CN113049812B - 一种检测克百威的elisa方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒，属于医疗技术领域。本发明提供的一种检测克百威的ELISA方法，包括以下步骤：S1.合成克百威半抗原；S2.制备克百威免疫原；S3.制备克百威包被原；S4.制备克百威单克隆抗体；S5.制备酶标二抗；S6.制备酶标板；S7.建立克百威标准品浓度相对吸光度的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的吸光度推算待测样品中克百威的实际浓度。本发明提供的一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒，能够快速对克百威进行检测，具有灵敏度高、特异性好、准确度高等优点。

Description

一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒
技术领域
本发明是一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒，属于酶联免疫检测技术领域。
背景技术
克百威，化学名称为2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃-N-甲基氨基甲酸酯，其作为杀虫剂广泛用于防治棉花、花生、烟草和大豆等作物害虫。克百威杀虫效果好，但是对人和野生动物的毒性很高，在粮食和蔬菜上过量使用克百威会对人体健康造成伤害，并且污染土壤和地下水源，造成环境污染。
目前，检测克百威残留的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和液-质联用法(HPLC-MS)，这些检测方法虽然灵敏准确，但是成本高、费时长。酶联免疫分析(ELISA)方法具有样品容量高、检测速度快、成本低等优点，酶联免疫分析试剂盒的质量很大程度上由抗原和抗体的性能决定，敏感性强和结合速度快的抗体有利于提高试剂盒的灵敏度和特异性。
CN107462715B公开了一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其应用，其中，试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次具有结合有克百威半抗原-载体蛋白偶联物的第一检测线、结合有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的第二检测线以及结合有羊抗鼠多克隆抗体的质控线，本发明还提供了装有上述试纸条的试剂盒及试剂盒在同时检测样品中克百威和异丙威的残存中的应用。本发明提供的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒可以同时实现克百威和异丙威残留的检测，检测准确性高，具有高灵敏度、高特异性的特点，能够实现简单快速检测，操作简便，适合于大规模筛选。
检测克百威时，合成的克百威半抗原的纯度对相应抗原和抗体的性能产生，从而影响了试剂盒检测克百威的特异性和灵敏度。
发明内容
针对现有技术存在不足，本发明的目的是提供一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒，能够快速对克百威进行检测，具有灵敏度高、特异性好、准确度高等优点。
为了实现上述目的，本发明提供了一种检测克百威的ELISA方法，包括以下步骤：S1.合成克百威半抗原；S2.制备克百威免疫原；S3.制备克百威包被原；S4.制备克百威单克隆抗体；S5.制备酶标二抗；S6.制备酶标板；S7.建立克百威标准品浓度相对吸光度的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的吸光度推算待测样品中克百威的实际浓度；
步骤S4包括以下步骤：将步骤S2得到的克百威免疫原注入小鼠体内使其产生抗血清前，利用BSA对小鼠进行初次免疫，之后取小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞融合，测定细胞上清液，筛选阳性孔，对阳性孔进行克隆化，得到分泌克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
采用上述方案，先利用BSA对Balb/c小鼠进行初次免疫，使后注入Balb/c小鼠体内的克百威免疫原更容易产生免疫应答，在细胞融合和克隆化过程中，取小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞融合，使步骤S4制备的克百威单克隆抗体敏感性提高，结合速度加快，从而提高了此检测方法的灵敏度、特异性和准确度。
优选的，步骤S4还包括以下步骤：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成0.5-2×105个/mL的细胞悬液，在液氮中保存，经复苏、培养、采集腹水、纯化后，冷冻保存。
优选的，步骤S4中，小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞的数量比为8-12:1。
优选的，步骤S4中，BSA和克百威免疫原的注射量为110-130μg/只。
优选的，步骤S1中，克百威半抗原的合成步骤如下：
1)以呋喃酚、氯甲酸对硝基苯酯为原料，以二氯甲烷为溶剂，同时加入三乙胺，合成中间体，合成路线如下；
