JPH07133229A - ダニアレルゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ダニ虫体の抽出液から分離精製された分子量
（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約１４，００
０から約１００，０００の糖蛋白質である７種のダニア
レルゲン、これらのダニアレルゲンの製造方法並びにこ
れらのダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー
疾患治療剤及びダニアレルギー疾患診断薬。さらに、本
発明のダニアレルゲンに対する抗血清を提供することに
ある。 【効果】本発明のダニアレルゲンは有効性および安全性
の観点から有用な減感作治療用抗原であり、ダニアレル
ギー疾患に対する減感作治療剤・予防剤として有用であ
る。また、本発明のダニアレルゲンは、ダニアレルギー
疾患の迅速かつ正確な診断において有用である。更に、
本発明のダニアレルゲンを哺乳動物に免疫することによ
り、抗血清を調製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアレルゲン活性を有する
ダニアレルゲンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療法としては、アレルギーの原
因物質であるアレルゲンを投与して減感作する減感作療
法が、最も重要な根本療法とされ、特に花粉症を始め昆
虫アレルギー等、抗原が特定され易い疾患においては、
その評価は今や確立されたものといえる。しかしなが
ら、この減感作療法ではアレルゲンによるアナフィラキ
シーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与が必要と
される。

【０００３】ダニアレルギー疾患については、屋内塵中
のダニアレルゲンとして、ヤケヒョウヒダニ（Dermatop
hagoides pteronyssinus）及びコナヒョウヒダニ（Derm
atophagoides farinae）の２種が重要であると報告され
ている[ J. Allergy : 42,14-28,(1968)] 。従来、主要
ダニアレルゲンとしては、ダニ排泄物、ダニ虫体中に含
有されている分子量24〜28kDの糖蛋白質（pI 4.6〜7.2)
および分子量14.5〜20kDの蛋白質（pI 5〜8.3)等が報告
されている[J. Immunol. : 125,587-592,(1980）／ J.
Allergy Clin. Immunol. : 76,753-761,(1985)／ Immun
ology : 46,679-687,(1982）／ Int. Arch. Allergy Ap
pl. Immunol. : 81,214-223,(1986)／ J. Allergy Cli
n. Immunol. : 75,686-692,(1985)等] 。

【０００４】一方、本発明者らは、前記の主要ダニアレ
ルゲンよりも高分子量の画分及び低分子量の画分に、ダ
ニ喘息患者血清IgG に特異的反応性を示し、ダニ喘息患
者の白血球ヒスタミン遊離を誘発する成分が存在するこ
とを報告した（日本農芸化学会，62:411, 1988）。しか
し、一部を除き、減感作治療用抗原として用いることが
できる程度までの精製は、未だなされていなかった。

【０００５】ダニアレルギー疾患の診断方法としては、
従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物
またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験を併用する
のが殆どであり、まれにRAST法による血清中のIgE 抗体
価の測定値（相対値）をも併用する程度であって、ダニ
アレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難であ
った。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来、屋内塵性ダニを
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト) 抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、また多種類の不
純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるため
に投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いのが
現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が期待されている。
また、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断は、ダ
ニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重要であり、
診断システムの確立が期待されている。

【０００７】本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダ
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬として極めて有用な
新規なダニアレルゲンを提供することにある。即ち、本
発明の目的は、ダニ虫体から抽出しうる、アレルゲン活
性を有する新規なダニアレルゲンおよび当該新規なダニ
アレルゲンの製造方法を提供すること、並びに新規なダ
ニアレルギー疾患治療剤および新規なダニアレルギー疾
患診断薬を提供することにある。さらに、本発明のダニ
アレルゲンに対する抗血清を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ダニアレ
ルギー疾患の治療剤、診断薬を開発することを目的とし
て、コナヒョウヒダニ虫体の抽出液中のアレルゲンにつ
いて鋭意研究を重ねた。その結果、ディスクプレパラテ
ィブＳＤＳ−ＰＡＧＥとダニアレルギー患者血清中のＩ
ｇＥを用いる免疫染色法とを組合せて分画することによ
り、各種の画分に含まれる糖蛋白質に強いアレルゲン活
性を見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明の要旨は、下記の理化学的性
質および生物学的性質を有する７種類のダニアレルゲ
ン、即ちＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ
−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−ＦおよびＤｆｂ−Ｇに関す
るものである。

