CN106520702A - 一种杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了分泌抗牛干扰素诱导蛋白‑10(IP‑10)单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D5，以及其分泌的单克隆抗体MAb 2D5。该单克隆抗体MAb 2D5具有效价高、特异性好、与天然牛IP‑10抗原亲和力强的优势，基于此建立的阻断ELISA检测试剂盒、Western‑Blot检测试剂盒、间接免疫荧光(IFA)检测试剂盒和流式细胞术(FCM)检测试剂盒，具有较好的灵敏度和特异性，可以用作重组表达牛IP‑10的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定等非诊断目的研究。

Description

一种杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤细胞株，特别是涉及分泌抗牛干扰素诱导蛋白-10(IP-10)单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用。

背景技术

干扰素诱导蛋白10(interferon-inducible protein-10，IP-10)是抗原提呈细胞经细胞因子刺激后分泌的趋化因子，属于CXC趋化因子家族。IP-10是Luster等在1985年从活化U937细胞株的基因表达谱中筛选出来的一种细胞因子。IP-10在感染性疾病、自身免疫性疾病、同种异体移植排斥反应、肿瘤、慢性炎症等疾病中可选择性地募集T淋巴细胞、自然杀伤细胞和单核细胞到损伤部位，发挥重要的宿主免疫防护作用。新近的研究显示IP-10表达水平的改变与感染性疾病，包括炎症性疾病、免疫功能异常与肿瘤的发展等相关。IP-10在牛结核等感染性疾病的诊断中作为重要的生物标志物，其效果也常与γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)相比较。有研究表明联合检测IFN-γ和IP-10能提高牛结核诊断的敏感性。

IP-10的免疫学检测是在特异性抗IP-10单克隆抗体(MAb)的基础上建立的用于对样本中的IP-10进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单抗标记物和检测技术，可建立多种检测方法，如酶免疫分析法(EIA)，酶联免疫吸附法(Enzyme-linked ImmunosorbentAssay，简称ELISA)，酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，简称ELISPOT)，流式细胞术(Flow Cytometry，简称FCM)分析法等。

IP-10的FCM具有高度的敏感性和应用广泛性。作为细胞免疫状态的重要指标之一，IP-10的FCM检测方法将被广泛地用于研究基础和临床医学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种病原感染的诊断等。

但是，现有技术中制备的抗牛IP-10(BoIP-10)抗体，在应用于上述检测方法时往往遇到很大问题，特别是当用于检测天然牛IP-10时效果不佳。因此，获得一种可用于临床检测的，效价高、特异性好、与天然牛IP-10有抗原亲和力的牛IP-10单抗，对牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究具有重要的意义。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌牛IP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。

所述杂交瘤细胞株分泌的抗牛IP-10的单克隆抗体效价高，其能与牛IP-10的高亲合力地特异结合，其作为诊断试剂检测牛IP-10，具有相当的灵敏度和特异性。

本发明第一方面涉及一种分泌牛IP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株2D5或其传代细胞株。

本发明第二方面涉及一种牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5，其由所述上述杂交瘤细胞株2D5或其传代细胞株分泌产生。

本发明第三方面涉及一种天然牛IP-10的阻断ELISA检测试剂盒，所述阻断ELISA检测试剂盒包括支持介质、抗原和检测抗体，其中，所述抗原为牛IP10蛋白，所述检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的所述牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5；所述抗原包被在支持介质中或所述抗原与支持介质分别放置。

本发明第四方面涉及提供了一种牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒，所述Western-Blot检测试剂盒包括检测抗体、酶标二抗，其中，所述检测抗体为所述牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5。

本发明第五方面涉及一种牛IP-10的间接免疫荧光(IFA)检测试剂盒，所述间接免疫荧光(IFA)检测试剂盒包括检测抗体、荧光二抗，其中，所述检测抗体为所述牛IP-10单克隆抗体MAb2D5。

本发明第六方面涉及一种牛IP-10的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括标记抗体、检测抗体，其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的所述牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5。

本发明第七方面涉及所述杂交瘤细胞株2D5或其传代细胞株、所述牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5、所述含有牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5的试剂盒在用于非诊断目的的检测牛IP-10中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛IP-10的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、进出口检疫检验、流行病学研究。

本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价很高、特异性好、与天然抗原结合的亲和力强的优势，可用于检测天然牛IP-10。

基于此建立的阻断ELISA检测试剂盒，可以有效检测牛外周血单核细胞样品和牛抗凝血浆中分泌天然牛IP-10，具有较好的灵敏度和特异性。

基于此建立的Western-Blot检测试剂盒，可以有效检测大肠杆菌表达系统表达的牛IP-10蛋白和牛外周血单核细胞分泌的天然牛IP-10蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。

基于此建立的间接免疫荧光(IFA)检测试剂盒，可以有效检测牛外周血单核细胞样品和真核质粒表达分泌牛IP-10，具有较好的灵敏度和特异性。

同时，基于此建立的牛IP-10FCM检测试剂盒，在检测牛外周血单核细胞样品时，可以检测出较高水平的分泌牛IP-10的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。

