CN103509760B - 可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用 - Google Patents
可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC No：C2013130。该杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的抗β2-微球蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在β2-微球蛋白检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法具有显著的优势。此外，本发明还涉及一种该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体、该杂交瘤细胞及其单克隆抗体的应用。
Description
技术领域
本发明涉及β2-微球蛋白免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用。
背景技术
β2微球蛋白以下简称β2M，是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11800，由99个氨基酸组成的单链多肽，电泳在β2区。β2M是细胞表面人类淋巴细胞抗原（HLA）的β链（轻链）部分（为一条单链多肽），分子内含一对二硫键，不含糖，与免疫球蛋白稳定区的结构相似。β2M广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。正常人β2M的合成率及从细胞膜上的释放量相当恒定，且不受年龄、性别、机体肌肉组织多少的影响。β2M可以从肾小球自由滤过，99.9%在近端肾小管吸收，并在肾小管上皮细胞中分解破坏，测定血β2M比血肌酐能更好地反映肾小球滤过率（GFR）的变化。研究发现血β2M与GFR显著负相关，而与血肌酐、尿素氮显著正相关，血β2M评价肾功能比血肌酐更敏感。血β2M测定可更早地发现肾小球功能受损，各种原发或继发性肾小球病变累及肾小球滤过功能时，均可使血β2M增高。正常情况下β2M的排出是很微量的，从而血清中β2M含量是肾损害诊断的早期指标。
血清β2M增高，除因肾小球过滤降低外，另一个原因是合成增加，如恶性增生性病变及结缔组织病变，如肺癌、肾癌、乳腺癌以及消化系统恶性肿瘤等，会导致血液中游离的β2M水平异常升高。因此，近几年，β2M成为一种重要的肿瘤血清学诊断标志物而被广泛关注。
发明内容
基于此，有必要提供一种可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
此外，还有必要提供上述杂交瘤细胞或其分泌的单克隆抗体在医学检测领域的应用。
一种可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2013130。
上述可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在制备诊断肾脏损伤疾病或肿瘤的检测试剂或检测设备领域的应用。
上述可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在制备β2-微球蛋白检测试剂或检测设备领域的应用。
一种由上述可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
上述单克隆抗体在制备诊断肾脏损伤疾病或肿瘤的检测试剂或检测设备领域的应用。
上述单克隆抗体在制备β2-微球蛋白检测试剂或检测设备领域的应用。
一种β2-微球蛋白检测试剂盒，包括上述单克隆抗体。
在其中一个实施例中，所述β2-微球蛋白检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包括200-220mol/L Tris缓冲液、5-10mmol/L聚乙二醇、1-5mmol/L叠氮钠、1-5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及1-5mmol/L牛血清白蛋白；所述第二试剂包括200-220mmol/L Tris缓冲液、结合有所述单克隆抗体的胶乳颗粒、1-5mmol/L吐温-20、0.5-3mmol/L叠氮钠、1-5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及1-5mmol/L牛血清白蛋白。
上述杂交瘤细胞，命名为β2M-2B1，于2013年8月28日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心（即中国典型培养物保藏中心），保藏号是CCTCC No：C2013130。
上述杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的抗β2-微球蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在β2-微球蛋白检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法具有显著的优势，易于实现高通量、自动化检测。
附图说明
图1为当检测原β2M天然抗原，包被浓度为2μg/mL时，β2M单抗效价测定结果图；
图2为临床定值样品，实施例2的试剂盒测定值与实际值相关性图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用作进一步详细的说明。
本实施方式的可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC No：C2013130。该杂交瘤细胞可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体。该杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可应用在制备β2-微球蛋白检测试剂或检测设备领域中，从而可广泛应用在制备诊断肾脏损伤疾病或肿瘤的检测试剂或检测设备领域中。
本实施方式还提供了一种β2-微球蛋白检测试剂盒，其含有上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，具体是将该单克隆抗体包裹在乳胶颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，校准品或待测样品中的β2-微球蛋白可与单克隆抗体乳胶颗粒发生凝聚反应，形成抗原抗体复合物而产生浊度，其浊度高低在一定量抗体存在时与样品中的β2-微球蛋白成正比。通过测定特定波长的吸光度值，参照校准曲线即可计算出待测样品中β2-微球蛋白的含量。具体在本实施方式中，该β2-微球蛋白检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂。其中，第一试剂包括200-220mol/L Tris缓冲液、5-10mmol/L聚乙二醇、1-5mmol/L叠氮钠、1-5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及1-5mmol/L牛血清白蛋白。第二试剂包括200-220mmol/L Tris缓冲液、上述结合有所述单克隆抗体的胶乳颗粒、1-5mmol/L吐温-20、0.5-3mmol/L叠氮钠、1-5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及1-5mmol/L牛血清白蛋白。其他所需的检测试剂可以根据需要直接在实验室制备。