【００１０】（１）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａの理化学
的性質および生物学的性質は、ダニ虫体の抽出液に含
まれる、約１０％の糖質を含む糖蛋白質である、分
子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約１４，
０００であり、そしてアレルゲン活性を有する。

【００１１】（２）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｂの理化学
的性質および生物学的性質は、ダニ虫体の抽出液に含
まれる、約１３％の糖質を含む糖蛋白質である、分
子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約２３，
０００であり、そしてアレルゲン活性を有する。

【００１２】（３）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｃの理化学
的性質および生物学的性質は、ダニ虫体の抽出液に含
まれる、約１０％の糖質を含む糖蛋白質である、分
子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約３０，
０００であり、そしてアレルゲン活性を有する。

【００１３】（４）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｄの理化学
的性質および生物学的性質は、ダニ虫体の抽出液に含
まれる、約１５％の糖質を含む糖蛋白質である、分
子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約４０，
０００であり、そしてアレルゲン活性を有する。

【００１４】（５）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｅの理化学
的性質および生物学的性質は、ダニ虫体の抽出液に含
まれる、約６％の糖質を含む糖蛋白質である、分子
量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約６５，０
００であり、そしてアレルゲン活性を有する。

【００１５】（６）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｆの理化学
的性質および生物学的性質は、ダニ虫体の抽出液に含
まれる、約３３％の糖質を含む糖蛋白質である、分
子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約８７，
０００であり、そしてアレルゲン活性を有する。

【００１６】（７）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｆの理化学
的性質および生物学的性質は、ダニ虫体の抽出液に含
まれる、約２６％の糖質を含む糖蛋白質である、分
子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約１０
０，０００であり、そしてアレルゲン活性を有する。

【００１７】また、本発明は、ダニ虫体を磨砕した後、
飽和食塩水および／または中程度イオン強度の緩衝液に
より抽出処理し、得られた抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびダニアレルギー患者血清ＩｇＥを用いる免疫染色法
を組合せて分画することを特徴とする前記のダニアレル
ゲンの製造方法を提供する。

【００１８】また、本発明は前記のダニアレルゲンを有
効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、ダニアレルギ
ー疾患診断薬を提供する。さらに、本発明は前記のダニ
アレルゲンに対する抗血清を提供する。

【００１９】本発明において、各ダニアレルゲンは、そ
れぞれ前記の〜の要件を満足する限り、単一のダニ
アレルゲンよりなるもの、また複数のダニアレルゲンよ
りなるもの（すなわち、ダニアレルゲンの混合物の態
様）のいずれでもよい。

【００２０】以下、本発明のダニアレルゲンについてよ
り詳細に説明する。即ち、本発明のダニアレルゲンの性
状は、次のとおりである。 （１）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ 色および性状：白色（凍結乾燥物） 水溶性：易溶性 分子量：１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約
１４，０００である。 組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であっ
て、糖含量が約１０％を占める。またアミノ酸組成は表
４に記載のとおりである。 アレルゲン活性を有する。 アナフィラキシー反応を誘発しない。

【００２１】（２）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｂ 色および性状：白色（凍結乾燥物） 水溶性：易溶性 分子量：１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約
２３，０００である。 組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であっ
て、糖含量が約１３％を占める。またアミノ酸組成は表
４に記載のとおりである。 アレルゲン活性を有する。 アナフィラキシー反応を誘発しない。

