KR0141678B1

KR0141678B1 - 정제 진드기 알레르겐

Info

Publication number: KR0141678B1
Application number: KR1019920003891A
Authority: KR
Inventors: 사또루 오까; 가쯔히사 오노; 세이꼬 시게따; 다께시 와다
Original assignee: 오오시따 도시아끼; 푸마킬라 가부시끼가이샤; 다나까 류우소오; 히로시마 다이가꾸
Priority date: 1991-03-09
Filing date: 1992-03-09
Publication date: 1998-06-01
Also published as: DE69204500T2; US6054125A; KR920017663A; EP0503505B1; AU1133992A; JPH05247098A; JP3068879B2; EP0503505A1; CA2062105A1; CA2062105C; US5747047A; DE69204500D1; AU651174B2

Abstract

본 발명은 진드기의 추출물로부터 단리할 수 있는 SDSPAGE에 의해 측정시 분자량이 약 94,000, 약 40,000, 약 16,000 또는 약 14,000 인 진드기 알레르겐 활성을 갖는 신규의 정제, 단리된 진드기 알레르겐 및 이 진드기 알레르겐의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 정제, 단리된 진드기 알레르겐은 진드기 알레르기 질환에 대한 제약학적 및 진단학적 조성물로서 유용하다.

Description

정제 진드기 알레르겐

제 1 도의 Dfb94로 면역된 생쥐의 항체에서의 변화를 보여준다.

제 2 도는 Dfb94로 면역된 기니아 피그의 항체에서의 변화를 보여준다.

제 3 도는 진드기 조항원의 울트로겔(Ultrogel) AcA 54 상에서의 겔 여과를 보여준다.

제 4 도는 Dfb2와 표준물질을 대형 디스크 SDS폴리아크릴아미드겔상에서의 전기 영동 분리상황을 보여준다.

제 5 도는 Dfb94, Dfb60, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14를 사용한 스포트면역 염색 테스트(spot immunostaining test)의 결과를 보여 준다.

본 발명은 알레르겐 활성을 갖는 정제 진드기 알레르겐에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 진드기 추출물에 함유된 알레르겐 활성을 갖는 신규 당단백질에 관한 것이다.

옥내진성 진드기(house dust mite)는 아토피성 기관지 천식 등의 알레르기성 질환의 주요한 원인으로서 중요하다. 종래, 알레르기 질환의 치료법으로서는 알레르기의 원인물질인 알레르겐을 투여하여 환자를 감감작(hyposensitization)하는 감감작 치료법이 가장 중요한 근본적인 치료법이다. 특히 화분증 및 곤충 알레르기등, 항원을 확인하기 쉬운 질환에 있어서는 감감작 치료법은 이미 높이 평가되었다. 그러나 이 감감작 치료법에서는 알레르겐에 의한 과민증의 위험이 수반되기 때문에 안전한 치료용 항원의 투여가 필요해진다.

진드기 알레르기성 질병에 있어서 옥내진성 진드기 알레르겐으로서, 데르마토파고이데스 프테로니시누스(Dermatophagoides pteronyssinus) 및 데르마토파고이데스 파리나에(Dermatophagoides farinae)의 2종이 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다[J. Allergy : 42, 1428(1968)]. 지금까지 보고된 주요한 진드기 알레르겐은 진드기 배설물 및/또는 진드기중에 함유되어 있는 분자량 24내지 28kD의 당단백질(pI 4.6 ~ 7.2) 및/또는분자량 14.5 내지 20kD의 단백질(pl 5∼ 8.3)을 포함한다 [예를들면, J. Immunol : 125, 587-592, (1980)/J. Allergy clin. Innunol. : 76, 753-761 (1985) / Immunology : 46, 679687(1982) / Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. : 81, 214223(1986)/ J. Allergy Clin. Immunol. : 75, 686692, (1985) ].

한편, 상기의 주요 진드기 알레르겐 보다도 고분자량의 분획 및 저분자량의 분획에 진드기 천식 환자 혈청 IgG에 특이적 반응성을 나타내고, 진드기 천식환자의 백혈구 히스타민 유리를 유도하는 성분이 존재하는 것을 본 발명자들은 보고하고 있다(일본농예화학회 62 : 411, 1988). 그러나, 감감작 치료용 항원으로서 사용할 수 있는 정도까지의 정제는 아직 이루어지지 않았다.

진드기 알레르기 질환은 대부분의 경우에 옥내진(house dust)추출물 및/또는 진드기 추출물을 사용하는 피부내 반응시험과, 간혹 RASTqjq에 의한 혈청 IgE 항체가(상대치)측정을 병용하는 연구를 기초로 하여 진단되며 ; 진드기 알레르기성 질환을 직접적으로 진단하는 것은 상당히 곤란했다.

종래, 옥내진성 진드기를 특이항원으로 하는 기관지 천식의 감감작 치료법으로는 옥내진 추출액이 사용되고 있지만 ; 화학적으로는 그 조성이 극히 불명확하고, 또 많은 종류의 불순물을 함유하여, 과민증 유발의 가능성이 있기 때문에 투여량이 극도로 제한되고, 치료효과가 극히 낮다. 따라서, 유효성 및 안전성의 관점에서 유용한 감감작치료용 항원이 개발되어야 할 것이다.

