JP3302418B2 - 精製ダニアレルゲン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアレルゲン活性を有する
精製ダニアレルゲンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療法としては、アレルギーの原
因物質であるアレルゲンを投与して減感作する減感作療
法が、最も重要な根本療法とされ、特に花粉症を始め昆
虫アレルギー等、抗原が特定され易い疾患においては、
その評価は今や確立されたものといえる。しかしなが
ら、この減感作療法ではアレルゲンによるアナフィラキ
シーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与が必要と
される。

【０００３】ダニアレルギー疾患については、屋内塵中
のダニアレルゲンとして、ヤケヒョウヒダニ（Dermatop
hagoides pteronyssinus）及びコナヒョウヒダニ（Derm
atophagoides farinae）の２種が重要であると報告され
ている[ J. Allergy : 42,14-28,(1968)] 。従来、主要
ダニアレルゲンとしてはダニ排泄物および／またはダニ
虫体中に含有されている分子量24〜28kDの糖蛋白（pI
4.6〜7.2)、および／または分子量14.5〜20kDの蛋白（p
I 5〜8.3)が報告されている[J. Immunol. : 125,587-59
2,(1980）／ J. Allergy Clin. Immunol. : 76,753-76
1,(1985)／ Immunology : 46,679-687,(1982）／ Int.
Arch. Allergy Appl. Immunol. : 81,214-223,(1986)／
J. Allergy Clin. Immunol. : 75,686-692,(1985)等]
。

【０００４】一方、前記の主要ダニアレルゲンよりも高
分子量の画分及び低分子量の画分に、ダニ喘息患者血清
IgG に特異的反応性を示し、ダニ喘息患者の白血球ヒス
タミン遊離を誘導する成分が存在することを本発明者ら
は報告している（日本農芸化学会，62:411, 1988）。し
かし、減感作治療用抗原として用いることができる程度
までの精製は、未だなされていなかった。

【０００５】ダニアレルギー疾患の診断方法としては、
従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物
および／またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験が
殆どであり、まれにRAST法による血清中のIgE 抗体価の
測定値（相対値）を併用する程度で、ダニアレルギー疾
患を直接的に断定するのはかなり困難であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来、屋内塵性ダニを
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト) 抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、また多種類の不
純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるため
に投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いのが
現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が期待されている。
また、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断は、ダ
ニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重要であり、
診断システムの確立が期待されている。

【０００７】本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダ
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬として極めて有用な
新規な精製ダニアレルゲンを提供することにある。即
ち、本発明の第１の目的は、ダニ培養中の排泄物から抽
出しうる、アレルゲン活性を有する新規な精製ダニアレ
ルゲンを提供することである。本発明の第２の目的は、
当該新規な精製ダニアレルゲンの製造方法を提供するこ
とである。本発明の第３の目的は、新規なダニアレルギ
ー疾患治療剤を提供することである。本発明の第４の目
的は、新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供すること
である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ダニアレ
ルギー疾患の治療剤、診断薬を開発することを目的とし
て、コナヒョウヒダニ排泄物の抽出物中のアレルゲンに
ついて鋭意研究を重ねた。その結果、分子量約13,000の
糖蛋白に強いアレルゲン活性を有することを見出し、さ
らに研究を重ねて本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明の要旨は、 （１）下記の理化学的性質および生物学的性質を有する
精製ダニアレルゲン。コナヒョウヒ ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、分
画分子量 10,000 の限外濾過膜を通過する成分である。 約１３％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（セファデックスＧ５０ゲル濾過法）: 約13,0
00 アレルゲン活性を有する。 （２）下記の理化学的性質および生物学的性質を有する
精製ダニアレルゲン。コナヒョウヒ ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、分
画分子量 10,000 の限外濾過膜を通過する成分である。 約３２、３８、４６、又は５１％の糖質を含む糖蛋白
である。 分子量（セファデックスＧ５０ゲル濾過法）: 約13,0
00 アレルゲン活性を有する。 （３）また、本発明はコナヒョウヒダニ培養中の排泄物
を飽和食塩水および／または中程度イオン強度の緩衝液
により抽出処理し、得られた抽出液を分画することを特
徴とする前記の精製ダニアレルゲンの製造方法である。 （４）さらに、本発明は前記の精製ダニアレルゲンを有
効成分とするダニアレルギー疾患診断薬である。