【００２２】（３）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｃ 色および性状：白色（凍結乾燥物） 水溶性：易溶性 分子量：１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約
３０，０００である。 組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であっ
て、糖含量が約１０％を占める。またアミノ酸組成は表
４に記載のとおりである。 アレルゲン活性を有する。 アナフィラキシー反応を誘発しない。

【００２３】（４）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｄ 色および性状：白色（凍結乾燥物） 水溶性：易溶性 分子量：１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約
４０，０００である。 組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であっ
て、糖含量が約１５％を占める。またアミノ酸組成は表
４に記載のとおりである。 アレルゲン活性を有する。 アナフィラキシー反応を誘発しない。

【００２４】（５）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｅ 色および性状：白色（凍結乾燥物） 水溶性：易溶性 分子量：１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約
６５，０００である。 組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であっ
て、糖含量が約６％を占める。またアミノ酸組成は表４
に記載のとおりである。 アレルゲン活性を有する。 アナフィラキシー反応を誘発しない。

【００２５】（６）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｆ 色および性状：白色（凍結乾燥物） 水溶性：易溶性 分子量：１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約
８７，０００である。 組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であっ
て、糖含量が約３３％を占める。またアミノ酸組成は表
４に記載のとおりである。 アレルゲン活性を有する。 アナフィラキシー反応を誘発しない。

【００２６】（７）ダニアレルゲンＤｆｂ−Ｇ 色および性状：白色（凍結乾燥物） 水溶性：易溶性 分子量：１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約
１００，０００である。 組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であっ
て、糖含量が約２６％を占める。またアミノ酸組成は表
４に記載のとおりである。 アレルゲン活性を有する。 アナフィラキシー反応を誘発しない。

【００２７】本発明のダニアレルゲンのアミノ酸組成は
すべて、次の操作により得られる。即ち、0.１％サンプ
ル溶液２００μl を１２Ｎ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ
₂ 置換をした密封試験管内で、１１０℃で２４時間加水
分解する。乾固させた後、少量の水を加え再び乾固させ
るという操作を３回繰り返すことによって脱塩酸を行
い、これをアミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液１ml
に溶解し、アミノ酸アナライザー（高速液体クロマトグ
ラフ；（株）日立製作所製）により定量する。

【００２８】本発明のダニアレルゲンの糖含量は、全中
性糖をGlucose を標準としてフェノール硫酸法で定量し
た結果である。

【００２９】アレルゲン活性については、ダニアレルギ
ー患者に対する皮内反応活性、ＨＰＬＣを用いた患者白
血球ヒスタミン遊離試験、ドットブロットテスト等によ
り判断する。

【００３０】アナフィラキシー反応については、常法に
より、モルモットを免疫し、追加免疫時のアナフィラキ
シー反応について観察する。

【００３１】本発明のダニアレルゲンの製造方法として
は、たとえば次のような方法が例示される。 ａ）粗ダニ虫体抗原の調製 ダニ抗原の製造原料として、特に制限されるものではな
いが例えばコナヒョウヒダニまたはヤケヒョウヒダニの
いずれを用いてもよい。これらのダニをダニ培養培地で
培養し、これを抽出処理する。抽出処理は飽和食塩水を
加えて攪拌し、室温で１時間穏やかに攪拌した後に、遠
心分離(3000 rpm 、30分) を行い上清をプールする。プ
ールした上清に浮遊するダニ虫体をろ過して集める。こ
のダニ虫体を溶媒と共に磨砕後、遠心分離し、その上清
を透析、凍結乾燥してダニ虫体粗抗原（出発原料）とす
る。この際、抽出溶媒としてはリン酸緩衝液の他に、中
程度イオン強度の緩衝液であればいずれを用いてもよ
い。例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。