또한, 진드기 알레르기성 질환의 신속 및 정확한 진단은 진드기 알레르기 질환의 중정도 치료를 위하여 중요하고, 새로운 진단 시스템의 확립이 기대되고 있다.

본 발명의 목적은, 진드기 알레르기 질환의 치료제, 진단약품으로서 극히 유용한 신규의 정제, 단리된 진드기 알레르겐을 제공함에 있다.

즉 본 발명의 목적은, 진드기 추출물에서 단리할 수 있는 알레르겐 활성을 갖는 임의의 다른 진드기 단백질이 실질적으로 없는 신규의 정제, 단리된 진드기 알레르겐을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 이 신규의 정제, 단리된 진드기 알레르겐의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 신규 진드기 알레르기성 질환 치료제를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 신규 진드기 알레르기성 질환 진단약품을 제공함에 있다.

이들 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 데르마토파고이데스 파리나에의 추출물중에 함유된 알레르겐에 관하여 예의 연구를 거듭했으며, 분자량 약 94,000, 약 40,000, 약 16,000 및 약 14,000의 당단백질이 강한 알레르겐 활성을 갖는 것을 발견하였다. 이 발견을 토대로 하여 더욱 연구를 거듭하고 본 발명을 완성했다. 따라서, 본 발명은 하기의 이화학적 성질 및 생물학적 성질을 갖는 임의의 다른 진드기 단백질은 실질적으로 없는 정제, 단리된 진드기 알레르겐을 포함한다.

ⅰ) 정제, 단리된 진드기 알레르겐

① 진드기 추출물에 함유되어 있다.

② 약 60%의 당질을 함유하는 당단백질이다.

③ SDSPAGE(SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동)에 의해 측정시 분자량 약 94,000이다.

④ 알레르겐활성을 갖는다.

ⅱ) 정제, 단리된 진드기 알레르겐

① 진드기 추출물에 함유되어 있다.

② 약 15%의 당질을 함유하는 당단백질이다.

③ SDSPAGE에 의해 측정시 약 40,000의 분자량을 갖는다.

④ 알레르겐 활성을 갖는다.

ⅲ) 정제, 단리된 진드기 알레르겐

① 진드기 추출물에 함유되어 있다.

② 약 20%의 당질을 함유하는 당단백질이다.

③ SDSPAGE에 의해 측정시 약 16,000의 분자량을 갖는다.

④ 알레르겐 활성을 갖는다.

ⅳ) 정제, 단리된 진드기 알레르겐

① 진드기 추출물에 함유되어 있다.

② 약 13%의 당질을 함유하는 당단백질이다.

③ SDSPAGE에 의해 측정시 약 14,000의 분자량을 갖는다.

④ 알레르겐 활성을 갖는다.

본 발명은 또한 하기 단계로 구성되는 상기 진드기 알레르겐의 제조방법을 포함한다 :

배양물내 진드기를 포화 염화나트륨 용액과 현탁하고 그 현탁액을 방치하고 :

현탁액을 원신분리시켜 얻은 상청액으로부터 상기 진드기를 수집하고 : 수집한 진드기를 마쇄하고 :

마쇄 진드기로부터 중정도 이온강도의 완충액으로 진드기 알레르겐을 추출하고 :

상기 추출물을 분획화하고 진드기 알레르겐 활성을 갖는 당단백질 분획을 단리한다.

이 명세서에 있어서는 아미노산등에 관하여 IUPACIUB 명명법에 의거하는 약호 및 이 분야에 있어서의 관용 약호로 표시하는 겅우가 있고, 이들을 예시하면 다음과 같다. 아미노산 잔기에 대한 약호는 하기와 같다.

Asx 아스파라긴산 및/또는 아스파라긴 ; Thr 트레오닌 ;

Ser 세린 ; Glx 글루타민산 및/또는 글루타민 ;

Gly 글리신 ; Ala 알라닌 ; Val 발린 ;

LLe 이소로이신 Leu 로이신 ; Tyr 티로신 ;

Phe 페닐알라닌 ; His 히스티딘 ; Lys 리신 ;

Arg 아르기닌 ; Pro 프롤린 ; Cys 시스테인 ;

Met 메티오닌 ;

당에 대한 약호는 이하와 같다.

Fuc 푸코오스 ; Ara 아라비노오스 ; Xyl 크실로오스 ;

Gal 갈락토오스 Man 만노오스 ; Glc 글루코오스 ;

HexNAc N아세틸헥소아민

본 발명에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐은 상기의 각 ① 내지 ④의 요건을 만족시키는 한 단일의 정제, 단리된 진드기 알레르겐으로 구성되거나 또 복수의 정제, 단리된 진드기 알레르겐으로 구성되는 것(즉, 정제, 단리된 진드기 알레르겐의 혼합물의 양태)의 어느 것도 좋다.

하기에, 본 발명에 따른 실질적으로 임의의 다른 진드기 단백질이 없는 정제, 단리된 진드기 알레르겐의 대표예에 관하여 더욱 상세히 설명한다.

ⅰ) 정제, 단리된 진드기 알레르겐(Dfb94)

(1) 색 및 성상 : 백색(동결 건조물).

(2) 수용성 : 쉽게 용해됨.

(3) 분자량 : SDSPAGE에 의하여 측정시 약 94,000.

