CN103575912A - 红花制剂中过敏原的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测红花制剂中过敏原的方法，该方法包括提取红花花粉总蛋白、免疫小鼠、制备单克隆抗体、并用该抗体以间接ELISA法对红花制剂进行过敏原检测的步骤；该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，以该方法控制红花制剂的质量，能显著降低过敏反应的发生，有效提高产品的安全性。

Description

红花制剂中过敏原的检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测红花制剂中过敏原的方法，属于药品安全检测技术领域。
背景技术
心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高，并发症多即“三高一多”的特点，目前，我国心脑血管疾病患者已接近3亿人，每年约300万人死于该病，占我国每年死亡病因的51%，在我国乃至全世界，心脑血管疾病都已成为人类的头号杀手。
红花制剂（如红花注射液、红花口服液等）为菊科植物红花经加工提取制得的中药制剂，是治疗心脑血管疾病的首选药物，具有活血化瘀之功效，用于治疗闭塞性脑血管疾病、冠心病、脉管炎等疾病，疗效确切，是国家医保品种，可谓质优价廉。但随着临床应用的不断增加，红花制剂特别是红花注射液的不良反应时有发生，而不良反应中以过敏反应为主。2012年，国家药品不良反应监测数据库中有关红花注射液的病例报告数共计3306例，严重病例报告共计154例。其主要不良反应/事件表现为：呼吸困难、胸闷、过敏样反应、过敏性休克等。国家食品药品监督管理局建议采取：该品种应在有抢救条件的医疗机构使用；建议医生用药前详细询问患者用药史、过敏史等情况；对本品或含红花的制剂有过敏或严重不良反应病史者禁用等措施降低不良反应发生率。过敏等不良反应使大量心脑血管疾病患者不得不放弃使用可使其达到达最佳治疗效果的红花制剂，严重影响了红花制剂的临床应用，阻碍了该药品良好医疗功效的发挥。
目前，各红花制剂生产厂家尚未成功建立成熟的、针对过敏原的检测方法，大多只停留在热原检测控制的水平。为降低红花制剂致患者过敏的发生率，少数厂家采用家兔过敏试验来进行控制，但临床实践证明，该方法检测合格的产品过敏现象仍时有发生，说明该法没有达到质量控制的目的，而且成本高、耗时长；还有的厂家采取优化制剂工艺、更换制药辅料等措施，但在过敏原缺乏了解的情况下调整，结果可想而知，都没能达到控制过敏发生的目的；医药工作者也进行了大量试验寻找过敏原、优化工艺，但红花制剂同大多中药制剂一样，成分复杂、物质基础不明，这使对过敏原的筛查十分困难。
至今，仍没有任何能有效控制红花制剂不良反应（特别是过敏反应）发生的方法的报道。为了广大心脑血管疾病患者能自由选择用药，得到及时有效的治疗，也为了最大限度发挥传统医药在医疗体系中的作用，急需一种能有效控制红花制剂质量的方法，特别是检测红花制剂中过敏原的方法，以提高产品质量，填补该项检测的空白。
发明内容
针对现有技术在红花制剂过敏原检测方面存在的不足，发明人经过大量的实验研究，建立了一种可灵敏检测出红花制剂中过敏原的方法，该方法特异性强、重复性好，以该方法控制红花制剂的质量，能显著降低过敏反应发生率，有效提高药品的安全性。
本发明提供了一种检测红花制剂中过敏原的方法，该方法包括以下步骤：
⑴提取红花花粉总蛋白；
⑵将步骤⑴得到的红花花粉总蛋白对鼠进行免疫、制备单克隆抗体；
⑶用步骤⑵得到的单克隆抗体以间接ELISA法对红花制剂进行过敏原的检测。
在本申请中，红花制剂为含有红花的药物制剂，包括口服制剂和注射剂，如红花注射液、红花口服液等，在此统一称为红花制剂。
红花制剂特别是红花注射液，在临床应用中发生过敏反应由来已久，随着适应症人群的迅速增加、临床应用不断扩大，以过敏为首的不良反应问题突显，严重影响了该类药品的临床应用，更限制了病患对适应症药物的选择。但由于中药制剂中可诱发过敏反应的物质很多，如多糖、多肽、蛋白质等大分子物质有完全的抗原性；另一些分子较小的化合物可作为半抗原与体内蛋白质结合成全抗原，从而引起过敏反应，这些半抗原在中草药中广泛存在。另外，药材来源也是造成中药制剂过敏反应发生的原因之一。由于药材产地不同，受土质、气候、采收季节等种植条件的影响，其中所含成分或成分的含量可能有较大差异，不同基源的同一药材差别就更大。药材质量的不稳定性，往往造成中药注射剂批次间质量的差异。具体到红花，其产地只在我国就多达十余省份，更是含有色素类、多酚类、多糖类等百余成分，十分复杂。因此，针对红花制剂的过敏现象，研究人员始终没有找到过敏原，也就无从谈起过敏原的检测与控制方法。