采用本发明的试剂盒操作简便，极大缩短了检测时间，可以广泛应用于免疫学研究，用作牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究、以及非诊断目的的牛IP-10的检测。

附图说明

图1为单克隆抗体阻断ELISA抑制率曲线图。

图2为本发明Western-Blot方法的牛IP-10蛋白检测结果图：A.重组GST-BoIP10蛋白检测结果，B.重组His-BoIP10蛋白检测结果。

图3为本发明间接免疫荧光(IFA)方法的牛外周血单核细胞样品检测结果图：A.未刺激牛外周血单核细胞检测结果，B.ConA刺激牛外周血单核细胞检测结果。

图4为本发明FCM试剂盒的牛外周血单核细胞样品检测结果图：A.未刺激牛外周血单核细胞检测结果，B.ConA刺激牛外周血单核细胞检测结果。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

本发明的目的是提供一种分泌牛IP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。

本发明一方面涉及一种分泌牛IP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株2D5或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株2D5保藏号为CCTCC NO:C2016122；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2016年6月7日。

本发明第二方面涉及一种本发明所述的杂交瘤细胞株2D5或其传代细胞株分泌产生的牛IP-10单克隆抗体MAb2D5。本发明的牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5具有很高的效价，效价达1：6553600。

本发明第三方面涉及一种天然牛IP-10的阻断ELISA检测试剂盒，所述牛IP-10的阻断ELISA检测试阻断ELISA方法包括支持介质、抗原和检测抗体，其中，所述抗原为牛IP10蛋白，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的牛IP-10单克隆抗体MAb2D5；所述抗原包被在支持介质中或所述抗原与支持介质分别放置。

所述牛IP10蛋白为重组牛IP10蛋白或提取的源自动物体内的牛IP10蛋白。

所述支持介质可以为酶标板。

所述酶标板可以事先包被有抗原，也可以只提供空白酶标板与抗原，在检测前由操作者自行采用常规方法在酶标板上包被抗原。

所述酶标板可为各种常见规格的酶标板，如96孔酶标板。

进一步的，所述牛IP-10的阻断ELISA检测试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：

1)底物液；

2)洗涤液。

上述试剂均为ELISA检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入，也可由操作者自行配置或者单独购买。

为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括底物液和洗涤液。

所述底物液可为ELISA检测方法中常用的通用底物液，如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物液。

所述洗涤液可为ELISA检测方法中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。

进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISA检测所需通用试剂，如封闭液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。

所述封闭液可为包被酶标板常用的封闭液，如FBS、BSA等。

本发明进一步涉及使用上述牛IP-10阻断ELISA检测试剂盒的检测方法，用于检测牛IP-10含量，从而进行机体免疫状态评价和其他非诊断目的的用途。

本发明的阻断ELISA检测方法可用于分析牛外周血单核细胞样品。

利用本发明的阻断ELISA检测方法检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：

1.抗原包被

①96孔酶标板中加入2μg/mL的牛IP-10，100μL/孔，4℃过夜包被；

②弃包被液，使用含有0.05％吐温的PBST洗板3次，5min/次；

③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封闭2h；

④弃封闭液，使用PBST洗板3次，将96孔酶标板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。

2.制备牛外周血单核细胞

①无菌采取5mL待测牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；

③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取外周血单核细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次，得到沉淀细胞；

④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×10⁷个细胞/mL。

3.细胞孵育及检测

①在24孔细胞培养板中加入下列试剂：500μL培养液至每个对照孔，500μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入500μL稀释的细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱培养24-48小时，吸取上清作为检测样品；

②将HRP标记MAb 2D5倍比稀释，分别与血浆上清1：1混合，37℃孵育2h；

③将HRP标记MAb 2D5、HRP标记MAb 2D5与血浆的混合物分别加入牛IP-10包被ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

④PBST洗涤6次，每次5min，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H2SO4终止反应，50μL/孔，测定OD450值。根据OD450值算出抑制率，抑制率大于50％判断阳性，抑制率计算公式为：抑制率＝(OD未刺激组-OD刺激组)/OD未刺激组×100％。

结果显示表明该方法可以有效检测出ConA刺激牛外周血中T淋巴细胞分泌的牛IP-10，具有较好的灵敏度和特异性。

本发明的阻断ELISA检测方法还可用于分析牛抗凝血浆样品。

利用本发明的阻断ELISA检测方法检测牛抗凝血浆样品的检测方法包括下列步骤：

1.抗原包被

同使用阻断ELISA检测方法检测牛外周血单核细胞样品的检测方法中步骤1.抗原包被。

2.全血孵育及检测

①无菌采取待测牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血，将血液加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至终浓度为10μg/mL，置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时，吸取血浆作为检测样品；

②将HRP标记MAb 2D5倍比稀释，分别与血浆上清1：1混合，37℃孵育2h；

③将HRP标记MAb 2D5、HRP标记MAb 2D5与血浆混合物分别加入牛IP-10包被ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

