KR101156523B1 - 아토피성 피부염 유도 물질 - Google Patents

아토피성 피부염 유도 물질 Download PDF

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Abstract

인간 자신의 IgE 항체에 결합하여 마스트 세포 및 호염기구를 활성화하는 아토피성 피부염 유도 물질로서, 인간 분비물을 필터 여과하여 불용물을 제거한 여과액을 회수하는 공정; 여과액과 ConA-어피니티 담체를 혼합하고, 상청액을 회수하는 공정; 컬럼 크로마토그래피에 의하여 상청액으로부터 히스타민 유리 활성 성분을 분리하는 공정을 거쳐서 얻어진 인간 분비물 정제 부분, 또는 이 정제 부분에 포함되는 항원 분자 또는 항원 결정기. 이 유도 물질은 인간 아토피성 피부염의 진단, 치료에 유효한다.

Description

아토피성 피부염 유도 물질{ATOPIC DERMATITIS INDUCER}
본 출원의 발명은, 아토피성 피부염 환자 자신이 분비하는 아토피성 피부염 유도 물질(이하,「유도 물질」이라고 기재함)과, 이 유도 물질 또는 그 물질에 대한 항체를 사용한 아토피성 피부염의 진단 방법, 및 이 유도 물질을 유효 성분으로 하는 아토피성 피부염의 감감작(減感作) 치료 약제에 관한 것이다.
최근, 아토피성 피부염 환자는 급증하고 있고, 피부과에 관계되는 환자 중의 아토피성 피부염 환자 비율은 30%을 넘는 정황으로, 주된 피부병의 하나가 되고 있다. 아토피성 피부염은, 일반적인 항원에 대하여 IgE 항체를 생산하기 쉬운 유전적 요인에, 다양한 환경인자가 가해짐으로써 야기되는 아토피성 질환의 하나이고, 유아기에서 발병하고, 나이가 듦에 따라 만성적으로 경과하고, 대부분은 사춘기전에 완화되지만, 일부의 증례는 사춘기 이후에도 지속되고, 또한 사춘기 이후 발병하는 예도 있다. 성인 증례의 대부분은 특히 난치이고, 그 이후의 나이가 듦에 의한 완화는 기대하기 어렵다. 완성된 병소는 태선(苔癬)화되고, 소양은 현저하고, 종종 발작적이며, 다른 아토피성 질환과 일정한 관련을 가져서 증세 악화, 완화를 되풀이한다는 것이다.
이러한 아토피성 피부염의 발병 메카니즘은 밝혀져 있지 않은 부분이 많고, 다른 피부질환과의 식별에도 아직 문제가 있으며, 치료 방법은 아직 확립되어 있지 않지만, 종래부터, 부신피질 호르몬제의 외용, 항히스타민제, 화학 전달 물질 유리 억제제의 투약 요법, 또는 식품 재료로부터 알(卵), 우유, 대두 등을 제거하는 식사 요법, 생활환경으로부터의 진드기, 진균(곰팡이) 등의 항원 물질의 제거 등을 시험해오고 있었다. 그러나, 약물 요법의 경우에는, 약제를 성장기의 아이에게, 게다가 장기에 걸쳐서 사용하는 것이기 때문에, 부작용의 점에서 문제가 남아있다. 또한, 식사 요법이나 환경 항원 제거 대책으로는, 완전하게 항원을 제거하는 것은 곤란하고, 정신적 부담도 크다는 문제점이 있었다.
이러한 상황을 감안하여, 최근에는, 분자 생물학적인 지견을 구사하여 아토피성 피부염의 발병 기구를 해명하면서, 그 발생 기구의 일부를 저해함으로써 치료 효과를 상승시키고자 하는 연구가 행하여지고 있다. 예를 들면, 상기한 바와 같이 항원에 대하여 IgE 항체를 생산하는 것이 증상을 발생시키는 기구의 일부가 되고 있는 것에 착안하고, 항원에 대한 IgE 항체의 생산을 억제하는 물질을 외용함으로써, 증상을 완화시키는 방법이 제안되어 있다(특허문헌 1-3).
또한, 발명자들은 비특허문헌 1에 있어서, 땀에 포함되는 항원 물질의 정제와 해석에 대해서 보고하고 있다. 또한,「아토피성 피부염 유도 단백질」의 발명을 특허출원하고 있다(특허문헌 4).
특허문헌 1: 일본특허공개 평 7-109290호 공보
특허문헌 2: 일본특허공개 평7-109292호 공보
특허문헌 3: 일본특허공개 평9-100236호 공보
특허문헌 4: WO03/084991A1
비특허문헌 1: 평성 14년도 후생 노동 과학 연구비 보조금 면역 알레르기 질환예방?치료 등 연구 사업의 연구 보고서(제1분책 p.101-103, 후생 노동성 l5년 3월 발행)
항원에 대한 IgE 항체의 생산 억제 물질을 투여하는 방법은 어느 정도의 효과를 발휘하지만, 병원을 본질적으로 차단하는 것이 아니기 때문에, 증상의 완화에는 도움이 되어도 본질적인 치료는 되지 않는다. 또한, 병원의 유래를 모두 음식물 또는 환경 중에 존재하는 외래성 물질에서 구하기 때문에, 체내에서 생산되는 물질에 관해서는 완전히 무대응이었다.
본 출원의 발명은 이상에서 설명한 바와 같은 사정을 감안하여 이루어진 것으로서, 아토피성 피부염의 원인 인자로서, 환자 자신이 생산하는 아토피성 피부염 유도 물질을 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 출원의 발명은, 상기의 유도 물질과 결합하는 항체를 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 출원의 발명은 상기 유도 물질 및/또는 항체를 사용한 아토피성 피부염의 진단 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 출원의 발명은, 유도 물질을 유효 성분으로 하는 아토피성 피부염의 감감작 치료약을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 출원은, 상기 과제를 해결하기 위한 발명으로서, 이하의 발명을 제공한다.
(1) 인간 자신의 IgE 항체에 결합하여 마스트 세포 및 호염기구를 활성화하는 아토피성 피부염 유도 물질로서, 이하의 공정:
인간 분비물을 필터 여과하여 불용물을 제거한 여과액을 회수하는 공정;
여과액과 ConA-어피니티 담체를 혼합하고, 상청액을 회수하는 공정;
컬럼크로마토그래피에 의하여 상청액으로부터 히스타민 유리 활성 성분을 분리하는 공정,
을 거쳐서 얻어지는 인간 분비물 정제 부분, 또는 이 정제 부분에 포함되는 항원 분자 또는 항원 결정기.
(2) 컬럼크로마토그래피가 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및/또는 역상 컬럼 크로마토그래피인 상기 발명(1)의 아토피성 피부염 유도 물질.
