JP2003128697A - ペプチドとその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本質的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピト
ープからなるペプチド及びそれに相同的なペプチドと、
それらペプチドを有効成分として含んでなる免疫療法剤
を提供する。 【解決手段】 スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグ
ロブリンＥ抗体に実質的に反応せず、³Ｈ−チミジンの
取込みにより判定する方法で試験すると、陰性対照と比
較して、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に
活性化するペプチドと、そのペプチドを有効成分として
含んでなる免疫療法剤を構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、新規ペプチドと
その用途、とりわけ、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ
細胞を活性化するペプチドと、そのペプチドを有効成分
として含んでなる免疫療法剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ここ十数年来、我国においては、春先に
なるとスギ花粉症による鼻炎や結膜炎を訴える人の数が
増加し続けている。患者の数が多いことと、発症季がい
ろいろな行事が続く春先ということもあり、マスコミな
どでも頻繁に取上げられ、今や、公衆衛生上無視できな
い問題の一つになっている。

【０００３】スギ花粉症はアレルギー症の一種であり、
その主因はスギ花粉中の抗原性物質、すなわち、スギ花
粉アレルゲンであると云われている。大気中に飛散した
スギ花粉がヒトの体内に侵入すると、スギ花粉アレルゲ
ンに対するイムノグロブリンＥ抗体が産生する。この状
態で次にスギ花粉が侵入すると、その花粉中のアレルゲ
ンとこのイムノグロブリンＥ抗体が免疫反応を起し、ア
レルギー症状を呈することとなる。

【０００４】現在、スギ花粉中には、抗原性の相違する
少なくとも二種類のアレルゲンの存在することが知られ
ている。その一つは、ヤスエダらが『ジャーナル・オブ
・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー』、
第７１巻、第１号、第７７〜８６頁（１９８３年）に報
告しているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙｊ
Ｉ」と呼称されている。もう一つは、タニアイら『エ
フ・イー・ビー・エス・レターズ』、第２３９巻、第２
号、第３２９〜３３２頁（１９８８年）やサカグチら
『アレルギー』、第４５号、第３０９〜３１２頁（１９
９０年）に報告されているアレルゲンであり、今日、こ
れは「Ｃｒｙ ｊ ＩＩ」と呼称されている。スギ花粉
中には、通常、Ｃｒｙ ｊ ＩとＣｒｙ ｊ ＩＩが約
５０：１乃至５：１の割合で存在し、花粉症患者から採
取した血清の殆どがＣｒｙ ｊＩにもＣｒｙ ｊ ＩＩ
にも反応すると云われている。澤谷らは、『アレルギ
ー』、第４２巻、第６号、第７３８〜７４７頁（１９９
３年）において、Ｃｒｙｊ ＩＩが、皮内試験やＲＡＳ
Ｔ試験すると、Ｃｒｙ ｊ Ｉと同程度の抗原性を発揮
すると報告している。

【０００５】このように、スギ花粉アレルゲンが既に幾
つか単離され、その性質・性状もある程度解明されたこ
とから、精製スギ花粉アレルゲンをヒトに投与して減感
作することにより、スギ花粉症を治療・予防できる見通
しがついてきた。最近ではそのための減感作剤も幾つか
考案されており、例えば、特開平１−１５６９２６号公
報や特開平３−９３７３０号公報には、Ｎ末端からのア
ミノ酸配列がＡｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ
−Ｓｅｒ又はＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎで表わされるスギ花粉アレルゲンに糖質を共有
結合せしめ、生成した複合体を減感作剤としてヒトに投
与する提案が為されている。しかしながら、アレルギー
症の診断や減感作療法には、通常、高純度のアレルゲン
が大量に必要とされるところ、スギ花粉中のアレルゲン
は僅少であるうえに安定性が低く、スギ花粉症の診断剤
や減感作剤をスギ花粉だけで賄おうとすると、多大の困
難が伴なうと予想される。

【０００６】このようなことから、最近のアレルギー疾
患の治療・予防においては、これまでのように、患者に
アレルゲン全体を投与するのではなく、アレルゲンにお
けるＴ細胞が特異的に認識する最小領域、すなわち、本
質的にＴ細胞エピトープからなる低分子のペプチドを投
与する免疫療法が注目を浴びつつある。

【０００７】一般に、アレルゲンは、マクロファージな
どの抗原提示細胞に取込まれると、そこで消化され、消
化断片が免疫提示細胞表層のＨＬＡ蛋白質に結合し、抗
原提示されることとなる。抗原提示される断片は、ＨＬ
Ａ蛋白質に対する親和性などにより、アレルゲンにおけ
る一部の特定領域に限られ、斯かる領域のうち、Ｔ細胞
が特異的に認識する領域は、通常、「Ｔ細胞エピトー
プ」と呼称される。本質的にＴ細胞エピトープからなる
ペプチドを投与する免疫療法には、 （ｉ） ペプチドがＢ細胞エピトープを欠いている、す
なわち、アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体
が反応しないので、従来の粗製又は精製アレルゲンで頻
発していたアナフィラキシーなどの副作用が起こり得な
い。 （ｉｉ） 少量からスタートし、有効投与量に達するま
での期間が、従来の減感作剤に比較して、大幅に短縮で
きる。などの利点がある。

【０００８】目下、種々のアレルゲンのＴ細胞エピトー
プが精力的に解析されているが、Ｔ細胞エピトープの解
析には、通常、アレルゲンの全アミノ酸配列が必須とな
り、少なくともスギ花粉アレルゲンに関するかぎり、Ｔ
細胞エピトープは実質的に解明されるに到っていないと
いうのが実状である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の第一の課題は、本質的にスギ花粉アレルゲンの
Ｔ細胞エピトープからなるペプチド及びそれに相同的な
ペプチドを提供することにある。

【００１０】この発明の第二の課題は、有効成分として
上記ペプチドを含んでなる免疫療法剤を提供することに
ある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリ
ンＥ抗体に実質的に反応せず、³Ｈ−チミジンの取込み
により判定する方法で試験すると、陰性対照と比較し
て、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性
化するペプチドにより解決するものである。

【００１２】この発明は、前記第二の課題を、有効成分
として斯かるペプチドを含んでなる免疫療法剤により解
決するものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】この発明のペプチドは、スギ花粉
アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的
に反応しないので、ヒトを含む哺乳類一般に投与する
と、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、ス
ギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化する。