由于红花注射直接入血，过敏反应发生率高、危害重，所以发明人首先以红花注射液为研究对象进行研究。发明人采用分子生物学技术对不同厂家的红花注射液的成品、生产工艺中各环节的中间体、及不同产地的原料及原料部位的不同成分的提取物等大量样本进行分析研究，结果惊喜的发现，残留的红花花粉蛋白是红花注射液的过敏原（又称致敏原），并通过豚鼠被动皮肤过敏试验得到验证，进而建立了以单克隆抗体技术检测该过敏原的方法。该方法灵敏度高、重复性好，可显著降低甚至避免过敏反应的发生，有效地控制了红花注射液的质量，在保证其有效性的同时，大大提高了该药品的安全性，也为进一步优化红花制剂的制备工艺提供参考。与直接免疫动物制备的多抗相比，本发明的检测方法具有更优良的特异性和可重复性。以该方法盲测已临床使用并有记录的7厂家20余批次样品，结果发生过敏批次的检出率达85%以上，以该检测方法对红花制剂进行质量控制，可显著降低过敏反应的发生。
上述的提取红花花粉总蛋白的方法为水提醇沉法，得到的沉淀即为总蛋白。所述的水提醇沉法为：取红花花粉加入到至少3倍量（v/w）的水中，50-80℃提取至少1小时，过滤，滤液加至少1倍量（v/v）的乙醇，低于室温下放置至沉淀完全，弃去上清液，得到的沉淀即为红花花粉总蛋白。室温或室温以下的温度一般是指2～25℃，所述低于室温优选室温以下的温度，例如2～8℃。
上述提取红花花粉总蛋白的方法可具体为，取适量的红花花粉，加入到3～10倍量（v/w）的水中，50～80℃提取1～4小时，过滤，取滤液加1～3倍量（v/v）的乙醇，2～8℃放置15～20小时，弃去上清液，得到的沉淀即为红花花粉总蛋白。
上述方法制备的红花花粉总蛋白得率约为0.05～0.2‰，以Bradford法检测蛋白含量约为0.08～3mg/ml。
为加快沉淀速度及使沉淀更彻底，优选用无水乙醇，特别是预冷的无水乙醇与提取滤液混合，即，所述的提取红花花粉总蛋白的方法优选为：取适量的红花花粉加入到4～8倍量（v/w）的水中，50～70℃提取1～3小时，过滤，取滤液加1～2倍量（v/v）的预冷无水乙醇，2～6℃放置16～18小时，离心，弃去上清液，得到的沉淀即为红花花粉总蛋白。
所述的预冷，是指将无水乙醇在使用前采用常规方法进行降温处理，使其在应用时达到2～6℃的温度。
所述的红花花粉总蛋白对鼠进行免疫的步骤，可以选用大鼠或小鼠，优选小鼠，特别是6-8周龄的BALB/c小鼠。
所述的红花花粉总蛋白对小鼠进行免疫的步骤分为初次免疫、加强免疫和冲击免疫；其中的初次免疫为，按蛋白量60-100μg/只，配合0.1-0.2ml完全弗氏佐剂，背部皮下多点注射免疫；加强免疫分为三次，首次加强免疫在初次免疫后7-20天进行，蛋白量为20-60μg/只，配合0.1-0.2ml不完全弗氏佐剂；后两次加强免疫与初次免疫相同，时间间隔为5-15天；冲击免疫按蛋白量20-80μg/只，采用脾内免疫方式于第三次加强免疫后5-15天进行。
在一优选实施例中，所述的红花花粉总蛋白对小鼠进行免疫的步骤是：初次免疫为按蛋白量80μg/只，配合0.125ml完全弗氏佐剂，背部皮下多点注射免疫；加强免疫分为三次，首次加强免疫在初次免疫后14天进行，蛋白量为40μg/只，配合0.125ml不完全弗氏佐剂；后两次加强免疫与初次免疫相同，时间间隔为7天；冲击免疫按蛋白量80μg/只，采用脾内免疫方式于第三次加强免疫后7天进行。
所述的制备单克隆抗体的方法为：取小鼠冲击免疫后2～5天的脾细胞，将该脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性细胞并对其进行克隆；进一步的，优选方法是：取小鼠冲击免疫后3～4天的脾细胞，采用PEG（聚乙二醇）常规融合方法，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合；采用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）方法对融合细胞上清液进行筛选，确认阳性细胞后采用有限稀释法对阳性细胞进行克隆，得到能产生特异性单克隆抗体的细胞克隆。