(3) 상기 발명(1)의 아토피성 피부염 유도 물질을 항원으로 하여 조제되고, 상기 발명(1)의 아토피성 피부염 유도 물질과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
(4) 피험자의 혈청 중에, 상기 발명(1) 또는 (2)의 아토피성 피부염 유도 물질과 결합하는 IgE 항체가 존재하는지의 여부를 시험하고, 그 IgE 항체가 존재하는 피험자를 아토피성 피부염 환자 또는 아토피성 피부염 고위험자로 판정하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 진단 방법.
(5) 피험자의 혈액으로부터 채취한 백혈구 부분에, 상기 발명(1) 또는 (2)의 아토피성 피부염 유도 물질을 첨가하고, 백혈구 부분에 있어서의 히스타민 유리의 정도로부터 아토피성 피부염 환자 또는 아토피성 피부염 고위험자로 판정하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 진단 방법.
(6) 피험자의 생체 시료에, 상기 발명(3)의 항체와 결합하는 물질이 존재하는지의 여부를 시험하고, 시료 중에 그 물질이 존재하는 피험자를 아토피성 피부염 환자 또는 아토피성 피부염 고위험자로 판정하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 진단 방법.
(7) 상기 발명(1) 또는 (2)의 아토피성 피부염 유도 물질을 패치 테스트용 소재에 유지시킨 아토피성 피부염 고위험자의 판정 시약.
(8) 상기 발명(1) 또는 (2)의 아토피성 피부염 유도 물질을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 감감작 치료약.
즉, 본 발명의 「아토피성 피부염 유도 물질」은, 「인간 분비물 정제 부분」(양이온 교환 수지 및 ConA 컬럼에는 흡착되지 않는 양이온 컬럼 비흡착 부분) 그 자체, 또는 이 정제 부분 중에 포함되는「항원 분자」 또는「항원 결정기」를 포함한다. 항원 분자가 될 수 있는 것에는 단백질, 당질, 지질 및 그들의 복합체나 수식물 등의 생체 구성 분자 등이 열거되지만, 그 밖의 합성 화합물이나 비천연화합물 등도 항원으로 될 수 있다. 일반적으로 항체가 인식하는 것은 항원 분자 전체가 아닌 그 표면의 특정 부위이다. 이 특정한 부위?구조를 항원 결정기(에피토프)라고 부른다. 항체가 인식하는 부위(에피토프)로서는 단백질의 아미노산 서열 등의 일차 구조 뿐만 아니라 분자상의 복수의 부분에 의해 구성되는 특이적인 입체 구조 등도 포함된다. 따라서, 고분자량의 분자상에는, 그 표면에 복수의 항원 결정기를 지니고 있을 경우가 많다.
또한,「인간 분비물」이란, 인간 체내 및 체표 분비선으로부터의 분비물이고, 특히 체외 분비선(침샘, 눈물샘, 유선 및 땀샘)으로부터 각각 분비되는 타액, 눈물, 젖 및 땀이다. 또한, 이하의 설명에 있어서, 「인간 분비물 정제 부분」을 「Fr.D」라고 기재하는 경우가 있다.
또한, 상기한 바와 같이, 발명자들은 땀에 포함되는 항원 물질이나 아토피성피부염 유도 단백질에 대해서 이미 보고하고 있다(비특허문헌 1, 특허문헌 4). 비특허 문헌 1에 기재되어 있는 땀항원 물질의 주요 구성 성분은, 양이온 교환 수지에 흡착된다. 또한, 특허문헌 4의 아토피성 피부염 유도 단백질도, 양이온 교환 수지 및 ConA 컬럼에 흡착되는 부분(양이온 컬럼 흡착 부분)에 포함되고 있고, 비특허 문헌 1과 특허 문헌 4의 물질은 실질적으로 동일하다. 이에 대하여, 본 발명에 따른 Fr.D는 양이온 교환 수지 및 ConA 컬럼에는 흡착되지 않는 양이온 컬럼 비흡착 부분이다.
또한, 본 발명에 따른 Fr.D(양이온 컬럼 비흡착 부분)은, 작용 효과의 점에 있어서도 이하와 같이 양이온 컬럼 흡착 부분(비특허 문헌 1, 특허문헌 4)과 상위하고 있다.
i:비흡착 부분(Fr.D)과 흡착 부분에 의한 임상 성적을 비교해 보면, Fr.D 에서는 아토피성 피부염 환자 40명 중 36명(90.0%)이 양성이라 판정된 것에 비해(실시예 5), 흡착 부분에서는 36인 중 26인(72.2%)이 양성을 나타내는데에 지나지 않는다(비특허문헌 1, 제101페이지, 왼쪽란 제41행).
ii: 동일한 땀에서 정제한 Fr.D과 특허문헌4에 나타내는 방법으로 얻어진 부분을 사용하여 AD환자 혈구에 대한 히스타민 유리 활성을 측정한 바, 전자는 농도7.74μg/ml에서 히스타민 유리 활성 45.5%이었던 것에 비해, 후자는 농도 100μg/ml에서 5.1%이었다. 이것은 전자는 후자에 비하여 지극히 높은 활성을 지니고 있는 것을 나타낸다.
본 발명에 있어서의 그 밖의 용어나 개념은, 발명의 실시형태의 설명이나 실시예에 있어서 상세하게 규정한다. 또한, 본 발명을 실시하기 위해서 사용하는 각종 기술은, 특별히 그 출전을 명시한 기술을 제외하고는, 공지의 문헌 등에 의거하여 당업자라면 용이하게 또한, 확실하게 실시가능하다. 예를 들면, 본 발명의 치료약의 조제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Pub1ishing Co., Easton, PA, 1990에, 유전자 공학 및 분자 생물학적 기술은 Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manua1, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y,1995 등에 기재되어 있다.
도 1은 음이온 교환 컬럼에 의한 분리 결과이다. 상단은 ConA Sepharose 비흡착 부분의 음이온 컬럼에 의한 용출 패턴이고, 하단은 각 단편마다의 히스타민 유리 활성이다.
도 2는 역상 컬럼에 의한 분리 결과이다. 상단은 음이온 컬럼으로 정제한 활 성 부분의 역상 컬럼에 의한 용출 패턴이고, 하단은 각 단편마다의 히스타민 유리 활성이다.
도 3은 15% 폴리아크릴아미드 겔전기영동에 의한 Fr.D의 전개 패턴이다.
도 4는 미변성 PAGE로부터 용출된 부분의 히스타민 유리 활성이고, 2명의 아토피성 피부염 환자(AD1, AD2)의 혈구 부분을 이용한 히스타민 유리 활성을 나타낸다. 번호는 도 3의 부분 번호에 대응한다. antiIgE: 항 IgE 항체, MW: 음성 대조군(negative control)으로서 사용한 분자량 마커 단백질.
도 5는 아토피성 피부염 환자 혈청에 의한 Fr.D의 활성 흡수 시험의 결과이고, 아토피성 피부염 환자 및 평소 건강한 자의 혈청과 Fr.D를 혼합시켰을 때의 히스타민 유리 활성을 나타낸다. antiIgE: 항 IgE 항체, Fr.D(x500): Fr.D의 500배 희석, serum(AD): 아토피성 피부염 환자 혈청, serum(N):평소 건강한 자의 혈청.
