CN110642949B - 一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β2‑微球蛋白单克隆抗体的制备方法。该方法首先筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列分别作为第一、第二抗原表位，再在第一、第二抗原表位的碳端氨基酸上分别连接1个半胱氨酸，通过SMCC偶联方法将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白的伯胺基偶联，获得体外合成的β2‑MG双表位多肽抗原；然后利用双表位多肽抗原对小鼠进行常规免疫、分离出脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合；最后筛选出阳性单克隆细胞，经腹腔注射及腹水回收提取出单克隆抗体。本发明通过对传统单表位抗原免疫方法进行改进，优化了抗原的免疫原性，缩短了免疫周期，提高了免疫阶段的血清效价，从而提升了抗β2‑MG的阳性单克隆抗体获得效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法。
背景技术
β2微球蛋白简称β2-MG，是一种源自淋巴细胞、血小板及多形核白细胞分泌的小分子球蛋白，由99个氨基酸组成的单链线性多肽，分子量为11800。β2-MG是HLA-Ⅰ类分子的组成部分，正常人血清中β2-MG的浓度处于0.5-2.0mg/L范围，β2-MG被排泄到体外的唯一脏器为肾脏，当发生肾功能不全时，因β2-MG的排泄障碍导致患者体内血清β2-MG浓度为正常人的60倍，当β2-MG在组织中过度沉积容易诱发β2-MG相关淀粉样病变。研究发现血清中β2-MG的水平与肾小球滤过率(GFR)呈现显著负相关，通过血清中β2-MG变化可以更早的发现肾小球功能受损【1】。
目前β2-MG的临床检测方法主要为放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)，这些方法均需要β2-MG的单克隆或多克隆抗体。但是，由于β2-MG参与形成组织相容性复合体(MHCⅠ和MHCⅡ)或类似二聚体，导致人与小鼠的β2-MG具有一定同源性，因此实施天然抗原免疫融合后的小鼠很难获得较多数量的阳性单克隆抗体【2】【3】。为解决上述问题，传统的方案是对特定目标表位片段氨基酸序列通过真核表达系统体外表达，利用单一抗原表位多肽设计及体外合成的方法实施免疫和杂交瘤融合，但是也很难获得较高数量阳性单克隆抗体，本研究已经给予证实。
参考文献
1.Calabrese M F,Miranker AD.Formation of a stable oligomer of beta-2microglobulin requires only transient encounter with Cu(II).Journal ofMolecular Biology,2007,367(1)：1-7.
2.Frey B F,Jiang J,Sui Y,Boyd L F,et al.Effects of cross-presentation,antigen procession,and peptide binding in HIV Evasion of T cellimmunity.Journal of Immunology,2018,200(5):1853-1864.
3.Joseph W,Becker and George N,Reeke JR.Three-dimensional structureofβ2-microglobulin.Proc.Natl.Acad Sci,1985,82:4225-4229.
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备β2-微球蛋白(β2-MG)单克隆抗体的方法。本发明基于传统体外合成单一抗原表位偶联载体提高免疫原性方法基础上，实施同一载体连接两个不同的双抗原表位，通过提高免疫原性和有效基团数从而提高免疫效果，在保障合成肽免疫原性的同时，有效提升β2-微球蛋白(β2-MG)单克隆抗体阳性率。本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：
(1)基于NCBI平台以及IEDB平台筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列IQRTPKIQVYSRHPAEN和YLLYYTEFTPTEK分别作为第一抗原表位和第二抗原表位；
(2)在第一抗原表位的末端天冬酰胺N及第二抗原表位的末端酪氨酸Y上分别连接1个半胱氨酸Cys，然后利用SMCC偶联方法将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白KLH的伯胺基偶联使得两个多肽表位序列同时连接到KLH分子上，作为体外合成的β2-MG双表位多肽抗原；