④PBST洗涤6次，每次5min，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H2SO4终止反应，50μL/孔，测定OD450值。根据OD450值算出抑制率，抑制率大于50％判断阳性，抑制率计算公式为：抑制率＝(OD未刺激组-OD刺激组)/OD未刺激组×100％。

该方法可以有效检测出ConA刺激牛抗凝血浆中的牛IP-10，具有较好的灵敏度和特异性。

本发明第四方面涉及一种牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒，所述牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒包括检测抗体、酶标二抗，其中，所述检测抗体为牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5；优选地，酶标二抗为HRP标记羊抗鼠IgG；

更优选地，所述Western-Blot检测试剂盒还可以包括下列试剂：

1)封闭液；

2)底物液；

3)洗涤液。本发明的牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒可用于分析牛IP-10蛋白。

利用本发明的牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒检测牛IP-10蛋白的检测方法包括下列步骤：

1.SDS-PAGE电泳

将纯化蛋白rHis-BoIP-10、rGST-BoIP-10分别加入5×SDS loading Buffer，100℃沸煮10min，进行SDS-PAGE电泳。

2.转印

电泳结束后，将凝胶置于转印Buffer中浸泡5min，同时将NC膜和滤纸同样浸泡，按照从下到上的顺序，2张滤纸-NC膜-凝胶-2张滤纸铺好后转至半干转印仪中，注意排去气泡。在Bio-Rad semi-Dry transfer Cell系统中以0.8mA/cm2转印2h。

3.检测

①用含5％脱脂奶的PBS封闭，室温摇晃封闭过夜；

②用PBST清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；

③加入用PBS 1:1000稀释的腹水，室温振荡作用2h；

④用PBST清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；

⑤加入用PBS 1:5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，室温振荡作用1h；

⑥用PBST清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；显色，自来水终止反应，扫描仪拍照反应结果。

本发明牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒可以有效检测大肠杆菌表达系统表达的牛IP-10蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。

本发明的牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒可用于分析牛外周血单核细胞样品。

利用本发明的牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：

1.制备牛外周血单核细胞

①无菌采取5mL待测牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；

③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次，得到沉淀细胞；

④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×10⁷个细胞/mL。

2.细胞孵育

①在24孔细胞培养板中加入下列试剂：500μL培养液至每个对照孔，500μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入500μL稀释的细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱培养24-48小时，收集细胞作为检测样品；

3.SDS-PAGE电泳

将细胞裂解液加入5×SDS loading Buffer，100℃沸煮10min，进行SDS-PAGE电泳。

4.转印

同利用牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒检测牛IP-10蛋白的检测方法中步骤2.转印。

5.检测

同利用牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒检测牛IP-10蛋白的检测方法中步骤3.检测。

利用本发明的牛IP-10的Western-Blot检测试剂盒可以有效检测牛外周血单个核细胞分泌的天然牛IP-10蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。

本发明第五方面涉及一种牛IP-10的间接免疫荧光(IFA)检测试剂盒，所述间接免疫荧光(IFA)检测试剂盒包括检测抗体、荧光二抗，所述检测抗体为所述牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5；优选地，荧光二抗为FITC标记羊抗鼠IgG；

更优选地，所述试剂盒还可以包括下列试剂：

1)固定剂；

2)洗涤液。

本发明的间接免疫荧光(IFA)检测方法可用于分析牛IP-10蛋白。

作为本发明的一种实施方式，以HEK293T细胞为表达宿主，利用本发明的间接免疫荧光(IFA)检测方法检测牛IP-10蛋白的检测方法包括下列步骤：

1.转染

①转染前24h，消化接种HEK293T细胞于24孔板中，2×10⁵个细胞/孔；

②加入1.5μL至含Opti-MEM的1.5mL指形管中至总体积50μL；

③分别加入重组质粒pVAX1-GFP-BoIP10和空载体质粒pVAX1各1μg，以及P3000TM2μL至含Opti-MEM的1.5mL指形管中至总体积50μL；

④分别加入含Opti-MEM 50μL，静置5min后，分别加入细胞板孔中，置培养箱继续培养。

2.细胞因子检测

①吸去HEK293T(pVAX1-GFP-BoIP10)和HEK293T(pVAX1)细胞的培养上清，使用500μL PBS洗2次，加入500μL-20℃预冷的冰甲醇于-20℃固定10min；

②用500μLPBS洗3次，加入1:1000稀释的MAb 2D5，置37℃水浴锅孵育2h；

③使用500μL PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠IgG，用PBS稀释至1:500的工作浓度，置37℃水浴1h；

④用500μL PBS洗3次，使用荧光倒置显微镜进行观察。

本发明的间接免疫荧光(IFA)方法可以有效检测真核表达系统表达的牛IP-10蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。