도 6은 15% 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔전기영동에 의한 Fr.D의 전개 패턴이다. 도면에 나타낸 밴드를 잘라 내고, 아미노산 서열의 결정에 제공하였다.
도 7은 랫 마스트 세포주를 아토피성 피부염 환자 혈청으로부터 얻어진 정제 IgE에 의해 감작하고, 정제 땀항원(Fr.D)으로 자극했을 때의 히스타민 유리 시험의 결과를 나타낸다. RBL-2H3: 랫 마스트 세포주. RBL-3D4: RBL-2H3을 호스트에 인간 고친화성 IgE수용체(FcεRI)α 서브 유닛 유전자를 도입해서 작성한 트랜스포먼트 세포주. 항 IgE 항체: 대조로서의 항인간 IgE 항체.
도 8은 평소 건강한 자의 말초혈 호염기구를 유산 처리한 후, 아토피성 피부염 환자 혈청으로부터 얻어진 IgE를 재감작하여 땀항원(Fr.D)로 자극했을 때의 히스타민 유리 시험의 결과를 나타낸다. 미처리: 평소 건강한 자의 말초혈 호염기 구를 Fr.D로 자극했을 경우. 유산 처리: 유산 처리한 평소 건강한 자의 말초혈 호염기구를 Fr.D로 자극했을 경우. ADIgE 감작:유산 처리한 후 아토피성 피부염 환자 혈청으로부터 얻어진 IgE를 재감작하여 땀항원(Fr.D)로 자극했을 경우.
도 9는 인간 마스트 세포주 LAD2를 골수종 IgE 및 아토피성 피부염 환자 혈청으로부터 얻어진 정제 IgE에 의해 감작하고, 정제 땀항원(Fr.D)로 자극했을 때의 히스타민 유리 시험의 결과를 나타낸다. 항 IgE 항체: 대조로서의 항인간 IgE 항체. 1/5000, 1/1500, 1/500은 정제 땀항원(Fr.D)의 희석 배율을 나타낸다.
발명(1)의 아토피성 피부염 유도 물질은, 인간 분비물에 포함되고, 인간 자신의 IgE 항체에 결합하여 마스트 세포 및 호염기구를 활성화하는 물질이고, 이하의 방법에 의해 정제되는 정제 부분, 또는 이 정제 부분에 포함되는 항원 분자 또는 항원 결정기이다.
(1) 인간 분비물을 필터 여과하여 불용물을 제거한 여과액을 회수하는 공정
예를 들면, 인간 분비물(타액, 눈물, 땀)을, 필터에 통액시켜 불용물(침전물)을 제거한다. 필터의 구경은 분비물의 종류 등에 따라서 O.10～1.00μm정도인 것을 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 땀을 여과할 경우에는 0.15～0.30μm 구경의 필터(Corning사 제작, Bottle Top Filter 431174) 등을 사용하는 것이 바람직하다.
(II)여과액과 ConA-어피니티 담체를 혼합시키고, 상청액을 회수하는 공정
ConA-어피니티 담체는, 시판품(예를 들면, ConA-Sepharose, Amersham Parmacia사 제작, 당단백 흡착 능력 45mg/ml, ConA-agarose, Calbiochem사 제작, 당단백 흡착 능력 3.5mg/ml, ConA-agarose, Sigma사 제작, 당단백 흡착 능력 3-6mg/ml등)을 사용할 수 있다. 어피니티 담체의 소요량은 여과액 중의 당단백 총량을 흡착하는데 충분한 양으로 하고, 4℃～실온 정도로 수시간에서 하룻밤 혼합 교반하여 흡착 처리를 행한다. 처리 후 원심 분리, 여과 등으로 상청액(ConA-어피니티 담체 비흡착 부분)을 회수한다.
(III)컬럼 크로마토그래피에 의하여 상청액으로부터 히스타민 유리 활성 성분을 분리하는 공정
공지의 컬럼 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 슬라롬 크로마토그래피(slalom chromatography) 등)를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 사용한다. 또한, 이 둘을 사용하는 경우에는, 음이온 교환 크로마토그래피를 행하고, 이어서, 역상 크로마토그래피를 행하는 것이 바람직하다(발명(2)).
음이온 교환 크로마토그래피로서는, 예컨대, MonoQ HR 10/10(Pharmacia Biotech사 제작), UNO Q12(BioRad사 제작) 등의 시판의 음이온 교환 컬럼을 사용할 수 있다. 이들의 컬럼은, 미리 완충액(예컨대, 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 등)으로 평형화시킨 것을 사용한다. 또한, 역상 크로마토그래피는, 예컨대, SOURCE 15RPC ST 4.6/100(Pharmacia Biotech사 제작) 등의 시판의 역상 컬럼을 사용할 수 있다. 또 한, 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 얻어진 부분을 역상 크로마토그래피에 로드하는 경우에는, 우선 그 부분을 증류수 등에 의해 5~20배 정도로 희석한 것을 후속의 크로마토그래피에 로드하도록 한다.
또한, 히스타민 유리 활성은, 문헌(Koro, O. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 103, 663-670, 1999)의 공지 방법에 의하여 히스타민 양을 측정함으로써 평가할 수 있다.
이상의 공정에 의하여, 아토피성 피부염 유도 물질로서의 인간 분비물 정제 부분(Fr.D)이 얻어진다.
즉, 이후에 서술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 히스타민 유리 활성을 지표로서 음이온 교환 컬럼으로 분리할 때, Fr.D에 포함되는 유도 물질은 0.05M~0.34M NaCl 농도로 용출되고(도 1), 역상 컬럼으로 분리할 때 25%~40% 아세토니트릴 농도로 용출되고(도 2), 미변성 PAGE(폴리아크릴아미드 겔전기영동)로 전개할 때, 농담은 있지만, 꽤 넓어진 밴드로서 관측되었다(도 3). 또한, 도 3에 나타내는 밴드 2로부터 밴드 6까지의 영역에 히스타민 유리 활성을 확인하였다(도 4). 이것은 Fr.D에는 다수의 유도 물질이 포함되어 있는 것을 나타낸다.
또한, 미리 Fr.D에 아토피성 피부염 환자의 혈청을 첨가하여 두면, Fr.D의 히스타민 유리 활성은 손실된다(도 5). 또한, 유산 처리된 평소 건강한 자의 혈구에 환자 혈청을 37℃에서 90분간 첨가하여 후세포를 세정하면, Fr.D에 대한 반응성을 획득하여 Fr.D 첨가에 의해 히스타민을 유리하게 된다. 이러한 변화는 평소 건강한 자의 혈청을 첨가하였을 경우에는 얻어지지 않는 것이므로, 이들의 결과는 Fr.D에 포함되는 아토피성 피부염 유도 물질은 아토피성 피부염 환자 혈청에 특이적으로 포함되는 물질을 통하여 마스트 세포 및 호염기구를 활성화시키고 있는 것을 나타낸다. 또한, 아토피성 피부염 환자 혈청에 의한 평소 건강한 자의 혈구의 Fr.D 응답성의 부여는, 유산 처리된 평소 건강한 자의 혈구에 미리 골수종 환자 혈청 유래의 비특이적 IgE를 첨가하거나, 아토피성 피부염 환자 혈청을 56℃, 1시간 가열함으로써 완전히 저해된다. 이것은 아토피성 피부염 환자 혈청에 포함되는 전달 물질이 특이적 IgE인 것을 나타낸다(실시예6).
