JP5523108B2 - 新規アレルゲンとしての前立腺カリクレイン - Google Patents
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Description
−哺乳類の尿を濾過する;
−疎水性相互作用クロマトグラフィーに適するバッファーでバッファー交換する;
−バッファー交換した尿サンプルを濾過する;
−バッファー交換した尿サンプルを、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムにかける;そして
−カリクレインを包含する素通り分画(flow through fraction)を集める、
というステップを包含する。
カリクレインは、正常な血液および尿中に見出されるセリンエンドペプチダーゼファミリーのタンパク質分解酵素である。IUBMB酵素ラベル法システムにおいて、血漿カリクレインは酵素番号EC3.4.21.34、および組織カリクレインは酵素番号EC3.4.21.35と指定されている。イヌ由来の尿カリクレインは、各々およそ10±2および18±2kDaの2つのサブユニットを包含する28kDaヘテロダイマータンパク質であるが、本発明の目的のためこれらを各々10および18kDaのサブユニットと呼ぶ。カリクレインは、配列番号1、GenBankアクセション番号:P09582に従ってのアミノ酸配列を有し、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラットおよび霊長類を含む広範囲の哺乳類の種において、相同のタンパク質が記載されている(例えばアクセション番号AAQ23713−4(ウマ)、NP_001008416(ウシ)、P00752(ブタ)、P00755−6およびP15947(マウス)、P36373およびP00758(ラット)、Q28773(ヒヒ)、XP_001174026(チンパンジー)、Q07276(マカク)、P20151、Q07276およびAAM11874(ヒト))。
イヌの尿がヒトのイヌアレルギーに関するアレルゲンを含有する可能性があるかどうかを調べるため、以下の実験を行った。尿は、7歳オスのシベリアンハスキーおよびポインター間交雑種より集めた。0.45μmセルロース混合エステル製フィルターを通しての濾過の後、10mLの尿を、20mM MOPS pH7.6、0.5M NaCl(MBS)で平衡化したSuperdex75サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(XK26/100、Vt=505mL、GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)にのせ、同じバッファーで2mL/分の流速で溶出を行った。3つのピークの分画を、図1に示したクロマトグラムに示したようにプールし、アレルゲン活性について分析した。各分画のタンパク質含有物を、ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)固相上に固定化し、そのIgE抗体結合活性を、イヌ皮屑により感作された個体由来の8血清を使用して検査した。これらの血清のほとんどはイヌ皮屑抽出物への高いIgE結合を有するが、rCan f1、rCan f2およびnCan f3に対しては相対的に低い結合を有するものとして選択した。検査した3つのピークの内ピーク2は、圧倒的に最も高レベルのIgE結合活性を含有することが見出された(表1)。ピーク2の還元サンプルの、NuPAGE MESバッファー系(10% NuPAGEゲル、Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いてのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)は、各々およそ10および18kDaの明確な分子量を有する2つの際立ったタンパク質のバンドを明らかにした(示していない)。
質量分析およびN末端配列決定を使用して、イヌ尿より単離したIgE結合タンパク質の同定を決定した。
RPCにより精製した尿タンパク質の溶液内消化のため、サンプルにDTTおよびヨードアセトアミドを各々およそ45倍および100倍モル過剰濃度で順次加えることにより、還元およびアルキル化を行った。その後トリプシン消化を、ブタトリプシン(Trypsin Gold、質量分析計グレード、Promega, Madison, WI, USA)を使用して、一晩、37℃で行った。消化したペプチドを含有するサンプルをMALDI標的プレート上にスポットし、50%アセトニトリル、10mM NH4[H2PO4]、0.1% TFA中のα−シアノマトリクスを加えた。溶媒を蒸発させた後、ペプチドマスフィンガープリンティング(PMF)をBruker Daltonics Autoflex 2 装置(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)にて行った。得られたPMFの結果とマッチするタンパク質を同定するため、MSDBデータベースからMascot サーバー(Matrixscience, London, UK)を使用して検索した。ポストソース分解(Post source decay (PSD))分析を、選択されたペプチドについて行った。ペプチドキャリブレーションスタンダード(Bruker Daltonics)を使用して外部較正を行った。