该单克隆抗体除了应用于上述检测剂盒外，还可以用于其他β2-微球蛋白检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本实施方式的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团（如磁性微球、辣根过氧化酶等），或将本实施方式的单克隆抗体作为包被抗体（例如ELISA）可用于其他形式的β2-微球蛋白检测试剂或设备中。
该杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的抗β2-微球蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在β2-微球蛋白检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法具有显著的优势。
以下为具体实施例部分
实施例1杂交瘤细胞株的建立与抗β2-微球蛋白单克隆抗体的制备
1.抗原免疫
将重组β2-微球蛋白抗原（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001）等量与弗氏完全佐剂(外观：琥珀色细胞悬浮液；组份：ParaffinOil85%，Mannide Monooleate15%，Mycobacterium smegmatis1mg/mL)混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠（广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只）背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫（等量抗原与弗氏不完全佐剂混合），增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。
融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。
2.杂交瘤细胞株的制备
（1）饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75%酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液（含HAT的RPMI1640完全培养液中）重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5%CO2培养过夜。
（2）免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI1640基础培养液重悬，如此重复三次，得到免疫脾细胞，计数。
（3）骨髓瘤细胞的制备
小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计数。
（4）细胞融合及HAT选择杂交瘤
将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI1640基础培养液洗1次，1200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL50%的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的RPMI1640筛选培养液轻轻重悬，平分于10块96孔板，50μL/孔，37℃，5%CO2培养。培养至第六天，换HAT培养液（含HAT的RPMI1640完全培养液）两次。
（5）抗体的检测
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释天然β2-微球蛋白（ADVY），使其终浓度为5μg/mL。每孔0.1mL，加入96孔聚苯乙烯板，37℃2小时或4℃过夜。次日，用含10%小牛血清或1%脱脂奶粉的0.02M pH7.2PBS，0.15mL/孔，37℃封闭2小时，用于检测。融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37℃30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001），37℃30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1%（M/V）邻苯二胺，0.1%（V/V）双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。RPMI1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值的比≧2.0为阳性细胞孔。
分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10%DMSO的培养液冻存，细胞密度为106个/mL。细胞融合一次共获得1株能稳定分泌抗体的细胞株，命名为β2M-2B1（CCTCC No：C2013130）细胞株。
3.单克隆抗体的制备
选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7-10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5-10mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。
取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱（购自AmershamBiosciences公司）。然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280nm下的吸收值达到基线为止。再用0.1M的甘氨酸洗脱液（pH2.5）洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0.1M Tris（pH8.8）中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，-20℃分装冻存。
4.效价测定
以间接ELISA法检测，上述杂交瘤细胞培养上清效价2.18×103，腹水抗体效价1.59×106。具体实验步骤如下：
（1）包被：将β2天然抗原（ADVY）稀释至2μg/mL，100μL/孔加至酶标板，37℃2小时或者4℃过夜；
（2）用洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；
（3）用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔150μL，37℃放置1.5-2小时；
（4）洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；