(4) 조성 : 조성 분석으로 측정치 약 60%의 당함량

[아미노산 조성]

0.2% 샘플 용액 200μl를 12N 염산 200μl와 혼합하고, 밀봉 N2 포화 시험관내에서, 100℃에서 24시간 가수분해 했다. 가수분해물을 건조상태까지 증발시킨 후, 소량의 물을 가하고 다시 건조상태까지 증발시키는 조작을 3회 반복함으로써 염산을 제거한다. 상기 결과 건조 생성물을 아미노산 분석기용의 희석용 완충액 1 ㎖에 용해시킨다. 아미노산 분석기 (Beckman Co. 제조)에 의하여 정량했다.

[당의 조성]

전체 중성당은 글루코오스를 표준물질로 하여 페놀 황산법으로 정량했다. 개개의 중성당과 아미노당은 시료를 4N 트리플루오르 초산(TFA) 중에서, 100℃에서 4시간 가수분해 하고, NaBH₄로 환원 후, 무수 초산 존재하에 100℃, 4시간 가열하여 아세틸화 한 후, GLC 법으로 정량했다.

아미노산(계 3260.1 nmol/mg)

Asp 413.2 ; Thr 461.0 ; Ser 298.0 ;

Glu 521.4 ; Gly 127.8 ; Ala 150.4 ;

Cys 21.5 ; Val 212.5 ; Met 19.4 ;

ILe 77.0 ; Leu 370.4 ; Tyr 3.3 ;

Phe 55.7 ; His 30.3 ; Lys 322.2

Arg 68.3 ; Pro 107.7

중성당(계 3154.9 nmol/mg)

Fuc 216.5 ; Ara 426.7 ; Xyl 490.0 ;

Gal 350.0 ; Man 1671.7 ; Glc ──

아미노당 (계 265.2 nmol/mg)

HexNAc 265.2

(5) 알레르겐 활성을 갖는다.

진드기 알레르기 환자에 대한 피부내 반응활성, HPLC를 사용한 환자백혈구 히스타민 유리시험에 의하여 판단한다.

(6) 과민증 반응을 유도하지 않는다.

표준방법에 의하여 기니아 피그를 면역하고 추가 면역시에 과민증 반응에 관하여 관찰한다.

ⅱ) 정제, 단리된 진드기 알레르겐(Dfb40)

(1) 색 및 성상 : 백색(동결건조물)

(2) 수용성 : 쉽게 용해됨

(3) 분자량 : SDSPAGE에 의하여 측정시 약 40,000.

(4) 조성 : 상기의 방법에 의한 조성 분석으로 측정시 약 15%의 당함량.

아미노산(계 6792.9 nmol/mg)

Asp 613.1 ; Thr 361.0 ; Ser 483.3 ;

Glu 846.4 ; Gly 676.4 ; Ala 875.4 ;

Cys 81.7 ; Val 511.1 ; Met 10.7 ;

IIe 273.6 ; Leu 540.4 ; Tyr 93.3 ;

Phe 212.5 ; His 147.6 ; Lys 433.7 ;

Arg 334.7 ; Pro 298.0 ;

중성당(계 797.4 nmol/mg)

Fuc 12.2 ; Ara 28.7 ; Xyl 153.3 ;

Gal 79.4 ; Man 469.4 ; Glc 54.4

아미노당(계 67.4 nmol/mg)

HexNAc 67.4

(5) 알레르겐 활성을 갖는다.

진드기 알레르기 환자에 대한 피부내 반응 활성, HPLC를 사용한 환자 백혈구 히스타민 유리시험에 의하여 판단한다.

(6) 과민증 반응을 유도하지 않는다.

표준방법에 의하여 기니아 피그를 면역하고, 추가 면역시에 과민증 반응에 관하여 관찰한다.

ⅲ) 정제, 단리된 진드기 알레르겐 (Dfb16)

(1) 색 및 성상 : 백색(동결건조물)

(2) 수용성 : 쉽게 용해됨

(3) 분자량 : SDSPAGE에 의하여 측정시 약 16,000.

(4) 조성 : 상기의 방법에 의한 조성 분석에 의하여 측정시 약 20%의 당함량.

아미노산(계 6378.4 nmol/mg)

Asp 753.6 ; Thr 569.3 ; Ser 530.0 ;

Glu 728.1 ; Gly 523.3 ; Ala 456.8 ;

Cys 64.4 ; Val 428.3 ; Met 12.7 ;

IIe 310.2 ; Leu 424.5 ; Tyr 164.5 ;

Phe 191.7 ; His 122.4 ; Lys 407.0 ;

Arg 350.2 ; Pro 341.4

중성당 (계 778.4 nmol/mg)

Fuc 47.6 ; Ara 48.0 ; Xyl 320.7 ;

Gal 182.7 ; Man ── Glc 179.4

아미노당 (계 290.5 nmol/mg)

HexNAc 290.5

(5) 알레르겐 활성을 갖는다.

(6) 과민증 반응을 유도하지 않는다.

ⅳ) 정제, 단리된 진드기 알레르겐(Dfb14)

(1) 색 및 성상 : 백색(동결건조물)

(2) 수용성 : 쉽게 용해됨

(3) 분자량 : SDSPAGE에 의하여 측정시 약 14,000.

(4) 조성 : 상기의 방법에 의한 조성 분석에 의해 측정시 약 13%의 당함량.