【００１０】この明細書においては、アミノ酸等につい
て、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに基づく略号および当該分野に
おける慣用略号で表示する場合があり、それらを例示す
ると次の通りである。アミノ酸残基に対する略号は、以
下の通りである。 Asp アスパラギン酸； Thr スレオニン； Se
r セリン；Glu グルタミン酸； Gly グリシ
ン； Ala アラニン；Val バリン；
Ile イソロイシン； Leu ロイシン；Phe フェ
ニルアラニン； Lys リジン； His ヒスチ
ジン；Arg アルギニン； Pro プロリン；
Tyr チロシン

【００１１】本発明において、精製ダニアレルゲンは前
記の〜の要件を満足する限り、単一の精製ダニアレ
ルゲンよりなるもの、また複数のダニアレルゲンよりな
るもの（すなわち、精製ダニアレルゲンの混合物の態
様）のいずれでもよい。

【００１２】以下、本発明の精製ダニアレルゲンについ
てより詳細に説明する。 ＬＭ−１ｂ画分の活性成分：本発明の精製ダニアレルゲ
ンとしては、例えば後述の実施例３で得られるＬＭ−１
ｂ画分の活性成分が挙げられるが、その性状は次のとお
りである。 （１）色および性状：白色（凍結乾燥物） （２）水溶性：易溶性 （３）分子量：セファデックスＧ５０ゲル濾過法により
約13,000である。 （４）組成成分：組成成分からの解析では、糖含量が約
13％を占める。

【００１３】本発明の精製ダニアレルゲンのアミノ酸組
成は、次の操作により得られる。即ち、0.2%サンプル溶
液２００μl を１２Ｎ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ₂ 置
換をした密封試験管内で、１１０℃で２４時間加水分解
する。乾固させた後、少量の水を加え再び乾固させると
いう操作を３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、こ
れをアミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液１mlに溶解
し、アミノ酸アナライザー（日立製作所）により定量す
る。ＬＭ−１ｂ画分の活性成分のアミノ酸組成は、次の
とおりである。 アミノ酸（計７．１μmol/mg) Asp 0.7 ； Thr 0.4 ； Ser 0.6 ； Glu 1.0 ； G
ly 0.8 ；Ala 0.7 ； Val 0.4 ； Ile 0.3 ； Leu
0.5 ； Phe 0.2 ；Lys 0.3 ； His 0.1 ； Arg
0.4 ； Pro 0.6 ； Tyr 0.1

【００１４】本発明の精製ダニアレルゲンの糖含量は、
全中性糖をGlucose を標準としてフェノール硫酸法で定
量した結果である。

【００１５】（５）アレルゲン活性を有する。ダニアレ
ルギー患者に対する皮内反応活性、HPLCを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験により判断する。 （６）アナフィラキシー反応を誘導しない。常法によ
り、モルモットを免疫し、追加免疫時に、アナフィラキ
シー反応について観察する。

【００１６】また、前記のＬＭ−１ｂ画分に相当する部
分をさらに分画した実施例３の（ｅ）で得られたＬＭ−
１ｂ−Ｉ〜ＬＭ−１ｂ−IV画分の活性成分も本発明の精
製ダニアレルゲンとして挙げられる。これらのＬＭ−１
ｂ−Ｉ〜ＬＭ−１ｂ−IV画分の活性成分の性状は、組成
成分を除いて前記のＬＭ−１ｂ画分の活性成分と同様で
ある。従って、以下に各活性成分の組成成分のみを示
す。

【００１７】ＬＭ−１ｂ−Ｉ画分の活性成分： アミノ酸（計５．４μmol/mg) 、糖含量は約３１．５％ アミノ酸の組成分析： Asp 0.6 ； Thr 0.3 ； Ser 0.4 ； Glu 0.8 ； G
ly 0.6 ；Ala 0.4 ； Val 0.3 ； Met 0.1 ； Ile
0.2 ； Leu 0.3 ；Tyr 0.1 ； Phe 0.1 ； His
0.3 ； Lys 0.3 ； Arg 0.2 ；Pro 0.4

【００１８】ＬＭ−１ｂ−II画分の活性成分： アミノ酸（計４．２μmol/mg) 、糖含量は約５０．９％ アミノ酸の組成分析： Asp 0.5 ； Thr 0.2 ； Ser 0.3 ； Glu 0.5 ； G
ly 0.5 ；Ala 0.4 ； Val 0.3 ； Met 0.2 ； Ile
0.2 ； Leu 0.3 ；Tyr 0.1 ； Phe 0.1 ； His
0.2 ； Lys 0.2 ； Arg 0.2 ；Pro 0.0