【００１４】有効成分として斯かるペプチドを含んでな
るこの発明の免疫療法剤は、ヒトを含む哺乳類一般に投
与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことな
く、スギ花粉症に対して顕著な治療・予防効果を発揮す
る。

【００１５】以下、実験例、実施例等によりこの発明を
説明するに、この発明は、本質的にスギ花粉アレルゲン
のＴ細胞エピトープからなるペプチドの発見に基づくも
のである。

【００１６】本発明者らは、長年に亙るスギ花粉アレル
ゲンに係わる研究の一成果として、昨年、スギ花粉アレ
ルゲンの主たる１成分が配列表における配列番号１４に
示すアミノ酸配列を有することを突止め、特願平５−３
４４５９６号明細書に開示した。一方、国際特許公開第
９３／０１２１３号明細書には、スギ花粉アレルゲンの
別の１成分が、配列表における配列番号１５に示すアミ
ノ酸配列を有すると開示されており、本発明者らも、平
成６年４月１４乃至１６日に熊本県熊本市で開催された
『第６回日本アレルギー学会春期臨床大会』において、
同じアミノ酸配列を発表している。

【００１７】そこで、本発明者が、スギ花粉アレルゲン
のＴ細胞エピトープを解明すべく、これら配列番号１４
及び１５に示すアミノ酸配列に基づき、それらアミノ酸
配列における連続する１１、１４又は１７個のアミノ酸
残基からなる、１８０余種の互いに相違するアミノ酸配
列のペプチドを合成し、スギ花粉アレルゲンに特異的な
イムノグロブリンＥ抗体に対する反応性と、スギ花粉ア
レルゲンに特異的なＴ細胞に対する活性化作用につき試
験した。その結果、配列表における配列番号８乃至１３
に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、スギ花粉アレ
ルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反
応せず、また、³Ｈ−チミジンの取込みにより判定する
方法で試験すると、陰性対照と比較して、スギ花粉アレ
ルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化することが明ら
かとなった。このことは、それら配列番号８乃至１３に
示すアミノ酸配列を有するペプチドが本質的にスギ花粉
アレルゲンのＴ細胞エピトープからなるものであること
を示唆している。また、その配列番号８乃至１３に示す
アミノ酸配列をさらに解析したところ、配列表の配列番
号１乃至７に示すアミノ酸配列は、Ｔ細胞が配列番号８
乃至１３に示すアミノ酸配列のペプチドを認識するため
に不可欠の配列であることが判明した。

【００１８】次の実験例１及び２では、これら事実を解
明するに到った一連の実験について説明する。

【００１９】

【実験例１】＜ペプチド及びスギ花粉アレルゲンの調製
＞

【００２０】

【実験例１−１】＜ペプチドの調製＞前述のとおり、こ
れまで、スギ花粉には、性質・性状の相違する、少なく
とも２種類のアレルゲンの存在することが知られてい
る。これらスギ花粉アレルゲンの成熟蛋白質は、組換え
ＤＮＡ技術により、配列表における配列番号１４又は１
５に示すアミノ酸配列を有することが明らかにされてお
り、現に、スギ花粉からは、配列番号１４に示すアミノ
酸配列における第４６乃至４３３番目又は第５１乃至４
３３番目に相当するアミノ酸配列のスギ花粉アレルゲン
（以下、「アレルゲンＡ」と云う。）と、配列番号１５
に示すアミノ酸配列における第１乃至３５３番目のアミ
ノ酸配列を有するスギ花粉アレルゲン（以下、「アレル
ゲンＢ」と云う。）が単離されている。なお、アレルゲ
ンＡをコードする遺伝子においては、未だ、シグナルペ
プチドが確定されていないので、配列番号１４において
は、暫定的に、ｃＤＮＡの塩基配列から解読したアミノ
酸配列におけるＮ末端側の最初のアミノ酸残基に符号
「１」を付している。

【００２１】本実験例では、配列表における配列番号１
４に示すアミノ酸配列については、その第４６乃至４３
３番目の領域に亙り、アミノ酸残基を１０個ずつ重複さ
せながら、１１又は１４個のアミノ酸残基からなる、９
５種類の相違するアミノ酸配列のペプチド（試料Ａ−１
乃至Ａ−９５）を化学合成する一方、配列番号１５に示
すアミノ酸配列については、その第１乃至３５３番目の
領域に亙り、同じく、アミノ酸残基を１０個ずつ重複さ
せながら、１４個のアミノ酸残基からなる、８６種類の
相違するアミノ酸配列のペプチド（試料Ｂ−１乃至Ｂ−
８６）を化学合成し、この発明のペプチドを検索するた
めの後記実験例２に供した。

【００２２】すなわち、常法にしたがって、１１又は１
４個のアミノ酸残基からなり、後記表１乃至６に示すア
ミノ酸配列を有する１８１種類のペプチドをケンブリッ
ジ・リサーチ・バイオケミカルズ製ペプチド合成キット
『マルチピン』を使用する固相法により合成し、合成
後、その一部をとり、パーキン・エルマー製ペプチドシ
ーケンサー『４７０Ａ型』により分析して所期のアミノ
酸配列を有していることを確認した。

【００２３】

【実験例１−２】＜スギ花粉アレルゲンの調製＞秋田県
産ウラスギの雄花から採取した花粉１重量部を約１６重
量部の０．１２５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ
８．２）に浸漬し、穏やかに攪拌しながら、４℃で１時
間抽出した。抽出物を遠心分離し、残渣を上記と同様に
再度抽出し、得られた上清と初回の上清をプールし、こ
れにセタブロンを０．１％（ｗ／ｖ）になるように加
え、緩やかに攪拌しながら、４℃で１時間静置して多糖
類を沈澱させ、遠心分離後、上清に硫酸アンモニウムを
８０％飽和になるように加え、４℃で一昼夜静置して塩
析した。

【００２４】塩析物における沈澱部を採取し、これを５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に対して１０
時間透析し、濾過後、予め５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）で平衡化させておいたＤＥＡＥ−セファ
デックスカラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を
通液して蛋白質成分を含む画分を溶出させた。この画分
を採取し、酢酸を加えてｐＨ５．０に調整後、予め１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化させておいたＣ
Ｍ−セファデックスカラムに負荷し、カラムを１０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄後、カラムに０．３Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を通液し、蛋白質成分を含む画分を採取した。