아미노산 (계 6601.5 nmol/mg)

Asp 722.8 ; Thr 715.4 ; Ser 577.5 ;

Glu 870.2 ; Gly 471.4 ; Ala 576.9 ;

Cys 59.4 ; Val 355.8 ; Met 76.4 ;

Ile 281.3 ; Leu 554.1 ; Tyr 15.5 ;

Phe 72.8 ; His 130.2 ; Lys 500.7 ;

Arg 237.1 ; Pro 384.0

중성당 (계 564.3 nmol/mg)

Fuc 37.8 ; Ara 20.0 ; Xyl 219.3 ;

Gal 66.1 ; Man 32.8 ; Glc 188.3

아미노당(계 184.2 nmol/mg)

HexNAc 184.2

(5) 알레르겐 활성을 갖는다.

(6) 과민증 반응을 유도하지 않는다.

[제조방법]

본 발명의 정제, 단리된 진드기 알레르겐의 제조방법으로서는 예를들면 다음과 같은 방법이 예시된다.

a) 진드기 조항원의 제조

진드기 항원의 제조원료로서 데르마토파고이데스 파리나에 또는 데르마토파고이데스 프테로니시누스의 어느 것을 사용해도 좋다. 이들의 진드기를 진드기 배양 배지에서 배양하고, 진드기에서 조항원을 추출한다.

추출물의 처리는 다음과 같이 실행한다. 포화 염화나트룸 용액을 첨가한 후에 배양물을 교반하고, 실용에서 30분간 정치한 후에 원심분리(3000rpm. 30분)을 하고, 상청액을 풀(pool) 한다. 풀한 상청액에 부유하는 진드기를 여과하여 수집한다. 이 조작을 2회 반복한다. 이들 수집된 진드기를 용매와 함께 마쇄후, 원심분리하고, 생성 상청액을 투석 동결건조하여 진드기 조항원(출발원료)을 수득한다. 이때, 중정도 이온강도의 완충액으로 인한 임의의 다른 추출 용매가 사용될 수 있다. 예를 들면, 젖산 완충액, 초산완충액, 시트르산 완충액, 트리스염산 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다.

b) 조 진드기 항원의 정제

조 진드기 항원은 단백질 정제의 공지된 통상적인 방법, 예컨대 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 등전 집중법 및 겔 전기영동에 의해 정제, 단리될 수 있다. 이들 방법은 독자적으로 또는 병용하여 사용될 수 있다. 이 정제 방법에 있어서, 용출 패턴은 하기에 의해 모니터 된다.

(ⅰ) 진드기 천식환자 혈청 특이 IgE, IgG, 토끼항 진드기 혈청, 토끼항 진드기 항체등과의 반응성을 효소면역 측정법(ELISA)에 의하여 측정함에 의한 각 분획의 항원활성의 측정 [Immunochemistry, 8, 871 (1971)]

(ⅱ) 토끼항 진드기 혈청을 사용한 방사성 면역 분석에 의한 각 분획의 항원 활성의 측정

(ⅲ) 피부내 반응 활성에 의한 각 분획의 알레르겐의 활성 측정.

(ⅳ) 진드기 알레르기 환자 백혈구 히스타민 유리 활성에 의한 각 분획의 알레르겐 활성의 측정.

진드기 항원을 울트로겔 AcA 54(LKB 사)로 겔 여과한다. 그때의 용출패턴을 진드기 천식 환자 혈청 특이 IgG 및 IgE 및 토끼항 진드기 항체에 대한 반응성(ELISA), 환자 백혈구 히스타민 유리능으로 모니터하고 ; 단백질 함량 및 280nm의 흡수를 가이드로서 사용하여 분획화를 실행한다.

환자 혈청 특이 IgG 및 IgE, 및 토끼항 진드기 항체를 사용하는 ELISA에서의 반응성이 강하고 백혈구 히스타민 유리능 및 피부내 반응성이 강한 분획에 대해서, 다시 조제용 디스크 SDSPAGE를 사용하여 항원 성분의 분리를 실시한다. 예를 들면 겔로부터의 목적하는 항원성분의 추출은 0.1% SDS 용액을 사용하여 진탕 확인법과 전기 용출법으로 행하고, 다시 추출에 사용한 SDS를 이온 교환수지 AG11A8(BioRad Laboratories 제조)를 통해서 제거한다. 이렇게 수득된 정제 알레르겐은 실질적으로 임의의 다른 진드기 단백질이 없는 정도까지 정제, 단리된다.

[진드기 알레르기 질환 치료제로서의 적용]

본 발명의 정제, 단리된 진드기 알레르겐은 진드기 알레르기 질환에 대한 감감작 치로제로서 유용하다.

여기에서 진드기 알레르기 질환이란 아토피성 기관지 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 아토피성 피부염등의 진드기의 특이 항원이 원인되는 모든 알레르기 질환을 말한다.

상기의 방법에 의하여 정제, 단리된 진드기 알레르겐은 농축하여 용액상 또는 시럽상으로서 채취하거나, 농축시키고, 건조한 다음 분말상으로 채취하여 진드기 알레르기 질환에 대한 감감작 치료제로서 사용된다. 본 감감작치료제는 그대로, 또는 필요에 따라서 일방전으로 사용되는 보조제 각종의 첨가제, 예를들면 안정제, 부형제, 용해보조제, 유탁화제, 완충제, 진통제, 보존제, 착색제 등을 첨가한 배합물로서 사용할 수 있다.