【００１９】ＬＭ−１ｂ−III 画分の活性成分： アミノ酸（計４．０μmol/mg) 、糖含量は約４５．７％ アミノ酸の組成分析： Asp 0.5 ； Thr 0.2 ； Ser 0.3 ； Glu 0.5 ； G
ly 0.4 ；Ala 0.4 ； Val 0.3 ； Met 0.2 ； Ile
0.2 ； Leu 0.2 ；Tyr 0.0 ； Phe 0.1 ； His
0.2 ； Lys 0.2 ； Arg 0.2 ；Pro 0.1

【００２０】ＬＭ−１ｂ−IV画分の活性成分： アミノ酸（計４．９μmol/mg) 、糖含量は約３７．７％ アミノ酸の組成分析： Asp 0.6 ； Thr 0.3 ； Ser 0.3 ； Glu 0.6 ； G
ly 0.5 ；Ala 0.4 ； Val 0.3 ； Met 0.1 ； Ile
0.3 ； Leu 0.4 ；Tyr 0.1 ； Phe 0.2 ； His
0.2 ； Lys 0.2 ； Arg 0.2 ；Pro 0.2

【００２１】本発明の精製ダニアレルゲンの製造方法と
しては、たとえば次のような方法が例示される。 ａ）粗ダニ排泄物抗原の調製 ダニ抗原の製造原料として、特に制限されるものではな
いが例えばコナヒョウヒダニまたはヤケヒョウヒダニの
いずれを用いてもよい。これらのダニをダニ培養培地で
培養し、これを抽出処理する。抽出処理は飽和食塩水お
よび／またはリン酸緩衝液を加えて攪拌し、室温で30分
間静置した後に、遠心分離(3000 rpm 、30分) を行い上
清をプールする。この際、抽出溶媒としては他に、中程
度イオン強度の緩衝液であればいずれを用いてもよい。
例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。上清表
面にダニ虫体が浮遊するのでこれを濾過して取り除く。
プールした上清を濾過およびイオン交換水に対して透析
したもの（粗ダニ排泄物抽出液）を出発材料とする。次
に、この粗ダニ排泄物抽出液を、例えば分子量１万カッ
トの限外濾過膜（UF-20CS-10PS) に通し、この膜を通過
しない高分子粗ダニ排泄物抗原と通過する低分子粗ダニ
排泄物抗原に分画する。

【００２２】ｂ）低分子粗ダニ排泄物抗原の精製 低分子粗ダニ排泄物抗原の精製は、(i) ダニ喘息患者
血清特異IgE 、IgG 、ウサギ抗ダニ排泄物抗血清、ウサ
ギ抗ダニ排泄物抗体、排泄物抗原に特異的なマウスモノ
クローナル抗体等との反応を酵素免疫測定法(ELISA) に
より測定することによる、各フラクションの抗原活性の
測定(Immunochemistry: 8, 871,(1971))、(ii) ウサギ
抗ダニ排泄物抗血清を用いたラジオイムノアッセイによ
る、各フラクションの抗原活性の測定、(iii) 皮内反
応活性による、各フラクションのアレルゲン活性の測
定、(iv) ダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離活
性による、各フラクションのアレルゲン活性の測定、等
のモニターの下に公知の精製法、例えばゲル濾過クロマ
トグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等を単独ま
たは組み合わせて精製することができる。

【００２３】例えば、具体的には低分子粗ダニ排泄物抗
原をセファデックスＧ５０（Pharmacia LKB Biotechnol
ogy AB) でゲル濾過する。その時の溶出パターンをダニ
喘息患者の白血球ヒスタミン遊離能、ELISA による患者
血清特異IgE およびウサギ抗ダニ排泄物血清に対する反
応性等によりモニターし、蛋白含量および２８０ｎｍ、
２１５ｎｍの吸収をガイドに画分に分ける。強い皮内反
応活性が認められる画分を、更にイオン交換クロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィー、デュアルモードク
ロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ等の精製手段を適宜組
み合わせることにより本発明の精製ダニアレルゲンであ
る活性成分を精製することができる。以上のようにして
得られる、精製活性成分の代表である、後述の実施例３
で得られるＬＭ−１ｂ画分の活性成分は、更にイオン交
換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、デュ
アルモードクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ等の精製
手段を適宜組み合わせることにより、数種の活性成分に
分画することができる。例えば、ＬＭ−１ｂ画分に相当
する部分をさらに逆相ＨＰＬＣにより分画することによ
り、後述の実施例で示されるようにＬＭ−１ｂ−Ｉ〜Ｌ
Ｍ−１ｂ−IV画分に分画することができる。

【００２４】本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレル
ギー疾患治療剤として適用することができ、例えば減感
作治療剤として有用である。ここでダニアレルギー疾患
とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレ
ルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原
が原因となるあらゆるアレルギー疾患をいう。

