CN104357404A - 一种杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学生物工程技术领域，具体涉及一种编号为CCTCCNO:C2014167的杂交瘤细胞及其分泌的抗前列腺小体蛋白的单克隆抗体LCZ4H3与应用。本发明以从慢性前列腺炎和前列腺癌患者体内分离的前列腺小体外泄蛋白为抗原，制备了单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌产生的单克隆抗体。该杂交瘤细胞能够稳定产生抗前列腺小体蛋白单克隆抗体，且细胞染色体稳定、抗体效价高，完全能够应用于前列腺小体蛋白的应用的研究中。该抗前列腺小体蛋白的单克隆抗体可应用于检测前列腺小体蛋白试剂的制备中。

Description

一种杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体与应用

技术领域

本发明属于医学生物工程技术领域，具体涉及一种抗前列腺小体外泄蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，并且由该杂交瘤细胞分泌的抗前列腺小体蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

慢性前列腺炎（chronic prostatitis, CP）因缺乏客观准确的诊断手段，临床的诊疗效果一直不理想。实验室检查在慢性前列腺炎诊断中具有重要作用，目前主要包括尿常规、前列腺按摩液（expressed prostatic secretion，EPS）常规检查、细菌学培养等。这些检查取材需要通过经肛门前列腺按摩取得前列腺液，再进行病原学培养。其特点为: ①有一定的痛苦；②对人体有侵袭性；③耗时较长；④费用较高。因此，亟需一种无创稳定、简便快捷，同时又准确可靠的生物标记物和诊断手段，作为慢性前列腺炎检测方法，为CP的筛选和诊断提供有效的工具，避免患者的侵入检查痛苦，提高患者的生活质量。

慢性前列腺炎中组织受到炎性细胞的浸润，从而释放出各种活性物质和趋化因子，一种称为前列腺小体的外泌蛋白通过解剖通道分泌进入男性生殖道。研究提示，前列腺疾病中可能存在表达前列腺小体蛋白质组的独特表型，已知的分子功能是多种多样的，包括结构膜蛋白、酶、监管蛋白和信号转导分子，如：CD13、CD26、CD59、MAC抑制剂、CD46以及高浓度的Zn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺等。慢性前列腺炎病程中，多种致病因子启动Wnt途径，Wnt信号通路异常表达，相应下游活性物质增加，与前列腺小体的释放和表型的变化均有密切的关系。高浓度的前列腺小体可以在精液、前列腺液中发现，电镜下有两种形态：小、黑色的，外面紧包电子致密物；大的，浅色的，不致密的结构，直径40-500nm。有脂质双层膜，多层融合排列，富含胆固醇。相似的结构也可以在前列腺细胞系的培养液中发现。前列腺小体的主要成分是鞘磷脂，含有磷酸胆碱和神经酰胺。胆固醇和磷脂的比例是二比一，而典型的哺乳动物细胞膜上的此种比例是一比一。前列腺小体蛋白有多重生理功能，在CD59、CD52、CD55的参与下，通过一系列生化反应，可以保护酸性环境中的精子，延迟顶体反应，增强精子的活力。前列腺小体CD42、TF可抑制PMN细胞的NADPH酶的活性使反应性氧核素（ROS）减少并具有抑制病毒活性及抗菌的作用。佛波醇酯（PMA）化学诱导肽-MLP能刺激PMN产生ROS，前列腺小体能抑制PMA和MLP的作用，抑制NADPH氧化酶的活性。由于前列腺小体胆固醇/磷脂比例高，鞘磷脂含量高，导致脂质成分从前列腺小体向PMN转移，使血浆中PMN细胞膜硬化，抑制PMN中NADPH氧化酶的活性，从而起到抗菌抗氧化作用。有证据表明，在精液中存在血液凝固成分和纤维蛋白溶解系统成分。正因为前列腺小体的TF成分，精液的血液凝固活性可以阻止感染因素，包括HIV。在培养皿实验条件下，小剂量的前列腺小体呈现出对肺炎球菌、地衣形杆菌、侧孢杆菌、Megatenium杆菌的强烈抑制作用，这种抗菌活性与细胞膜的变性密切相关。在扫描电镜下，可直接观察到前列腺小体粘附到光滑的细菌包膜表面，是其外观逐渐变粗破裂，引起细菌死亡。