또한, 아토피성 피부염 환자로부터 정제한 IgE로 감작한 경우에는, 정제 땀항원(Fr.D)의 농도 의존성에 탈과립을 야기하였다(실시예 7). 이것은 상기 땀항원을 이용하여 특이적 IgE를 검출할 수 있는 것을 나타내고, 환자 혈청을 이용하여 아토피성 피부염의 진단이 가능한 것을 나타낸다.
Fr.D는 85℃, 15분의 가온에서 안정하다. 또한, DNase 및 리파아제에 대해서는 저항성을 나타내지만, Fr.D를 프로테아제로 처리하면 히스타민 유리 활성을 손실하므로, 유도 물질은 적어도 단백질 또는 펩티드를 구성요소의 하나로서 가진다.
이상은 상기 단백질 또는 펩티드, 혹은 상기 단백질 또는 펩티드와 복합체를 형성하는 물질이, 예를 들면 당쇄와 같은, 다양성이 있는 수식을 받고 있을 가능성을 나타낸다.
또한, 변성 PAGE의 밴드 1～밴드 5(도 6)로부터 회수된 유도 물질을 질량 분석계에 의해 해석한 바, 어느 쪽의 밴드에서도 LGKDAVEDLESVGK(서열 번호 1) 및 DAVEDLESVGK(서열 번호 2)의 아미노산 서열을 지닌 펩티드 단편이 얻어졌다. 이 서 열은 공지의 Dermcidin(Br.J.Cancer, 276, 5707-5713, 2000; 이하「DCD」라고 기재함)의 아미노산 번호 83번부터 96번 및 86번부터 96번에 해당하는 것이므로, 유도 물질을 구성하는 단백질 또는 펩티드 중 적어도 하나는 DCD 또는 그 단편이다. 또, DCD의 C단측 펩티드(DCDl)는 땀샘으로부터 분비되는 항균 펩티드로서 보고되어 있지만(Nature Immunology, 2, 1133-1137, 2001), DCD 및 DCD1이 그것을 분비하는 본인의 IgE 항체에 결합하고, 마스트 세포 및 호염기구를 활성화함으로써 아토피성 피부염을 야기하는 유도 단백질인 것은 종래에 전혀 알려져 있지 않다.
DCD 또는 그 부분 펩티드는, 후기 실시예 1과 같은 방법에 의해 인간의 땀으로부터 단리 정제할 수 있다. 또한, 공지의 펩티드 합성법(신생화학 실험강좌 1, 단백질, IV합성 및 발현, 남강당, 1992년)등에 의거하여 화학 합성할 수도 있다. 또한, 단백질을 코드하는 DNA서열(GenBank No. NM-053283)을 사용하고, in vitro 전사 번역계로 단백질이나 펩티드를 조제하는 방법, 또는 적당한 숙주 벡터계(고초균 등의 원핵세포나, 효모, 곤충 세포, 동식물 세포 등의 진핵세포)를 사용하는 공지의 유전자 공학적으로 조제할 수도 있다(예를 들면, 신생화학 실험강좌 1, 단백질, IV합성 및 발현, 남강당, 1992년; 신생화학 실험강좌 2, 핵산, III조합 DNA기술, 일본 생화학회 편, 1992년; 분자생물학 프로토콜 개정 제2판, 편집: 코이케 요시로, 세키야 타케오, 콘도 히사토, 남강당, 1999년).
또한, 발명(1)의 유도 물질은, 2개 이상의 항원 결정기를 가짐으로써 2개 이상의 항체에 결합하고, 그것에 의해서 생리적 활성을 발휘한다. 따라서, 본 발명의 아토피성 피부염 유도 물질은, 2개 이상의 항원 결정기를 포함하는 것으로 할 수 있다. 이러한 항원결정기는, 유도 물질과 동일한 생리 활성(즉, 아토피성 피부염 유도 활성)을 가지므로, 본 발명의 진단 방법이나 감감작 치료약의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항원결정기는 1개 이어도 된다. 그러한, 항원 결정기는 항체 제작을 위한 항원으로서, 발명(4)의 진단 방법의 재료로서, 또는 감감작 요법의 재료로서 사용할 수 있다.
또한, 항원결정기를 단백질(예를 들면, BSA), 다당류 또는 폴리아크릴아미드와 같은 합성 고분자 등에 결합해서 이용할 수도 있다.
발명(3)은 상기 발명(1)의 아토피성 피부염 유도 물질을 항원으로 하여 조제되어, 상기 발명(1)의 아토피성 피부염 유도 물질과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체이다.
이들의 항체는 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체이고, 상기의 유도 물질 또는 그 에피토프 부분에 결합할 수 있는 전체 분자, 및 Fab, F(ab')2, Fv 단편 등이 모두 포함된다. 이러한 항체의 조제는 문헌(신생화학 실험강좌 12, 분자면역학, III항원?항체?보체, 남강당, 1992년;「단일클론항체」, 나가무네 코메이, 테라다 히로시 공저, 히로가와 서점, 1990년; "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996 등)에 기재된 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
또한, 본 발명(3)의 항체에는, 표식 물질에 의해 표식화된 항체도 포함된다.표식 물질은, 효소, 방사성 동위체 또는 형광색소를 사용할 수 있다. 효소는 대사 회전수가 큰 것, 항체와 결합되어도 안정한 것, 기질을 특이적으로 착색시키는 등의 조건을 만족시키는 것이면 특별한 제한은 없고, 일반적인 EIA에 사용되는 효소, 예를 들면, 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알카리포스파타아제, 글리코오스옥시다아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코오스-6-인산화 탈수소효소, 사과산 탈수소 효소 등을 사용할 수도 있다. 또한, 효소 저해 물질이나 조효소 등을 사용할 수도 있다. 이들 효소와 항체의 결합은, 말레이미드 화합물 등의 가교제를 사용하는 공지의 방법에 의하여 행해질 수 있다. 기질로서는, 사용하는 효소의 종류에 따라서 공지의 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소로서 퍼옥시다아제를 사용할 경우에는, 3,3',5,5'-테트라메틸벤디신을, 또 효소로서 알칼리포스파타아제를 사용하는 경우에는, 파라니트로페놀 등을 사용할 수 있다. 방사성 동위체로서는 125I나 3H 등의 일반적인 RIA에서 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 형광 색소로서는, 플루오레슨스 이소티오시아네이트(fluorescence isothiocyanate)(FITC)나 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(TRITC) 등의 일반적인 형광 항체법에 사용되는 것을 사용할 수 있다.