【００２５】前記の方法により精製された精製ダニアレ
ルゲンは、濃縮して溶液状又はシロップ状として採取す
るか、更に乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー疾
患に対する減感作治療剤として用いられる。この場合、
本発明の精製ダニアレルゲンは単独で、あるいは２種以
上を混合して用いられる。本減感作治療剤はそのまま
で、又は必要に応じて一般的に用いられるアジュバント
や各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、
乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を添加
した配合剤として用いることができる。

【００２６】本減感作治療剤は、通常の投与経路、例え
ば、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法に
より行うことができる。更に、例えばトローチ、舌下
錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ロ
ーション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することが
できる。本減感作治療剤の投与量及び投与回数は、投与
経路、症状等に応じて成人１回当たり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
また、本減感作治療剤はダニアレルギー疾患に対する治
療剤のみならず予防剤としても有用である。本減感作治
療剤は、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対し
て安全に用いることができる。

【００２７】本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレル
ギー疾患の診断薬として有用である。即ち、患者の血
液、及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分
を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、それぞれ精
製ダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレ
ルゲン刺激により好塩基球（白血球の一種）から遊離す
るヒスタミン量を測定する[ アレルギー：33,692,(198
4) ／アレルギー：33,733,(1984)]。この場合、本発明
の精製ダニアレルゲンは単独で、あるいは２種以上を混
合して用いられる。

【００２８】このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量
の50％量( 滴定曲線の変曲点) から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、 （i) 血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感受性
を直接測定することになる。 （ii）血液の滴定値は、通常、血球浮遊液の値より高い
値が得られる。これは血漿中にアレルゲン中和能を持つ
IgG 抗体（遮断抗体）が存在するためである。

【００２９】従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液
滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得ら
れる。感受性とこの遮断抗体価から表１のように、ダニ
アレルギーの正確な診断が可能となる。また、減感作治
療効果のモニターとしても有用である。

【００３０】

【表１】

【００３１】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 低分子粗ダニ排泄物抗原の調製：ラット、マウス、ハム
スター用飼料Ｍ（オリエンタル酵母社）中で、温度２６
±２℃、湿度７５％ＲＨの環境で、ダニ密度が２〜３万
匹／ｇ培地になるようにコナヒョウヒダニを飼育し、ダ
ニ培養培地１００ｇに対して、飽和食塩水を１リットル
加えてよく攪拌した。室温で３０分間静置した後、３０
００ｒｐｍ、３０分遠心分離を行った。この時、ダニ虫
体は上清表面に浮遊するので、これを濾過して取り除い
た。沈澱に再び飽和食塩水を加えて同じ操作を繰り返し
た。さらに沈澱に１０ｍＭリン酸緩衝液を１リットル加
えて飽和食塩水の場合と同じ操作を繰り返した（２
回）。得られた抽出液を水道水に対して一夜透析し、分
画分子量１万の限外濾過（膜はUF-20CS-10PS，東ソー)
により分子量１万以上とそれ以下に分画した。各分画を
濃縮し凍結乾燥して、それぞれ高分子粗ダニ排泄物抗原
および低分子粗ダニ排泄物抗原とした。ダニ培養培地
３．７ｋｇから、高分子粗ダニ排泄物抗原（ＨＭ）１２
７．０ｇ、低分子粗ダニ排泄物抗原（ＬＭ）６９．７ｇ
を得た。

【００３２】実施例２ 低分子粗ダニ排泄物抗原（ＬＭ）からのアレルゲン活性
画分の分画 実施例１で得られた低分子粗ダニ排泄物抗原（ＬＭ）５
００ｍｇ（濃度５００ｍｇ／３０ｍｌ ０．９％ＮａＣ
ｌ）をUltrogel AcA 54 カラム(IBF, サイズ 4.4×100
ｃｍ）に入れ、溶出液に０．９％ＮａＣｌを用いて、流
速１２０ｍｌ／時間でゲル濾過して分画した。各フラク
ションについて、抗原性を抗血清との応答で（図には示
されていない）、さらにアレルゲン活性をダニアレルギ
ー患者白血球に対するヒスタミン遊離試験で検定したと
ころ、図１のヒストグラムで示されるようにヒスタミン
遊離活性が大きく２つに分かれた。そこでフラクション
No. 27-31 とNo. 37-39 をアレルゲン活性成分を含む画
分として集め、それぞれをＬＭ−１画分、ＬＭ−２画分
とした。なお、図中のＢＤはボイドボリュームに相当し
ブルーデキストランの溶出位置を、ＢＳＡは牛血清アル
ブミンの溶出位置を、またＴＶはトータルボリュームで
Ｋ₂ ＣｒＯ₄ の溶出位置である。破線は２８０ｎｍの紫
外部吸収を示す。それぞれの画分の凍結乾燥後の収量
は、ＬＭ−１画分２３．４ｍｇ、ＬＭ−２画分７０．８
ｍｇであった。また、ダニアレルギー患者に対する皮内
反応試験も同時に検定したところ、どちらの画分にも強
いアレルゲン活性を認めた。