【００２５】次に、この画分に予め１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）で平衡化させておいたＭｏｎｏ Ｓカラ
ムに負荷し、カラムを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０）で洗浄後、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩化ナトリ
ウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を通液したところ、０．１乃至０．３付近の塩
化ナトリウム濃度でアレルゲンＢが、また、０．４Ｍ付
近の塩化ナトリウム濃度でアレルゲンＡが溶出した。ア
レルゲンＡ又はＢを含む画分を別々に採取し、適宜濃縮
後、凍結乾燥して次の実験例２に供した。収量は、原料
スギ花粉固形分当たり、アレルゲンＡで約０．０１％、
アレルゲンＢで約０．０２％であった。

【００２６】

【実験例２】＜スギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープ
を含むペプチドの検索＞

【００２７】

【実験例２−１】＜スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細
胞の活性化＞フィコール・ハイパック比重遠心法によ
り、花粉症患者のヘパリン加末梢血からスギ花粉アレル
ゲンに特異的なＴ細胞を含む単核細胞群を分離した。こ
の単核細胞群を５％（ｖ／ｖ）ＡＢ血清を補足したＲＰ
ＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．０）に浮遊させ、９６ウェ
ルマイクロプレート上に５×１０5個／ウェルずつ分注
し、実験例１−１及び１−２で調製したペプチド又はス
ギ花粉アレルゲンを１μｇ／ウェル加え、新鮮な同一培
地で２００μｌ／ウェルとした後、５％ＣＯ2培養器
中、３７℃で２日間インキュベートした。その後、³Ｈ
−チミジンを１．０μＣｉ／ウェルずつ加え、同一条件
下でさらに１６時間インキュベートした後、シンチレー
ションカウンタを使用する公知の方法により、単核細胞
群における³Ｈ−チミジンの取込み量を測定した。同時
に、ペプチドもスギ花粉アレルゲンも含まない系を設
け、上記と同様に処置して陰性対照とした。

【００２８】スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞に対
する活性化作用の有無は、同Ｔ細胞を含む単核細胞群に
おける³Ｈ−チミジンの取込み量（ｃｐｍ）に基づき判
定し、取込み量が陰性対照の略２倍以上に達した系を
「陽性」、達しなかった系を「陰性」とした。結果を表
１乃至６に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】

【表３】

【００３２】

【表４】

【００３３】

【表５】

【００３４】

【表６】

【００３５】表１乃至６の結果は、試験に供したペプチ
ド及びスギ花粉アレルゲンが、スギ花粉アレルゲンに特
異的なＴ細胞に対して明らかに異なる挙動をしたことを
示している。すなわち、試料Ａ−１９、Ａ−２０、Ａ−
２３、Ａ−４８、Ａ−４９、Ａ−８９、Ｂ−３９、Ｂ−
８０又はスギ花粉アレルゲンＡ若しくはＢを添加した系
では、陰性対照と比較して、明らかに有意な³Ｈ−チミ
ジンの取込み促進が認められたのに対して、その余の試
料を添加した系においては、有意な取込み促進が認めら
れなかった。このことは、試料Ａ−１９、Ａ−２０、Ａ
−２３、Ａ−４８、Ａ−４９、Ａ−８９、Ｂ−３９、Ｂ
−８０並びにスギ花粉アレルゲンＡ及びＢのみが、単核
細胞群中のスギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意
に活性化したことを意味している。

【００３６】さらに、アミノ酸配列が互いに重複する試
料Ａ−１９、Ａ−２０、Ａ−４８及びＡ−４９並びにＴ
細胞活性化作用が他の陽性試料に比べてやや低かった試
料Ａ−２３及びＡ−８９につき、別途、１７個のアミノ
酸残基からなる、配列表における配列番号８乃至１１に
示すアミノ酸配列のペプチドを化学合成した。

【００３７】すなわち、ミリジェン／バイオリサーチ製
ペプチド合成機『エクセル』を使用し、常法にしたがっ
て、配列表における配列番号８乃至１１に示すアミノ酸
配列のペプチド（試料Ｃ−１乃至Ｃ−４）を別々に合成
し、バイオラド製クロマトグラフィーカラム『Ｈｉ−Ｐ
ｏｒｅ ＲＰ−３１８型』を使用する逆相高速液体クロ
マトグラフィーによりそれぞれ純度９５％まで精製し
た。精製後、試料Ｃ−１乃至Ｃ−４の一部をとり、パー
キン・エルマー製ペプチドシーケンサ『４７０Ａ型』に
より分析したところ、合成に係る４種類のペプチドすべ
てが所期のアミノ酸配列を有していた。

【００３８】これら試料Ｃ−１乃至Ｃ−４につき、上記
と同様に試験したところ、いずれも陽性であり、スギ花
粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化すること
が判明した。

【００３９】

【実験例２−２】＜スギ花粉アレルゲンに特異的なイム
ノグロブリンＥ抗体に対する反応性＞実験例２−１にお
いてスギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性
化することが明らかとなった試料Ｂ−３９、Ｂ−８０、
Ｃ−１乃至Ｃ−４並びにアレルゲンＡ及びＢに、タニア
イらが『モレキュラー・イムノロジー』、第３０巻、第
２号、第１８３〜１８９頁（１９９３年）に報告してい
るＥＩＡ法を適用し、スギ花粉症患者の血液から採取し
たスギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗
体との反応性を調べた。

【００４０】すなわち、ピアス製架橋剤『（スルホスク
シンイミジル）スベラート（ＢＳ３）』１ｇを蒸留水１
０ｍｌに溶解し、ヌンク製『コバリンク型』９６ウェル
マイクロプレートに５０μｌ／ウェルずつ分注し、３７
℃で３時間インキュベートした。蒸留水でマイクロプレ
ートを洗浄し、実験例１及び２で調製した試料Ｂ−３
９、Ｂ−８０、Ｃ−１乃至Ｃ−４又はアレルゲンＡ若し
くはＢを２０μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌになるように
ＰＢＳに溶解し、マイクロプレートに５０μｌ／ウェル
分注し、３７℃でさらに３時間インキュベートしてマイ
クロプレートに共有結合させた。そして、マイクロプレ
ートに１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ
を５０μｌ／ウェル加え、４℃で一晩静置して未反応の
活性基をブロックした後、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清
アルブミンを含むＰＢＳで洗浄し、ウシ血清アルブミン
を同量含む新鮮なＰＢＳで５倍希釈したスギ花粉症患者
の血清を５０μｌ／ウェル加え、３７℃で１時間反応さ
せた。