本发明的间接免疫荧光(IFA)检测方法可用于分析牛外周血单核细胞样品。

利用本发明的间接免疫荧光(IFA)检测方法检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：

1.制备牛外周血单核细胞

①无菌采取5mL待测牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；

③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次；

④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/mL。

2.细胞因子检测

同利用间接免疫荧光(IFA)检测方法检测牛IP-10蛋白的检测方法的步骤2.细胞因子检测。

在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔(B)有明显绿色荧光，而对照样品孔(A)中没有绿色荧光，这表明该试剂盒可以有效检测出ConA刺激牛外周血中分泌牛IP-10的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。

本发明第六方面涉及牛IP-10的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括标记抗体、检测抗体，

其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的所述牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5。

优选地，所述标记抗体为别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记针对牛CD4单抗。

更优选地，所述FCM检测试剂盒中还可以包括下列试剂的一种或多种：

1)阻断剂布雷菲德菌素(Brefeldin，BFA)；

2)固定剂、破膜剂；以及

3)洗涤液。

上述试剂均为FCM检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括阻断剂BFA、APC标记针对牛CD4单抗、固定剂、破膜剂和洗涤液。

所述洗涤液可为FCM检测试剂盒中常用的洗涤液，如含1％BSA的磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他FCM检测所需通用试剂，如细胞培养液、磷酸盐缓冲液等。

通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。

本发明进一步基于上述牛IP-10FCM检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的牛IP-10的FCM检测方法，用于检测分泌牛IP-10的T淋巴细胞，从而进行机体免疫状态评价及疾病诊断方面的研究。

本发明的FCM检测试剂盒可用于分析牛外周血单核细胞样品。

利用本发明的FCM检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：

1)制备牛外周血单核细胞悬液；

2)细胞孵育：

①在96孔细胞培养板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入50μL牛外周血单核细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养8小时；

②加入细胞因子分泌阻断剂BFA，再放入37℃、5％CO₂培养箱培养16小时。

3)细胞因子检测：

①次日收集培养细胞，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清；

②使用1％BSA的PBS溶液将针对牛CD4分子单抗稀释至0.5μg/mL，室温避光染色20min，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；

③加固定剂，室温静置作用15min；用含1％BSA的PBS洗涤细胞；于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；

④使用破膜剂稀释FITC标记特异性针对牛IP-10单抗MAb2D5至0.5μg/mL，室温作用20min，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；

⑤使用200μL PBS重悬细胞，进行FACS检测分泌牛IP-10的T淋巴细胞比例。

上述方法通过密度梯度离心分离牛外周血单核细胞，以经刀豆蛋白A刺激的牛外周血单核细胞为阳性样品，以未经刺激的牛外周血单核细胞为对照样品，以异硫氰酸荧光素标记的MAb 2D5为检测抗体，FACS结果显示，该方法可以有效检测出分泌牛IP-10的T淋巴细胞比例。

本发明第七方面涉及本发明所述分泌牛IP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D5或其传代细胞株，或所述的牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。

本发明第八方面提供了本发明上述试剂盒在用于非诊断目的检测牛IP-10中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛IP-10的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、进出口检疫检验、流行病学研究。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1杂交瘤细胞株的获得

保藏号为CCTCC NO：C2016122的杂交瘤细胞株获得。

1.动物免疫

具体免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多点注射100μg经弗氏完全佐剂充分乳化的牛IP-10纯化蛋白，2周后腹部皮下多点注射100μg经弗氏不完全佐剂充分乳化的纯化蛋白进行二次免疫，间隔2周后腹腔注射100μg不加佐剂的纯化蛋白进行第三次免疫，7天后采血测定血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行腹腔加强免疫100μg不加佐剂的纯化蛋白。

2.细胞融合

具体步骤如下：尾静脉加强免疫3天后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。按生物安全方法处死免疫鼠，75％酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG(MW4000)作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、5％CO2培养箱中培养。5天后加入新鲜HAT培养基，10天后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。

3.间接ELISA检测方法的建立

采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原的包被浓度。

检测抗原用包被缓冲液横向梯度稀释，每孔100μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔100μL，正常小鼠血清同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔100μL，37℃孵育1.5h；PBST洗涤后，TMB显色，酶联检测仪测定OD450的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。

根据方阵试验确定的检测抗原的包被浓度，将稀释后的检测抗原100μL/孔加入酶标板中，4℃过夜，PBST洗液洗涤3次，5min/次，用含10％小牛血清的PBST洗液4℃封闭过夜，洗涤，-20℃保存，用于筛选阳性细胞克隆。

4.筛选阳性克隆

采用建立好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌抗体的情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清加入预先以步骤3中确定的最佳包被浓度包被好的ELISA板中，100μL/孔，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃水浴1.5h；洗涤后，TMB显色10～15min，显色终止后酶标仪测定OD450读数。被测孔OD450读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的阳性克隆命名为2D5。

5.阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆2D5进行2～3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆2D5对应保藏号为CCTCC NO：C2016122的杂交瘤细胞株。

实施例2：牛IP-10单抗制备

1.腹水制备

采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。10～12周龄健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3～0.5mL/只，7～10天后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数生长期的杂交瘤细胞2D5，5×105个细胞/只；7天后收集腹水，离心去除沉淀，收集上清，间接ELISA法测定抗体效价，分装，-70℃保存。杂交瘤细胞株CCTCC NO：C2016122(对应杂交瘤细胞2D5)分泌的单抗记为MAb 2D5。