上述的骨髓瘤细胞选自单抗制备常用的骨髓细胞株，如：骨髓瘤细胞Sp2/0细胞株、骨髓瘤细胞S194/5细胞株、骨髓瘤细胞F0细胞株、骨髓瘤细胞P3/X63细胞株等，优选骨髓瘤细胞Sp2/0细胞株。
本发明所述的检测红花制剂中过敏原的方法，还包括对步骤⑵得到的单克隆抗体进行纯化的步骤。该纯化步骤为：先以体内诱生法制备含大量单克隆抗体的腹水，将该腹水加到结合缓冲液平衡后的Protein G亲和柱上，收集流出液，将该流出液再次上柱，继续平衡至基线平稳；再以洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰并用结合缓冲液透析，得到纯化后的单克隆抗体。
上述的结合缓冲液为pH值7.0-7.4的常用缓冲液，如0.01-0.03M/L（即，10-30mM/L）的磷酸盐缓冲液；所述的洗脱缓冲液为pH值2.0-3.0的常用缓冲液，如0.05-0.2M/L的甘氨酸-盐酸缓冲液。
所述的对单克隆抗体进行纯化的方法，优选为：先以体内诱生法制备含大量单克隆抗体的腹水，将该腹水加到由pH值7.4的20mM/L磷酸盐缓冲液平衡后的Protein G亲和柱上，收集流出液，将该流出液再次上柱，继续平衡至基线平稳；再以pH值为2.5的0.1M/L甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，洗脱峰用pH值7.4的20mM/L磷酸盐缓冲液透析，得到纯化后的单克隆抗体（本案中命名为1B6）。
发明人采用间接ELISA法检测了单克隆抗体1B6对红花花粉蛋白抗原识别的特异性，用酶标仪检测的结果（波长450nm）显示：单克隆抗体1B6组检测的OD值是相应空白对照组的10倍以上，说明该单克隆抗体对红花花粉蛋白抗原的识别，具有很好的特异性。
本发明所述的步骤⑶：用步骤⑵得到的单克隆抗体以间接ELISA法对红花制剂进行过敏原的检测，具体操作步骤是：
①样品前处理：液体制剂（如注射液）可直接或稀释一定倍数后作为供试样品。固体制剂可用水或其他溶剂溶解，滤液直接或稀释一定倍数后作为供试样品。
②包被：将红花花粉蛋白配制成2～100ug/ml的溶液，100ul/孔，4℃过夜。
③封闭：pH7.0-7.4磷酸缓冲液洗涤3-5次，加150ul/孔封闭液（5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白），37℃封闭2小时后，洗涤3-5次，拍干。
④一抗：加入经稀释的单克隆抗体1B6（1：2000-5000倍稀释）100ul/孔，37℃孵育30-180min，洗板3-5次，拍干。
⑤二抗：加入经辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（IgG特异二抗），按1：3000-10000稀释，100ul/孔，37℃孵育30-180min，洗板3-5次，拍干。
⑥显色：稀释20×TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）至1×TMB，按体积加入适量过氧化氢，混匀，100ul/孔，37℃显色2-30min。
⑦终止：加入终止液（2M H2SO4）50ul/孔。
⑧测定：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值（S/N）2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点，即，比值大于、等于2.1时为阳性。
本发明所述的检测红花制剂中过敏原的方法为科技部重大新药创制项目中课题（项目编号：2011ZX09201-201），得到了自然科学基金的资助（项目编号：81072446）。该技术方案不但可以明显提高红花制剂（特别是红花注射液）自身在临床应用中的安全性，更为中药注射液的质量稳定可控、安全有效研究提供了新的思路和方法，在一定程度上推动了中药产业发展、走向国际化。
中药注射液中抗原物质的明确和检测一直是影响中药注射剂发展的重要因素，本发明应用单克隆抗体技术检测红花注射液中抗原活性物质，并建立灵敏的检测方法，是中药注射液的一大进步。实验证明，本发明所述的检测方法不但可灵敏地检测出红花注射液中的过敏原，同时也适用于含有红花的其他制剂，如红花颗粒、红花口服液、红花丸及酒剂等。该检测方法有助于红花制剂更好的发挥其药用价值。
发明人通过以下实验来对本发明检测方法进行了方法学验证。