【００３２】ｂ）粗ダニ虫体抗原の精製 粗ダニ虫体抗原の精製は、(i) ダニ喘息患者血清特異
ＩｇＥを用いる免疫染色法、(ii) ダニ喘息患者血清特
異IgE 、IgG 、ウサギ抗ダニ虫体血清等との反応を酵素
免疫測定法(ELISA) により測定することによる、各フラ
クションの抗原活性の測定(Immunochemistry, 8, 871
(1971))、(iii)ウサギ抗ダニ虫体血清を用いたラジオイ
ムノアッセイによる、各フラクションの抗原活性の測
定、(iv) 皮内反応活性による、各フラクションのア
レルゲン活性の測定、(v) ダニアレルギー患者白血球
ヒスタミン遊離活性による、各フラクションのアレルゲ
ン活性の測定、等のモニターの下に公知の精製法、例え
ばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、焦点電気泳動法、ゲル電
気泳動法等を単独または組み合わせて精製することがで
きる。例えば、次のような方法が例示される。

【００３３】粗ダニ虫体抗原を、ディスクプレパラティ
ブＳＤＳ−ＰＡＧＥ（日本エイドー（株）製) で種々の
バンドに分離する。得られた各バンドに対してダニ喘息
患者血清特異ＩｇＥを用いる免疫染色法により染色を行
い、高頻度に染色されるバンドより抗原成分の分離を行
う。例えばゲルからの目的の抗原成分の抽出は、0.1％S
DS 溶液を用いて振盪拡散法と電気溶出法で行い、更に
抽出に用いた SDSをイオン交換樹脂 AG11A8 (Bio Rad
社) に通して吸着除去し、抗原活性成分を精製すること
ができる。本発明においては、このようにして例えば実
施例で示すようなダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−
Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−
Ｆ、Ｄｆｂ−Ｇが得られる。

【００３４】このようにして抗原活性成分は、必要に応
じて更にゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー、デュアルモードクロマトグラフ
ィー、逆相ＨＰＬＣ等の精製手段を適宜組み合わせるこ
とによりダニアレルゲンである活性成分をさらに精製す
ることができる。この場合、溶出液の分画は、ＥＬＩＳ
Ａ法、蛋白質量、糖含有量等を指標として行う。

【００３５】本発明のダニアレルゲンはダニアレルギー
疾患治療剤として適用することができ、例えば減感作治
療剤として有用である。ここでダニアレルギー疾患と
は、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレル
ギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が
原因となるあらゆるアレルギー疾患をいう。

【００３６】前記の方法により得られたダニアレルゲン
は、濃縮して溶液状又はシロップ状として採取するか、
更に乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー疾患に対
する減感作治療剤として用いられる。本減感作治療剤は
そのままで、又は必要に応じて一般的に用いられるアジ
ュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解
補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤
等を添加した配合剤として用いることができる。

【００３７】本減感作治療剤は、通常の投与経路、例え
ば、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法に
より行うことができる。更に、例えばトローチ、舌下
錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ロ
ーション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することが
できる。本減感作治療剤の投与量及び投与回数は、投与
経路、症状等に応じて成人１回当たり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
また、本減感作治療剤はダニアレルギー疾患に対する治
療剤のみならず予防剤としても有用である。本減感作治
療剤は、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対し
て安全に用いることができる。

【００３８】本発明のダニアレルゲンはダニアレルギー
疾患の診断薬として有用である。即ち、患者の血液、及
びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝
液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、それぞれダニアレ
ルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激
により好塩基球（白血球の一種）から遊離するヒスタミ
ン量を測定する[ アレルギー：33,692,(1984) ／アレル
ギー：33,733,(1984)]。

【００３９】このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量
の50％量( 滴定曲線の変曲点) から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、 （i) 血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感受性
を直接測定することになる。 （ii）血液の滴定値は、通常、血球浮遊液の値より高い
値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能を持
つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためである。

【００４０】従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液
滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得ら
れる。感受性とこの遮断抗体価から表１のように、ダニ
アレルギーの正確な診断が可能となる。また、減感作治
療効果のモニターとしても有用である。