(3)采用β2-MG双表位多肽抗原对8w龄BALb/C小鼠进行3次连续免疫后，在最后一次免疫3天后取其脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合；细胞融合后采用间接ELISA方法进行筛选，对阳性杂交瘤细胞株使用有限稀释法克隆，得到的抗β2-MG抗体的单克隆细胞经腹腔注射及腹水回收提取出抗β2-MG的单克隆抗体。
本发明中，步骤(1)中，经web.expasy.org平台中疏水性和表面可接触性指标筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列。
和现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明将传统的单一表位免疫方法进行优化为双表位免疫，在保障体外合成多肽抗原表位免疫原性基础上，通过增加抗原表位数，从而有效提升β2-微球蛋白(β2-MG)单克隆抗体阳性率。
本方法通过增加抗原表位数，从而实现制备和增加抗β2-MG的单克隆抗体数。与单一表位抗原制备抗β2-MG的单克隆抗体相比，含两个表位的抗原经免疫融合后制备的抗β2-MG的单克隆抗体的数量会进一步得到提升。本发明生产的单克隆抗体与β2-MG天然抗原发生特异性反应，且获得了3种不同的特异性单克隆抗体：抗β2-MG多肽表位1的单克隆抗体、抗β2-MG多肽表位2的单克隆抗体、抗β2-MG双表位多肽抗原3的单克隆抗体。
附图说明
图1是β2-MG的不同抗原表位疏水性得分(Hphop·Kyte&Doolittle)；其中：A、B、C、D、E、F分别是表位序列1#、2#、3#、4#、5#、6#的疏水性得分；1#表位序列YLLYYTEFTPTEK；2#表位序列IQRTPKIQVYSRHPAEN；3#表位序列VTLSQPKIVKWDRDM；4#表位序列AENGKSNFL；5#表位序列HPSDIEVDL；6#DWSFYLLYYTE。
图2是β2-MG的不同抗原表位氨基酸的表面可及性。
图3β2-MG多肽抗原1组的特异性间接ELISA检测结果。
图4β2-MG多肽抗原2组的特异性间接ELISA检测结果。
图5β2-MG多肽抗原3组的特异性间接ELISA检测结果。
图6β2-MG天然抗原4组的特异性间接ELISA检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。
本发明采用双多肽表位连接同一载体体外合成方法，此方法是基于NCBI平台和IEDB平台，首先，基于NCBI平台www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3CIQ_L中β2-MG的氨基酸序列以及IEDB平台http://www.iedb.org中β2-MG的理论抗原表位，对其表位信息归类并整理所有理论表位氨基酸序列，经web.expasy.org平台中疏水性(Hphob.Kyte&Doolittle)和表面可及性(％Accessible residues)指标筛选，从理论上筛选出免疫原性相对较强的β2-MG抗原多肽表位1(IQRTPKIQVYSRHPAEN)和抗原多肽表位2(YLLYYTEFTPTEK)，
根据β2-MG的不同抗原表位氨基酸疏水性(图1)及表面可及性(图2)初步比较，依据疏水性得分越低且表面可触比例越高则免疫原性越好的原则，筛选获得的免疫原性最佳的第一抗原表位和第二抗原表位。为进一步提高多肽抗原表位免疫原性，首先将第一、第二抗原表位的碳端氨基酸分别连接1个半胱氨基酸作为键桥，将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白(KLH)的伯胺基通过SMCC偶联方法将第一、第二抗原表位分别与1个KLH分子连接，形成多肽抗原1(IQRTPKIQVYSRHPAEN-Cys-KLH)和多肽抗原2(YLLYYTEFTPTEK-Cys-KLH)；其次，通过将第一抗原表位和第二抗原表位的C段分别连接1个半胱氨酸，然后通过SMCC偶联方法将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白(KLH)的伯胺基偶联使得两个抗原表位序列同时连接到KLH分子上，作为体外合成的β2-MG双表位多肽抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-KLH-CYS-YLLYYTEFTPTEK)。
在相同免疫程序基础上，使用β2-MG多肽抗原1(IQRTPKIQVYSRHPAEN-Cys-KLH)、多肽抗原2(YLLYYTEFTPTEK-Cys-KLH)、多肽抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-KLH-CYS-YLLYYTEFTPTEK)及β2-MG天然抗原对8w龄BALb/C小鼠分别免疫，每种抗原免疫3只，共计12只。经过3次连续免疫后，对12只小鼠血清效价进行ELISA检测，在最终免疫3日后采集脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞，并与已经公知的骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合。