2.抗体纯化

将制备的MAb 2D5腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化。

实施例3：单克隆抗体特性检测

1.单抗亚类的鉴定

按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的ELISA法。在已包被的酶标板内分别加入细胞培养上清100μL/孔，37℃1h，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入1:1000稀释的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM亚类抗体50μL/孔，37℃0.5h，每株单抗加每种亚类两孔，PBST洗涤3次每次5min；加入1:5000稀释的兔抗羊酶标二抗50μL/孔，37℃15min，PBST洗涤3次；加TMB显色液100μL/孔，37℃避光显色10～15min，2M H₂SO₄ 50μL/孔终止反应，以肉眼观察颜色明显高于其它孔者所加亚类抗体为单抗亚类。

结果显示，单抗MAb 2D5亚类均为IgG2a。

2.单抗腹水效价的测定

使用包被缓冲液将检测抗原稀释至一定浓度，每孔100μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；将单抗腹水倍比稀释，每孔100μL，同样倍数稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔100μL，37℃孵育1.5h；PBST洗涤后，TMB显色，酶联检测仪测定OD450的值，以P/N值≥2.1为判定标准，测定单抗腹水效价。

结果显示，单抗MAb 2D5的效价为1：6553600。单抗MAb2D5的效价很高，显示利用其制备诊断试剂能产生高的灵敏性。。

3.单抗特异性的鉴定

采用间接ELISA方法鉴定单抗的特异性。将相同浓度的rGST-BoIP-10、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-BoIL-2、rGST-BoIL-2包被过夜；次日，PBST洗涤3遍，每遍5min，尽量将液体拍干，2％BSA的PBS封闭2h；PBST洗涤3遍，每遍5min，尽量将液体拍干，加入各株杂交瘤细胞上清，100μL/孔，37℃孵育2h；PBST洗涤6次，每次5min，将洗涤液尽量拍干，加入用1％BSA的PBS稀释至工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤6次，每次5min，将洗涤液尽量拍干，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H₂SO₄终止反应，50μL/孔，测定OD450值。

在间接ELISA试验中，单抗MAb 2D5只与rGST-BoIP-10反应，而不与原核表达的上述其它重组细胞因子反应，说明本发明杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体MAb 2D5与BoIP-10抗原蛋白具有较好的反应性和亲和力。

本实验确定了本发明制备的单克隆抗体MAb 2D5具有良好的特异性，仅能与牛IP-10特异性结合，显示具有制备高特异诊断试剂的特性。

4.流式细胞术鉴定单抗与天然抗原的反应性

无菌采取健康奶牛尾静脉血5mL加入含肝素钠的采血管中，将抗凝管上下颠倒混匀数次；在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌PBS 1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温2000rpm离心25min；管内液体分成三层，在血清和淋巴细胞分离液之间有一层可见的外周血单个核细胞云雾状层为淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温2000rpm离心10min，重复两次；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后，将细胞加入24孔板中，并分为2组，一组加入ConA刺激剂，终浓度为10μg/mL，另一组不加ConA刺激，置于37℃5％CO₂培养箱培养24h。刺激培养8h后，加入BFA阻断；次日，2000rpm 10min离心，收集细胞；使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，2000rpm 10min，离心，弃上清；加固定剂，室温静置作用15min；用含1％BSA的PBS洗涤细胞；2000rpm 10min离心，弃上清；在空白对照、加入ConA和未加入ConA刺激的三组中分别加入SP2/0腹水和单抗的腹水。用破膜剂稀释SP2/0腹水和单抗腹水，2μL/样；室温作用20min；用含1％BSA的PBS洗涤细胞；2000rpm 10min离心，弃上清；加入用含1％BSA的PBS稀释至工作浓度的FITC标记羊抗鼠IgG，室温避光作用20min，用含1％BSA的PBS洗涤2次，2000rpm 10min离心，弃上清；使用200μL含1％BSA的PBS重悬细胞，进行FACS检测。

流式细胞术检测结果显示，ConA刺激剂和未刺激组之间存在一定的差异，表明MAb2D5单抗可以识别牛天然IP-10，显示其能作为诊断试剂应用。

实施例4阻断ELISA试剂盒的组装：

阻断ELISA试剂盒的组装步骤如下：

1.制备辣根过氧化物酶标记的牛IP-10单克隆抗体(命名为HRP-MAb 2D5)：

称取辣根过氧化物酶(HRP)2mg于5mL离心管，以0.5mL去离子水溶解，此时溶液显红棕色立即避光保存；加入0.5mL新鲜配制的0.06mol/L高碘酸钠，此时溶液变青色，4℃避光作用30min；加入160mmol/L乙二醇0.5mL室温作用30min；加入纯化单克隆抗体2D5 2mg混匀，将混合液装入透析袋在2L 0.05mo1/L碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜；将透析液转入离心管中，加入0.2mL新鲜配制的5mg/mL硼氢化钠混匀，于4℃作用2h；加入等体积饱和硫酸铵4℃作用30min，以4000r/min离心20min弃上清，用PBS溶解沉淀4℃透析过夜，加等体积甘油，加入0.1％ProClin 300，0.45μm滤膜过滤，按110μL/支分装，2～8℃保存。