【００４１】

【表１】

【００４２】更に、本発明のダニアレルゲンをウサギ、
ラット等の哺乳動物に免疫することにより、抗血清を調
製することができる。こうして得られる抗血清はダニ虫
体のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡをλｇｔ１１等に連
結することにより作製されたｃＤＮＡライブラリーの免
疫スクリーニングに使用することが可能である。この免
疫スクリーニングにより得られた陽性クローンをクロー
ニングすることにより、新規な組み換えダニアレルゲン
を得ることが可能である。

【００４３】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例により何等限定される
ものではない。なお、以下の実施例において使用される
各種分析方法については、一部を除き、実施例１４の末
尾にまとめて記述する。

【００４４】実施例１ 粗ダニ虫体抗原の調製：ラット、マウス、ハムスター用
飼料Ｍ（オリエンタル酵母社）中で、温度２６±２℃、
湿度７５％ＲＨの環境で、ダニ密度が２〜３万匹／ｇ培
地になるようにコナヒョウヒダニを飼育し、凍結殺菌済
のダニ培養物（１Ｋｇ）に、質量換算で１０倍量の飽和
食塩水を加えて室温で１時間穏やかに攪拌した後、３０
００ｒｐｍ、３０分遠心分離を行った。この時、ダニ虫
体は上清表面に浮遊するので、これを吸引濾過により回
収した。得られたダニ虫体（１１１ｇ）に質量換算で１
／２のＰＢＳを加え、乳鉢でよく磨り潰した。この磨砕
物に最終的にもとのダニ虫体の２倍量になるようにＰＢ
Ｓを加え、攪拌しながら１時間抽出した。この懸濁液を
４℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を蒸
留水に対して透析した後、不純物を除くために更に４
℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を凍結
乾燥したダニ虫体粗抗原（Ｄｆｂ）９４７ｍｇを得た。

【００４５】実施例２ ダニ虫体粗抗原（Ｄｆｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
画とアレルゲン成分の検出：以下の条件によりダニ虫体
粗抗原（Ｄｆｂ）をディスクプレパラティブＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（日本エイドー（株）製) で分画した。 （分離ゲル組成）１２．５％ゲル 30％アクリルアミド、0.8 ％ N,N'- メチレンビス １２．５ｍｌ １．５Ｍ トリス-HCl(pH8.8) ７．５ｍｌ １０％ ＳＤＳ ０．３ｍｌ Ｈ₂ Ｏ ８．７ｍｌ １．５％ アンモニウムパーサルフェート １．０ｍｌ ＴＥＭＥＤ １５．０μｌ （濃縮ゲル組成） 30％アクリルアミド、1.5 ％ N,N'- メチレンビス １．８ｍｌ １．５Ｍ トリス-HCl(pH6.8) ４．５ｍｌ １０％ ＳＤＳ ０．１８ｍｌ Ｈ₂ Ｏ １０．８ｍｌ １．５％ アンモニウムパーサルフェート ０．６７５ｍｌ ＴＥＭＥＤ １０．０μｌ （泳動バッファー）pH8.3 ２５ｍＭ トリス １９２ｍＭ グリシン ０．１％ ＳＤＳ （試料液） サンプル(Dfb) １５０ｍｇ−２００ｍｇ ６２．５ｍＭ トリス-HCl(pH6.8) ２％ ＳＤＳ ２−メルカプトエタノール ５．０μｌ （泳動条件）１００Ｖ，４℃ この結果、Ｄｆｂは分子量の異なる１７画分に分画され
た。