本发明使用的融合剂为聚乙二醇(又称PEG)，融合方法与通常的方法相同。骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞以1:10进行混合，选择浓度为45％，分子量为5000的PEG进行融合。杂交瘤融合使用含20％FBS的完全培养基饲养层细胞培养，融合后16小时补充5×HAT选择培养基培养，融合后第10-14天，采用有限稀释法，对目标抗体产生细胞株进行检测及单克隆化筛选，计算获得的阳性克隆率(％)，见下式：
阳性克隆率(％)＝(阳性孔/融合孔)×100％
获得产生目标抗体的单克隆细胞株的方法，主要采用间接ELISA法，选择产生目标抗体的杂交瘤细胞，所产生的抗体与β2-MG天然抗原发生特异性反应且与标记其他载体的此相同表位抗原发生反应。
具体来说，杂交瘤单克隆细胞培养上清中的单克隆抗体与固相化处理后的纯化β2-MG抗原发生反应，之后与标记有抗IgG的抗体发生反应，通过间接ELISA法筛选出可以产生抗β2-MG抗体的单克隆杂交瘤细胞。获得的杂交瘤细胞进一步培养，筛选纯化产生抗β2-MG抗体的单克隆细胞，获得的阳性β2-MG抗体的单克隆细胞经腹腔注射及腹水回收提取大量抗β2-MG的单克隆抗体。
以下是对本发明的具体实施措施及详细数据的描述，描述过程中未详细描述各种过程和方法，这些过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实例1抗β2-MG单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
a使用由非专利文献(Andreas Gloger,Danilo Ritz,Tim Fugmann,DarioNeri.Cancer Immunol Immunother,2016,65(11):1377-1393；Heyder T,Kohler M,Tarasova N K,et al.Approach for Identifying Human Leukocyte Antigen(HLA)-DRBound peptides from Scarce Clinical Samples.)所述的氨基酸序列且由GL Biochem合成纯化的多肽抗原1(IQRTPKIQVYSRHPAEN-Cys-KLH)、抗原2(YLLYYTEFTPTEK-Cys-KLH)及抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-KLH-CYS-YLLYYTEFTPTEK)采用离子色谱法制备。将1mg合成β2-MG多肽抗原1、2、3和天然β2-MG抗原分别与1ml pH7.2 PBS溶液均匀混合稀释成浓度为1mg/ml抗原溶液。
b选择12只体重(18-22g)、周龄(8w)及性别(雌性)均差异不显著的Balb/c小鼠，随机分为三组即抗原1组、抗原2组、抗原3组和天然抗原组，每组各3只重复。四组均接受相同的免疫程序，免疫程序为：第0d皮下注射80μg抗原(含CFA)+第14d皮下注射100微克抗原(含IFA)+28d腹腔注射100微克抗原(含PBS)+35d血清抗体效价检测。四组均于第35天，用经β2-MG天然抗原包被的ELISA96孔板进行尾静脉血清抗体水平检测，ELISA检测结果抗β2-MG(+)抗原的小鼠尾血血清效价，采集脾脏并用淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞，将分离的脾淋巴细胞与小鼠的细胞SP2/0以50％PEG介导条件下融合。融合后的细胞及培养液(20％FBS+1640培养液)以40μl/孔铺板到含80μl/孔饲养层96孔板中，培养16h后加入80μl/孔5×HAT选择培养基进行筛选，培养第7-8天全部更换为200μl含2％HT+20％FBS+1640的培养基进行克隆培养，待克隆大小为孔面积的1/8以上进行检测。融合后第7天将HAT筛选培养基更换为HT培养基，同时计算融合率(96孔板中融合孔占整板的比例)，比较四组抗原免疫结果及融合结果，见表1。
表1四组不同的β2-MG抗原的血清效价及融合率比较
实例2抗β2-MG的四种抗原的单克隆抗体的ELISA检测及鉴定