再次重申：以下实验只是本发明研制过程中众多试验中的举例性实验，并未涵盖和穷尽了发明人为本发明所做的所有实验，目的仅仅在于用那些数据来阐述本发明检测方法的灵敏度及重复性。
1、检测灵敏度试验
1.1实验材料
红花花粉蛋白提取物，自制，批号：20121016；
1B6单克隆抗体，自制，批号20130409：
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0102，批号：00051304。
1.2试验方法
采用间接ELISA方法测试本方法的灵敏度。
1.2.1红花花粉蛋白系列稀释：将红花花粉蛋白提取物用水进行10倍系列稀释，稀释至花粉蛋白的终浓度分别为：10000ng/ml、1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml，4℃冰箱保存备用。
1.2.2包被：取各浓度红花花粉蛋白稀释液加入96孔酶标板中，100ul/孔，每个浓度加3个复孔，空白对照3个复孔，以水作为空白溶剂对照，4℃孵育过夜。
1.2.3封闭：pH7.2磷酸缓冲液洗涤5次，加牛血清白蛋白150ul/孔，37℃封闭2小时后，洗涤5次，拍干。
1.2.4一抗孵育：加入经1：3000稀释的单克隆抗体1B6，100ul/孔，37℃孵育120min，洗板5次，拍干。
1.2.5二抗孵育：加入经1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，100ul/孔，37℃孵育60min，洗板5次，拍干。
1.2.6显色：稀释20×TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）至1×TMB，按体积加入适量过氧化氢，混匀，100ul/孔，37℃显色15min。
1.2.7终止：加入终止液（2M H2SO4）50ul/孔。
1.2.8测定：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值（S/N）大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
1.3实验结果
实验结果详见表1，该结果表明：单克隆抗体1B6检测红花花粉蛋白的灵敏度不低于0.1ng/ml，即，每毫升供试液中含有0.1ng残留红花花粉蛋白即可被检出，可有效控制红花制剂因残留红花花粉蛋白而造成的过敏现象。
表1抗红花花粉蛋白单克隆抗体1B6间接ELISA方法灵敏度实验
Figure BDA0000423122360000081
2、重复性试验
2.1实验材料
同实验1。
2.2试验方法
采用间接ELISA方法测试本方法的重复性。
2.2.1红花花粉蛋白：将红花花粉蛋白加水稀释至1ug/ml浓度，4℃冰箱保存备用。
2.2.2包被：将稀释后的红花花粉蛋白液加入96孔酶标板中，100ul/孔，4℃孵育过夜。
2.2.3封闭：pH7.2磷酸缓冲液洗涤5次，加牛血清白蛋白150ul/孔，37℃封闭2小时后，洗涤5次，拍干。
2.2.4一抗孵育：加入经1：3000稀释的单克隆抗体1B6，100ul/孔，37℃孵育120min，洗板5次，拍干。
2.2.5二抗孵育：加入经1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，100ul/孔，37℃孵育60min，洗板5次，拍干。
2.2.6显色：稀释20×TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）至1×TMB，按体积加入适量过氧化氢，混匀，100ul/孔，37℃显色15min。
2.2.7终止：加入终止液（2M H2SO4）50ul/孔。
2.2.8测定：以450nm单波长测定各孔OD值。
2.2.9重复性实验随机抽取3条酶标反应板，8孔/条，比较各孔450nmOD值，计算各孔间变异系数。板内实验分别重复5次，板间实验分别重复5次。
2.3实验结果
按照上述实验方法进行单克隆抗体1B6检测红花花粉蛋白的重复性试验，测得的板内变异系数和板间变异系数结果详见表2、表3。
表2板内重复性实验
Figure BDA0000423122360000091
表3板间重复性实验
Figure BDA0000423122360000092