前列腺小体(prostasomes)是存在于前列腺液中的直径约30~150纳米的超微结构，由前列腺上皮或间质细胞等外吐(exocytosis)或外泄(excretion)形成，与其他组织中的外吐小体(exosome) 结构、大小、成分相似但不相同。虽然目前外吐途径、信号传导机制了解甚少，但近年来研究发现，前列腺小体中存在核酸、蛋白、糖类、脂肪和小分子代谢物等。在精液中前列腺小体比中性粒细胞发挥更强的抗菌功能。前列腺小体可作为强有力的抗氧化剂，中和白细胞的ROS作用。前列腺小体的特殊的脂质结构和成分是其抗氧化抗菌功能的关键因素，推测在炎症的过程中可以检测到前列腺小体，同时此研究为开发新类型的抗菌药物提供了理论基础。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一株抗前列腺小体蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌的抗前列腺小体蛋白的单克隆抗体，并且提供了该抗体在检测前列腺小体蛋白中的应用，在慢性前列腺炎的检测和诊断中具有重要作用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种杂交瘤细胞（mus musculus hybridoma) ，其分类命名杂交瘤细胞株LCZ4H3，保藏编号为CCTCC NO：C2014167。

本发明提供了上述杂交瘤细胞的制备方法：用前列腺小体蛋白蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA 检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗前列腺小体蛋白单克隆抗体，即获得抗前列腺小体蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞。

具体地，所述前列腺小体蛋白蛋白免疫BALB/C 小鼠具体为：取前列腺小体蛋白蛋白30μg 加等质量福氏完全佐剂对BALB/C 小鼠进行第一次免疫注射；2 周后取前列腺小体蛋白蛋白50μg 加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C 小鼠进行第二次免疫注射；4 周后取前列腺小体蛋白蛋白50μg 对BALB/C 小鼠进行第三次免疫注射；6 周后取前列腺小体蛋白蛋白50μg 对BALB/C 小鼠进行第四次强化注射。

具体地，所述HAT 培养具体操作为：用含20% 胎牛血清的HAT 选择性培养基与杂交瘤细胞混匀并加入到种有饲养细胞的96孔板中培养2 周。

具体地，所述ELISA 检测具体操作为：杂交瘤细胞培养上清液加入到前列腺小体蛋白包被的酶标板中于37℃孵育20min，洗涤后以工作浓度为1:2500 的标准加HRP 标记的羊抗鼠IgG 于37℃孵育20min，然后加邻苯二胺底物显色15min 后终止反应。

经过上述方法制备后，最终筛选出能够稳定分泌抗前列腺小体蛋白的杂交瘤细胞，命名为LCZ4H3，并于2014年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学。保藏编号为CCTCC  NO：C2014167。

本发明还提供了一种抗前列腺小体蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO：C2014167 的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗前列腺小体蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水，本发明优选为：

将保藏编号为CCTCC NO：C2014167的杂交瘤细胞传代培养，取对数生长期的细胞计数，小鼠腹腔接种1×10⁶个/只，诱导腹水，离心，收集上清，用透析法纯化抗前列腺小体蛋白单克隆抗体。

本发明所述保藏编号为CCTCC NO：C2014167 的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗前列腺小体蛋白单克隆抗体均为IgG1 型，效价较高，直接培养的上清可达1:2000，小鼠腹水可达14mg/ml，效价可达1:10000，完全能够应用于前列腺小体蛋白应用研究。

本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO：C2014167的杂交瘤细胞在制备抗前列腺小体蛋白单克隆抗体中的应用。

由以上技术方案可知，本发明提供了一株抗前列腺小体蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌产生的抗前列腺小体蛋白单克隆抗体，该杂交瘤细胞能够稳定产生抗前列腺小体蛋白单克隆抗体，且细胞染色体稳定、抗体效价高，完全能够应用于前列腺小体蛋白的应用的研究中。主要包括：

所述的单克隆抗体LCZ4H3在制备前列腺小体蛋白检测试剂盒中的应用，上述试剂盒包含有保藏编号为CCTCC NO：C2014167的杂交瘤细胞分泌的抗前列腺小体蛋白的单克隆抗体。