2.将辣根过氧化物酶标记的牛IP-10单克隆抗体，分别包装组装成试剂盒。

进一步的，试剂盒中依据需要组装入：包被抗原、封闭液、洗涤液、底物液、终止液的一种或多种。

实施例5牛外周血单个核细胞样品的阻断ELISA检测：

1.抗原包被

①96孔酶标板中加入2μg/mL的牛IP-10，100μL/孔，4℃过夜包被；

②弃包被液，使用含有0.05％吐温的PBST洗板3次，5min/次；

③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封闭2h；

④弃封闭液，使用PBST洗板3次，将96孔酶标板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。

2.制备牛外周血单核细胞

①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；

③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次；

④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/mL。

3.细胞孵育及检测

①在24孔细胞培养板中加入下列试剂：500μL培养液至每个对照孔，500μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入500μL细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时，吸取上清作为检测样品；

②将HRP标记MAb 2D5倍比稀释，分别与血浆上清1：1混合，37℃孵育2h；

③将HRP标记MAb 2D5、HRP标记MAb 2D5与血浆混合物分别加入牛IP-10包被ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

④PBST洗涤6次，每次5min，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H2SO4终止反应，50μL/孔，测定OD450值。根据OD450值算出抑制率，抑制率大于50％判断阳性，抑制率计算公式为：抑制率＝(OD未刺激组-OD刺激组)/OD未刺激组×100％。

结果显示表明该方法可以有效检测出ConA刺激牛外周血中T淋巴细胞分泌的牛IP-10，具有较好的灵敏度和特异性。

实施例6牛抗凝血浆样品的阻断ELISA检测：

1.抗原包被

①96孔酶标板中加入2μg/mL的牛IP-10，100μL/孔，4℃过夜包被；

②弃包被液，使用含有0.05％吐温的PBST洗板3次，5min/次；

③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封闭2h；

④弃封闭液，使用PBST洗板3次，将96孔酶标板直接用于检测，或放于密封袋中，置4℃保存，1周内使用。

2.全血孵育及检测

①无菌采取牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血，将血液加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至终浓度为10μg/mL，置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时，吸取血浆作为检测样品；

②将HRP标记MAb 2D5倍比稀释，分别与血浆上清1：1混合，37℃孵育2h；

③将HRP标记MAb 2D5、HRP标记MAb 2D5与血浆混合物分别加入牛IP-10包被ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

④PBST洗涤6次，每次5min，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H2SO4终止反应，50μL/孔，测定OD450值。根据OD450值算出抑制率，抑制率大于50％判断阳性，抑制率计算公式为：抑制率＝(OD未刺激组-OD刺激组)/OD未刺激组×100％。

结果见图1，从抗体量117.19ng至抗体量7.32ng的抑制率均高于50％，最高可达到85.05％，表明该方法可以有效检测出ConA刺激牛抗凝血浆中的牛IP-10，具有较好的灵敏度和特异性。当抗体含量仅为7.32ng时，其抑制率仍达～69.77％(>50％)，表明MAb 2D5单抗制备的阻断ELISA检测牛外周血单个核细胞样品具有相当高的灵敏度。

实施例7Western-blot试剂盒的组装：

Western-blot试剂盒的组装步骤如下：

1.制备辣根过氧化物酶标记的牛IP-10单克隆抗体(命名为HRP-MAb 2D5)：

称取辣根过氧化物酶(HRP)2mg于5mL离心管，以0.5mL去离子水溶解，此时溶液显红棕色立即避光保存；加入0.5mL新鲜配制的0.06mol/L高碘酸钠，此时溶液变青色，4℃避光作用30min；加入160mmol/L乙二醇0.5mL室温作用30min；加入纯化单克隆抗体2D5 2mg混匀，将混合液装入透析袋在2L 0.05mo1/L碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜；将透析液转入离心管中，加入0.2mL新鲜配制的5mg/mL硼氢化钠混匀，于4℃作用2h；加入等体积饱和硫酸铵4℃作用30min，以4000r/min离心20min弃上清，用PBS溶解沉淀4℃透析过夜，加等体积甘油，加入0.1％ProClin 300，0.45μm滤膜过滤，按110μL/支分装，2～8℃保存。

