放置到预先准备好的含5%（W/V）脱脂奶粉的TBS[20mM Tris-HCl，500 mM NaCl（pH7.5）]中，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。

4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

将HRP标记的MAb-TSIFNγ（500μg/ml）按照1:1000体积比用TBS稀释，和封闭完成后的PVDF膜在侧摆摇床上缓慢摇动室温孵育一小时。

5. 洗膜

弃一抗稀释液，将一抗孵育好的膜置于洗膜盒（购买自Millipore）内,加入10ml洗膜液TBST（20mM Tris-HCl，500 mM NaCl（pH7.5）, 0.01%Tween-20(V/V）)10ml，在侧摆摇床上摇动，10分钟后换新的TBST，重复4次；

6. 蛋白检测(Detection of proteins)

按照说明书加入ECL（购买自Millipore）试剂，在暗室压片，经显影液定影液进行洗片。结果如图3和图4，最低0.5ug的树鼩淋巴细胞裂解蛋白样品和50ng的重组蛋白GST-TS-IFNγ可检测到清晰的IFNγ免疫印迹条带。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQ ID NO.1

tgttactgcc aggccccatt tatgaaagaa gtacaaaacc tgaagaacta ttttaatgca 60

actgatccag gagtagggga tactgggcgt ctttttgtag atattttgaa gaattggaca 120

gaggagagtg acaaaaaaat atttcagagc caaatcgtct ctttctactt caaacttttc 180

gaaagcttca aagacaacca ggtcatcaaa aagagtgtgg atatcatcaa ggaagacatg 240

attgataaat tcttcaacag cagtcccact aaactggatg tctttctaaa cttgactcga 300

atttcagtaa atgatgtaca agtccagcgc aaggcaatat atgaactcct caatgtgatg 360

attgacctga ccccaaaatc taaccaaaag aagcgaaaaa ggagtcagat gctgtttcga 420

ggtcggagag cttccagata a 441

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 抗树鼩干扰素γ单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgttactgcc aggccccatt tatgaaagaa gtacaaaacc tgaagaacta ttttaatgca 60

actgatccag gagtagggga tactgggcgt ctttttgtag atattttgaa gaattggaca 120

gaggagagtg acaaaaaaat atttcagagc caaatcgtct ctttctactt caaacttttc 180

gaaagcttca aagacaacca ggtcatcaaa aagagtgtgg atatcatcaa ggaagacatg 240

attgataaat tcttcaacag cagtcccact aaactggatg tctttctaaa cttgactcga 300

atttcagtaa atgatgtaca agtccagcgc aaggcaatat atgaactcct caatgtgatg 360

attgacctga ccccaaaatc taaccaaaag aagcgaaaaa ggagtcagat gctgtttcga 420

ggtcggagag cttccagata a 441

Claims (5)

1.一种分泌抗树鼩干扰素γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS-IFNγ-13，保藏号为CCTCC NO:C2016222，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗树鼩干扰素γ单克隆抗体。

3.权利要求2所述的抗树鼩干扰素γ单克隆抗体在制备树鼩干扰素γ检测试剂或试剂盒中的应用。

4.一种树鼩干扰素γ的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括抗树鼩干扰素γ单克隆抗体。

5.一种树鼩干扰素γ的western-blot检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括辣根过氧化物酶标记的抗树鼩干扰素γ单克隆抗体。