N末端配列決定のため、還元された10kDaおよび18kDaのタンパク質バンドを、SDS−PAGEゲルより別々に切り出し、均一にするためにプラスチック棒を使用して、6M グアにジニウム−HCl、20mM Tris pH8.0、0.5M NaCl中に抽出した。抽出された10kDaおよび18kDaバンドのN末端配列分析は、Hewlett-Packard G1000A装置(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA)を使用して行い、各々アミノ酸配列IIGGREXLKNおよびAVIRPGEDRSを得たが、この配列は、アクセション番号P09582のイヌ前立腺カリクレイン前駆体の配列の25−34残基および108−117残基にマッチすることが見出された。
精製されたリコンビナントまたは天然のイヌアレルゲンのin vitroIgE結合活性を、アトピー性アレルギーの臨床診断における特異的IgE抗体の測定用に使用されるイムノアッセイシステムであるImmunoCAP(登録商標)(Phadia, Uppsala, Sweden)を使用して調べた。リコンビナントのCan f1およびCan f2(5)は、本質的には記載されている(26)ように、大腸菌内でクローン化し、発現させた。イヌアルブミンは、本質的には記載されている(27)ように、陰イオン交換クロマトグラフィーグラフィーおよびBlue Sepharoseアフィニティークロマトグラフィーを使用して、血清より精製した。実験レベルでのImmunoCAP検査は、記載されている(26)ように血清分析用に調製し、使用した。
IgE阻害実験を行い、イヌ皮屑が、カリクレイン反応性IgE抗体に結合する能力のあるエピトープを含有するかどうかを調べた。イヌに感作されている3名の被験者(A−C)由来の、カリクレインへのIgE反応性を有する血清サンプルを、最初に、最終濃度100μg/mLの精製されたカリクレインと共に、そして並行してネガティブコントロールとして血清希釈液または大腸菌の非アレルギー性マルトース結合プロテイン(MBP)と共に、室温で2時間インキュベーションした。次にすべてのサンプルを、固定化したイヌ皮屑抽出物を保有するImmunoCAP検査へのIgEの結合についてダブルで分析し、カリクレインとのプレインキュベーションが固相に付着させた皮屑タンパク質へのIgEの結合を特異的に妨げるかことになるどうかを研究した。阻害物質としてのカリクレインの特異性に関するコントロールとして、Can f1およびCan f2に感作されているが、カリクレインには感作されていない被験者(D)由来の血清を、実験において他の血清と平行して含めた。
観察されたカリクレイン様アレルゲン活性が起因すると思われるイヌ皮屑中に存在するタンパク質を同定する目的で、公知のレベルのカリクレイン反応性IgEを有する37血清を、免疫ブロット実験において使用した。免疫ブロット分析は、SDS−PAGE(12.5% Excel 2-D gel, GE Healthcare Biosciences)により分離した非還元イヌ皮屑抽出物において行い、ニトロセルロース膜(Hybond ECL, GE Healthcare Biosciences)上に電気的にブロッティングした。タンパク質のブロットは、ブロッキングバッファー(50mM リン酸塩 pH7.4、0.1%(v/v)Tween−20、0.9%(w/v)NaCl、0.3%(w/v)デキストランT10)を使用して、室温で1時間ブロックした後、ブロッキングバッファー中で1.5倍から20倍希釈した各患者の血清と共に、一晩インキュベーションした。各血清の希釈倍数は、図5の対応する短冊状の膜の上端の括弧内に表示する。膜は、0.5%(v/v)Tween−20を含むブロッキングバッファー中で洗浄した後、ブロッキングバッファー中で125I標識した抗ヒトIgE抗体と共に、室温で4時間インキュベーションし、その後ストレージホスファスクリーン(storage phosphor screen)およびVariable Mode Imager, Typhoon 9410 (GE Healthcare Biosciences)を使用して、X線撮影により検出した。