2.将辣根过氧化物酶标记牛IP-10单克隆抗体，分别包装组装成试剂盒。

进一步的，试剂盒中依据需要组装入：封闭液、洗涤液、底物液的一种或多种。

实施例8牛重组IP-10蛋白的Western-blot检测：

1.SDS-PAGE电泳

将纯化蛋白rHis-BoIP-10、rGST-BoIP-10分别加入5×SDS loading Buffer，100℃沸煮10min，进行SDS-PAGE电泳。

2.转印

电泳结束后，将凝胶置于转印Buffer中浸泡5min，同时将NC膜和滤纸同样浸泡，按照从下到上的顺序，2张滤纸-NC膜-凝胶-2张滤纸铺好后转至半干转印仪中，注意排去气泡。在Bio-Rad semi-Dry transfer Cell系统中以0.8mA/cm²转印2h。

3.检测

①用含5％脱脂奶的PBS封闭，室温摇晃封闭过夜；

②用PBST清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；

③加入用PBS 1:1000稀释的HRP-MAb 2D5，室温振荡作用2h；

④用PBST清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；显色，自来水终止反应，扫描仪拍照反应结果。

结果见图2，A部分示出重组GST-BoIP10的蛋白检测结果，B部分示出重组His-BoIP10蛋白检测结果。结果显示Western-blot方法可以有效检测大肠杆菌表达系统表达的牛IP-10蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。

实施例9牛外周血单个核细胞样品的Western-blot检测：

1.制备牛外周血单核细胞

①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；

③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次；

④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×10⁷个细胞/mL。

2.细胞孵育

①在24孔细胞培养板中加入下列试剂：500μL培养液至每个对照孔，500μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入500μL细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱培养24-48小时，收集细胞作为检测样品；

3.SDS-PAGE电泳

将细胞裂解液加入5×SDS loading Buffer，100℃沸煮10min，进行SDS-PAGE电泳。

4.转印

电泳结束后，将凝胶置于转印Buffer中浸泡5min，同时将NC膜和滤纸同样浸泡，按照从下到上的顺序，2张滤纸-NC膜-凝胶-2张滤纸铺好后转至半干转印仪中，注意排去气泡。在Bio-Rad semi-Dry transfer Cell系统中以0.8mA/cm²转印2h。

5.检测

①用含5％脱脂奶的PBS封闭，室温摇晃封闭过夜；

②用PBST清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；

③加入用PBS 1:1000稀释的HRP-MAb 2D5，室温振荡作用2h；

④用PBST清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；显色，自来水终止反应，扫描仪拍照反应结果。

结果显示Western-blot方法可以有效检测牛外周血单个核细胞分泌的天然牛IP-10蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。

实施例10间接免疫荧光(IFA)试剂盒的组装：

FCM试剂盒的组装步骤如下：

1.制备异硫氰酸荧光素标记的牛IP-10单克隆抗体(命名为FITC-MAb 2D5)：

将纯化MAb 2D5单抗采用标准异硫氰酸荧光素标记法进行标记。将待交联单抗MAb2D5(浓度≥1mg/ml)对交联反应液4℃透析三次，至pH为9.0；将新鲜配制的FITC(浓度为1mg/mL)溶于DMSO中；按P：F(蛋白质：FITC)＝1mg：150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；加入5mol/L的NH₄Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2h；将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮；进行交联物蛋白浓度、F/P比例的鉴定；FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％NaN₃、1％BSA，4℃避光保存。

2.将异硫氰酸荧光素标记牛IP-10单克隆抗体，分别包装组装成试剂盒。

进一步的，试剂盒中依据需要组装入：阻断剂BFA、APC标记针对牛CD4分子单抗、固定剂、破膜剂、细胞培养液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。

实施例11牛IP-10蛋白的间接免疫荧光(IFA)检测：

1.转染

①转染前24h，消化接种HEK293T细胞于24孔板中，2×10⁵个细胞/孔；

②加入1.5μL至含Opti-MEM的1.5mL指形管中至总体积50μL；

③分别加入重组质粒pVAX1-GFP-BoIP10和空载体质粒pVAX1各1μg，以及P3000TM2μL至含Opti-MEM的1.5mL指形管中至总体积50μL；

④分别加入含Opti-MEM 50μL，静置5min后，分别加入细胞板孔中，置培养箱继续培养。

2.细胞因子检测

①吸去细胞的培养上清，使用500μLPBS洗2次，加入500μL-20℃预冷的冰甲醇于-20℃固定10min；

②用500μL PBS洗3次，加入1:1000稀释的MAb 2D5单抗，置37℃水浴锅孵育2h；

③使用500μL PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠IgG，用PBS稀释至1:500的工作浓度，置37℃水浴1h；

④用500μL PBS洗3次，使用荧光倒置显微镜进行观察。

结果显示间接免疫荧光(IFA)方法可以有效检测真核表达系统表达的牛IP-10蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。

实施例12牛外周血单核细胞样品的间接免疫荧光(IFA)检测：

1.制备牛外周血单核细胞

①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；

③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次；

④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×10⁷个细胞/mL。

3.细胞因子检测

①吸去细胞的培养上清，使用500μL PBS洗2次，加入500μL-20℃预冷的冰甲醇于-20℃固定10min；

②用500μL PBS洗3次，加入1:1000稀释的MAb 2D5，置37℃水浴锅孵育2h；

③使用500μL PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠IgG，用PBS稀释至1:500的工作浓度，置37℃水浴1h；