본 감감작 치료제는 통상의 투여경로, 예를 들면 경구, 피내, 피하, 근육내, 복강내 주사등의 투여방법에 의하여 실시할 수 있다.

또한 예를 들면 정제, 설하제, 점안제, 비강내 분무제, 찜질제, 크림제, 로숀제 등의 경피, 경점막약으로서도 사용할 수 있다. 본 감감작치료제의 투여량 및 투여 회수는 누여경로, 증상에 따라 성인 회당 약 20㎍이하의 범위가 되도록 적절히 선택하여 매주 1회 정도 투여된다.

또, 본 감감작 치료제는 진드기 알레르기 질환에 대한 치료제 뿐만 아니라 예방제로서도 유용하다. 본 감감작치료제는 과민증 유발작용이 없으므로, 인체에 대해서 안전하게 사용할 수 있다.

[진드기 알레르기 질환 진단 약품으로서의 적용]

본 발명의 정제, 단리된 진드기 알레르겐은 진드기 알레르기 질환의 진단약으로서 유용하다.

즉 정제, 단리된 진드기 알레르겐은 환자의 혈액의 일정량, 및 이 혈액에서 원심분리에 의하여 얻어진 혈구분획을 완충액에 현탁하여 제조한 혈구 부유액의 일정량을 각각 적정하는 적정시약으로서 사용되고 알레르겐 자극에 의하여 호염기구(백혈구의 일종)에서 유리되는 히스타민양을 측정한다[Journal of Japanese Society of Allergology : 33, 692(1984)/ Journal of Japanese Society of Allergology : 33, 733 (1984) ].

이 히스타민 유리 적정에서는 최대 유리량의 50%양(적정 곡선의 변곡점)으로부터 유리되는 히스타민양을 구한다. 이 적정에서는,

(ⅰ) 혈구 부유액의 적정치에서 환자의 알레르겐 감수성을 직접 측정하게 된다.

(ⅱ) 혈액의 적정치는 통상, 혈구 부유액의 적정치보다 높은 치가 얻어진다. 이것은 혈장중에 알레르겐 중화능을 갖는 IgG 항체(차단 항체)가 존재하기 때문이다.

따라서, 혈액 적정 곡선의 혈구 부유액 적정곡선으로 부터의 시프트의 크기에서 차단항체 역가가 얻어진다. 감수성과 이 차단항체로부터 표 1과 같이 진드기 알레르기의 정확한 진단이 가능해진다. 또, 감감작 치료효과를 모니터 하는데에도 유용하다.

표 1

[알레르겐 활성 및 과민증 유발시험]

본 발명의 정제, 단리된 진드기 알레르겐은 하기의 실험으로 알레르겐 활성을 가지며, 과민증 유발성은 없음이 판명되었다.

실험예 1

Balb/ 생쥐(4주령) 2마리의 복강내에 Dfb94, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14 각각 100㎍을 프로인트 완전 보조액(Freund's Complete adjuvant (Difco))와 혼합해서 주입함으로서, 0주째에 첫 번째 면역을 했다. 추가 면역은 첫 번째 면역 후 2주째와 4주째에 실시했다.

생쥐의 혈청중의 항 Dfb94, 항 Dfb40, 항 Dfb16 및 항Dfb14 항체역가가 상승하고 ; 충분한 면역원성이 인정되었다. 이를 근거로 하여 차단항체 유도능이 있고 치료용 항원으로서 사용할 수 있음이 판단되었다. 일례로서 Dfb94의 면역원성 시험의 결과를 제 1도에 나타낸다.

실험예 2

기니아 피그 2마리의 복강내에 Dfb94, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14 각각 1㎎을 알룸(alum)과 함께 주입함으로써 0주째에 첫 번째 면역을 하고, 추가 면역은 3주째에 실시했다. 대조용으로서 기니아 피그 1마리의 복강내에 알룸과 함께 생리식염수를 동일하게 주입했다. 기니아 피그에 있어서도 혈청중의 항 Dfb94, 항 Dfb40, 항 Dfb16 및 항 Dfb14 항체가는 상승하고, 충분한 면역원성이 인정되었다. 그러나, 3주째의 추가면역 직후의 관찰에서는 과민증 증상은 전혀 나타나지 않았다. 이 사실로부터 Dfb94, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14에는 과민증 유발성은 없다고 판단되었다. 일례로서 Dfb94의 면역원성 및 과민증 유발성시험의 결과를 제 2도에 나타낸다.

실시예

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 구체적으로 설명하지만 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(진드기 조항원의 조제)

쥐, 생쥐, 함스터용 사료 M (Oriental Yeast 제조) 속에서, 온도 26± 2℃, 습도 75% RH의 환경으로 진드기 밀도가 2 내지 3만마리/g 배지 정도가 되도록 데르마토파고이데스 파리나에를 사육한다. 진드기 배양물중의 진드기를 동결하여 죽이고, 진드기 배양물 12.2kg에 질량 환산으로 10배량의 포화 염화나트륨 용액을 가하고, 조심스럽게 교반했다. 4℃에서 1시간 정치후, 4℃ 3000rpm으로 30분간 원심분리하고 진드기를 상청액 표면에 부유시키고 흡인 여과에 의하여 회수했다. 다음에 얻어진 진드기 1.7kg에 ½량의 PBS를 가하고, 막자로 잘 마쇄한다. 이 마쇄물에 다시 최종적으로 2배량이 되도록 PBS를 가하고, 때때로 교반하면서 1시간동안 추출했다. 이 현탁액을 4℃, 8000rpm으로 30분간 원심분리한다. 상청액을 이온교환수에 대해서 투석한 후, 불용물을 제거하기 위하여 다시 4℃, 800rpm으로 30분간 원심분리하고 상청액을 동결건조함으로써 진드기 조항원(Dfb) 19.6g을 얻었다.