2)将步骤1)得到的中间体和氨基丁酸为原料，以四氢呋喃和饱和碳酸钠溶液为溶剂，合成克百威半抗原，合成路线如下：
采用上述方案，步骤1)中加入的三乙胺能够促进中间体的合成，有利于提高克百威半抗原的纯度，从而提高检测的特异性和灵敏度。
优选的，步骤S1的步骤1)中，呋喃酚与三乙胺的用量比为10-15mg:2-7μL。
优选的，步骤S1的步骤1)中，将呋喃酚和氯甲酸对硝基苯酯分别溶于二氯甲烷后再进行反应，其中，呋喃酚与二氯甲烷的用量比为10-15mg:1-4mL，氯甲酸对硝基苯酯与二氯甲烷的用量比为12-18mg:2-5mL。
采用上述方案，将呋喃酚、氯甲酸对硝基苯酯分别溶于二氯甲烷中再进行反应，并且提高了二氯甲烷的用量，能够使呋喃酚与氯甲酸对硝基苯酯之间反应的更彻底，有利于提高克百威半抗原的纯度，从而提高检测的特异性和灵敏度。
优选的，步骤S1的步骤2)中，将氨基丁酸溶于饱和碳酸钠溶液，中间体溶于四氢呋喃溶液后，再进行反应，氨基丁酸的用量为1-5mg，饱和碳酸钠溶液的用量为1-5mL，中间体的用量为2-8mg，四氢呋喃的用量为1-5mL。
优选的，步骤S2具体为，将步骤S1制备的克百威半抗原溶于DMF中，加入碳二亚胺盐酸盐，搅拌，加入溶解有BSA的PBS缓冲液，继续反应，离心后用PBS透析，得到克百威免疫原，克百威半抗原的加入量为2-8mg，DMF的加入量为0.1-0.5mL，碳二亚胺盐酸盐的加入量为0.2-3mg，BSA的加入量为40-60mg。
优选的，步骤S3具体为，将克百威半抗原、N-羟基琥珀亚胺和二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中反应，离心，取上清液吹干，加入DMF和溶解有OVA的PBS缓冲液，经离心和透析后得到克百威包被原。
优选的，步骤S5具体为，以山羊作为免疫动物，以克百威单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到克百威抗体，将克百威抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标二抗。
本发明还提供一种采用上述检测克百威的ELISA方法的ELISA试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)首先利用BSA对Balb/c小鼠进行初次免疫，使后注入Balb/c小鼠体内的克百威免疫原更容易产生免疫应答。
(2)在细胞融合和克隆化过程中，取小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞融合，使制备的克百威单克隆抗体敏感性提高，结合速度加快，从而提高了此检测方法和试剂盒的灵敏度、特异性和准确度。
(3)合成克百威半抗原时，加入三乙胺，同时提高二氯甲烷的用量，有利于提高克百威半抗原的纯度，从而提高检测的特异性和灵敏度。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
本发明提供一种检测克百威的ELISA方法，包括以下步骤：
S1.合成克百威半抗原；
在本实施例中，克百威半抗原的合成步骤如下：
1)将12mg呋喃酚溶于2mL二氯甲烷中，加入5μL三乙胺，在冰浴下搅拌，将15mg氯甲酸对硝基苯酯溶于3mL二氯甲烷中缓慢滴加，完毕，撤去冰浴缓慢恢复至室温，继续反应3h，TLC监控反应完全后，加入浓盐酸，调节溶液的pH至弱酸性，分液，得到的水相利用10mL二氯甲烷萃取多次，合并有机相，利用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得油状物，用10mL无水乙醚打浆得到中间体，其中，TLC监控反应中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为10:1，合成路线如下；
2)将3mg氨基丁酸溶于2mL饱和碳酸钠溶液中，冰浴，取5mg步骤1)得到的中间体溶于2mL四氢呋喃溶液，然后缓慢滴加到氨基丁酸的碳酸钠溶液中，完毕，升至室温搅拌过夜，TLC监控反应完毕后，过滤，滤液用浓盐酸调节pH至4-5，利用5mL乙酸乙酯萃取3次后，合并有机相，利用无水硫酸钠干燥，浓缩，所得残余物利用体积比为1:2的乙酸乙酯和石油醚的混合物重结晶，得到克百威半抗原，其中，TLC监控反应中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:2，合成路线如下：
S2.制备克百威免疫原；
将步骤S1制备的5mg克百威半抗原溶于0.2mLDMF中，加入1mg碳二亚胺盐酸盐，于25℃搅拌4h，取50mgBSA溶解于2mL 0.01mol/L的PBS缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应24h，将反应物离心后用0.01mol/L的PBS透析3d，每12h换液一次，得到克百威免疫原。
S3.制备克百威包被原；
将5mg克百威半抗原、2.5mgN-羟基琥珀亚胺和5mg二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中30℃震荡反应2h，将反应物4000r/min离心15min，取上清液吹干，加入0.2mLDMF，取40mgOVA溶解于2mL 0.01mol/LPBS缓冲液中，加入到反应物中于25℃反应24h，将反应物离心后用0.01mol/LPBS透析3d每12h换液一次，得到克百威包被原，-20℃保存备用。