④用500μL PBS洗3次，使用荧光倒置显微镜进行观察。

结果见图3，结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔(B)有明显绿色荧光，而对照样品孔(A)中没有绿色荧光，这表明该试剂盒可以有效检测出ConA刺激牛外周血中分泌牛IP-10的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。

实施例13FCM试剂盒的组装

FCM试剂盒的组装步骤如下：

1.制备异硫氰酸荧光素标记的牛IP-10单克隆抗体(命名为FITC-MAb 2D5)：

将纯化MAb 2D5单抗采用标准异硫氰酸荧光素标记法进行标记。将待交联单抗MAb2D5(浓度≥1mg/mL)对交联反应液4℃透析三次，至pH为9.0；将新鲜配制的FITC(浓度为1mg/mL)溶于DMSO中；按P：F(蛋白质：FITC)＝1mg：150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；加入5mol/L的NH₄Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2h；将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮；进行交联物蛋白浓度、F/P比例的鉴定；FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％NaN₃、1％BSA，4℃避光保存。

2.将异硫氰酸荧光素标记牛IP-10单克隆抗体，分别包装组装成试剂盒。

进一步的，试剂盒中依据需要组装入：阻断剂BFA、APC标记针对牛CD4分子单抗、固定剂、破膜剂、细胞培养液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。

实施例14牛外周血单核细胞样品的FCM检测

1.制备牛外周血单核细胞

①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；

②将抗凝血与灭菌PBS 1：1稀释后，再按1：1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rpm离心20-30min；

③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于4℃2000rpm离心10min，重复两次；

④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入10μL台酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×10⁷个细胞/mL。

2.细胞孵育

①在96孔细胞培养板中加入下列试剂：50μL培养液至每个对照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每个阳性孔。每孔加入50μL细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱培养5小时；

②加入细胞因子分泌阻断剂BFA，再放入37℃、5％CO₂培养箱培养16小时。

3.细胞因子检测

①次日收集细胞，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清；

②使用1％BSA的PBS溶液将APC标记针对牛CD4分子单抗稀释至0.5μg/mL，室温避光染色20min，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；

③加固定剂，室温静置作用15min；用含1％BSA的PBS洗涤细胞；于4℃2000rpm离心10min离心，弃上清，重复两次；

④使用破膜剂稀释特异性针对牛IL-2分子单抗FITC-MAb2D5至0.5μg/mL，室温作用20min，使用含1％BSA的PBS洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min离心，弃上清，重复两次；

⑤使用200μL PBS重悬细胞，进行荧光激活细胞分离法(FACS)检测分泌牛IP-10的T淋巴细胞比例。

结果见图4，结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔B中分泌牛IP-10的T淋巴细胞比例(14.21％)显著高于对照样品孔A(1.13％)，这表明该试剂盒可以有效检测出ConA刺激牛外周血中分泌牛IP-10的T淋巴细胞，具有较好的灵敏度和特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种分泌牛IP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株2D5或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株2D5保藏号为CCTCC NO:C2016122。

2.一种牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5，其由根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

3.一种检测牛IP-10的阻断ELISA检测试剂盒，所述阻断ELISA检测试剂盒包括支持介质、抗原和检测抗体，

其中，所述抗原为重组牛IP-10蛋白，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的根据权利要求2所述的牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5；所述抗原包被在支持介质中或所述抗原与支持介质分别放置；

优选地，所述试剂盒还包括下列试剂的一种或多种：

1)底物液；

2)洗涤液。

4.一种检测牛IP-10的阻断Western-Blot检测试剂盒，所述Western-Blot检测试剂盒包括检测抗体、酶标二抗，

其中，所述检测抗体为根据权利要求2所述的牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5，

优选地，酶标二抗为HRP标记羊抗鼠IgG；

更优选地，所述试剂盒还包括下列试剂的一种或多种：

1)封闭液；

2)底物液；

3)洗涤液。

5.一种检测牛IP-10的间接免疫荧光(IFA)检测试剂盒，所述间接免疫荧光(IFA)检测试剂盒包括检测抗体，荧光二抗，

其中，所述检测抗体为根据权利要求2所述的牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5，

优选地，荧光二抗为FITC标记羊抗鼠IgG；

更优选地，所述试剂盒还包括下列试剂的一种或多种：

1)固定剂；

2)洗涤液。

6.一种牛IP-10的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括标记抗体、检测抗体，

其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的根据权利要求2所述的牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5；

优选地，所述标记抗体为APC标记针对牛CD4单抗，

更优选地，所述试剂盒中还包括下列试剂的一种或多种：

1)阻断剂布雷菲德菌素Brefeldin(BFA)；

2)固定剂、破膜剂；

3)洗涤液。

7.根据权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。

8.根据权利要求2所述的牛IP-10单克隆抗体MAb 2D5在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。

9.根据权利要求3～6任一项所述的检测试剂盒在用于非诊断目的检测牛IP-10中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛IP-10的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、进出口检疫检验、流行病学研究。