所述的单克隆抗体LCZ4H3在制备检测前列腺小体蛋白的胶体金快速检测试纸条中的应用，上述的试纸条包含有保藏编号为CCTCC NO：C2014167的杂交瘤细胞分泌的抗前列腺小体蛋白的单克隆抗体。

附图说明

图1为前列腺小体蛋白的胶体金快速检测试纸条示意图。

生物保藏信息说明：本发明的生物材料，其分类命名为杂交瘤细胞株LCZ4H3，于2014年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称为CCTCC），地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2014167。

具体实施方式

以下对本发明原理和特征进行举实例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1、杂交瘤细胞LCZ4H3及其产生的抗前列腺小体蛋白的单克隆抗体的获得。

1．前列腺小体蛋白的提取

取500毫升慢性前列腺炎病人晨尿中段尿，加入等量HEPES缓冲液(pH7.3) 和蛋白酶抑制剂(美国Sigma公司), 用纱布过滤。于-40℃以下条件保存备用。取尿液样品过滤液，分别置于10只50毫升离心管，在4℃低温下400g离心10分钟。去沉淀，取上清液。在4℃低温下10,000g离心20分钟。去沉淀，取上清液。分别置于200只3毫升超速离心管，在4℃低温下100，000g离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。加入2.5毫升TBS缓冲液(pH7.8)和蛋白酶抑制剂(美国Sigma公司)，混匀。在4℃低温下100,000g离心120分钟。倒去上清液，取沉淀。分别溶于2.5毫升0.5 % NP-40，80mM NaCl, 0.2% Deoxycholate, 50 mM Tris, pH 8.0和蛋白酶抑制剂(美国Sigma公司)。在4℃低温下100，000g离心20分钟。取上清液，是为前列腺小体蛋白。-80℃冷冻保存。

2．前列腺小体蛋白鉴定

蛋白标准：用分光光度计法，波长560nm（1mg/ml IgG 吸光值为1.34）测定，蛋白含量≥3mg/ml。

3. 杂交瘤细胞的制备

3.1选6只8-12周龄Balb/C小鼠进行肌肉内免疫，初次免疫用50ug/ml前列腺小体蛋白加弗氏完全佐剂。两周后，用25ug/ml 前列腺小体蛋白加弗氏不完全佐剂强化免疫2次，每次间隔2周。最后一次用25ug/ml前列腺小体蛋白肌肉注射强化免疫（不含佐剂），3天后尾部采血，ELISA检测血清抗体效价。

3.2 杂交瘤细胞融合筛选:融合前4天将阳性小鼠强化免疫，小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0比例为 10 :1，PEG(分子量1500)融合，选择培养基为含HAT的RPMI640培养基。10天后，ELISA 筛选杂交瘤细胞上清，用有限稀释法对抗体分泌阳性杂交瘤细胞进行克隆，经过4次筛选最终确定5株细胞为阳性细胞。

3.3间接 ELISA 法 用2ug/ml的抗原（前列腺小体蛋白）50ul/孔包被96孔板，1小时，用洗液洗涤3次，加100μl/孔封闭液在37℃封闭2h，洗涤3次，拍干。加入待测样品（血清）， 第一孔1 : 800稀释，往下1 : 2的梯度倍比稀释，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。取辣根酶标记的羊抗鼠IgG按照1 : 2500倍稀释，100ul/孔加入板子，37℃孵育30min，洗涤4次，拍干。最后加入TMB 100ul/孔，37。显色15-30min。然后加入终止液(2M H₂SO₄) 50μl/孔。以450nm单波长测定各孔OD值，并用阳性对照孔OD值（1: 800），作为判断阳性或者确定效价的临界点。结果为血清效价为1 : 128000的阳性小鼠，可以用于细胞融合。

3.4间接ELISA法检测所有阳性5株细胞是否能够特异识别前列腺小体蛋白，以 前列腺小体蛋白为抗原，可以看出，一株命名为LCZ4H3的阳性细胞可以与前列腺小体蛋白特异结合，说明LCZ4H3可以特异识别前列腺小体蛋白。经筛选得到能稳定分泌抗人前列腺小体蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LCZ4H3，该杂交瘤细胞株LCZ4H3的分类命名为小鼠杂交瘤细胞mus musculushybridoma，已于2014年9月11日保藏于保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO: C2014167。