a分别将由PBS稀释后终浓度为1μg/ml的多肽检测抗原1(IQRTPKIQVYSRHPAEN-Cys-OVA)、多肽检测抗原2(YLLYYTEFTPTEK-Cys-OVA)、多肽检测抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-OVA-CYS-YLLYYTEFTPTEK)和β2-MG天然抗原溶液加入到96孔酶标板的小孔中，4℃过夜放置一晚，第二天将多肽检测抗原1、多肽检测抗原2、多肽检测抗原3及β2-MG天然抗原溶液包被的96孔酶标板用洗液(含0.05％Tween的PBS缓冲液)清洗两次，然后用封闭液(1％BSA)室温封闭酶标板两个小时，封闭结束后将封闭液倒掉，在吸水纸上拍干，贴上封闭纸放置到-20℃保存。
b融合后第10-14d，将实例1获得的杂交瘤细胞以每孔分别取100μl细胞上清液加入到96孔酶标板，室温孵育1小时，将上清液倒掉，用洗液(含有0.05％Tween的PBS缓冲液)在洗板机上洗涤3个循环后，取下96孔酶标板于吸水纸上拍干，然后加入100μlHRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG抗体到96孔酶标板的小孔中，室温孵育1小时，用洗液洗涤2次，加入100μl TMB显色液(3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺)室温显色3min，50μl1M的HCl终止反应后，于450nm波长吸光度检测，挑取与阳性的克隆对照孔吸光度值最高的单克隆孔，并进行进一步的亚克隆筛选，融合后初次检测结果，见表2。通过对四组融合后产生的抗检测抗原1(IQRTPKIQVYSRHPAEN-Cys-OVA)、抗检测抗原2(YLLYYTEFTPTEK-Cys-OVA)、抗检测抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-OVA-CYS-YLLYYTEFTPTEK)和抗β2-MG天然抗原的阳性克隆细胞比例比较可知，β2-MG多肽抗原3组获得的抗对应抗原(+)且抗β2-MG天然抗原(+)的融合孔阳性率最高。
表2四组不同的β2-MG抗原的融合阳性率比较单位：[n＝个，n/％]
备注：每只鼠融合后铺20块96孔细胞培养板，共计1920个融合孔/只鼠；对应抗原即分别为多肽检测抗原1(IQRTPKIQVYSRHPAEN-Cys-OVA)、多肽检测抗原2(YLLYYTEFTPTEK-Cys-OVA)、多肽检测抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-OVA-CYS-YLLYYTEFTPTEK)和β2-MG天然抗原
实例3抗β2-MG天然抗原(+)单克隆抗体杂交瘤细胞的克隆化培养
实例2中所获得的阳性杂交瘤细胞MC经过有限稀释法稀释后挑选阳性单克隆实施克隆化培养。具体方法如下：分别将实例2获得的抗天然抗原(+)的杂交瘤细胞进行计数，经过梯度稀释制备为浓度为1个/200μl的单细胞悬液，将200μl单细胞悬液加入到96孔细胞培养板的小孔中，于37℃5％二氧化碳培养箱中培养，培养约9d左右选择单克隆孔上清液进行间接ELISA检测，设置阴性对照(PBS)和阳性对照(β2-MG抗原免疫效价高的小鼠眼血清)，挑选吸光度(OD)值高于阳性对照孔且为单克隆的杂交瘤细胞进行连续3次稀释传代，最终选择吸光度(OD)值高于阳性对照孔，细胞形态完整、大小均匀、生长状态正常且经0.4％台盼蓝染色活细胞率达98％以上的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养、建系及冻存。
实例4抗β2-MG天然抗原(+)的单克隆抗体的腹水生产
首先，确定Pristane预刺激时间表；其次，选择10-12周龄健康的Balb/c雌性鼠，在计划注射细胞前10-14d用Pristane预刺激小鼠，于小鼠下腹部中线右侧注射0.5ml/只；第三，杂交瘤单克隆细胞腹腔接种前1-2d用新鲜1640培养基(含有10％FBS)传代杂交瘤细胞保证其处于对数期，同时用0.4％台盼蓝染色确定注射当天杂交瘤细胞活力在95％以上；第四，在Pristane腹腔注射第7-10d，将实例4最终获得细胞活力95％以上且处于对数期的杂交瘤细胞悬液加入15ml离心管中，200g离心5min，弃后用D-PBS重悬调整细胞含量为0.6-1.2×106个/ml，在重悬后1h内尽快腹腔注射，用带有21号针头的无菌注射器实行腹腔注射0.5ml/只；第五，对于杂交瘤细胞注腹腔射24h内的小鼠，注意观察健康状况，同时于杂交瘤细胞注射后7-10d观察并无菌收集腹水，对每次获得的腹水合并后经1500g离心10min，去除上层油脂同时将离心后的腹水上清转移到50ml离心管中，以1:1000的比例加入硫柳汞，混匀后保存于4℃。
实例5间接ELISA法对抗β2-MG特定表位抗原(+)且抗天然抗原(+)的单克隆抗体的特异性检测