실시예2

(울트로겔 AcA 54(LKB Co. 제조)을 사용하는 진드기 조항원의 분획화)

30 ㎖의 2%(w/v) 진드기 조항원을 2000rpm에서 10분간 원심분리하고 불용성 물질을 제거한다. 이 생성물을 0.9% NaCl 용액으로 평형화된 울트로겔 AcA 54(LKB Co., 칼럼 체적 4.4 × 75.0 cm) 칼럼에 걸고, UV 280 mn에 의해 분획 진전을 모니터하면서 유속 2 ml/분에서 분획부피 32 ml로 분획했다. 각 분획의 항원 활성은 환자혈청 및 토끼항진드기 조항원 혈청의 ELISA에 의하여 측정했다. 단백질 및 중성당의 분포는 각각 폴린로우리 방법(FolinLowry method) 및 페놀황산법으로 결정했다. 사전에 실시한 어낼리티칼 스케일(Analytical scale)에 의해 측정된 알레르겐 분포와 UV 280 nm 흡수패턴에 의하여, 진드기 조항원을 4분획(Dfb 1 내지 4)로 분획했다(제 3도). Dfb 1 g으로부터 상기 분획의 수득량은 Dfb 1이 506 mg, Dfb 2가 148mg, Dfb 3이 33mg 및 Dfb 4 가 3mg 이었다.

이와같이 하여 울트로겔 AcA 54 (LKB Co. 제조)로 분획하여 얻어진 4분획에 관해서 천식환자의 피부내 반응시험을 실시했다. 그 결과, 4분획(Dfb 1내지 4) 중, Dfb 2 분획은 가장 높은 피부내 반응 활성을 나타내고, 또 히스타민 유리시험에 있어서도 상기 분획이 가장 높은 알레르겐 활성을 나타냈다(표 2).

이 결과에서 이 dFB 2 분획이 진드기 조항원중의 주요 레르겐을 다량으로 함유하고 있다고 판단되었다.

표 2

실시예 3

(SDS-PAGE, 웨스턴법 (Western blot), 면역 염색법(Immunostaining) 에 의한 Dfb 2 분획의 알레르겐 성분의 검출)

가장 높은 알레르겐 활성을 보여주는 Dfb 2 분획을 SDSPAGE에 걸었다. 시료의 환원, 비환원에 의한 영향은 시료가 환원될 때에 분자량 약 100k의 밴드가 사라지는 것 이외에는 변화가 없었다. Dfb 2 분획의 SDSPAGE에 의해 측정된 분자량 분포는 14k에서 94k 까지 폭 넓게 분포되어 있었다.

이 분획을 웨스턴 법에 적용시키고 Auro Dye(Janssen Pharmaceutica 제조)로써 면역 염색을 실시한 바, 환자에 따라 Dfb 2 분획중의 각양각색의 성분과의 반응이 일어나지만 94 k, 60 k, 40 k, 16 k, 및 14 k 의 성분은 매우 높은 빈도로 반응하고 있었다. 이 사실로부터 이것이 가장 높은 알레르겐 활성을 보여주는 분획 Dfb 2의 주요 알레르겐 성분인 것으로 판단된다.

실시예 4

(대형 디스크 SDSPAGE에 의한 알레르겐의 단리, 추출, 정제)

Dfb 2 분획중의 알레르겐이라고 생각되는 94 k, 60 k, 40 k, 16 k 및 14 k의 성분을 대형 디스크 SDSPAGE로 정제했다. 20mg의 Dfb 2와 표준물질을 대형 디스크 SDSPAGE에 적용했다. 전기영동 분리 상황을 제 4도에 나타낸다. 제 4도중, 화살표시한 94 k, 60 k, 16 k 및 14 k의 알레르겐에 해당한다고 생각되는 겔 부분을 각각 절단하고 진탕확산법 혹은 전기 용출법으로 겔에서의 알레르겐 추출을 실시했다.

정제가 불충분한 경우에는 필요에 따라서 적절히 10% T 겔 혹은 12.5 % T겔을 사용하여 정제를 반복하여 실시한다.

Dfb 2(148 mg)로부터 단리, 정제한 각 성분은 Dfb94가 1.2mg, Dfb60이 1.8mg, Dfb40이 2.1 mg, Dfb16이 6.5 mg 및 Dfb14가 7.7mg 얻어졌다.

실시예 5

(성분의 알레르겐성의 확인)

정제 및 단리에 의하여 수득한 성분 Dfb94, Dfb60, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14를 니트로 셀룰로오스 시트를 사용하는 스포트 면역 염색 테스트를 15명의 천식 환자 혈청을 사용하여 실시했다. 그 결과를 제 5도에 나타내었다. 이들 성분은 15명의 천식환자의 혈청 IgG와 매우 높은 빈도로 반응했다. 그러나 Dfb60은 환자 혈청 IgG와 반응하지만 낮은 빈도였다. 환자혈청 IgE에 있어서도 유사하게 Dfb94, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14는 모두 8명 이상의 높은 빈도로 환자 혈청 IgE와 반응했다. 따라서 이들 Dfb94, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14는 진드기 항원 유래의 주요 알레르겐인 것이 확인되었다. Dfb60은 천식환자 혈청 IgE와는 전혀 반응하지 않고, 알레르겐으로서의 가능성은 적다고 판단되었다. 이와 같이, 진드기 조항원에서 겔 크로마토그래피 및 대형 디스크 SDSPAGE를 사용하여 종래 보고되어 있지 않은 신규의 주요 알레르겐을 검출, 분리, 정제하고 취득했다.