【００４６】実施例３ 実施例２で得られた１７画分をドットスポットテストに
より３０人のダニアレルギー患者血清ＩｇＥとの反応性
を検討し、どの画分にアレルゲン成分が含まれるかを検
討した。即ち、各画分の０．００１％、０．０１％また
は０．１％溶液の各１μｌをニトロセルロースフィルム
（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ ニトロセルロース、０．４μ、ア
マシャム社製）にブロットし、５％スキムミルク、０．
２％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０２％アジ化ナトリウム
を含むＰＢＳ溶液に室温で１時間浸漬した。ついで、Ｉ
ｇＧ染色のために、ダニアレルギー患者のプール血清の
１００倍スキムミルク希釈液をシート上に注ぎ、冷所で
一夜インキュベートした。ＩｇＥ染色のためには、同血
清の１０倍希釈液を用いた。

【００４７】このシートを０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０
を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で完全に洗浄したのち、ホー
スラディッシュペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒト
ＩｇＧ抗体を含むＰＢＳＴ溶液またはビオチンと結合し
たヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体を含むＰＢＳＴ溶液中に室温で
１時間反応させた。ついで、後者については、ストレプ
トアビジン−ペルオキシダーゼを含むＰＢＳＴ溶液に室
温で１時間浸漬した。ＰＢＳＴで完全に洗浄した後、免
疫反応をしたスポットは、シートを０．０３％の過酸化
水素、０．０６％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を含む
５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）とともにイン
キュベートすることにより、検出した。シートを乾燥し
た後、着色したスポットをポジティブの対照およびネガ
ティブの対照として用いたダニアレルゲンＤｅｒｆＩ、
ダニアレルゲンＤｅｒｆIIおよびＢＳＡと比較した（Ｄ
ｅｒｆＩおよびＤｅｒｆIIは国立相模原病院、安枝浩博
士より入手した）。

【００４８】その結果、分子量１４ｋ（１０．０％）、
２３ｋ（６３．３％）、３０ｋ（２０．０％）、４０ｋ
（２３．３％）、６５ｋ（５６．７％）、８７ｋ（６
０．０％）、１００ｋ（７０．７％）の画分が、比較的
高頻度に患者血清ＩｇＥと反応した（表２）。

【００４９】

【表２】

【００５０】これらの画分にダニアレルゲンの成分が含
まれていると考えられるので、これらの７つの画分（分
子量の小さいものから順にＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄ
ｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−Ｆ、Ｄｆ
ｂ−Ｇとする）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度検定及び
分子量測定を行った（図１）。

【００５１】実施例４ ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、
Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−Ｆ、Ｄｆｂ−Ｇにつ
いてのダニアレルゲン活性およびアナフィラキシー誘発
試験：本発明のダニアレルゲンは、下記の実験によりア
レルゲン活性を有し、アナフィラキシー誘発性は無いこ
とが判明した。

【００５２】実験例１ Ｂａｌｂ／ｃマウス（４週令）３匹の腹腔内に、ダニア
レルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ
−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−ＦまたはＤｆｂ−Ｇの各１
００μg をフロイントの完全アジュバンド（Difco)と混
合して注入することにより、０週目に初回免疫をした。
追加免疫は、２週目と４週目に行った。マウスの血清中
の抗Ｄｆｂ−Ａ抗体価等の各抗体価は、明らかな上昇が
認められ、充分な免疫原性が認められた。従って、いず
れも遮断抗体誘導能があり、治療用抗原として用いるこ
とができると判断された。

【００５３】実験例２ モルモット２匹の腹腔内に、ダニアレルゲンＤｆｂ−
Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−
Ｅ、Ｄｆｂ−ＦまたはＤｆｂ−Ｇの各水溶液１mgをAlum
に加えて注入することにより、０週目に初回免疫をし、
追加免疫は３週目と６週目に行った。対照は、モルモッ
ト１匹の腹腔内にAlumを加えた生理食塩水を同様に注入
した。モルモットの血清中の各ダニアレルゲンに対する
抗体価は、明らかな上昇を認め、充分な免疫原性が認め
られた。しかし、３週目と６週目の追加免疫の直後の観
察では、アナフィラキシー症状は全く認められなかっ
た。このことから、ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ
−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−
ＦおよびＤｆｂ−Ｇにはアナフィラキシー誘発性はいず
れも無いと判断された。