S4.制备克百威单克隆抗体；
1)动物免疫：将BSA注入到Balb/c(6周)小鼠体内，进行初次免疫，从第二次开始将步骤S2得到的免疫原注入到小鼠体内，注入的BSA和免疫原免疫剂量均为120μg/只，皮下注射结合腹腔注射免疫，使其产生抗血清；
2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按数量配比为10:1的比例与FO骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3)细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×105个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
4)单克隆抗体的生产与纯化：采用动物体内诱生单克隆抗体方法，7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。
S5.制备酶标二抗；
以山羊作为免疫动物，以克百威单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到克百威抗体。将克百威抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标二抗。
S6.制备酶标板；
用包被缓冲液(pH8.0磷酸盐)将步骤S3制备的克百威包被原稀释成1μg/mL，每孔加入100μL，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然后在每孔中加入150μL封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
S7.建立克百威标准品浓度相对吸光度的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的吸光度推算待测样品中克百威的实际浓度；
1)组建检测克百威的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
a)包被克百威偶联抗原的酶标板；
b)克百威标准品溶液6瓶(溶剂为含10％甲醇的pH值为7磷酸盐缓冲液)，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L；
c)用辣根过氧化物酶标记的克百威抗体；
d)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
e)终止液为2mol/L硫酸；
f)洗涤液为pH值为7.2，含有0.01％吐温-20、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；
g)复溶液为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
2)用试剂盒检测克百威
加50μL标准溶液或样本到对应的微孔中，再加入克百威抗体50μL/孔，最后加入酶标二抗50μL/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头轻轻戳破)。加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15min。加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪检测波长450nm，参比波长620nm，测定每孔OD值。
3)试剂盒检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值除以第一个标准品(0标准)的吸光度值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以克百威标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克百威的实际浓度。
实施例1重复进行三个批次实验。
实施例2
具体同实施例1，所不同的是：
步骤S1中，克百威半抗原的合成步骤如下：
1)将10mg呋喃酚溶于1mL二氯甲烷中，加入4μL三乙胺，在冰浴下搅拌，将12mg氯甲酸对硝基苯酯溶于2mL二氯甲烷中缓慢滴加，完毕，撤去冰浴缓慢恢复至室温，继续反应2h，TLC监控反应完全后，加入浓盐酸，调节溶液的pH至弱酸性，分液，得到的水相利用13mL二氯甲烷萃取多次，合并有机相，利用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得油状物，用13mL无水乙醚打浆得到中间体，其中，TLC监控反应中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为10:1；
2)将1mg氨基丁酸溶于1mL饱和碳酸钠溶液中，冰浴，取7mg步骤1)得到的中间体溶于4mL四氢呋喃溶液，然后缓慢滴加到氨基丁酸的碳酸钠溶液中，完毕，升至室温搅拌过夜，TLC监控反应完毕后，过滤，滤液用浓盐酸调节pH至4-5，利用5mL乙酸乙酯萃取3次后，合并有机相，利用无水硫酸钠干燥，浓缩，所得残余物利用体积比为1:2的乙酸乙酯和石油醚的混合物重结晶，得到克百威半抗原，其中，TLC监控反应中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:2。