실시예 6

(교차 면역 전기 영동(CIE)에 의한 면역학적 특성의 검출)

실시예 4에서 얻어진 정제, 단리된 진드기 알레르겐의 면역 학적 순도를 측정하기 위하여 면역 2차원 전기영동을 실시했다. 그 결과 Dfb94는 토끼항진드기 혈청과의 침강 밴드를 예리하게 1개만 형성했다. 이 사실로부터, 이 Dfb94는 항원 레벨에서 극히 균일한 것임을 확인했다. Dfb40에 관해서도 1개의 예리한 침강밴드를 형성하고 토끼항 혈청과의 항원 레벨에서 균일한 것으로 발견되었다. Dfb16 에 관해서도 상당히 균일하게 정제되어 있음이 관찰되었다. Dfb14에 관해서도 또한 침강밴드 1개밖에 형성되지 않았다. CIE의 결과에 의하여 대형 디스크 SDSPAGE에 의하여 극히 균일하게 정제가 실시되어 있음이 확인되었다.

실시예 7

(조성분석)

Dfb94, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14 의 조성 분석을 실시했다. 아미노산 조성은 하기의 방법으로 측정했다.

0.2% 샘플 용액 200μl를 12N 염산 200 μl와 혼합하고 밀봉 N2 포화시험관 내에서 110℃에서 24시간 가수분해 했다. 가수분해물을 건조상태까지 증발시킨 후 소량의 물을 가하고 다시 건조상태까지 증발시켰다. 이 조작을 3회 반복함으로써 탈염산을 하고 이것을 아미노산 분석기용의 희석용 완충액 1㎖에 용해했다. 상기 결과 건조 생성물을 아미노산 분석기(Beckman Co. 제조)에 의해 정량했다.

전체 중성당은 글루코오스를 표준물질로 사용하여 페놀 황산법으로 정량했다.

또 개개의 중성당과 아미노당은 시료를 4N 트리플루오르 초산(TFA) 속에서 100℃, 4시간 가수분해하고, NaBH4로 환원 후, 무수초산 존재하에 100℃, 4시간 가열하여 아세틸화한 후, GLC 법으로 정량했다.

그 결과, Dfb94, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14의 조성을 하기표 3 내지 6에 나타낸다.

표 3

표 4

표 5

표 6

이들 데이터로부터 Dfb94, Dfb40, Dfb16 및 Dfb14는 각각 약 60%, 약 15%, 약 20%, 약 13%의 당을 함유하고 있었다. Dfb16 및 Dfb14는 종래 보고되어 있는 진드기 유래 주요 알레르겐 Derf II와 유사한 분자량이지만 Derf II가 단백질 알레르겐인데 대해서 Dfb16 및 Dfb14 는 당 단백질 알레르겐이라는 것에서 상이한 알레르겐이다.

실시예 8

( 감감작 치료용 항원제제의 제조 )

0.5% 페놀을 첨가한 0.9% 염화나트륨 용액에 Dfb94, Dfb40, Dfb16 또는 Dfb14를 1mg/ml의 농도로 용해하고 ; 생성용액을 감감작 치료용 항원 제제를 제조하기 위한 원액으로 한다.

실시예 9

(진드기 알레르기 진단용 적정시약의 제조)

행크스 용액(Hank's solution)에 Dfb94, Dfb40, Dfb16 또는 Dfb14를 1mg/ml의 농도로 용해하고 ; 진드기 알레르기 진단용 적정 시약을 제조학 위한 원액으로 사용한다.

Claims

하기의 이화학적 성질 및 생물학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 단리된 진드기 알레르겐 :

① 진드기 추출물에 함유되어 있다. ;

② 60%의 당지을 함유하는 당단백질 ;

③ SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정시 94,000의 분자량 ;

④ 알레르겐 활성을 갖는다.
하기의 이화학적 성질 및 생물학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 단리된 진드기 알레르겐.

① 진드기 추출물에 함유되어 있다. ;

② 15%의 당질을 함유하는 당단백질 ;

③ SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정시 40,000의 분자량 ;

④ 알레르겐 활성을 갖는다.
하기의 이화학적 성질 및 생물학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 단리된 진드기 알레르겐

① 진드기 추출물에 함유되어 있다. ;

② 20%의 당질을 함유하는 당단백질 ;

③ SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정시 16,000의 분자량 ;

④ 알레르겐 활성을 갖는다.
하기의 이화학적 성질 및 생물학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 단리된 진드기 알레르겐.