【００３３】実施例３ ＬＭ−１画分中の活性成分の精製 （ａ）ＬＭ−１画分のセファデックスＧ５０でのゲル濾
過クロマトグラフィー セファデックスＧ５０（Pharmacia LKB Biotechnology
AB) でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ＬＭ−１画
分を分画した。同時にオボアルブミンおよびチトクロー
ムＣを用いて、キャリブレーションを行い、ＬＭ−１画
分中の活性成分の分子量推定を行った。その結果を図２
に示す。ゲル濾過の条件は、サンプル量１０ｍｇ（濃度
１０ｍｇ／３ｍｌ）、溶離液０．９％ＮａＣｌ、流速３
０ｍｌ／時間、カラムサイズ 1.5×100 ｃｍである。各
フラクションを、抗血清の応答とともに、白血球ヒスタ
ミン遊離活性でモニターした。図中、ヒストグラムは白
血球ヒスタミン遊離活性を、ＯＶＡは分子量 45,000の
オボアルブミンの溶出位置を、また Cyt. C は分子量 1
3,500 のチトクロームＣの溶出位置を示す。各成分のピ
ークの溶出位置までの体積とそれぞれの分子量の片対数
とのプロットから、ＬＭ−１画分中の白血球ヒスタミン
遊離活性を示す成分の分子量は、約 13,000 であると推
定された。ここで、図中に矢印で示した画分（フラクシ
ョンNo. 13-16 ）をプールし、ＬＭ−１活性画分とし、
凍結乾燥を行った。その収量は３ｍｇであった。

【００３４】（ｂ）ＬＭ−１活性画分のイオン交換クロ
マトグラフィー （ａ）で得たＬＭ−１活性画分１０ｍｇ（濃度１０ｍｇ
／０．１ｍｌ）を HPLC カラム DEAE GM（栗田工業、サ
イズ0.78×10ｃｍ）でイオン交換クロマトグラフィーを
行い分画した。溶離液に２０ｍＭ Tris-HCｌ緩衝液 (ｐ
Ｈ8.0)を用い、サンプルを注入して１０分後から、Ｎａ
Ｃｌの５００ｍＭ／４０分の直線グラジエントにより、
流速１ｍｌ／分で溶出を行った。その結果を図３に示
す。ここで、ヒストグラムは白血球ヒスタミン遊離活性
を、実線は２１５ｎｍの紫外部吸収を、さらに破線はＮ
ａＣｌの濃度を示す。図中、ヒストグラムからわかるよ
うに、ヒスタミン遊離活性は、フラクションNo. 19-20
の約２５０ｍＭ ＮａＣｌに相当するところにのみ溶出
した。ＬＭ−１活性画分として、この酸性フラクション
を集め、透析後凍結乾燥し、活性画分２ｍｇを得た。

【００３５】（ｃ）ＬＭ−１活性画分の逆相ＨＰＬＣ （ｂ）で得たＬＭ−１活性画分１０ｍｇ（濃度１０ｍｇ
／0.1 ｍｌ）を、TSKgel ODS-120T （東ソー、サイズ0.
46×25ｃｍ) でさらに逆相ＨＰＬＣを行い分画した。即
ち、溶離液に３０％メタノール＋０．１％トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）を用い、サンプルを注入して、メタノー
ルの１％／分の直線グラジエントにより、流速１ｍｌ／
分で溶出を行った。その結果を図４に示す。ここで、ヒ
ストグラムは白血球ヒスタミン遊離活性を、実線は２１
５ｎｍの紫外部吸収を、さらに破線はメタノールの濃度
（％）を示す。図中、ヒストグラムからわかるように、
弱いヒスタミン遊離活性がフラクションNo. 13−15（Ｌ
Ｍ−１ａ画分）に、また、強いヒスタミン遊離活性はフ
ラクションNo. 20−30に溶出した。この後者のフラクシ
ョンをＬＭ−１ｂ画分として集め、透析後凍結乾燥し
０．５ｍｇを得た。このＬＭ−１ｂ画分を用いて、ダニ
アレルギー患者に対する皮内反応試験も同時に検定した
ところ、強いアレルゲン活性を認めた。