발명(4)의 아토피성 피부염 진단 방법은, 피험자의 혈청 중에 상기의 아토피성 피부염 유도 물질과 결합하는 항체가 존재하는지 여부를 시험하고, 혈청 중에 그 항체가 존재하는 피험자를 아토피성 피부염 환자 또는 그 고위험자로 판정한다.
구체적인 진단은, 예를 들면, 아토피성 피부염 유도 물질에 피험자 혈청을 접촉시켜, 유도 물질과 피험자 혈청 중의 IgE 항체를 액상 중에 있어서 반응시킨 다. 또한 혈청 중의 IgE 항체와 특이적으로 결합하는 표식화 IgE 항체를 반응시켜서, 표식화 IgE 항체의 시그널을 검출하면 좋다. 표식화 IgE 항체의 표식 물질은, 상기의 표식화 항체에 있어서 예시한 바와 같은 효소, 방사성 동위체 또는 형광 색소를 사용할 수 있다. 효소를 사용할 경우에는, 효소 작용에 의하여 분해되어 발색하는 기질을 첨가하고, 기질의 분해량을 광학적으로 측정함으로써 효소 활성을 구하고, 이것을 결합 항체량으로 환산하고, 표준치와의 비교로부터 항체량이 산출된다. 방사성 동위체를 사용할 경우에는, 방사성 동위체의 발하는 방사선량을 신틸레이션 카운터(scintillation counter) 등에 의해 측정한다. 또한, 형광 색소를 사용할 경우에는, 형광 현미경을 조합시킨 측정 장치에 의하여 형광량을 측정하면 된다.
시그널의 검출은, 예를 들면, 웨스턴 블롯 분석을 사용할 수 있다. 또는, 항원 펩티드 + 혈청 중 항체 + 표식화 IgE 항체의 결합체를, 공지의 분리 수단(크로마토법, 염석법, 알코올 침전법, 효소법, 고상법 등)에 의하여 분리하고, 표식화 IgG 항체의 시그널을 검출하도록 하여도 좋다.
발명(4)의 진단 방법은, 또한 유도 물질을 플레이트 또는 멤브레인 상에 고정화하고, 이 기판상에 있어서 피험자 혈청의 항체와의 결합을 시험하는 방법으로서 실시할 수도 있다. 유도 물질을 기판 상에 고정화시킴으로써, 미결합의 표식화결합 분자를 용이하게 제거할 수 있다.
또한, 본 발명(4)의 방법은 아토피성 피부염의 진단 뿐만 아니라, 검출 목적의 항체가 어느 정도 존재하는 지를 정량하는 것도 가능하게 한다. 사전에, 스탠다 드(검량선 등)를 작성하고, 피험자의 혈청으로부터 얻어진 항체량을 스탠다드와 비교함으로써, 정확한 항체량을 측정할 수 있고, 질환의 정도 또는 발병의 위험성의 정도를 높은 정밀도로 추정하는 것이 가능해진다.
발명(5)는, 상기의 유도 물질을 백혈구 부분에 첨가함으로써 유리되어 가는 히스타민량으로부터, 아토피성 피부염 환자 또는 아토피성 피부염 하이 리스크 환자를 진단하는 방법이다. 히스타민량은 문헌(Koro, O. et. al., J.Allergy Clin. Immunol., 103,663-670, 1999)에 기재된 방법에 의하여 측정하면 좋다.
Sabroe등은 두드러기 환자에 있어서의 히스타민 유리량(전체 히스타민량에 대한 분비된 히스타민량의 비율)의 검토로부터, 판정의 컷오프값을 5%로 설정하고 있다(J. Am. Acad. Dermato1., 40, 443-450, 1999). 따라서, 5%를 컷오프값으로서, 평소 건강한 자 및 아토피성 피부염 환자 유래의 백혈구 부분에 대한 Fr.D에 의한 히스타민 유리량을 측정한 바, 평소 건강한 자 33명 중 3명(9.1%), 아토피성 피부염 환자 40명 중 36명(90%)이 양성이라 판정되었다(실시예 5).
본 출원의 발명(6)의 진단 방법은, 피험자의 생체시료(타액, 땀, 눈물 등의 분비물) 중에, 상기 발명(3)의 항체와 결합하는 유도 물질이 존재하는지의 여부를 시험하고, 시료 중에 그 유도 물질이 존재하는 피험자를 아토피성 피부염 환자 또는 아토피성 피부염 고위험자로 판정한다.
본 발명(6)의 진단 방법에 있어서의 하나의 형태는, 항체와 유도 물질과의 결합을 액상계에 있어서 행하는 방법이다. 예를 들면, 표식화한 항체와 생체 시료를 접촉시켜서 표식화 항체와 유도 물질을 결합시켜, 이 결합체를 상기 발명(4)와 동일한 방법으로 분리하고, 표식 시그널을 동일한 방법으로 검출한다.
액상계에서의 진단의 다른 방법은, 항체(1차 항체)와 생체시료를 접촉시켜서 1차 항체와 유도 물질을 결합시키고, 이 결합체에 표식화 항체(2차 항체)을 결합시켜서, 이 세개의 결합체에 있어서의 표식 시그널을 검출한다. 또는, 시그널을 더욱 증강시키기 위해서는, 비표식의 2차 항체를 우선 항체 + 유도 물질 결합체에 결합시키고, 이 2차 항체에 표식 물질을 결합시켜도 좋다. 이러한 2차 항체로의 표식 물질의 결합은, 예를 들면, 2차 항체를 비오틴화시키고, 표식 물질을 아비딘화시켜 둠으로써 행할 수 있다. 또는, 2차 항체의 일부 영역(예를 들면, Fc영역)을 인식하는 항체(3차 항체)을 표식하고, 이 3차 항체를 2차 항체에 결합시켜도 좋다. 또, 1차 항체와 2차 항체는, 양쪽 모두 모노크로날 항체를 사용할 수도 있고, 또는, 1차 항체와 2차 항체 중 어느 하나의 한쪽을 폴리크로날 항체로 할 수도 있다. 액상으로부터의 결합체의 분리나 시그널의 검출은 상기 발명(4)과 동일하게 할 수 있다.