① 진드기 추출물에 함유되어 있다. ;

② 13%의 당질을 함유하는 당단백질 ;

③ SDS폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 측정시 14,000의 분자량 ;

④ 알레르겐 활성을 갖는다.
제 1 항에 있어서, 상기 진드기가 데르마토파고이데스 프테로니시누스 또는 데르마토파고이데스 파리나에인 정제, 단리된 진드기 알레르겐.
제 2항에 있어서, 상기 진드기가 데르마토파고이데스 프테로니시누스 또는 데르마토파고이데스 파리나에인 정제, 단리된 진드기 알레르겐.
제 3항에 있어서, 상기 진드기가 데르마토파고이데스 프테로니시누스 또는 데르마토파고이데스 파리나에인 정제, 단리 된 진드기 알레르겐
제 3항에 있어서, 상기 진드기가 데르마토파고이데스 프테로니시누스 또는 데르마토파고이데스 파리나에인 정제, 단리 된 진드기 알레르겐
제 1 항에 있어서, 표 3에 보여진 바와 같은 아미노산 조성, 중성당 조성 및 아미노당 조성을 갖는 정제, 단리된 진드기 알레르겐.
제 2 항에 있어서, 표 4에 보여진 바와 같은 아미노산 조성, 중성당 조성 및 아미노당 조성을 갖는 정제, 단리된 진드기 알레르겐.
제 3 항에 있어서, 표 5에 보여진 바와 같은 아미노산 조성, 중성당 조성 및 아미노당 조성을 갖는 정제, 단리된 진드기 알레르겐.
제 4 항에 있어서, 표 6에 보여진 바와 같은 아미노산 조성, 중성당 조성 및 아미노당 조성을 갖는 정제, 단리된 진드기 알레르겐.
배양물내 진드기를 포화 염화나트륨 용액과 현탁하고 그 현탁액을 방치하고 :

현탁액을 원심분리시켜 얻은 상청액으로부터 상기 진드기를 수집하고 : 수집한 진드기를 마쇄하고 :

마쇄진드기로부터 중정도 이온 강도의 완충액으로 진드기 알레르겐을 추출하고 :

상기 추출물을 분획화하고 진드기 알레르겐 활성을 갖는 제 1항에 따른 당단백질 분획을 단리하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 정제, 단리된 제 1항에 따른 알레르겐의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 분획화가 겔 여과크로마토그래피에 의해 실행되는 방법.
활성 성분으로서 제약학적 유효량의 제 1항, 제 5항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 진드기 알레르기 질환 치료용 제약학적 조성물.
활성 성분으로서 제약학적 유효량의 제 2항, 제 6항 또는 제 10항중 어느 한 항에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 진드기 알레르기 질환 치료용 제약학적 조성물.
활성 성분으로서 제약학적 유효량의 제 3항, 제 7항 또는 제 11항중 어느 한 항에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 진드기 알레르기 질환 치료용 제약학적 조성물.
활성성분으로서 제약학적 유효량의 제 4항, 제 8항 또는 제 12항중 어느 한 항에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 진드기 알레르기 질환 치료용 제약학적 조성물.
활성성분으로서 진단학적 유효량의 제 1항, 제 5항 또는 제 9항중 어느 한 항에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐을 포함하는 진드기 알레르기 질환 진단용 조성물.
활성성분으로서 진단학적 유효량의 제 2항, 제 6항 또는 제 10항 중 어느 한 항에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐을 포함하는 진드기 알레르기 질환 진단용 조성물.
활성성분으로서 진단학적 유효량의 제 3항, 제 7항 또는 제 11항중 어느 한 항에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐을 포함하는 진드기 알레르기 질환 진단용 조성물.
활성성분으로서 진단학적 유효량의 제 4항, 제 8항 또는 제 12항중 어느 한 항에 따른 정제, 단리된 진드기 알레르겐을 포함하는 진드기 알레르기 질환 진단용 조성물
배양물내 진드기를 포화 염화 나트륨 용액과 현탁하고 그 현탁액을 방치하고 :

현탁액을 원심분리시켜 얻은 상청액으로부터 상기 진드기를 수집하고 ;

수집한 진드기를 마쇄하고 ;

마쇄 진드기로부터 중정도 이온 강도의 완충액으로 진드기 알레르겐을 추출하고 ;

상기 추출물을 분획화하고 진드기 알레르겐 활성을 갖는 제 2항에 따른 당단백질 분획을 단리하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 정제, 단리된 제 2항에 따른 알레르겐의 제조방법.
배양물내 진드기를 포화 염화 나트륨 용액과 현탁하고 그 현탁액을 방치하고 :

현탁액을 원심분리시켜 얻은 상청액으로부터 상기 진드기를 수집하고 ;

수집한 진드기를 마쇄하고 ;

마쇄 진드기로부터 중정도 이온 강도의 완충액으로 진드기 알레르겐을 추출하고 ;

상기 추출물을 분획화하고 진드기 알레르겐 활성을 갖는 제 3항에 따른 당단백질 분획을 단리하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 정제, 단리된 제 3항에 따른 알레르겐의 제조방법.
배양물내 진드기를 포화 염화 나트륨 용액과 현탁하고 그 현탁액을 방치하고 :

현탁액을 원심분리시켜 얻은 상청액으로부터 상기 진드기를 수집하고 ;

수집한 진드기를 마쇄하고 ;

마쇄 진드기로부터 중정도 이온 강도의 완충액으로 진드기 알레르겐을 추출하고 ;

상기 추출물을 분획화하고 진드기 알레르겐 활성을 갖는 제 4항에 따른 당단백질 분획을 단리하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 정제, 단리된 제 4항에 따른 알레르겐의 제조방법.