首先，对实例4获取的腹水经辛酸沉淀法进行纯化处理，将透析纯化后的不同抗体做好名称标记；其次，对纯化后的所有抗体均分别加入到含有β2-MG天然抗原的ELISA包被板子中，进行间接ELISA检测(参见实例2)，筛选出与β2-MG天然抗原发生反应的抗体(结果同表2)；第三，对筛选出的抗天然β2-MG抗原的抗体用PBS(pH 7.4)以1:10000的比例稀释，分别加入到经多肽检测抗原1(IQRTPKIQVYSRHPAEN-Cys-OVA)、多肽检测抗原2(YLLYYTEFTPTEK-Cys-OVA)、多肽检测抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-OVA-CYS-YLLYYTEFTPTEK)及β2-MG天然抗原包被的ELISA板子中进行间接ELISA检测，结果详见表3和图3，表4和4，表5和图5、表6和图6。由表3和图3可知，β2-MG多肽抗原1组共计获得8株抗特定抗原表位1(IQRTPKIQVYSRHPAEN)和天然β2-MG抗原的单克隆抗体；由表4和图4可知，β2-MG多肽抗原2组共计获得12株抗特定抗原表位2(YLLYYTEFTPTEK)和天然β2-MG抗原的单克隆抗体；由表5和图5可知，β2-MG多肽抗原3组共计获得30株抗特定抗原表位(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-KLH-CYS-YLLYYTEFTPTEK),同时由β2-MG多肽抗原3免疫获得了2株(C17和C19)对多肽抗原1、多肽抗原2、多肽抗原3及天然抗原均产生阳性反应的单克隆抗体。
本发明获得的抗β2-MG单克隆抗体，经过与天然β2-MG包被的抗原进行酶联免疫反应(ELISA)检测可知，与传统的单一表位多肽抗原1和2相比，实施双表位多肽抗原3免疫可显著提升抗β2-MG天然抗原(+)的阳性克隆比例，经腹水接种扩增抗β2-MG天然抗原的阳性单克隆抗体。
本发明获得的单克隆抗体与β2-MG的多肽检测抗原1(IQRTPKIQVYSRHPAEN-Cys-OVA)发生反应(图3和表3)、与多肽检测抗原2(YLLYYTEFTPTEK-Cys-OVA)发生反应(图4和表4)或多肽检测抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-OVA-CYS-YLLYYTEFTPTEK)发生特异性反应(图5和表5)，且均与β2-MG天然抗原均发生特异性反应。
表3 β2-MG多肽抗原1组的特异性间接ELISA检测结果
表4 β2-MG多肽抗原2组的特异性间接ELISA检测结果
表5 β2-MG多肽抗原3组的特异性间接ELISA检测结果
表6 β2-MG天然抗原4组的特异性间接ELISA检测结果
本发明经体外合成的双表位多肽抗原3(IQRTPKIQVYSRHPAEN-CYS-OVA-CYS-YLLYYTEFTPTEK)与单表位多肽抗原1和抗原2在相同免疫程序下比较可知，多肽抗原3免疫的实验鼠经天然抗原包被ELISA板检测证实，其血清抗体效价最高且融合后获得的抗天然β2-MG的阳性杂交瘤细胞比例最高。除此之外，β2-MG多肽抗原3免疫获得的单克隆抗体涵盖了抗多肽抗原1的单克隆抗体、抗多肽抗原2的单克隆抗体或抗多肽抗原3的单克隆抗体，且均具有与天然β2-MG发生特异性反应，增加了抗天然β2-MG单克隆抗体的种类和数量。
因此，本发明经体外合成的β2-MG双表位多肽抗原免疫方法，通过增加抗原表位数，有效提升了β2-微球蛋白(β2-MG)单克隆抗体阳性率，同时本发明方法中获得的抗β2-MG天然抗原的抗体适用于通常的免疫学测定方法中的任意一种，包括竞争性ELISA法、双抗体Elisa夹心法、免疫层析法及乳胶凝胶法等，本抗体适用于任意β2-MG的免疫学测定。
Claims (2)
1.一种β2-微球蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)基于NCBI平台以及IEDB平台筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列IQRTPKIQVYSRHPAEN和YLLYYTEFTPTEK分别作为第一抗原表位和第二抗原表位；
(2)在第一抗原表位的末端天冬酰胺N及第二抗原表位的末端酪氨酸Y上分别连接1个半胱氨酸Cys，然后利用SMCC偶联方法将半胱氨酸的巯基与蓝钥蛋白KLH的伯胺基偶联使得两个多肽表位序列同时连接到KLH分子上，作为体外合成的β2-MG双表位多肽抗原；
(3)采用β2-MG双表位多肽抗原对8w龄BALb/C小鼠进行3次连续免疫后，在最后一次免疫3天后取其脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合；细胞融合后采用间接ELISA方法进行筛选，对阳性杂交瘤细胞株使用有限稀释法克隆，得到的抗β2-MG抗体的单克隆细胞经腹腔注射及腹水回收提取出抗β2-MG的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，经web.expasy.org平台中疏水性和表面可接触性指标筛选出免疫原性相对较强的两个多肽表位序列。
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