【００４１】次に、マイクロプレートを０．１％（ｗ／
ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで洗浄し、ウシ血
清アルブミンを同量含む新鮮なＰＢＳで１μｇ／ｍｌに
希釈したキルケガード・アンド・ペリー製ビオチン標識
抗ヒトε鎖抗体を５０μｌ／ウェルずつ加え、３７℃で
１時間インキュベートした後、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ
血清アルブミンを含むＰＢＳで再度洗浄後、ウシ血清ア
ルブミンを同量含む新鮮なＰＢＳで５，０００倍に希釈
したザイメッド製パーオキシダーゼ標識アビジンを５０
μｌ／ウェル加え、３７℃でさらに１時間インキュベー
トした。そして、マイクロプレートを０．１％（ｗ／
ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで洗浄後、過酸化
水素を０．０３％（ｖ／ｖ）とオルトフェニレンジアミ
ンを０．５ｍｇ／ｍｌ含む０．１Ｍクエン酸−燐酸緩衝
液（ｐＨ５．０）を１００μｌ／ウェル加え、室温下で
５分間静置して酵素反応させた。２Ｎ硫酸を１００μｌ
／ウェルずつ加えて反応を停止させた後、分光光度計を
使用する公知の方法で４９２ｎｍの波長下における吸光
度を測定した。

【００４２】同時に、スギ花粉患者の血清に代えて健常
者の血清を使用する系を設け、同様に処置して陰性対照
とした。結果を表１乃至６に示す。

【００４３】表１乃至６に示す結果から明らかなよう
に、アレルゲンＡ及びＢがスギ花粉症患者由来のスギ花
粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に強く
反応したのに対して、試料Ｂ−３９、Ｂ−８０及びＣ−
１乃至Ｃ−４は実質的に反応しなかった。このことは、
これら試料がアレルゲンＡ及びＢに含まれるスギ花粉ア
レルゲンのＢ細胞エピトープを欠いていることを意味し
ている。これらの結果と実験例２−１の結果を総合的に
判断すると、上記試料、すなわち、配列表における配列
番号８乃至１３に示すアミノ酸配列のペプチドは、本質
的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープからなるも
のであると判断される。

【００４４】

【実験例３】＜Ｔ細胞がＴ細胞エピトープを認識するた
めに不可欠なアミノ酸配列の検索＞本実験例では、実験
例２で明らかにした６種類のＴ細胞エピトープをさらに
解析し、Ｔ細胞がそれらを認識するために不可欠なアミ
ノ酸配列を検索した。

【００４５】すなわち、実験例１−１の方法により、配
列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列並
びに表５乃至６において陽性を否定し切れなかった試料
Ｂ−３８、Ｂ−８１及びＢ−８２のアミノ酸配列につ
き、それらの一端又は両端のアミノ酸の１個又は２個以
上をアラニンで置換したアミノ酸１４個又は１７個から
なる種々のペプチドを化学合成した。そして、それらペ
プチドにつき、実験例２の方法により、スギ花粉アレル
ゲンに特異的なＴ細胞の活性化とスギ花粉アレルゲンに
特異的なイムノグロブリンＥ抗体に対する反応性を調べ
た。

【００４６】その結果、表７に示すように、配列表の配
列番号１乃至７に示すアミノ酸配列を含んでなる試料Ｄ
−１乃至Ｄ−７のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特
異的なＴ細胞及びスギ花粉アレルゲンに特異的なイムノ
グロブリンＥ抗体に対して配列番号８乃至１３に示すア
ミノ酸配列のペプチドとほぼ同様の挙動を示すことが判
明した。このことは、配列表の配列番号１乃至７に示す
アミノ酸配列は、Ｔ細胞が配列番号８乃至１３に示すア
ミノ酸配列のペプチドを認識するために不可欠な配列で
あることを強く示唆している。

【００４７】

【表７】

【００４８】以上説明したように、この発明は、スギ花
粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質
的に反応せず、³Ｈ−チミジンの取込みにより判定する
方法により試験すると、陰性対照と比較して、スギ花粉
アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に活性化するペプチ
ドに関するものである。この発明は、ペプチドが斯かる
性質を具備するかぎり、その構造、出所・由来、調製方
法に係わりなく、すべて包含するものとする。

【００４９】この発明のペプチドは、通常、５乃至５０
個、望ましくは、１０乃至２０個のアミノ酸がペプチド
結合してなる。個々のペプチドとしては、例えば、配列
表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸配列を有
するものと、それらアミノ配列に相同的なアミノ酸配列
を有するものが挙げられる。相同的なアミノ酸配列のペ
プチドは、上記の免疫学的作用を実質的に変えることな
く、配列表における配列番号８乃至１３に示すアミノ酸
配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ
酸で置換するか、それらアミノ酸配列の一端又は両端に
適宜のアミノ酸を１個又は２個以上結合させることによ
り得ることができる。

【００５０】具体的には、例えば、配列表の配列番号８
乃至１３に示すアミノ酸配列において、Ｔ細胞がそれら
を認識するために不可欠なアミノ酸配列のみを不変と
し、それ以外のアミノ酸については、スギ花粉のＴ細胞
エピトープとしての免疫学的作用を実質的に変えない範
囲で他のアミノ酸により置換する。あるいは、その不可
欠なアミノ酸配列の一端又は両端に、必要に応じて、例
えば、アラニンなどの適宜アミノ酸を１個又は２個以上
結合させ、得られるペプチドが全体としてＴ細胞の認識
し得る長さ、すなわち、通常、アミノ酸残基数にして１
０乃至２０個になるようにする。斯かるアミノ酸配列と
しては、例えば、配列表における配列番号１乃至７に示
すアミノ酸配列が挙げられ、また、斯かる相同体の例と
して、例えば、配列表における配列番号１６乃至２４に
示すアミノ酸配列のペプチドを挙げることができる。