발명(6)의 진단 방법에 있어서의 다른 형태는, 항체와 유도 물질의 결합을 고상계에 있어서 시험하는 방법이다. 이 고상계에 있어서의 방법은, 극미량의 유도 물질의 검출과 조작의 간편화 때문에 바람직한 방법이다. 즉, 이 고상계의 방법은, 항체(1차 항체)를 수지 플레이트 또는 멤브레인 등에 고정화하고, 이 고정화 항체에 유도 물질을 결합시켜, 비결합 분자를 세정제거한 후, 플레이트 상에 남은 항체 + 유도 물질 결합체에 표식화 항체(2차 항체)를 결합시켜, 이 2차 항체의 시그널을 검출하는 방법이다. 이 방법은, 소위 「샌드위치법」이라고 불리는 방법이고, 마커로서 효소를 사용할 경우에는,「ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)」로서 널리 사용되고 있는 방법이다. 1차 항체와 2차 항체는, 양쪽 모두 모노크로날 항체를 사용할 수도 있고, 또는, 1차 항체와 2차 항체 중 어느 한쪽을 폴리크로날항체로 할 수도 있다. 시그널의 검출은 상기 발명(6)과 마찬가지로 할 수 있다. 또한, 이러한 진단 방법은, ELISA 키트의 사용에 의해 간편하면서 광범위한 실시가 가능하다.
또한, 본 발명(6)의 방법은, 아토피성 피부염의 진단뿐만 아니라, 아토피성 피부염 유도 물질이 어느 정도 존재하는지를 정량하는 것도 가능하게 한다. 사전에, 스탠다드(검량선 등)를 작성하고, 피험자의 생체 시료로부터 얻어진 단백질량을 스탠다드와 비교함으로써, 정확한 단백질을 측정할 수 있고, 질환의 정도 또는 발병의 위험성의 정도를 높은 정밀도로 추정하는 것이 가능해진다.
또한, 상기 발명(4) 또는 (6)의 실시는, 상기의 예 이외에도, 문헌(개정 4판, 와타나베?나카네 효소항체법, 편집:나구라 히로시, 나가무라 요시유키, 쯔쯔미 히로시, 가쿠사이키카쿠 가부시키가이샤, 2002년 등)에 의거하여 적당하게 행할 수 있다.
또한, 아토피성 피부염의 진단은, 상기 발명(1)의 유도 물질을 사용한, 소위 「패치 테스트」에 의해서도 행할 수 있다. 패치 테스트는 접촉성 알레르기의 간편한 검사법으로서 피부과 영역에서는 널리 행해지고 있다. 접촉성 알레르기가 존재할 때는, 피부염이 있는 부위뿐만 아니라 전신의 피부가 감작되어 있으므로, 건강피부에 알레르기성 접촉 피부염을 인공적으로 재현시킴으로써 접촉 피부염의 원인을 판정할 수 있다. 구체적으로는, 반창고에 상기의 유도 물질을 적하, 또는 도포 하고, 등부분?상완(上腕)?대퇴 등에 부착한다. 판정은, 2일, 3일, 1주간 후에 ICDRG(국제 접촉 피부염 연구반) 준칙을 따라서 행한다. 아무런 반응이 없으면 (-), 반창고의 시약 부분에 붉은 반점과 부종을 동반하고 있는 상태를 (+)로 해서, 반응의 정도에 따라 (++), (+++)로 판정한다. 본 출원은, 이러한 패치 테스트에 의한 아토피성 피부염의 진단을 간편하면서, 균질하게, 또한 저렴하면서 대규모로 실시할 수 있는 수단으로서, 발명(7)의 판정 시약을 제공한다.
발명(8)은, 상기의 아토피성 피부염 유도 물질을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 감감작 치료약이다. 「감감작 치료 」란, IgE 항체가 관여하는 알레르기에 있어서, 미량의 치료용 알레르겐을 일정 일수를 날마다 차츰 증량시키면서 투여하고, 원인 알레르겐이 진입해도 알레르기 반응이 생기지 않도록 하는 치료법이다. 본 발명의 아토피성 피부염 유도 물질은, 상기한 바와 같이 아토피성 피부염의 유도활성을 갖는 것이기 때문에, 감감작에 있어서의 치료용 알레르겐이 될 수 있다.
실시예 9에 나타내는 바와 같이, 실제로 땀에 대하여 알레르기 반응을 나타내는 아토피성 피부염 환자를 대상으로 Fr.D를 사용한 감감작 요법을 시험해 본 바, 피부내 테스트 및 임상 소견에서의 개선을 확인하였다.
이 감감작 치료약은, 상기의 유도 물질과 약리학적으로 허용할 수 있는 담체를 균일하게 혼합하여 제제화시킬 수 있다. 담체는, 약제의 투여 형태에 따라서 넓은 범위에서 적당하게 선택될 수 있지만, 본 발명의 약제는, 경구적으로 또는 주사에 의해 투여할 수 있는 단위 복용 형태로 있는 것이 바람직하다.
현탁제 및 시럽제와 같은 경구액체 조제물은, 물, 수크로오스, 소르비톨, 프룩토오스 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 대두유 등의 기름류, 알킬파라히드록시벤조에이트 등의 방부제, 스트로베리?플레이버, 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 사용하여 제조할 수 있다.
산제, 환제, 캅셀제 및 정제는, 락토오스, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨류의 부형제, 전분, 알긴산 소다 등의 붕괴제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알콜, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 표면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 이용하여 제제화할 수 있다.정제 및 캅셀제는, 투여가 용이하다고 하는 점에 있어서, 본 발명의 제제에 있어서의 바람직한 단위 투여 형태이다. 정제나 캅셀을 제조할 때에는, 고체의 제약 담체가 사용된다.
또한, 주사용의 용액은, 염용액, 글루코오스 용액, 또는 염수와 글루코오스 용액의 혼합물, 각종 완충액 등으로 이루어지는 담체를 이용하여 제제화할 수 있다. 또한, 분말 상태에서 제제화하고, 사용시에 상기 액체 담체와 혼합하여 주사액을 조제하여도 좋다.
본 발명의 감감작 치료약의 투여 스케줄은, 환자의 연령이나 체중, 증상, 투여 경로 등에 따라 달라지지만, 치료용 알레르겐으로서의 단백질/펩티드 양은 미리 피부내 테스트를 행하고, 개인마다 역치를 측정하고, 그 역치의 전후의 양을 첫회투여로 하는 것이 바람직하다. 2회째 이후의 투여 간격과 알레르겐 증량폭은 알레르기 반응의 유무나 정도에 따라서 적당하게 할 수 있다. 최종적으로는 역치량의 10,O00배 정도의 알레르겐을 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 감감작 치료약에 있어서는, 첫회 투여의 알레르겐 양을 1ng/ml×0.05ml로 하여 제제화했을 경우, 최종 투여의 약제를 10mg/ml×0.05ml로서 제제화할 수 있다.
(실시예)
이하, 실시예를 게시해서 본 출원의 발명을 더욱 상세하고 구체적으로 설명하지만, 본 출원의 발명은 이하의 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
히스타민 유리 활성 부분(Fr.D)의 정제
1-1. 인간의 땀을 필터 여과하여 불용물을 제거한 여과액을 회수하는 공정
인간의 땀 500ml를 필터 여과(0.22μm)하여 침전물을 제거하였다. 흡광도(OD280nm)로부터 개산(槪算)하고, 총단백량 1.07mg의 여과액을 얻었다.