イヌ皮屑由来カリクレイン様タンパク質を、生化学的同定のためSECおよびRPCにより精製した。3グラムのイヌの皮屑(Allergon, Valinge, Sweden)から、100mLのMBS中で転倒式回転により3時間、室温で抽出した。20,000×gでの遠心、およびAmicon フィルター(PM-10, Millipore, Billerica, MA, USA)を使用しての濃縮の後、抽出物をXK50/100Superdex 75カラム(GE Healthcare Biosciences)にのせ、MBSを使用して溶出した(図8)。6つのピーク(図8において1−6と示した)からの分画をプールし、アレルゲン活性について分析した。各分画のタンパク質含有物をImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)固相上に固定化し、そのIgE抗体結合活性をイヌ皮屑に感作された個体由来の8血清を使用して、表4に示したように検査した。これら血清のほとんどは、イヌ皮屑への高いIgE結合を有するが、rCan f1、rCan f2、およびnCan f3のいずれかに対しては相対的に低い結合を有するものとして選択した。表4から、SEC分離によるピーク3が、検査した6つのピークの中で最も高レベルのIgE結合活性を含有していたことは、明らかである。このプールをさらなる精製のために選択した。
イヌの尿および皮屑由来のカリクレインのIgE抗体結合活性を比較するため、カリクレイン反応性の2つの血清(表2の血清No.6および8)、ならびにカリクレイン非反応性の1つの血清(No.11)を、イヌ皮屑抽出物、精製された尿カリクレイン、および部分的に精製されたイヌ皮屑由来カリクレインの、非還元サンプルの免疫ブロット分析において使用した(図10)。すべての3つの調製物において、カリクレイン反応性の2つの血清は、28kDaバンドへのIgEの結合を表し、イヌ皮屑抽出物中の28kDaへのIgEの結合がカリクレインによるものであることを示した。加えて、精製された尿カリクレイン中の28kDaバンドへの支配的な反応性は、同じ調製物のクマシー染色したタンパク質バンドと一致することが明らかになった。非還元カリクレイン調製物中の約55kDaのバンドへのIgE結合は、カリクレインの推定ダイマーという、上の実施例1の考え方と一致する。ImmunoCAPによりカリクレイン非反応性であった血清は、分析した3つのアレルゲン調製物のいずれにおいても28kDaバンドに対するIgEの結合は示さなかった。
分析物を、固体支持体、例えばImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)に固定化する。関連種に感作され、その種由来のカリクレインへのIgE反応性を示す、少なくとも3名の代表的なヒト患者由来の血清サンプルを、最終濃度100μg/mLのカリクレインと共に、そして並行してネガティブコントロールとして、バッファー単独および大腸菌の非アレルギー性マルトース結合タンパク質(MBP)と共に、室温で3時間インキュベーションする。次にサンプルを、固定化した分析物を保有するImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)検査でのIgEの結合について分析して、カリクレインとのプレインキュベーションがIgEの結合を特異的に阻害する、または有意に低下させるかどうかの研究を行う。
イヌの尿のプールしたサンプルを、窒素圧下で、5μmおよび0.45μmのフィルターを通して濾過した。すべてのクロマトグラフィーの操作は、AKTA Explorer 100 Air システム (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)を用いて行った。120mlの濾過したイヌの尿の4つのアリコートを、Sephadex G−25カラム(GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden) (カラム容積 461ml)を使用して、検体をカラムに通す毎にカラム洗浄して、バッファー交換した。使用したバッファー:50mM リン酸ナトリウム、1M (NH4)2SO4、0.02% NaN3、pH=7。次にサンプル(約505ml)を、0.45μmフィルターを通して濾過し、HICカラム(HiPrep Phenyl FF (high sub)、20ml、GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)にかけた。HIC分離に使用したバッファーは:A)50mM リン酸ナトリウム、1M (NH4)2SO4、0.02% NaN3、pH=7、およびB)50mM リン酸ナトリウム、0.02% NaN3、pH=7、であった。素通り分画(カリクレインを含有する)を流速5ml/分で、10mlずつの分画(950分画)にて集めた後、素通り分画をプールした。吸着された材料は、100%バッファーBを使用して段階的勾配にて溶出させた。