【００５１】この発明のペプチドは、「固相法」又は
「液相法」として知られる斯界において慣用のペプチド
合成法により、容易に調製することができる。この発明
はペプチド合成そのものに係わるものではないので、詳
しい説明は省略するが、例えば、社団法人日本生化学会
編『新生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質Ｖ
Ｉ」、第３〜４４頁、１９９２年、東京化学同人発行な
どにはペプチド合成の詳細が記載されている。ただし、
この発明のペプチドは化学合成により調製されたものに
限定されず、例えば、スギの花粉又は雄花から採取する
か、組換えＤＮＡ技術により調製したスギ花粉アレルゲ
ンを適宜分解し、分解物から採取したものであってもよ
い。あるいは、例えば、配列表における配列番号８乃至
１３に示すアミノ酸配列又はそれらに相同的なアミノ酸
配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを調製し、こ
れを自律複製可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡと
し、これを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの適宜宿
主に導入して形質転換体とし、その培養物からこの発明
のペプチドを採取してもよい。配列表における配列番号
８乃至１３に示すアミノ酸配列のペプチドをコードする
ＤＮＡは、例えば、特願平５−３４４５９６号明細書や
国際特許公開第９３／０１２１３号明細書に記載された
ｃＤＮＡの塩基配列に基づいて調製することができる。
さらに、この発明のペプチドは、斯くして得られるペプ
チドに糖質やポリエチレングリコールを付加して得られ
る複合体としての形態、さらには、ペプチドをアセチル
化、アミド化及び／又は多官能試薬により架橋重合させ
て得られる誘導体又は重合体としての形態であってもよ
い。

【００５２】この発明のペプチドは、比較的粗な形態で
投与しても所期の治療・予防効果を発揮するが、通常は
使用に先立って精製される。精製には、例えば、濾過、
濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグフラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、等電点電気泳動などのペプチド乃至蛋白質を精製す
るための斯界における慣用の方法が用いられ、必要に応
じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終
使用形態に応じて、精製したペプチドを濃縮・凍結乾燥
して液状又は固状にすればよい。

【００５３】前述のとおり、この発明のペプチドは、ス
ギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に
実質的に反応せず、しかも、スギ花粉アレルゲンに特異
的なＴ細胞を有意に活性化するので、スギ花粉症を治療
・予防するための免疫療法剤として広範な用途を有す
る。有効成分としてこの発明のペプチドを含んでなる免
疫療法剤は、スギ花粉症に罹患したヒトを含む哺乳類一
般に投与すると、アナフィラキシーなどの副作用を実質
的に引起こすことなく、スギ花粉症を治療することがで
きる。一方、この発明の免疫療法剤を、スギ花粉が飛散
し始める前に健常な個体や潜在的なスギ花粉症の個体に
投与するときには、スギ花粉症に対して顕著な予防効果
を発揮するとともに、発症時のアレルギー症状の緩解に
著効を発揮する。

【００５４】この発明の免疫療法剤につきさらに詳しく
説明すると、この発明の免疫療法剤は、通常、この発明
によるペプチドの１種又は２種以上を０．０１乃至１０
０％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０５乃至５０％（ｗ
／ｗ）、さらに望ましくは、０．５乃至５．０％（ｗ／
ｗ）含んでなる。この発明の免疫療法剤は、当該ペプチ
ド単独の形態はもとより、それ以外の生理的に許容され
る、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、マンニトー
ル、マルトース、トレハロースなどの担体、賦形剤、免
疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、ステロイ
ドホルモンやクリモグリク酸ナトリウムなどの抗炎症剤
や抗ヒスタミン剤を含む１種又は２種以上の他の薬剤と
の組成物としての形態を包含する。さらに、この発明の
免疫療法剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投
薬単位形態の薬剤とは、この発明のポリペプチドを、例
えば、１日当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）又
はその約数（１／４０まで）に相当する量を含有し、投
与に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意
味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、散
剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トロー
チ剤、シロップ剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、
坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられ
る。

【００５５】この発明の免疫療法剤の使用方法について
説明すると、この発明の免疫療法剤は、スギ花粉症の治
療・予防を目的に、ヒトを含む哺乳類一般に経皮、経
口、点鼻、点眼又は注射投与される。ヒトにおける投与
量は、投与の目的や症状に依っても変わるが、通常、対
象者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人１日当
たり０．０１乃至１．０ｇ、望ましくは、０．０１乃至
０．１ｇを目安に、毎週１回乃至毎月１回の頻度で、約
１乃至６カ月間、通常、用量を増やしながら反復投与さ
れる。

【００５６】以下、この発明によるペプチドの調製と用
途につき、２〜３の実施例を挙げて説明する。

【００５７】

【実施例Ａ−１】＜ペプチドの調製＞ミリジェン／バイ
オリサーチ製ペプチド合成機『エクセル』を使用し、常
法にしたがって、配列表における配列番号８乃至１１に
示すアミノ酸配列のペプチドを別々に合成し、バイオラ
ド製クロマトグラフィーカラム『Ｈｉ−Ｐｏｒｅ ＲＰ
−３１８型』を使用する逆相高速液体クロマトグラフィ
ーによりそれぞれ純度９５％まで精製後、凍結乾燥して
固状物とした。固状物の一部をとり、パーキン・エルマ
ー製ペプチドシーケンサ『４７０Ａ型』により分析した
ところ、合成に係る４種類のペプチドすべてが所期のア
ミノ酸配列を有していた。

【００５８】

【実施例Ａ−２】＜ペプチドの調製＞ケンブリッジ・リ
サーチ・バイオケミカルズ製ペプチド合成キット『マル
チピン』を使用し、常法にしたがって、配列表における
配列番号１２及び１３に示すアミノ酸配列のペプチドを
別々に化学合成し、実施例Ａ−１と同様にしてそれぞれ
純度９５％まで精製後、凍結乾燥して固状物とした。固
状物の一部をとり、実施例Ａ−１と同様に分析したとこ
ろ、いずれも所期のアミノ酸配列を有していた。

【００５９】

【実施例Ａ−３】＜ペプチドの調製＞実施例Ａ−１と同
様にして、配列表における配列番号１６に示すアミノ酸
配列のペプチドを化学合成し、純度９５％まで精製し
た。精製後、ペプチドの一部をとり、実施例Ａ−１と同
様に分析したところ、所期のアミノ酸配列を有してい
た。