1-2. 여과액과 ConA?어피니트 담체를 혼합하고, 상청액을 회수하는 공정
필터 여과된 땀에 24ml의 ConA-어피니티 담체(ConA-Sepharose, Amersham Parmacia사 제작; 당단백 흡착 능력 45mg/ml)를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 교반하고, 상청액(ConA-Sepharose 비흡착 부분)을 회수하였다.
1-3. 상청액을 음이온교환 컬럼으로 분리하고, 히스타민 유리 활성을 갖는 부분을 회수하는 공정
미리 20mM Tris-HC1(pH8.0)에서 평형화시킨 음이온 교환 컬럼(Mono QHRl0/10; Pharmacia Biotech사 제작)에, pH8.0으로 조제한 상청액을 로드하고, 0M～1M NaC1의 농도구배에 의해 용출하였다. 용출된 각 단편의 2μl과 48μl의 백혈구 부분을 혼합하고, 37℃에서 40분 반응시켰다. 그 후에, 원심분리하여 상청액과 침전으로 분리시키고, 과염소산을 가하여 변성시킨 후 히스타민 양을 HPLC로 측정하였다. 전체 히스타민 양에 대한 상청액의 히스타민 양의 비율을 히스타민 유리 활성으로 한다. 히스타민 유리 시험의 결과, 0.05M～0.34M NaC1농도에서 용출되는 활성부분을 회수하였다(도 1). 또한, 히스타민 양은 문헌 기재의 방법에 따라서 측정되었다(Koro,O. et.al., J.Allergy Clin. Immuno1., 103, 663-670, 1999).
1-4. 상기 활성 부분을 역상 컬럼으로 분리하고, 히스타민 유리 활성을 갖는 부분(Fr.D)을 회수하는 공정
음이온 컬럼으로 회수한 단편을 0.1% TFA/증류수로 10배로 희석하고, 역상 컬럼(SOURCE 15RPC ST 4.6/100;Pharmacia Biotech사 제작)에 로드하고, 0.1% TFA/증류수로부터 0.1% TFA/CH3CN까지의 농도구배로 용출하였다. 용출된 각 단편의 2μl을 동결건조하여 TFA나 CH3CN을 휘발시킨 후, 히스타민 유리 시험을 행하고, 유리 활성이 있는 단편(CH3CN 농도25%～40%)을 회수한다(도 2).
Fr.D를 미변성 15% PAGE로 전개했을 때의 패턴을 도 3에 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이 6개의 밴드로 분할되고, 각각의 히스타민 유리 활성을 측정한 바, 밴드 2부터 밴드 6까지 활성을 확인하였다(도 4).
실시예 2
아토피성 피부염 환자 혈청에 의한 Fr.D의 히스타민 유리 활성으로의 작용
Fr.D를 회수하고, 동결건조 후, PBS에 재용해해서 농도를 1mg/ml로 한 것을 Fr.D의 표품(標品)으로 하였다. 아토피성 피부염 환자의 혈청 40μl에 Fr.D 표품의 50배 희석 10μl를 가하여 37℃, 30분간 프리인큐베이트하면 히스타민 유리 활성은 완전하게 손실된 것에 비해, 평소 건강한 자의 혈청을 가했을 경우에는 히스타민 유리 활성은 손실되지 않았다(도 5). 또한, antiIgE와 Fr.D(x500)는 양성 대조군(positive control), serum(AD;환자 혈청)과 serum(N; 평소 건강한 자)은 음성 대조군이다.
실시예 3
효소처리
3-1. DNase처리, 리파아제 처리
Fr.D 표품 5μl에 DNase(Ambion사 제작) 0.2U/μl(종농도(終濃度))를 가하여 37℃, 16시간, 또는 췌장 유래의 리파아제(SIGMA사 제작) 30mU/μl(종농도)를 가하여 37℃, 16시간, 인큐베이트하였지만, 어느 쪽의 경우도 히스타민 유리 활성의 저하는 확인되지 않았다.
3-2. 프로테아제 처리
Fr.D 표품 5μl에 ProteinaseK(Ambion사 제작) 2μg/μl, 또는 Trypsin(SIGMA사 제작) 2μg/μl을 가하여 종농도를 0.1μg/μl로 하고, 37℃, 16시간 인큐베이트하면, 모든 경우, 히스타민 유리 활성은 완전하게 손실되었다.
실시예 4
질량 분석계에 의한 아미노산 서열의 결정
Fr.D를 15%의 SDS-PAGE로 전개하였을 때의 패턴을 도 6에 나타낸다(밴드의 번호는 도 3의 번호와는 반드시 대응하지 않는다). 각 밴드를 잘라 내어 겔내 트립 신 소화를 하고, 용출 부분의 MS/MS측정에 의해 내부 아미노산 서열을 결정하였다. 그 결과, 밴드 1부터 밴드 5까지의 모두에 있어서, LGKDAVEDLESVGK 및 DAVEDLESVGK의 아미노산 서열을 지닌 펩티드가 검출되었다. 데이터베이스의 검색으로부터, 이들은 dermcidin의 아미노산 번호 83번부터 96번 및 86번부터 96번에 해당하는 것이 분명해졌다.
또한, 질량 분석계에 의한 아미노산 서열의 결정 및 데이터베이스 검색에 의한 단백질 동정(同定)은 주식회사 프로 페닉스에 위탁하였다.
실시예 5
Fr.D을 이용한 아토피성 피부염 환자의 진단
실시예 1 및 2에 기재된 방법에 따라서, 평소 건강한 사람 또는 아토피성 피부염 환자 유래의 백혈구 부분에 Fr.D 표품(종농도 2μg/ml)을 가하여, 히스타민 유리량을 측정하였다. 그 결과를 기초로 컷오프값을 5%로 설정하여 판정한 바, 평소 건강한 자 33명 중 3명(9.1%), 아토피성 피부염 환자 40명 중 36명(90%)이 양성으로 판정되었다.
실시예 6
인간 말초혈 호염기구를 사용한 혈청 중의 땀항원 특이적 IgE의 검출
땀에 대한 감수성이 없는 평소 건강한 사람 3인의 말초혈 호염기구 표면으로부터 유산 처리에 의해 IgE를 제거한 후, 아토피성 피부염 환자 혈청으로부터 정제한 IgE로 이 호염기구를 감작하고, 정제 땀항원 Fr.D로 자극하였다.