電気泳動を使用して以下のサンプルについて、同一ゲル上で、コロイド状のクーマシーブリリアントブルー(CBB)染色法を適用して比較した:
1.標準分子量マーカー
2.イヌの尿
3.HIC溶出材料(還元)
4.HIC素通り分画(還元)
5.HIC素通り分画(非還元)
6.HIC溶出材料(非還元)
サンプル2、3および6に関しては、多数のタンパク質が検出された。しかしながらサンプル4(還元HIC素通り分画)においては、2つの主要なバンドしか認められなかった。これら2つのバンドは後に、MALDI−TOF(−TOF)分析(以下参照)の使用により、(アルギニンエステラーゼ活性によるR107でのタンパク質分解の結果として)カリクレインタンパク質の2つの異なるバリアントに対応することが見出された。サンプル5(非還元HIC素通り分画)では7つの個別のバンドが検出され、すべてのバンドは、MALDI−TOF(−TOF)分析(以下参照)の使用により、カリクレインタンパク質の異なるバリアントに対応することが見出された。カリクレインは12のシステイン残基を包含しており、それ故異なるバリアンドの形成は、非還元条件下ではシステインシステイン架橋の形成により可能である。したがって例えばダイマー、トリマーなどの形成が、非還元条件下で起こる可能性は高い。
希釈サンプルは、SDS−PAGE精製キットを使用して、供給元(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)のマニュアルに推奨されている方法に従って調製した。ゲルはMESバッファー中、200Vで、35分間流した。還元サンプルおよび非還元サンプルは別々のまとまりとして流した。染色は、コロイドCBBを用いて一晩行った(脱染色は後に水に約5時間浸して行った)。サンプルは、ピペットの先端部を使用して手動でゲルから採取し、標準的なプロトコル(アセトニトリルの代わりにエタノールを使用して)に従って処理し、12.5ng/μlのトリプシンと共に37℃で一晩インキュベーションした。消化されたサンプルのうち0.5μlを、MALDIシステム用の標的プレートにのせ、0.5μl MALDIマトリクス溶液(50%アセトニトリル、0.1%TFA中のHCCの飽和溶液)と混合した。すべてのサンプルはMALDI−TOF−TOF(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)質量分析計を使用して分析した。得られたPMFの結果とマッチするタンパク質を同定するため、Mascot サーバー(Matrixscience, London, UK)を使用してMSDBデータベースを検索した。選択されたペプチドについてMS−MS分析を行った。ペプチドキャリブレーションスタンダード(Bruker Daltonics)を使用して、外部較正を行った。データベースの検索は、以下の検索基準を使用して実行した:
分類学:哺乳類
質量の誤差範囲:100ppm
メチオニンの酸化および1回の開裂失敗を考慮する
データベースからのカリクレインの配列:
MWFLALCLAMSLGWTGAEPHFQPRIIGGRECLKNSQPWQVAVYHNGEFACGGVLVNPEWVLTAAHCANSNCEVWLGRHNLSESEDEGQLVQVRKSFIHPLYKTKVPR−−−−−−−−−
AVIRPGEDRSHDLMLLHLEEPAKITKAVRVMDLPKKEPPLGSTCYVSGWGSTDPETIFHPGSLQCVDLKLLSNNQCAKVYTQKVTKFMLCAGVLEGKKDTCKGDSGGPLICDGELVGITSWGATPCGKPQMPSLYTRVMPHLMWIKDTMKANT (配列番号: 1)
(MALDI−TOF(/TOF)MS(/MS)により同定されたペプチド配列を下線で示す)
実施例11:メタノール資化酵母(Pichia pastoris)において発現させるリコンビナントイヌカリクレインのクローン化、精製、およびIgE結合活性の評価
イヌアレルゲンとしての尿カリクレインの同定および重要性を検証するため、メタノール資化酵母を発現ホストとして使用して、リコンビナントアレルゲンとしてタンパク質を作成し、精製し、そしてIgE抗体結合活性について分析した。
成熟タンパク質に対応するイヌの前立腺アルギニンエステラーゼ(尿カリクレイン、アクセション番号P09582)の報告されているアミノ酸配列の一部を、ヌクレオチド配列中に逆翻訳することにより、合成のイヌ尿カリクレイン遺伝子をデザインした。ヌクレオチド配列は、最適なコドンが利用されるようにデザインし、二次構造を最小化し、所望のように制限酵素を削除または付加するため、同義となるように調整した。最終コード配列に対応するオリゴヌクレオチドを得、これを組み立て、そして完全長の合成遺伝子をPCRにより増幅し、金属イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によるタンパク質の精製を可能にするC末端のヘキサヒスチジンタグを加えて、ベクターpPICZ A(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)のXhoI部位およびSalI部位内にクローン化した。プラスミドDNAコンストラクトをSac I消化により直線化し、染色体のAOX1遺伝子座内への相同なリコンビナント化のため、メタノール資化酵母株X−33内に形質転換した。