【００６０】

【実施例Ａ−４】＜ペプチドの調製＞実施例Ａ−２と同
様にして、配列表における配列番号１７に示すアミノ酸
配列のペプチドを化学合成し、純度９５％まで精製し
た。精製後、ペプチドの一部をとり、実施例Ａ−１と同
様に分析したところ、所期のアミノ酸配列を有してい
た。

【００６１】

【実施例Ａ−５】＜ペプチドの調製＞実施例Ａ−１乃至
Ａ−２と同様にして、実験例３の試料Ｄ−１乃至Ｄ−７
に相当する配列表における配列番号１８乃至２４に示す
アミノ酸配列のペプチドを化学合成し、それぞれ純度９
５％まで精製後、凍結乾燥して固状物とした。固状物の
一部をとり、パーキン・エルマー製ペプチドシーケンサ
『４７０型』により分析したところ、合成に係る７種類
のペプチドすべてが所期のアミノ酸配列を有していた。

【００６２】

【実施例Ｂ−１】＜液剤＞実施例Ａ−１及びＡ−２の方
法により得た６種類のペプチドのいずれかを最終濃度
０．１ｇ／ｍｌになるように安定剤として１％（ｗ／
ｖ）精製ゼラチンを含む蒸留水に溶解し、常法により滅
菌濾過して６種類の液剤を得た。

【００６３】この発明のペプチドに対する感受性は、個
体ごとに変わるのが通例であるから、本品は、個々の個
体に最も適した組成になるよう、６種類の液剤を適宜配
合して使用する。安定性に優れた本品は、スギ花粉症を
治療・予防するための点眼剤、点鼻剤、口腔内噴霧剤用
の液剤として有用である。

【００６４】

【実施例Ｂ−２】＜注射剤＞安定剤として１％（ｗ／
ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−
１及びＡ−２の方法により得た６種類のペプチドをそれ
ぞれ最終濃度０．０１、０．１又は１ｍｇ／ｍｌになる
ように溶解し、滅菌濾過した後、滅菌バイアル瓶に２ｍ
ｌずつ分注し、凍結乾燥し、密栓した。

【００６５】本品は、投与に先立ち、先ず、バイアル瓶
内に注射用蒸留水等を１ｍｌ加え、次いで、内容物を均
一に溶解して使用する。安定性に優れ、有効成分として
この発明による６種類のポリペプチドを含んでなる本品
は、スギ花粉症を治療・予防するための乾燥注射剤とし
て有用である。

【００６６】

【実施例Ｂ−３】＜錠剤＞平均分子量約２０，０００ダ
ルトンの精製プルラン２ｇを蒸留水１００ｍｌに均一に
溶解し、溶液に塩化シアヌルの１．７％（ｗ／ｖ）アセ
トン溶液を２ｍｌ加え、５％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム
水溶液でｐＨを７付近に保ちつつ、攪拌下、５℃で２時
間反応させた。その後、同様にして反応物のｐＨを７付
近に保ちながら、４℃の冷水に対して一晩透析し、活性
化プルランを含む水溶液２０ｍｌを得た。

【００６７】この水溶液に実施例Ａ−１の方法により得
た配列表における配列番号８、１０及び１１に示すアミ
ノ酸配列のペプチドと、実施例Ａ−２の方法により得た
配列表に配列番号１３に示すアミノ酸配列のペプチド
と、実施例Ａ−３の方法により得たペプチドと、実施例
Ａ−４の方法により得たペプチドをそれぞれ０．２ｍｇ
加え、溶液のｐＨを７付近に保ちつつ、緩やかに攪拌し
ながら、３７℃で１２時間反応させた。反応後、反応物
にグリシンを４ｇ加え、緩やかに攪拌しながら、３７℃
で５時間インキュベートし、未反応の活性基をブロック
した。

【００６８】反応物を濃縮し、予め０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化させておいたセファデックスＧ
−５０カラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通
液して、この発明のペプチドとプルランの複合体を含む
画分を採取した。収量は、原料ペプチド固形分当たり、
約３０％であった。

【００６９】常法にしたがって、この画分を滅菌濾過
し、濃縮し、凍結乾燥し、粉砕後、マンニトールを均一
に混合し、混合物を打錠して製品１錠（２００ｍｇ）当
たり複合体を２、１０又は５０ｍｇ含む錠剤を得た。

【００７０】摂取性、安定性に優れた本品は、スギ花粉
症を治療・予防するための舌下剤として有用である。

【００７１】

【実施例Ｂ−４】＜シロップ剤＞大腸菌由来の精製リポ
多糖１ｇを１０ｍＭ燐酸カルシウム水溶液１００ｍｌに
溶解し、溶液に１００ｍＭ過沃素酸ナトリウムを６ｍｌ
加え、室温下で２０分間反応させてリポ多糖を活性化し
た。反応物を４℃の１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ
４．４）に対して一晩透析して未反応の過沃素酸を除去
した後、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液によりｐＨ
９．５付近に調整する一方、別途、実施例Ａ−１及びＡ
−２の方法により得た６種類のペプチドを０．１Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌにそれぞれ１０ｍｇず
つ溶解し、活性化リポ多糖を含む上記反応物に加え、室
温下で１２時間静置して反応させた。

【００７２】その後、新たに得られた反応物を実施例Ｂ
−３の方法により精製し、得られたこの発明のペプチド
とリポ多糖の複合体を含む画分を濃縮し、凍結乾燥し、
粉砕して固状物とした。収量は、原料ペプチド固形分当
たり、約３０％であった。

【００７３】この固状物と蔗糖をそれぞれ最終濃度が
０．１若しくは１ｍｇ／ｍｌ又は５０％（ｗ／ｗ）にな
るように安定剤として精製ゼラチンを１％（ｗ／ｖ）含
む蒸留水に溶解し、溶液を常法により滅菌濾過してシロ
ップ状物を得た。このシロップ状物を２ｍｌずつ滅菌バ
イアル瓶に分注し、密栓して製品とした。