上述实验结果显示，本发明检测方法的板内变异系数在4.82%-8.45%之间，板间变异系数为9.07%，明显低于本领域对板内和板间变异系数的一般要求（分别为小于10%和小于15%），说明本发明所述检测方法的重复性良好。
3、对比试验
发明人采用本发明的检测方法（具体是实施例1方法）对7个厂家20余批全检合格并已投入市场的红花注射液（均具有临床使用记录）进行盲样测试，并将检测结果与临床应用中的不良反应情况进行核实。
其中A厂家的13批样品的检测结果分别为：1.65、1.55、1.25、2.38、1.24、2.70、1.92、0.88、1.20、3.06、1.49、1.72、1.88、1.07、2.08，以本发明检测方法的标准，有3批结果为阳性，存在过敏风险。而临床应用中该13批样品中有4批发生了过敏反应。
其中B厂家的2批样品的检测结果分别为：2.41和0.52，以本发明检测方法的标准，有1批结果为阳性，存在过敏风险。而临床应用中该2批样品中有1批发生了过敏反应。
其中C厂家的2批样品的检测结果分别为：2.25和2.71，以本发明检测方法的标准，2批结果均为阳性，存在过敏风险。而临床应用中该2批样品中有2批发生了过敏反应。
其中D厂家的2批样品的检测结果分别为：1.64和3.17，以本发明检测方法的标准，有1批结果为阳性，存在过敏风险。而临床应用中该2批样品中有1批发生了过敏反应。
另外的E、F、G厂家的各1批样品的检测结果分别为：1.13、1.22和1.32，以本发明检测方法的标准，3批结果均为阴性，过敏风险很低。临床应用中该3批样品均未发生过敏反应。
上述结果表明，该检测方法对发生过敏反应的产品检出率达85%以上，换而言之，若采用本发明检测方法对红花注射液进行质量控制，临床应用中过敏发生率会降低约85%，该品种的安全性会得到显著的提高。
发明人采用本发明的实施例2-4的检测方法重复了上述测试，结果基本相同，差值在数据统计学可接受的范围内。
为了验证本发明方法的适应性及有益效果，发明人进行了大量重复性的实验，与上述实验不同的是，一些实验是检测含红花的不同产品，如红花口服液、红花颗粒，另一些实验是本发明检测方法的步骤或采用的试剂、参数不同（包括实施例2-4方法）。
实验结果证明以下几点：
1.本发明的检测方法可以特异性且灵敏地检测出红花制剂中过敏原，即残留花粉蛋白的存在，可显著降低该类制剂过敏反应的发生，保障患者的用药安全；
2.本发明检测方法各步骤中的具体参数稍有浮动不会影响检测的结果；
3.本发明的检测方法重复性好，可稳定地控制红花制剂的质量。
由于篇幅所限，上述实验的方法、步骤以及相关数据在此不再赘述。
具体实施方式
实施例1：
1、提取红花花粉总蛋白：
称取红花花粉50g，加入250ml水，60℃煮2小时，过滤，取滤液80ml，加入预冷的无水乙醇120ml，4℃条件下放置17h后，以5000rpm/min离心20分钟，弃去上清液，沉淀即为红花花粉总蛋白，收率为0.12‰，用Bradford方法检测蛋白含量为0.95mg/ml。
2、将上述得到的红花花粉总蛋白对小鼠进行免疫、制备单克隆抗体：
具体免疫流程为：初次免疫按蛋白量80μg/只，配合0.125ml完全弗氏佐剂，背部皮下多点注射免疫；首次加强免疫在初次免疫后14天进行，蛋白量为40μg/只，配合0.125ml不完全弗氏佐剂；后两次加强免疫与初次免疫相同，时间间隔为7天；冲击免疫按蛋白量80μg/只，以脾内免疫方式于第三次加强免疫后7天进行。
制备单克隆抗体：取小鼠冲击免疫后3天的脾细胞，以PEG融合法将该脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0细胞株进行融合；用ELISA实验方法对融合细胞上清液液进行筛选，经过2次筛选确认阳性细胞，再通过有限稀释法对阳性细胞进行克隆，得到能产生特异性识别红花花粉蛋白抗体的细胞克隆。
3、单克隆抗体的纯化：
先以体内诱生法（取BALB/c小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后将杂交瘤细胞按1×106个细胞/0.5ml/只给小鼠接种，接种细胞约10天后收集腹水备用）制备含大量单克隆抗体的腹水，将该腹水加到由pH值7.4的20mM/L磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液平衡后的Protein G亲和柱上，收集流出液，将该流出液再次上柱，继续平衡至基线平稳；再以pH值为2.5的0.1M/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，洗脱峰用pH值7.4的20mM/L磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液透析，得到纯化单克隆抗体。