【００５４】実験例３ ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、
Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−ＦまたはＤｆｂ−Ｇ
のアレルゲン活性をダニアレルギー患者に対する皮内反
応試験で検定した。皮内反応試験の方法は、後述のとお
りである。その結果、ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆ
ｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ
−ＦおよびＤｆｂ−Ｇはいずれも陽性の皮内反応を示し
た。

【００５５】実施例５ ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、
Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−ＦおよびＤｆｂ−Ｇ
のアレルゲン活性をダニアレルギー患者白血球ヒスタミ
ン遊離試験により測定する。白血球ヒスタミン遊離試験
は、後述のように公知の方法に準じて行った[ アレルギ
ー：33，692,(1984)] 。ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄ
ｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆ
ｂ−ＦおよびＤｆｂ−Ｇのいずれにもヒスタミン遊離活
性を認めた。

【００５６】実施例６ ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、
Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−ＦおよびＤｆｂ−Ｇ
について、中性糖量はフェノール硫酸法により、また蛋
白質量はフォリンローリー法によりそれぞれグルコース
換算又はウシ血清アルブミン換算で表示し、その重量比
を表３に示す。

【００５７】

【表３】

【００５８】実施例７ ダニアレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、
Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−ＦおよびＤｆｂ−Ｇ
についてのアミノ酸組成分析：各ダニアレルゲンについ
て、蛋白質の構成アミノ酸を後述の方法で分析した。そ
の結果を表４に示す。

【００５９】

【表４】

【００６０】実施例８ 減感作治療用抗原製剤の調製：0.5 ％フェノールを添加
した 0.9％食塩水を溶媒とし、実施例３で得られたダニ
アレルゲンＤｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆ
ｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−ＦまたはＤｆｂ−Ｇをそ
れぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治療用抗原
の原液とした。

【００６１】実施例９ ダニアレルギー診断用滴定試薬の調製：ハンクス緩衝液
を溶媒とし、実施例３で得られたダニアレルゲンＤｆｂ
−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ−
Ｅ、Ｄｆｂ−ＦまたはＤｆｂ−Ｇをそれぞれ１ｍｇ／ｍ
ｌの濃度に溶解し、ヒスタミン遊離滴定用試薬の原液と
した。

【００６２】実施例１０ ダニ全ＲＮＡの抽出とダニアレルゲンPoly(A)mＲＮＡの
分離：常法によりコナヒョウヒダニを培養増殖させて得
られる生ダニ虫体６g を200ｍｌの5.5 Ｍイソチアン酸
グアニジン (片山化学社製) 液中で石英砂10ｇとともに
乳鉢中ですりつぶし遠心分離(9000rpm、 10分間、４℃）
し、その上清を、18Ｇの注射針をつけた50ｍｌ容のシリ
ンジで吸入、射出を繰り返すことにより、ＤＮＡを部分
切断する。再度遠心分離した上清を、17ｍｌのトリフル
オロ酢酸セシウム溶液 (片山化学社製) に対して16ｍｌ
の割合で重層し、85,000×ｇで24時間 (15℃, HITACHI
SCP55H swing PRS-27-2)密度勾配遠心分離を行い、管底
にペレットを形成する全ＲＮＡ画分を回収する。次に、
Fast Track mRNA isolation kit(Invitrogen社製）を用
いて、得られた全ＲＮＡ画分からpoly(A)mＲＮＡ画分を
回収した。濃度既知のＲＮＡ溶液希釈系列とともにスポ
ットテストを行なって収量を測定する。

【００６３】実施例１１ ダニアレルゲンｃＤＮＡの合成：次に、このpoly(A)mＲ
ＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（Ph
armacia 社製) を用いてそのマニュアルに従ってｃＤＮ
Ａを合成し、その両端にNot I 部位を含んだ１３mer の
EcoRI リンカーを接続する。