4．单克隆抗体LCZ4H3的生产及纯化

4.1同系小鼠单克隆抗体腹水的制备：采用动物体内生产单抗的方法。每只Balb/C小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml，7天后，每只小鼠腹腔注射1× 10⁶个小鼠杂交瘤细胞（mus musculus hybridoma) LCZ4H3。7天后观察小鼠腹水生产情况，如腹部明显膨大，即可抽取腹水。腹水采集后 13000RPM离心10min除去油脂和沉淀，收集上清液，即为腹水单克隆抗体。

4.2 纯化采用硫酸铵沉淀和透析法，纯化腹水单克隆抗体。

5．单克隆抗体特性鉴定 

5.1 采用 Sigma分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类，杂交瘤细胞株LCZ4H3分泌的单克隆抗体的重链为IgG1，轻链为Kappa型。

5.2 ELISA效价的测定  采用间接ELISA测定纯化的腹水单克隆抗体，2μg/ml的抗原100μl/孔包被96孔板做ELISA，结果显示纯化后效价为1: 25600。

5.3抗体的分子质量鉴定：采用SDS-PAGE进行测定单克隆抗体，显示单克隆抗体的重链约为 46KD，轻链约为25KD。

5.4 单抗浓度测定：紫外分光法测定单克隆抗体在280nm和260nm处的吸光度值A280和A260。结果为蛋白质含量为14 mg/ml。

蛋白含量按照下列公式计算：

蛋白质含量（g/L) =1.45×A280-0.74×A260。

实施例2、单克隆抗体LCZ4H3在制备前列腺小体蛋白检测试剂盒中的应用。

本试剂盒采用酶联免疫法定量检测人体前列腺小体外泄蛋白前列腺小体蛋白（间接ELISA方法）：

1．将稀释为一定比例的前列腺小体蛋白包被在96孔板中(B1-F1孔)，其余孔加尿液标本，37℃恒温箱孵育1小时，洗板机洗板后，加BSA封闭，每孔100微升，37℃恒温箱孵育40分钟，洗板5次。加入单克隆检测抗体LCZ4H3，37℃恒温箱孵育40分钟，洗板后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG, 37℃恒温箱孵育20分钟，洗板后避光显色，然后加入终止液，终止反应。用酶标仪测定各反应孔在双波450,630 nm处的OD值。根据不同浓度的标准品OD值绘出标准曲线，将病人的数值与阳性标准孔数值比较，从而得出被测试者尿样本的实际前列腺小体蛋白浓度。

2.自配清洗液，显色剂，终止液:清洗液为含0.05%吐温-20的PBS溶液；显色剂A含柠檬酸，乙酸钠，过氧化脲；显色剂B含柠檬酸，EDTA，TMB盐酸盐，硫代硫酸钠溶液；终止液为2mol/L H2SO4。

3.分析精密度：批内变异：用两个浓度水平的样本（炎症和正常人）各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV。批间差：用3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，各重复10次，计算30次结果的平均值M和标准差SD，求出变异系数CV。

4．样本检测: 用间接ELISA方法检测前列腺炎症和正常人尿样本。根据临床样本检测真阳性a，假阳性b，假阴性c，真阴性d，求出检测灵敏度，特异度，阳性预期值，阴性预期值并计算Cutoff值。

表1 患者和正常人群中前列腺小体蛋白含量比较（ng/ml）

 

* Note:    Z=10.74    P<0.05

炎症患者尿液中前列腺小体蛋白含量与正常人相比较明显升高，统计学有显着性差异。

4.1 灵敏度、特异度、符合率评价

按方案要求对200例样本进行临床金标准和考核试剂的两种检测。计算前列腺小体蛋白检测试剂盒临床检测的灵敏度、特异性、总符合率、阳性预期值、阴性预期值等统计学结果，整理成表2。

表2 临床诊断和考核试剂前列腺小体蛋白检测临床数据归纳表

 