实施例2：
1、提取红花花粉总蛋白：
称取红花花粉50g，加入400ml水，50℃煮1小时，过滤，取滤液80ml，加入无水乙醇160ml，6℃条件下放置18h，弃去上清液，沉淀即为红花花粉总蛋白，收率为0.08‰，用Bradford方法检测蛋白含量为0.83mg/ml。
2、将上述得到的红花花粉总蛋白对小鼠进行免疫、制备单克隆抗体：
具体免疫流程为：初次免疫为，按蛋白量60μg/只，配合0.2ml完全弗氏佐剂，背部皮下多点注射免疫；首次加强免疫在初次免疫后7天进行，蛋白量为60μg/只，配合0.2ml不完全弗氏佐剂；后两次加强免疫与初次免疫相同，时间间隔为15天；冲击免疫按蛋白量60μg/只，采用脾内免疫方式于第三次加强免疫后15天进行。
制备单克隆抗体：取小鼠冲击免疫后5天的脾细胞，以PEG融合法将该脾细胞和骨髓瘤细胞S194/5细胞株进行融合；用ELISA实验方法对融合细胞上清液液进行筛选，经过3次筛选确认阳性细胞，再通过有限稀释法对阳性细胞进行克隆。
实施例3：
1、提取红花花粉总蛋白：
称取红花花粉50g，加入150ml水，70℃煮4小时，过滤，取滤液80ml，加入乙醇（95%）240ml，2℃条件下放置20h，以4000rpm/min离心，15分钟，弃去上清液，沉淀即为红花花粉总蛋白，收率为0.18‰，用Bradford方法检测蛋白含量为1.32mg/ml。
2、将上述得到的红花花粉总蛋白对小鼠进行免疫、制备单克隆抗体：
具体免疫流程为：初次免疫，按蛋白量100μg/只，配合0.1ml完全弗氏佐剂，背部皮下多点注射免疫；首次加强免疫在初次免疫后20天进行，蛋白量为40μg/只，配合0.1ml不完全弗氏佐剂；后两次加强免疫与初次免疫相同，时间间隔为5天；冲击免疫按蛋白量40μg/只，采用脾内免疫方式于第三次加强免疫后5天进行。
制备单克隆抗体：取小鼠冲击免疫后2天的脾细胞，以PEG融合法将该脾细胞和骨髓瘤细胞F0细胞株进行融合；用ELISA实验方法对融合细胞上清液液进行筛选，经1次筛选确认阳性细胞，再通过有限稀释法对阳性细胞进行克隆。
3、单克隆抗体的纯化：
先以体内诱生法制备含大量单克隆抗体的腹水，将该腹水加到由pH值7.0的10mM/L磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液平衡后的Protein G亲和柱上，收集流出液，将该流出液再次上柱，继续平衡至基线平稳；再以pH值为3.0的0.2M/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，洗脱峰用pH值7.0的10mM/L磷酸盐缓冲液透析，得到纯化单克隆抗体。
实施例4：
1、提取红花花粉总蛋白：
称取红花花粉50g，加入500ml水，80℃煮3小时，过滤，取滤液80ml，加入预冷的无水乙醇80ml，8℃条件下放置15h，以5500rpm/min离心，25分钟，弃去上清液，沉淀即为红花花粉总蛋白，收率为0.13‰，用Bradford方法检测蛋白含量为1.15mg/ml。
2、将上述得到的红花花粉总蛋白对大鼠进行免疫、制备单克隆抗体：
具体免疫流程为：初次免疫，按蛋白量80μg/只，配合0.15ml完全弗氏佐剂，背部皮下多点注射免疫；首次加强免疫在初次免疫后10天进行，蛋白量为20μg/只，配合0.15ml不完全弗氏佐剂；后两次加强免疫与初次免疫相同，时间间隔为10天；冲击免疫按蛋白量20μg/只，采用脾内免疫方式于第三次加强免疫后10天进行。
制备单克隆抗体：取大鼠冲击免疫后4天的脾细胞，以PEG融合法将该脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0细胞株进行融合；用ELISA实验方法对融合细胞上清液液进行筛选，经过2次筛选确认阳性细胞，再通过有限稀释法对阳性细胞进行克隆。