步骤S2为，将步骤S1制备的2mg克百威半抗原溶于0.1mLDMF中，加入2mg碳二亚胺盐酸盐，于25℃搅拌4h，取40mgBSA溶解于2mL 0.01mol/L的PBS缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应24h，将反应物离心后用0.01mol/L的PBS透析3d，每12h换液一次，得到克百威免疫原。
步骤S3为，将2mg克百威半抗原、1mgN-羟基琥珀亚胺和2mg二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中30℃震荡反应2h，将反应物4000r/min离心15min，取上清液吹干，加入0.3mLDMF，取30mgOVA溶解于2mL0.01mol/LPBS缓冲液中，加入到反应物中于25℃反应24h，将反应物离心后用0.01mol/LPBS透析3d每12h换液一次，得到克百威包被原，-20℃保存备用。
步骤S4中，步骤1)中BSA和克百威免疫原的免疫剂量均为110μg/只，步骤2)小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞的数量比为8:1，步骤3)单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成0.5×105个/mL的细胞悬液。
实施例3
具体同实施例1，所不同的是：
步骤S1中，克百威半抗原的合成步骤如下：
1)将12mg呋喃酚溶于4mL二氯甲烷中，加入2μL三乙胺，在冰浴下搅拌，将16mg氯甲酸对硝基苯酯溶于5mL二氯甲烷中缓慢滴加，完毕，撤去冰浴缓慢恢复至室温，继续反应4h，TLC监控反应完全后，加入浓盐酸，调节溶液的pH至弱酸性，分液，得到的水相利用6mL二氯甲烷萃取5次，合并有机相，利用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得油状物，用13mL无水乙醚打浆得到中间体，其中，TLC监控反应中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为10:1；
2)将5mg氨基丁酸溶于5mL饱和碳酸钠溶液中，冰浴，取8mg步骤1)得到的中间体溶于5mL四氢呋喃溶液，然后缓慢滴加到氨基丁酸的碳酸钠溶液中，完毕，升至室温搅拌过夜，TLC监控反应完毕后，过滤，滤液用浓盐酸调节pH至4-5，利用5mL乙酸乙酯萃取3次后，合并有机相，利用无水硫酸钠干燥，浓缩，所得残余物利用体积比为1:2的乙酸乙酯和石油醚的混合物重结晶，得到克百威半抗原，其中，TLC监控反应中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:2。
步骤S2为，将步骤S1制备的8mg克百威半抗原溶于0.5mLDMF中，加入3mg碳二亚胺盐酸盐，于25℃搅拌4h，取60mgBSA溶解于2mL 0.01mol/L的PBS缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应24h，将反应物离心后用0.01mol/L的PBS透析3d，每12h换液一次，得到克百威免疫原。
步骤S3为，将8mg克百威半抗原、3mgN-羟基琥珀亚胺和6mg二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中30℃震荡反应2h，将反应物4000r/min离心15min，取上清液吹干，加入0.4mLDMF，取50mgOVA溶解于2mL0.01mol/LPBS缓冲液中，加入到反应物中于25℃反应24h，将反应物离心后用0.01mol/LPBS透析3d每12h换液一次，得到克百威包被原，-20℃保存备用。
步骤S4中，步骤1)中BSA和克百威免疫原的免疫剂量均为115μg/只，步骤2)小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞的数量比为11:1，步骤3)单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1.5×105个/mL的细胞悬液。
实施例4
具体同实施例1，所不同的是：
步骤S1中，克百威半抗原的合成步骤如下：
1)将14mg呋喃酚溶于3mL二氯甲烷中，加入7μL三乙胺，在冰浴下搅拌，将18mg氯甲酸对硝基苯酯溶于4mL二氯甲烷中缓慢滴加，完毕，撤去冰浴缓慢恢复至室温，继续反应3h，TLC监控反应完全后，加入浓盐酸，调节溶液的pH至弱酸性，分液，得到的水相利用15mL二氯甲烷萃取2次，合并有机相，利用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得油状物，用15mL无水乙醚打浆得到中间体，其中，TLC监控反应中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为10:1；
2)将4mg氨基丁酸溶于4mL饱和碳酸钠溶液中，冰浴，取2mg步骤1)得到的中间体溶于1mL四氢呋喃溶液，然后缓慢滴加到氨基丁酸的碳酸钠溶液中，完毕，升至室温搅拌过夜，TLC监控反应完毕后，过滤，滤液用浓盐酸调节pH至4-5，利用5mL乙酸乙酯萃取3次后，合并有机相，利用无水硫酸钠干燥，浓缩，所得残余物利用体积比为1:2的乙酸乙酯和石油醚的混合物重结晶，得到克百威半抗原，其中，TLC监控反应中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:2。