灵敏度= a/（a+c）×100%=124/140×100%=88.57%

特异度= d/（b+d）×100%=54/60×100%=90%

总符合率=（a+d）/（a+b+c+d）=(124+54)/200×100%=89%；

实施例3、单克隆抗体LCZ4H3在制备检测前列腺小体蛋白的胶体金快速检测试纸条中的应用。

1．采用免疫层析双抗体夹心法原理接胶体金标记技术制成，用于定性检测尿液标本中的前列腺小体蛋白。在试剂条的检测区包被有抗前列腺小体蛋白抗体(T)，质控区包被有抗鼠IgG抗体(C)。检测时，尿液标本中的前列腺小体蛋白蛋白与试剂条上事先固相的单克隆抗体LCZ4H3胶体金结合成结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区，与膜上的LCZ4H3抗体起反应(T)，出现一条红色条带。无论标本中是否存在前列腺小体蛋白，当液面继续迁移至固定羊抗鼠区带时，质控区必定出现一条红色条带。

2．检测区(T)红色条带的颜色如果比质控区(C)红色条带的颜色深或者相近，则提示阳性结果，提示被测者有罹患慢性前列腺炎的可能；检测区(T)红色条带的颜色如果比质控(C)红色条带的颜色浅，则提示阴性结果，表明被测者未有慢性前列腺炎；质控区(C)红色条带同时作为试剂的内控标准，有助于判定样本量是否足够或层析过程是否正常。如图1所示：

阳性：出现两条有色条带，且检测线等于或深于对照线的显色。

检测线和对照线颜色一致，提示有有罹患慢性前列腺炎的可能；

检测线比对照线颜色深，表明有罹患慢性前列腺炎的可能。

阴性：仅在对照区出现一条色带或检测线浅于对照线。

出现一条色带，即对照线显色，检测线不显色，表示未患病；

出现两条有色条带，检测线比对照线明显浅色，表示未患病。

无效：对照线不显色，表明试验失败或试剂失效。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，其分类命名杂交瘤细胞株LCZ4H3，保藏编号为CCTCC NO: C2014167。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞由以下方法制备获得：前列腺小体蛋白蛋白免疫BALB/C 小鼠，然后取BALB/C 小鼠脾细胞与SP2/0 细胞在聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT 培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA 检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗前列腺小体蛋白单克隆抗体，即获得抗前列腺小体蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞。

3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述前列腺小体蛋白蛋白免疫BALB/C 小鼠具体为：取前列腺小体蛋白蛋白30μg 加等质量福氏完全佐剂对BALB/C 小鼠进行第一次免疫注射；2 周后取前列腺小体蛋白蛋白50μg 加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C 小鼠进行第二次免疫注射；4 周后取前列腺小体蛋白蛋白50μg 对BALB/C 小鼠进行第三次免疫注射；6 周后取前列腺小体蛋白蛋白50μg 对BALB/C 小鼠进行第四次强化注射。

4.根据权利要求2 所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述HAT 培养具体操作为：用含20% 胎牛血清的HAT 选择性培养基与杂交瘤细胞混匀并加入到种有饲养细胞的96孔板中培养2 周；所述ELISA 检测具体操作为：杂交瘤细胞培养上清液加入到前列腺小体蛋白包被的酶标板中于37℃孵育20min，洗涤后以工作浓度为1:2500 的标准加HRP 标记的羊抗鼠IgG 于37℃孵育20min，然后加邻苯二胺底物显色15min 后终止反应。

5.权利要求1所述的杂交瘤细胞在制备抗前列腺小体蛋白单克隆抗体中的应用。

6.一种抗前列腺小体蛋白单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCC NO：C2014167的杂交瘤细胞分泌产生。

7.权利要求6所述的单克隆抗体在制备前列腺小体蛋白检测试剂盒中的应用。

8.权利要求6所述的单克隆抗体在制备检测前列腺小体蛋白的胶体金快速检测试纸条中的应用。

9.一种检测前列腺小体蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求6所述的单克隆抗体。

10.一种检测前列腺小体蛋白的胶体金快速检测试纸条，其特征在于，包含权利要求6所述的单克隆抗体。