3、先以体内诱生法制备含大量单克隆抗体的腹水，将该腹水加到由pH值7.2的30mM/L磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液平衡后的Protein G亲和柱上，收集流出液，将该流出液再次上柱，继续平衡至基线平稳；再以pH值为2.0的0.05M/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，洗脱峰用pH值7.2的30mM/L磷酸盐缓冲液透析，得到纯化单克隆抗体。
本发明不局限于上述实施方式，任何人在本发明的启示下得出的其他任何与本发明相同或相近似的产品，均不排除在本发明的保护范围之外。

Claims (10)

1.一种检测红花制剂中过敏原的方法，该方法包括以下步骤：
⑴提取红花花粉总蛋白；
⑵将步骤⑴得到的红花花粉总蛋白对鼠进行免疫，制备单克隆抗体；
⑶用步骤⑵得到的单克隆抗体以间接ELISA法对红花制剂进行过敏原的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取红花花粉总蛋白的方法为水提醇沉法，得到的沉淀即为总蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的水提醇沉法为：取红花花粉加入到至少3倍量（v/w）的水中，50-80℃提取至少1小时，过滤，滤液加至少1倍量（v/v）的乙醇，低于室温下放置至沉淀完全，弃去上清液，得到的沉淀即为红花花粉总蛋白。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的水提醇沉法为：取适量的红花花粉加入到3-10倍量（v/w）的水中，50-80℃提取1-4小时，过滤，取滤液加1～3倍量（v/v）的乙醇，2～8℃放置15～20小时，弃去上清液，得到的沉淀即为红花花粉总蛋白。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法得到的沉淀为红花花粉总蛋白，该总蛋白得率为0.05～0.2‰，以Bradford法检测蛋白的含量为0.08～3mg/ml。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵是将红花花粉总蛋白对小鼠进行免疫，分为初次免疫、加强免疫和冲击免疫；其中的初次免疫为，按蛋白量60-100μg/只，配合0.1-0.2ml完全弗氏佐剂，背部皮下多点注射免疫；加强免疫分为三次，首次加强免疫在初次免疫后7-20天进行，蛋白量为20-60μg/只，配合0.1-0.2ml不完全弗氏佐剂；后两次加强免疫与初次免疫相同，时间间隔为5-15天；冲击免疫按蛋白量20-80μg/只，采用脾内免疫方式于第三次加强免疫后5-15天进行。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的制备单克隆抗体的方法为：取小鼠冲击免疫后2～5天的脾细胞，将该脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性细胞并对其进行克隆。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的制备单克隆抗体的方法为：取小鼠冲击免疫后3～4天的脾细胞，采用PEG常规融合方法，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合；采用间接酶联免疫吸附实验方法对融合细胞上清液进行筛选，确认阳性细胞后采用有限稀释法对阳性细胞进行克隆。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括对步骤⑵得到的单克隆抗体进行纯化的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的单克隆抗体进行纯化的方法为：先以体内诱生法制备含大量单克隆抗体的腹水，将该腹水加到由pH值7.0～7.4的10～30mM/L磷酸盐缓冲液平衡后的Protein G亲和柱上，收集流出液，将该流出液再次上柱，继续平衡至基线平稳；再以pH值为2.0～3.0的0.05～0.2M/L甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，洗脱峰用pH值7.0～7.4的10～30mM/L磷酸盐缓冲液透析，得到纯化后的单克隆抗体。
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