リコンビナントタンパク質は、メタノール資化酵母株X−33(Invitrogen)において、7Lバイオリアクター(Belach Bioteknik, Solna, Sweden)を使用して作成した。rich broth培地(20g/L ペプトン、10g/L 酵母抽出物、3.4g/L 酵母窒素ベース、10g/L 硫酸アンモニウム、0.4mg/L ビオチン、および0.1M リン酸カリウム)を使用し、培養は30℃で行った。培養液にメタノールを0.1%(v/v)の定常状態の濃度で与えることにより、発現を誘発、維持した。70時間の発酵後、培養液から+4℃、10000g、10分間の遠心により収穫し、上清をタンパク質の精製のため回収した。
作成されたリコンビナントカリクレインの免疫学的活性を、イヌ尿より精製された天然のタンパク質と比較して評価した。2つのタンパク質をImmunoCAP(登録商標)固相上に別々に固定化し、それらのin vitroでのIgE結合能を、上の実施例3に記載したイヌアレルギー被験者由来の37血清サンプルを使用して調べた。
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Claims (11)
- イヌの前立腺カリクレインを含有するI型アレルギーのin vitroの診断のための診断薬。
- 前記カリクレインが、イヌより精製される、または遺伝子組換えにより作成されることを特徴とする、請求項1に記載の診断薬。
- 前記カリクレインが配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1または2に記載の診断薬。
- イヌの前立腺カリクレインを、アレルゲン抽出物および/または少なくとも1つの精製されたアレルゲン成分を包含する組成物に添加するステップを包含する、アレルゲン組成物を作成するための方法。
- イヌの前立腺カリクレインの添加より前において、前記アレルゲン抽出物および/または少なくとも1つの精製されたアレルゲン成分を包含する組成物がカリクレインを含有しないまたはカリクレイン含有量が低いことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記イヌの前立腺カリクレインが配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項4または5に記載の方法。
- I型アレルギーのin vitroでの検出を補助する方法であって、以下のステップ
−I型アレルギーを有するのではないかと疑われる患者由来の免疫グロブリンを含有する体液サンプルを、イヌの前立腺カリクレインと接触させる;そして
−前記イヌの前立腺カリクレインに特異的に結合するIgE抗体の、サンプル中の存在を検出する、
を包含し、
ここで前記イヌの前立腺カリクレインに特異的に結合するそのようなIgE抗体の存在がI型アレルギーの指標となる、前記方法。 - 前記カリクレインが、イヌより精製される、または遺伝子組換えにより作成されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記カリクレインが配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項7または8に記載の方法。
- イヌの前立腺カリクレイン、またはその10kDaサブユニットまたは18kDaサブユニットを含有するI型アレルギーの免疫療法に使用される治療薬であって、そのような治療に感受性である哺乳類において使用され、前記哺乳類が、ヒトを含む霊長類、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ラットまたはマウスから成る群より選択される、治療薬。
- イヌの尿由来の前立腺カリクレインの単離のための方法であって、以下のステップ
−イヌの尿を濾過する;
−疎水性相互作用クロマトグラフィーに適するバッファーでバッファー交換する;
−バッファー交換した尿サンプルを濾過する;
−バッファー交換した尿サンプルを、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムにかける;そして
−前立腺カリクレインを含む素通り分画を集める、
を包含する、前記方法。
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