그 결과, 호염기구의 도너의 여하에 상관없이 유산 처리 후의 땀항원 자극으 로는 히스타민 유리는 확인되지 않았지만, 아토피성 피부염 환자 혈청으로부터 정제된 IgE(ADIgE)로 이들의 세포를 감작하였을 경우에는 땀항원 자극에 의한 히스타민 유리가 확인되었다(도 7). 이 시험에 의해, 아토피성 피부염 환자 혈청 중에 포함되는 땀항원 특이적 IgE의 존재를 검출할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 7
인간 마스트 세포주를 사용한 혈청 중의 땀항원 특이적 IgE의 검출
인간 마스트 세포주(LAD2: Arnold S.외; Leukemia Research 27(2003) 677-682)를 골수종 IgE 또는 환자 IgE로 감작하여 정제 땀항원으로 자극하였다. 그 결과, 도 8에 나타나 있는 바와 같이, 인간 IgE의 대조군으로서의 비특이적 골수종 IgE로 감작한 경우에는 정제 땀항원에 의한 자극에 의한 탈과립(그 정도는 히스타민과 동시에, 또 같은 정도 유리되는 효소인 β-헥소사미니다아제의 유리로 나타내어짐)은 확인되지 않았지만, 아토피성 피부염 환자로부터 정제한 IgE로 감작한 경우에는, 정제 땀항원의 농도 의존성에 탈과립을 야기하였다(도 8). 이 시험에 의해, 아토피성 피부염 환자 혈청 중에 포함되는 땀항원 특이적 IgE의 존재를 검출할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 8
랫 마스트 세포주를 사용한 혈청 중의 땀항원 특이적 IgE의 검출
랫 마스트 세포주 RBL-2H3을 호스트에 인간 고친화성 IgE수용체(FcεRI)α서브 유닛 유전자를 포함하는 인간?랫 키메라 cDNA유전자를 도입하여 제작된 RBL-3D4 트랜스포먼트 세포주(히데미치 히로시 외; 일본 피부과학회 잡지 109: 475, 1999)를 이용하여 실험을 행하였다. 호스트의 세포주인 RBL-2H3세포에서는 항 IgE 항체, 정제 땀항원 중 어느 쪽의 자극으도 탈과립 반응은 확인되지 않았지만, 인간 FcεRIα 서브 유닛을 발현하고 있는 RBL-3D4 세포를 환자 IgE로 감작하고, 항 IgE 항체 및 정제 땀항원으로 자극하면 모든 경우에 탈과립 반응이 확인되었다(도 9). 실시예 8과 같이, 본 시험에 의해, 아토피성 피부염 환자 혈청 중에 포함되는 땀항원 특이적 IgE의 존재를 검출할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 9
정제 땀항원에 의한 감감작 치료 효과
정제 땀항원을 이용하여 2명의 아토피성 피부염 환자에 대하여 감감작 치료를 실시하고, 그 효과를 조사하였다. 피부내 테스트에 있어서의 역치 농도를 참고로 하면서 정제 땀항원의 0.5mL를 3일에 한 번의 빈도로 피하에 주사하였다. 3회의 피하 주사마다 농도를 2배로 상승시키면서 치료를 계속하였다. 항원 농도는 최고 농도를 약 250배가 될 때까지 상승시켰다. 치료 효과는 피부내 테스트에 있어서의 반응 역치 및 임상 증상에 의해 판단되었다.
1명은 발한에 의한 증상 출현의 정도가 분명하게 감약되고, 또 1명은 아토피성 피부염의 증상이 개선되었다. 이하에 그 일례의 치료 경과를 나타낸다.
치료 개시전: 정제 땀항원을 사용한 말초혈 호염기구의 히스타민 유리 시험에서는, 정제 항원에 의한 히스타민 유리율-59%로 강양성이었다.(대조-4.33%, 항IgE 항체자극-55%)
치료 개시: 정제 땀항원 12800배 희석액 O.5mL를 피하 주사하였다.
치료 계속: 3회의 피하 주사마다 정제 항원 농도를 2배로 상승시키면서 0.5mL를 피하 주사. 250배에 달한 후는 이 농도를 유지하여 치료를 계속하였다.
치료 경과에 따르는 역치 변화는 표 1에 나타낸 바와 같다.
감감작 치료(Lot 1) 피부내 테스트(Lot 1)의 역치
치료 개시부터 9일째 ×64
치료 개시부터 65일째(2개월) ×32
표 1에 나타낸 바와 같이, 치료 2개월째에 역치가 2배 농도가 되는 치료 효과가 확인되었다. 임상 소견상에서도 개선이 확인되었다. 이후, 치료를 계속하였지만, 피부내 테스트용 정제 항원은 Lot2로 바꿔 경과를 조사하였다. 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
감감작 치료(Lot 2) 피부내 테스트(Lot 2)의 역치
치료 개시부터 75일째 ×512
치료 개시부터 125일째(4개월) ×128
치료 개시부터 9개월째 ×128
치료 후 75일째 이후의 역치가 높은 수치가 되어 있지만, 대조로서 동시에 테스트한 히스타민의 피부내 테스트에 대한 환자의 감수성은 첫회 치료시부터 변화가 없으므로, Lot2의 항원 역가가 높은 것에 의해서라고 생각된다. Lot2로 변경 후에서도 125일에서는 역치가 4배농도가 되어 치료 효과가 더욱 상승된 것을 확인할 수 있었다.
이상 상세하게 설명한 바와 같이, 본 출원의 발명에 의하여, 아토피성 피부염의 원인 인자로서, 환자 자신이 생산하는 아토피성 피부염 유도 물질이 제공된 다. 이것에 의하여, 아토피성 피부염의 정확한 진단과, 그 치료가 가능해진다.
<110> HIDE, Michihiro Wakunaga Pharmaceutical Co.,Ltd. <120> Atopic dermatitis-inducing substance <130> O4-F-038PCT <150> JP2003-194642 <151> 2003-07-09 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Gly Lys Asp Ala Val Glu Asp Leu Glu Ser Val Gly Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ala Val Glu Asp Leu Glu Ser Val Gly Lys 1 5 10

Claims (10)

  1. 인간 땀샘으로부터의 분비물로부터 이하의 공정:
    인간 땀샘으로부터의 분비물을 필터 여과하여 불용물을 제거한 여과액을 회수하는 공정;
    여과액과 ConA-어피니티 담체를 혼합하고, 상청액을 회수하는 공정; 및
    컬럼 크로마토그래피에 의하여 상청액으로부터 히스타민 유리 활성 성분을 분리하는 공정
    을 거쳐서 얻어지는 조성물로서, 인간 자신의 IgE 항체에 결합하여 마스트 세포 및 호염기구를 활성화시키고, 아토피성 피부염 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 컬럼 크로마토그래피가 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 역상 컬럼 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 조성물을 항원으로 하여 조제되고, 제 1항 또는 제 2항에 기재된 조성물과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 조성물을 패치 테스트용 소재에 유지시킨 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 고위험자의 판정 시약.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 감감작 치료약.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 진단용 키트.
  10. 인간 땀샘으로부터의 분비물 유래이고, 인간 자신의 IgE항체에 결합하여 마스트 세포 및 호염기구를 활성화시키고, 아토피성 피부염 유도 활성을 갖는 조성물을 제조하는 방법으로서, 이하의 공정:
    인간 땀샘으로부터의 분비물을 필터 여과하여 불용물을 제거한 여과액을 회수하는 공정;
    여과액과 ConA-어피니티 담체를 혼합하고, 상청액을 회수하는 공정; 및
    컬럼 크로마토그래피에 의하여 상청액으로부터 히스타민 유리 활성 성분을 분리하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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