【００３６】（ｄ）ＬＭ−１活性画分の逆相ＨＰＬＣ （ｂ）で得られたＬＭ−１活性画分１０ｍｇ（濃度１０
ｍｇ／0.1 ｍｌ）を、TSKgel ODS-120T （東ソー、サイ
ズ０．４６×２５ｃｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣを（ｃ）
とは溶離液の条件を変えて再度行い、前記のＬＭ−１ｂ
画分に相当する部分についてさらに分画した。即ち、溶
離液に５０％メタノール＋０．１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）を用い、サンプルを注入して、メタノールの
１％／分の直線グラジエントにより、流速１ｍｌ／分で
溶出を行い、２１５ｎｍの紫外部吸収をもとに、ＬＭ−
１ｂ画分に相当する部分をＩ〜IVの画分に分画し、透析
後に凍結乾燥した。その結果を図５に示す。ここで、実
線は２１５ｎｍの紫外部吸収を、さらに破線はメタノー
ルの濃度（％）を示す。このＬＭ−１ｂ画分に相当する
部分のＩ〜IV画分を以下、各々ＬＭ−１ｂ−Ｉ、ＬＭ−
１ｂ−II、ＬＭ−１ｂ−III およびＬＭ−１ｂ−IV画分
と呼ぶ。

【００３７】ＬＭ−１ｂ−Ｉ、ＬＭ−１ｂ−II、ＬＭ−
１ｂ−III およびＬＭ−１ｂ−IV画分を用いて、ダニア
レルギー患者に対する皮内反応試験を行ったところ、強
いアレルゲン活性を認めた。その結果を表２に示す。

【００３８】

【表２】

【００３９】（ｅ）ＬＭ−１ｂ−Ｉ〜ＬＭ−１ｂ−IV画
分の逆相ＨＰＬＣ （ｄ）で得られたＬＭ−１ｂ−Ｉ、II、III およびIV画
分のそれぞれについて、TSKgel ODS-120T （東ソー、サ
イズ０．４６×２５ｃｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣを行い
さらに分画した。即ち、各画分について、溶離液に６０
％メタノール＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を
用い、サンプルを注入して、メタノールの１％／分の直
線グラジエントにより、流速１ｍｌ／分で溶出を行っ
た。その結果を図６〜９に示すが、２１５ｎｍの紫外部
吸収をもとに、ＬＭ−１ｂ−Ｉ（図６）、II（図７）、
III（図８）およびIV（図９）画分のピーク部分を活性
成分（各図中に矢印で示した画分）として分取し、それ
ぞれ０．７、０．２、０．２、０．１ｍｇが得られた。
各図において、実線は２１５ｎｍの紫外部吸収を、さら
に破線はメタノールの濃度（％）を示す。これらの画分
中の活性成分を用いてダニアレルギー患者に対する白血
球ヒスタミン遊離試験を行った。その結果を図１０に示
すが、各画分において強いアレルゲン活性が認められ
た。

【００４０】実施例４ ＬＭ−１ｂ画分の活性成分の性状 実施例３の（ｃ）で得られたＬＭ−１ｂ画分の活性成分
のアミノ酸分析、およびフェノール硫酸法による糖分析
を行ったところ、アミノ酸８７μｇ、グルコース換算で
１３μｇの中性糖（即ち、糖含量として約13％）が検出
された。アミノ酸の組成分析の結果は以下の通りであっ
た。 Asp 0.7 ； Thr 0.4 ； Ser 0.6 ； Glu 1.0 ； G
ly 0.8 ；Ala 0.7 ； Val 0.4 ； Ile 0.3 ； Leu
0.5 ； Phe 0.2 ；Lys 0.3 ； His 0.1 ； Arg
0.4 ； Pro 0.6 ； Tyr 0.1 また、このＬＭ−１ｂ画分の活性成分の色および性状は
白色（凍結乾燥物）であり、水には易溶性のものであっ
た。また、モルモットを用いたアナフィラキシー反応試
験では、アナフィラキシー反応を誘導しないものであ
る。

【００４１】実施例５ ＬＭ−１ｂ−Ｉ〜ＬＭ−１ｂ−IV画分の活性成分の性状 実施例３の（ｅ）で得られたＬＭ−１ｂ−Ｉ、ＬＭ−１
ｂ−II、ＬＭ−１ｂ−III およびＬＭ−１ｂ−IV画分の
活性成分のアミノ酸分析、およびフェノール硫酸法によ
る糖分析を実施例４と同様にして行った。その結果を以
下に示す。