步骤S2为，将步骤S1制备的6mg克百威半抗原溶于0.4mLDMF中，加入1mg碳二亚胺盐酸盐，于25℃搅拌4h，取45mgBSA溶解于2mL 0.01mol/L的PBS缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应24h，将反应物离心后用0.01mol/L的PBS透析3d，每12h换液一次，得到克百威免疫原。
步骤S3为，将4mg克百威半抗原、4mgN-羟基琥珀亚胺和8mg二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中30℃震荡反应2h，将反应物4000r/min离心15min，取上清液吹干，加入0.1mLDMF，取20mgOVA溶解于2mL0.01mol/LPBS缓冲液中，加入到反应物中于25℃反应24h，将反应物离心后用0.01mol/LPBS透析3d每12h换液一次，得到克百威包被原，-20℃保存备用。
步骤S4中，步骤1)中BSA和克百威免疫原的免疫剂量均为120μg/只，，步骤2)小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞的数量比为12:1，步骤3)单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成2×105个/mL的细胞悬液。
对比例1：具体同实施例1，区别仅在于，步骤S4中进行动物免疫时，不进行BSA初次免疫，直接将免疫原注入到小鼠体内。
对比例2：具体同实施例2，区别仅在于，步骤S4中进行动物免疫时，不进行BSA初次免疫，直接将免疫原注入到小鼠体内。
对比例3：具体同实施例3，区别仅在于，步骤S4中进行动物免疫时，不进行BSA初次免疫，直接将免疫原注入到小鼠体内。
对比例4：具体同实施例4，区别仅在于，步骤S4中进行动物免疫时，不进行BSA初次免疫，直接将免疫原注入到小鼠体内。
对比例5：具体同实施例1，区别仅在于，步骤S4中进行细胞融合和克隆化时，将小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。
对比例6：具体同实施例2，区别仅在于，步骤S4中进行细胞融合和克隆化时，将小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。
对比例7：具体同实施例3，区别仅在于，步骤S4中进行细胞融合和克隆化时，将小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。
对比例8：具体同实施例4，区别仅在于，步骤S4中进行细胞融合和克隆化时，将小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。
对比例9：具体同实施例1，区别仅在于，步骤S1合成克百威半抗原时，不加入三乙胺。
对比例10：具体同实施例1，区别仅在于，步骤S1合成克百威半抗原时，呋喃酚与二氯甲烷的用量比、氯甲酸对硝基苯酯与二氯甲烷的用量比采用公告号为CN107462715B专利的实施例1中的添加比例，实施例1中二氯甲烷与呋喃酚用量比、二氯甲烷与氯甲酸对硝基苯酯的用量比为对比例10的10倍左右。
试验例1特异性检测
抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准，交叉反应率越小，抗体的特异性则越高。
配置丁硫克百威不同浓度标准曲线0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，使用实施例1-4以及对比例1-8制备的克百威试剂盒进行检测，通过吸光光度值得出丁硫克百威的IC50值，丁硫克百威的交叉反应率如下式所示，结果见表1。
表1丁硫克百威的交叉反应率
由表1可以看出，与对比例1-10相比，实施例1-4制备的克百威检测试剂盒测得的丁硫克百威的交叉反应率明显较小，均小于0.08％，说明该试剂盒检测克百威的特异性和准确性较高。
试验例2灵敏度检测
对实施例1、对比例1、对比例5、对比例9-10制备的试剂盒进行最低检出限检测，结果如表2所示。
表2最低检出限检测结果
由表2可以看出，与对比例1、对比例5、对比例9-10相比，实施例1制备的试剂盒的最低检出限最低，为0.2μg/L，说明实施例1制备的试剂盒的灵敏度较高。
试验例3精密度检测
1)标准溶液的精密度检测
从实施例1、对比例1、对比例5制备的不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，每个酶标板随机抽取10个微孔测定标准溶液(含1μg/L克百威)的吸光光度值，计算变异系数，如下式所示。实验重复三次，结果如表3所示。
表3实施例1、对比例1和对比例5制备的试剂盒测试的标准溶液浓度和变异系数
由表3可以看出，与对比例1和对比例5相比，实施例1制备的试剂盒检测标准溶液(含1μg/L克百威)的变异系数较小，为3.06％-3.09％，说明实施例1制备的试剂盒能够有效提高克百威检测的准确度。
2)样本的精密度检测
将不含克百威的蔬菜添加3μg/L克百威，从实施例1、对比例1和对比例5制备的3个不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒进行检测，计算变异系数。
表4实施例1、对比例1和对比例5制备的试剂盒测试的蔬菜中克百威的浓度和变异系数