【００７４】安定性に優れ、有効成分としてこの発明の
ペプチドとリポ多糖の複合体を含む本品は、スギ花粉症
を治療・予防するためのシロップ剤として有用である。

【００７５】

【実施例Ｂ−５】＜液剤＞実施例Ａ−５の方法により得
た７種類のペプチドのいずれかを最終濃度０．１ｇ／ｍ
ｌになるように安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチ
ンを含む蒸留水に溶解し、常法により滅菌濾過して７種
類の液剤を得た。

【００７６】この発明のペプチドに対する感受性は、個
体ごとに変わるのが通例であるから、本品は、個々の個
体に最も適した組成になるよう、７種類の液剤を適宜配
合して使用する。安定性に優れた本品は、スギ花粉症を
治療・予防するための点眼剤、点鼻剤、口腔内噴霧剤用
の液剤として有用である。

【００７７】

【実施例Ｂ−６】＜注射剤＞安定剤として１％（ｗ／
ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−
５の方法により得た７種類のペプチドをそれぞれ最終濃
度０．０１、０．１又は１ｍｇ／ｍｌになるように溶解
し、滅菌濾過した後、滅菌バイアル瓶に２ｍｌずつ分注
し、凍結乾燥し、密栓した。

【００７８】本品は、投与に先立ち、先ず、バイアル瓶
内に注射用蒸留水等を１ｍｌ加え、次いで、内容物を均
一に溶解して使用する。安定性に優れ、有効成分として
この発明による７種類のポリペプチドを含んでなる本品
は、スギ花粉症を治療・予防するための乾燥注射剤とし
て有用である。

【００７９】

【実施例Ｂ−７】＜シロップ剤＞精製ゼラチンを１％
（ｗ／ｖ）含む蒸留水に実施例Ａ−５の方法により得た
７種類のペプチドをそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌと蔗糖を
５０％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、溶液を常法によ
り滅菌濾過してシロップ状物を得た。このシロップ状物
を２ｍｌずつ滅菌バイアル瓶に分注し、密栓して製品と
した。

【００８０】安定性に優れ、有効成分としてこの発明の
ペプチドを含む本品は、スギ花粉症を治療・予防するた
めのシロップ剤として有用である。

【００８１】

【実験例４】＜急性毒性試験＞常法により、生後２０日
目のマウスに実施例Ｂ−１乃至Ｂ−７の方法により得た
免疫療法剤を経口又は腹腔内投与した。その結果、これ
ら免疫療法剤は、いずれの投与経路によっても２００ｍ
ｇ／ｋｇ以上のＬＤ５０であることが判明した。このこ
とは、この発明のペプチドが、ヒトを含む哺乳類に投与
する免疫療法剤に安全に配合使用し得ることを示してい
る。

【００８２】

【発明の効果】以上説明したように、この発明は、本質
的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープからなるペ
プチドの発見に基づくものである。この発明のペプチド
は、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ
抗体に実質的に反応しないので、ヒトを含む哺乳類に投
与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことな
く、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化す
る。したがって、有効成分として斯かるペプチドを含ん
でなるこの発明の免疫療法剤は、ヒトを含む哺乳類に投
与すると、副作用少なく、短期間でスギ花粉症に対して
顕著な治療・予防効果を発揮する。しかも、この発明の
ペプチドは、所望量を容易に製造でき、品質管理も容易
なことから、スギ花粉症の治療・予防にきわめて安全に
使用できるものである。

【００８３】斯くも顕著な作用効果を発揮するこの発明
は、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明と
云える。