【００４２】 （１）ＬＭ−１ｂ−Ｉ画分の活性成分の性状 アミノ酸５．４μｍｏｌ／ｍｇ、糖含量として約３１．
５％が検出された。アミノ酸の組成分析の結果は以下の
通りであった。 Asp 0.6 ； Thr 0.3 ； Ser 0.4 ； Glu 0.8 ； G
ly 0.6 ；Ala 0.4 ； Val 0.3 ； Met 0.1 ； Ile
0.2 ； Leu 0.3 ；Tyr 0.1 ； Phe 0.1 ； His
0.3 ； Lys 0.3 ； Arg 0.2 ；Pro 0.4 また、このＬＭ−１ｂ−Ｉ画分の活性成分の色および性
状は白色（凍結乾燥物）であり、水には易溶性のもので
あった。また、モルモットを用いたアナフィラキシー反
応試験では、アナフィラキシー反応を誘導しないもので
ある。

【００４３】 （２）ＬＭ−１ｂ−II画分の活性成分の性状 アミノ酸４．２μｍｏｌ／ｍｇ、糖含量として約５０．
９％が検出された。アミノ酸の組成分析の結果は以下の
通りであった。 Asp 0.5 ； Thr 0.2 ； Ser 0.3 ； Glu 0.5 ； G
ly 0.5 ；Ala 0.4 ； Val 0.3 ； Met 0.2 ； Ile
0.2 ； Leu 0.3 ；Tyr 0.1 ； Phe 0.1 ； His
0.2 ； Lys 0.2 ； Arg 0.2 ；Pro 0.0 また、このＬＭ−１ｂ−II画分の活性成分の色および性
状は白色（凍結乾燥物）であり、水には易溶性のもので
あった。また、モルモットを用いたアナフィラキシー反
応試験では、アナフィラキシー反応を誘導しないもので
ある。

【００４４】 （３）ＬＭ−１ｂ−III 画分の活性成分の性状 アミノ酸４．０μｍｏｌ／ｍｇ、糖含量として約４５．
７％が検出された。アミノ酸の組成分析の結果は以下の
通りであった。 Asp 0.5 ； Thr 0.2 ； Ser 0.3 ； Glu 0.5 ； G
ly 0.4 ；Ala 0.4 ； Val 0.3 ； Met 0.2 ； Ile
0.2 ； Leu 0.2 ；Tyr 0.0 ； Phe 0.1 ； His
0.2 ； Lys 0.2 ； Arg 0.2 ；Pro 0.1 また、このＬＭ−１ｂ−III 画分の活性成分の色および
性状は白色（凍結乾燥物）であり、水には易溶性のもの
であった。また、モルモットを用いたアナフィラキシー
反応試験では、アナフィラキシー反応を誘導しないもの
である。

【００４５】 （４）ＬＭ−１ｂ−IV画分の活性成分の性状 アミノ酸４．９μｍｏｌ／ｍｇ、糖含量として約３７．
７％が検出された。アミノ酸の組成分析の結果は以下の
通りであった。 Asp 0.6 ； Thr 0.3 ； Ser 0.3 ； Glu 0.6 ； G
ly 0.5 ；Ala 0.4 ； Val 0.3 ； Met 0.1 ； Ile
0.3 ； Leu 0.4 ；Tyr 0.1 ； Phe 0.2 ； His
0.2 ； Lys 0.2 ； Arg 0.2 ；Pro 0.2 また、このＬＭ−１ｂ−IV画分の活性成分の色および性
状は白色（凍結乾燥物）であり、水には易溶性のもので
あった。また、モルモットを用いたアナフィラキシー反
応試験では、アナフィラキシー反応を誘導しないもので
ある。

【００４６】実施例６ 減感作治療用抗原製剤の調製 0.5 ％フェノールを添加した 0.9％食塩水を溶媒とし、
実施例３の（ｃ）で得られたＬＭ−１ｂ画分の活性成分
を１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治療用抗原の原
液とする。

【００４７】実施例７ 減感作治療用抗原製剤の調製 0.5 ％フェノールを添加した 0.9％食塩水を溶媒とし、
実施例３の（ｅ）で得られたＬＭ−１ｂ−Ｉ〜ＬＭ−１
ｂ−IV画分の活性成分を単独で又は２種以上を混合して
１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治療用抗原の原液
とする。

【００４８】実施例８ ダニアレルギー診断用滴定試薬の調製 ハンクス緩衝液を溶媒とし、実施例３の（ｃ）で得られ
たＬＭ−１ｂ画分の活性成分を１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶
解し、ヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とする。