由表4可以看出，与对比例1和对比例5相比，实施例1制备的试剂盒检测样本溶液(含3μg/L克百威)的变异系数较小，为2.03％-2.25％，说明实施例1制备的试剂盒能够有效提高克百威检测的准确度。
试验例4试剂盒稳定性试验
实施例1-4以及对比例1-10制备的试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、克百威添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将实施例1-4以及对比例1-10制备的试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将实施例1-4以及对比例1-10制备的试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明该试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出，实施例1-4及对比例1-10制备的试剂盒可以在2-8℃至少保存12个月。
试验例5克百威半抗原纯度的测定
测试实施例1、对比例9-10合成的克百威半抗原的纯度，具体结果详见表5。
表5测试的克百威半抗原的纯度
实施例 克百威半抗原的纯度/％
实施例1 95.3
对比例9 91.3
对比例10 90.5
由表5可以看出，与对比例9相比，实施例1的步骤S4合成克百威半抗原中间体时，加入三乙胺，能够明显提高克百威半抗原的纯度，从而有利于提高检测试剂盒的特异性和灵敏度。
与对比例10相比，实施例1的步骤S4合成克百威半抗原中间体时，提高二氯甲烷的用量，能够有效提高克百威半抗原的纯度，从而对提高检测试剂盒的特异性和灵敏度有一定的积极作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种检测克百威的ELISA方法，包括以下步骤：S1.合成克百威半抗原；S2.制备克百威免疫原；S3.制备克百威包被原；S4.制备克百威单克隆抗体；S5.制备酶标二抗；S6.制备酶标板；S7.建立克百威标准品浓度相对吸光度的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的吸光度推算待测样品中克百威的实际浓度；
其特征在于，步骤S4包括以下步骤：将步骤S2得到的克百威免疫原注入小鼠体内使其产生抗血清前，利用BSA对小鼠进行初次免疫，之后取小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞融合，测定细胞上清液，筛选阳性孔，对阳性孔进行克隆化，得到分泌克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
步骤S1中，克百威半抗原的合成步骤如下：
1)以呋喃酚、氯甲酸对硝基苯酯为原料，以二氯甲烷为溶剂，同时加入三乙胺，合成中间体，合成路线如下；
2)将步骤1)得到的中间体和氨基丁酸为原料，以四氢呋喃和饱和碳酸钠溶液为溶剂，合成克百威半抗原，合成路线如下：
2.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S4还包括以下步骤：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成0.5-2×105个/mL的细胞悬液，在液氮中保存，经复苏、培养、采集腹水、纯化后，冷冻保存。
3.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S4中，小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞的数量比为8-12:1。
4.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S4中，BSA的注射量为110-130μg/只。
5.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S1的步骤1)中，呋喃酚与三乙胺的用量比为10-15mg:2-7μL。
6.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S1的步骤1)中，将呋喃酚和氯甲酸对硝基苯酯分别溶于二氯甲烷后再进行反应，其中，呋喃酚与二氯甲烷的用量比为10-15mg:1-4mL，氯甲酸对硝基苯酯与二氯甲烷的用量比为12-18mg:2-5mL。
7.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S1的步骤2)中，将氨基丁酸溶于饱和碳酸钠溶液，中间体溶于四氢呋喃溶液后，再进行反应，氨基丁酸的用量为1-5mg，饱和碳酸钠溶液的用量为1-5mL，中间体的用量为2-8mg，四氢呋喃的用量为1-5mL。
8.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S2具体为，将步骤S1制备的克百威半抗原溶于DMF中，加入碳二亚胺盐酸盐，搅拌，加入溶解有BSA的PBS缓冲液，继续反应，离心后用PBS透析，得到克百威免疫原。
9.一种检测克百威的ELISA试剂盒，其特征在于，采用权利要求1-8任一所述的检测克百威的ELISA方法。
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