（5）加样品：分别将稀释成不同梯度的细胞培养上清和腹水加入用β2天然抗原包被好的酶标板，100μL/孔，37℃反应1小时（同时做阴性对照孔和阳性对照孔）；
（6）洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；
（7）加辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗（用封闭液稀释6000倍），100μL/孔，37℃反应1小时；
（8）洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；
（9）加显色液TMB：即用即配，100μL/孔，37℃避光反应30分钟；
（10）终止反应：于各反应孔中加入2M的硫酸，50μL/孔；
（11）酶标仪读数：450nm，630nm波长测定，最终测定该杂交瘤细胞培养上清与β2天然抗原的反应效价为1.1×104，腹水抗体与β2-天然抗原反应效价为2.1×106。
通过ELISA法，在450nm，630nm波长测定吸光度，用抗体亚类鉴定试剂盒，对β2-微球蛋白单抗类、亚类进行鉴定，表1为鉴定结果。
表1β2-微球蛋白单抗类型鉴定结果
图1为当检测原β2M天然抗原，包被浓度为2μg/mL时，β2M单抗效价测定结果图。
5.单克隆抗体鉴定
亲和力：上述β2M-2B1杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体以ELISA法检测，其亲和力常数（Kaff）为8.66×109。以下为具体测定β2M-2B1杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亲和力的过程：
采用紫外吸收法测定纯化后单抗的浓度，即：
蛋白浓度(mg/mL)=1.45×OD280nm﹣0.74×OD260nm
采用ELISA方法计算亲和常数，步骤如下：将4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL RBP重组抗原分别包板酶标板，加入已知浓度且进行倍比稀释的抗RBP单抗，其它同上述效价测定步骤。最后以各单抗不同浓度的对数值为横坐标，以其相应的450nm，630nm波长吸光度为纵坐标，绘制出不同浓度抗原的三条反应曲线，取各曲线上部趋于平坦段的数值为OD-100，查出其OD-50点的单抗浓度[Ab]t，故可得[Ab]t，[Ab′]t和[Ab〞]t三个值，按下列Beatty等推导公式计算Kaff值：
当包被抗原浓度为2μg/mL时：
Kaff1=1/2（2[Ab′]t-[Ab]t）
或Kaff2=1/2（2[Ab〞]t-[Ab′]t）
1μg/mL时：Kaff3=3/2（4[Ab〞]t-[Ab]t）
这样单抗每次测定可得三个Kaff值，平均值即其亲和力常数Kaff。
实施例2β2-微球蛋白乳胶免疫比浊法检测试剂盒
1、本实施例的检测试剂盒的主要试剂配制如下：
试剂R1:200mmol/L Tris缓冲液、8mmol/L聚乙二醇、5mmol/L叠氮钠、5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及5mmol/L牛血清白蛋白。
试剂R2：200mmol/L Tris缓冲液、结合有β2-微球蛋白单克隆抗体的胶乳颗粒5%（v/v）、5mmol/L吐温-20、3mmol/L叠氮钠、5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及5mmol/L牛血清白蛋白。
β2-微球蛋白校准品：在0.9%生理盐水中加入不同含量的β2-微球蛋白，除菌过滤，所述的β2-微球蛋白校准品含量控制在0-18mg/L，这些校准品均为无色透明液体。
2试剂盒的使用方法
（1）试剂准备，试剂为液体双试剂，开瓶即用，其中试剂R1：200mmol/LTris缓冲液、8mmol/L聚乙二醇、5mmol/L叠氮钠、5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及5mmol/L牛血清白蛋白；试剂R2：200mmol/L Tris缓冲液、结合有β2-微球蛋白单克隆抗体的胶乳颗粒5%（v/v）、5mmol/L吐温-20、3mmol/L叠氮钠、5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及5mmol/L牛血清白蛋白；β2-微球蛋白校准品。
（2）检测步骤（在全自动生化分析仪中完成）
本实施例描述的β2-微球蛋白检测试剂盒。适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如下，采用两点终点法，具体步骤如下，240μL试剂R1加入3μL样本于37℃5min后加入60μL试剂R2，反应0.5min后在550nm条件下检测2.5min的吸光度变化；检测波长主波长570nm，副波长700nm。通过校准品中β2-微球蛋白浓度与吸光度变化的关系，建立校准曲线，测定待检样品中的吸光度值，参照校准曲线即可计算得到样品中的β2-微球蛋白浓度。
该试剂盒结果准确性强、试剂稳定性好、使用方便、便于大规模推广。
实施例3β2-微球蛋白乳胶免疫比浊法检测试剂盒的应用
用实施例2试剂盒检测200份正常人血清及100份临床定值标本，结果见表2，200份正常人血清检测结果见表3，100份临床定值标本检测结果见表4。
表2试剂盒临床样本检测结果
表3实施例2试剂盒正常人血清样品检测结果
表4发明试剂盒临床样品检测结果
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCCNo：C2013130。
2.如权利要求1所述的可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在制备诊断肾脏损伤疾病或肿瘤的检测试剂或检测设备领域的应用。
3.如权利要求1所述的可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在制备β2-微球蛋白检测试剂或检测设备领域的应用。
4.一种由如权利要求1所述的可分泌抗β2-微球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的单克隆抗体在制备诊断肾脏损伤疾病或肿瘤的检测试剂或检测设备领域的应用。
6.如权利要求4所述的单克隆抗体在制备β2-微球蛋白检测试剂或检测设备领域的应用。
7.一种β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包括200-220mol/L Tris缓冲液、5-10mmol/L聚乙二醇、1-5mmol/L叠氮钠、1-5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及1-5mmol/L牛血清白蛋白；所述第二试剂包括200-220mmol/L Tris缓冲液、结合有所述单克隆抗体的胶乳颗粒、1-5mmol/L吐温-20、0.5-3mmol/L叠氮钠、1-5mmol/L乙二胺四乙酸钠以及1-5mmol/L牛血清白蛋白。
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