【００４９】実施例９ ダニアレルギー診断用滴定試薬の調製 ハンクス緩衝液を溶媒とし、実施例３の（ｅ）で得られ
たＬＭ−１ｂ−Ｉ〜ＬＭ−１ｂ−IV画分の活性成分を単
独で又は２種以上を混合して１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解
し、ヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とする。

【００５０】

【発明の効果】本発明の精製ダニアレルゲンは有効性お
よび安全性の観点から有用な減感作治療用抗原であり、
ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤・予防剤とし
て有用である。また、本減感作治療剤はアナフィラキシ
ー誘発作用もなく、人体に対して安全に用いることがで
き、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断におい
て、またダニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重
要であり、診断システムの確立が期待されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例２においてＬＭをゲル濾過して
得た各フラクションについて、アレルゲン活性をダニア
レルギー患者白血球に対するヒスタミン遊離試験で検定
した結果を示す。ここで図中のＢＤはボイドボリューム
に相当しブルーデキストランの溶出位置を、ＢＳＡは牛
血清アルブミンの溶出位置を、またＴＶはトータルボリ
ュームでＫ₂ ＣｒＯ₄ の溶出位置を示す。破線は２８０
ｎｍの紫外部吸収を示す。

【図２】図２は実施例３においてＬＭ−１画分をオボア
ルブミンおよびチトクロームＣと共にセファデックスＧ
５０でのゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ＬＭ−１
ｂ画分中の活性成分の分子量推定を行った図である。こ
こで図中のヒストグラムは白血球ヒスタミン遊離活性
を、ＯＶＡは分子量 45,000 のオボアルブミンの溶出位
置を、また Cyt. C は分子量 13,500 のチトクロームＣ
の溶出位置を示す。

【図３】図３は実施例３において（ａ）で得られたＬＭ
−１活性画分１０ｍｇを、 HPLC カラム DEAE GMでイオ
ン交換クロマトグラフィーを行い分画した結果を示す図
である。

【図４】図４は実施例３において（ｂ）で得られたＬＭ
−１活性画分１０ｍｇを、TSKgel ODS-120T で逆相ＨＰ
ＬＣを行い分画した結果を示す図である。

【図５】図５は実施例３において（ｂ）で得られたＬＭ
−１活性画分１０ｍｇを、TSKgel ODS-120T で逆相ＨＰ
ＬＣを行い分画した結果を示す図である。

【図６】図６は実施例３において（ｄ）で得られたＬＭ
−１ｂ−Ｉ画分を、TSKgel ODS-120T で逆相ＨＰＬＣを
行い分画した結果を示す図である。

【図７】図７は実施例３において（ｄ）で得られたＬＭ
−１ｂ−II画分を、TSKgel ODS-120T で逆相ＨＰＬＣを
行い分画した結果を示す図である。

【図８】図８は実施例３において（ｄ）で得られたＬＭ
−１ｂ−III 画分を、TSKgel ODS-120T で逆相ＨＰＬＣ
を行い分画した結果を示す図である。

【図９】図９は実施例３において（ｄ）で得られたＬＭ
−１ｂ−IV画分を、TSKgel ODS-120T で逆相ＨＰＬＣを
行い分画した結果を示す図である。

【図１０】図１０は実施例３において（ｄ）で得られた
ＬＭ−１ｂ−Ｉ、ＬＭ−１ｂ−II、ＬＭ−１ｂ−III お
よびＬＭ−１ｂ−IV画分を用いて、ダニアレルギー患者
に対する白血球ヒスタミン遊離試験を行った結果を示し
た図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 和田 武志 広島県佐伯郡大野町908番地334号 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 1/00 - 14/825 ＪＩＣＳＴ（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有する精製ダニアレルゲン。コナヒョウヒ ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、分
   画分子量 10,000 の限外濾過膜を通過する成分である。 約１３％の糖質を含む糖蛋白である。 分子量（セファデックスＧ５０ゲル濾過法）: 約13,0
   00 アレルゲン活性を有する。
2. 【請求項２】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有する精製ダニアレルゲン。コナヒョウヒ ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、分
   画分子量 10,000 の限外濾過膜を通過する成分である。 約３２、３８、４６、又は５１％の糖質を含む糖蛋白
   である。 分子量（セファデックスＧ５０ゲル濾過法）: 約13,0
   00 アレルゲン活性を有する。
3. 【請求項３】 コナヒョウヒダニ培養中の排泄物を飽和
   食塩水および／または中程度イオン強度の緩衝液により
   抽出処理し、得られた抽出液を分画することを特徴とす
   る請求項１又は２記載の精製ダニアレルゲンの製造方
   法。
4. 【請求項４】 請求項１又は２記載の精製ダニアレルゲ
   ンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。