【００８４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120> Peptide and uses of the same <130> 10047604 <150> JP94/242137 <151> 1994-9-10 <150> JP95/200221 <151> 1995-7-14 <160> 24 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 1 Lys Val Asp Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 2 Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 3 Asn Arg Ile Trp Leu Gln Phe Ala Lys Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 4 Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 5 Ser Leu Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 6 Leu Thr Leu Arg Thr Ala Thr Asn 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 7 Ala Phe Asn Val Glu 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 8 Lys Val Asp Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Lys Asn 1 5 10 15 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 9 Asn Arg Ile Trp Leu Gln Phe Ala Lys Leu Thr Gly Phe Thr Leu Met Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 10 Asp Ile Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln Lys Asn Thr Ile Gly Thr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 11 Asp Ile Ser Leu Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Asp 1 5 10 15 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223 Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consists of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 12 Leu Thr Leu Arg Thr Ala Thr Asn Ile Trp Ile Asp His Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 13 Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu 1 5 10 <210> 14 <211> 514 <212> PRT <213> Cryptomeria japonica <400> 14 Met Ala Met Lys Phe Ile Ala Pro Met Ala Phe Val Ala Met Gln Leu Ile 1 5 10 15 Ile Met Ala Ala Ala Glu Asp Gln Ser Ala Gln Ile Met Leu Asp Ser Asp 20 25 30 Ile Glu Gln Tyr Leu Arg Ser Asn Arg Ser Leu Arg Lys Val Glu His Ser 35 40 45 50 Arg His Asp Ala Ile Asn Ile Phe Asn Val Glu Lys Tyr Gly Ala Val Gly 55 60 65 Asp Gly Lys His Asp Cys Thr Glu Ala Phe Ser Thr Ala Trp Gln Ala Ala 70 75 80 85 Cys Lys Lys Pro Ser Ala Met Leu Leu Val Pro Gly Asn Lys Lys Phe Val 90 95 100 Val Asn Asn Leu Phe Phe Asn Gly Pro Cys Gln Pro His Phe Thr Phe Lys 105 110 115 Val Asp Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Lys Asn Asn 120 125 130 135 Arg Ile Trp Leu Gln Phe Ala Lys Leu Thr Gly Phe Thr Leu Met Gly Lys 140 145 150 Gly Val Ile Asp Gly Gln Gly Lys Gln Trp Trp Ala Gly Gln Cys Lys Trp 155 160 165 170 Val Asn Gly Arg Glu Ile Cys Asn Asp Arg Asp Arg Pro Thr Ala Ile Lys 175 180 185 Phe Asp Phe Ser Thr Gly Leu Ile Ile Gln Gly Leu Lys Leu Met Asn Ser 190 195 200 Pro Glu Phe His Leu Val Phe Gly Asn Cys Glu Gly Val Lys Ile Ile Gly 205 210 215 220 Ile Ser Ile Thr Ala Pro Arg Asp Ser Pro Asn Thr Asp Gly Ile Asp Ile 225 230 235 Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln Lys Asn Thr Ile Gly Thr Gly Asp 240 245 250 255 Asp Cys Val Ala Ile Gly Thr Gly Ser Ser Asn Ile Val Ile Glu Asp Leu 260 265 270 Ile Cys Gly Pro Gly His Gly Ile Ser Ile Gly Ser Leu Gly Arg Glu Asn 275 280 285 Ser Arg Ala Glu Val Ser Tyr Val His Val Asn Gly Ala Lys Phe Ile Asp 290 295 300 305 Thr Gln Asn Gly Leu Arg Ile Lys Thr Trp Gln Gly Gly Ser Gly Met Ala 310 315 320 Ser His Ile Ile Tyr Glu Asn Val Glu Met Ile Asn Ser Glu Asn Pro Ile 325 330 335 340 Leu Ile Asn Gln Phe Tyr Cys Thr Ser Ala Ser Ala Cys Gln Asn Gln Arg 345 350 355 Ser Ala Val Gln Ile Gln Asp Val Thr Tyr Lys Asn Ile Arg Gly Thr Ser 360 365 370 Ala Thr Ala Ala Ala Ile Gln Leu Lys Cys Ser Asp Ser Met Pro Cys Lys 375 380 385 390 Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Ser Leu Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala 395 400 405 Ser Cys Leu Asn Asp Asn Ala Asn Gly Tyr Phe Ser Gly His Val Ile Pro 410 415 420 425 Ala Cys Lys Asn Leu Ser Pro Ser Ala Lys Arg Lys Glu Ser Lys Ser His 430 435 440 Lys His Pro Lys Thr Val Met Val Lys Asn Met Gly Ala Tyr Asp Lys Gly 445 450 455 Asn Arg Thr Arg Ile Leu Leu Gly Ser Arg Pro Pro Asn Cys Thr Asn Lys 460 465 470 475 Cys His Gly Cys Ser Pro Cys Lys Ala Lys Leu Val Ile Val His Arg Ile 480 485 490 Met Pro Gln Glu Tyr Tyr Pro Gln Arg Trp Met Cys Ser Arg His Ala Lys 495 500 505 510 Ile Tyr His Pro <210> 15 <211> 353 <212> PRT <213> Cryptomeria japonica <400> 15 Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp Ser Asn Trp Ala Gln Asn 1 5 10 15 Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe Gly Ser Ser Thr Met Gly 20 25 30 Gly Lys Gly Gly Asp Leu Tyr Thr Val Thr Asn Ser Asp Asp Asp Pro Val 35 40 45 50 Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg Tyr Gly Ala Thr Arg Asp Arg Pro Leu 55 60 65 Trp Ile Ile Phe Ser Gly Asn Met Asn Ile Lys Leu Lys Met Pro Met Tyr 70 75 80 85 Ile Ala Gly Tyr Lys Thr Phe Asp Gly Arg Gly Ala Gln Val Tyr Ile Gly 90 95 100 Asn Gly Gly Pro Cys Val Phe Ile Lys Arg Val Ser Asn Val Ile Ile His 105 110 115 Gly Leu Tyr Leu Tyr Gly Cys Ser Thr Ser Val Leu Gly Asn Val Leu Ile 120 125 130 135 Asn Glu Ser Phe Gly Val Glu Pro Val His Pro Gln Asp Gly Asp Ala Leu 140 145 150 Thr Leu Arg Thr Ala Thr Asn Ile Trp Ile Asp His Asn Ser Phe Ser Asn 155 160 165 170 Ser Ser Asp Gly Leu Val Asp Val Thr Leu Thr Ser Thr Gly Val Thr Ile 175 180 185 Ser Asn Asn Leu Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His Asp 190 195 200 Asp Ala Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe Asn Gln 205 210 215 220 Phe Gly Pro Asn Cys Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr Gly Leu Val 225 230 235 His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Thr Ile Tyr Ala Ile Gly Gly 240 245 250 255 Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser Phe Thr Ala Pro Asn 260 265 270 Glu Ser Tyr Lys Lys Gln Val Thr Ile Arg Ile Gly Cys Lys Thr Ser Ser 275 280 285 Ser Cys Ser Asn Trp Val Trp Gln Ser Thr Gln Asp Val Phe Tyr Asn Gly 290 295 300 305 Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys 310 315 320 Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu Asn Gly Asn Ala Thr Pro Gln Leu Thr Lys 325 330 335 340 Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys Ser Leu Ser Lys Arg Cys 345 350 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 16 Asn Arg Ile Trp Leu Gln Phe Ala Lys Leu Gln Gly Phe Thr Leu Met Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 17 Leu Ala Leu Arg Thr Ala Thr Asn Ile Trp Ile Asp His Asn 1 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 18 Lys Val Asp Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 19 Ala Ala Ala Ala Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 20 Asn Arg Ile Trp Leu Gln Phe Ala Lys Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 21 Ala Ala Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln Lys Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 22 Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala Ser Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 23 Leu Thr Leu Arg Thr Ala Thr Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide which consist s of T cell epitopes derived from ceder pollen allergens <400> 24 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Phe Asn Val Glu 1 5 10

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｐ 37/08 Ｆターム(参考） 4C076 AA12 AA22 AA29 AA36 BB01 BB11 BB22 BB24 BB25 DD38 DD60 DD67 EE30 EE41 EE42 FF01 FF04 FF11 FF36 4C085 AA02 AA03 BB03 BB11 CC21 CC31 DD62 EE01 4H045 AA11 AA30 BA15 BA16 CA30 DA86 EA20 FA10

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグ
   ロブリンＥ抗体に実質的に反応せず、^３Ｈ−チミジンの
   取込みにより判定する方法で試験すると、陰性対照と比
   較して、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を有意に
   活性化することを特徴とする、配列表における配列番号
   １、２、３、４又は５で表されるアミノ酸配列のペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 有効成分として請求項１に記載のペプチ
   ドを含んでなる免疫療法剤。
3. 【請求項３】 有効成分として請求項１に記載のペプチ
   ドを０．０１乃至１００％（ｗ／ｗ）含んでなる請求項
   ２に記載の免疫療法剤。
4. 【請求項４】 安定剤又は賦形剤として血清アルブミ
   ン、ゼラチン、マンニトール、マルトース及び／又はト
   レハロースを含む請求項２又は３に記載の免疫療法剤。