【００６４】実施例１２ ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの作製：このｃＤ
ＮＡのうちの１／１０量を、１μｇのEcoRI 消化λgtll
(StratageneCloning System 社製）と混合し、これを
エタノールで濃縮した後２００ unitsのT4 ＤＮＡ lig
ase を加えて12℃で15時間反応させることにより、ｃＤ
ＮＡをλgtllのEcoRI 部位に挿入した。この反応液か
ら、in vitroパッケージングキット (Gigapack PLUS, S
tratagene Cloning System社製) を用いてそのマニュア
ルにしたがって、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。こ
のライブラリー作製操作を７度行い、ｃＤＮＡライブラ
リーを得る。

【００６５】実施例１３ 抗血清の調製：実施例３で得られたダニアレルゲンＤｆ
ｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、Ｄｆｂ
−Ｅ、Ｄｆｂ−ＦまたはＤｆｂ−Ｇを用いた０．２％サ
ンプル溶液５００μｌとフロイントの完全アジュバント
５００μｌとを混合し乳化したものを、一週置きに、ウ
サギの前足の付け根のリンパ節付近に注射した。採血
は、毎週、耳の静脈から行なった。８週間免疫を続け、
ＥＬＩＳＡ法により抗体価の上昇を確認した後、最終免
疫を行い、その三日後に、耳から吸引により全採血を行
なった。

【００６６】実施例１４ ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニ
ング：実施例１２より得られた、ｃＤＮＡライブラリー
の１３６，０００個の組み換え体について、実施例１３
で得られた抗血清を用いて免疫スクリーニングを行な
う。本実施例で行なう免疫スクリーニングの詳しいプロ
トコールを以下に記載する。ファージおよび宿主（E.co
li Y1090，Stratagene Cloning System 社製) を、３７
℃で３０分間インキュベートし、溶けた状態のLB-soft
agarと共にＬｂプレート上に重層し、４２℃で３〜４時
間インキュベートを行なう。その後、１０ｍＭのイソプ
ロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを含有させた
ニトロセルロースフィルターで上部を覆い３７℃で３時
間インキュベートしてレプリカ（複製）フィルターを得
る。

【００６７】前記フィルターを、１０ｍＭトリス緩衝食
塩水（ｐＨ７．６）に０．０５％Tween 20を加えた溶液
（ＴＢＳＴ）を用いて１０分間の洗浄を３回繰り返した
後、２％の脱脂粉乳を含有したＴＢＳと共に、室温にて
１時間以上インキュベートを行なう。この後、ＴＢＳを
用いて１０分間の洗浄を３回繰り返した後、５００倍に
希釈したウサギ抗血清（E.coliライゼートで前処理を行
なったもの）を含むＴＢＳＴと共に、室温にて１時間イ
ンキュベートを行なう。さらに、ＴＢＳを用いた１０分
間の洗浄を３回繰り返した後、２０００倍に希釈したペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを用い、室温に
て１時間以上インキュベートを行なう。次に、０．６ｍ
ｇ／ｍｌの３，３’−diaminobenzidine tetrahydrochl
oride, 0.3％のNiCl₂ および０．０１％のＨ₂ Ｏ₂ を含
有するＴＢＳとの酵素反応を行ない、黒灰色〜黒色のシ
グナルが得られたものを陽性のクローンとして回収す
る。

【００６８】以下に、上記実施例で使用した各種分析方
法および特殊な材料について述べる。 （１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（デュアルミニスラブモデルＡＥ６４
００；アトー（株）製）により、下記の条件にて分画し
た。 ゲル組成：１２．５％ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 泳動バッファー：０．０２５Ｍ トリス、０．１９２Ｍ
グリシン、０．１％ ＳＤＳ 泳動条件：３０ｍＡ

【００６９】（２）ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法） ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際の各フラクションの抗原活性、及
びマウス、ウサギの抗体価の測定を本法で行った。最初
にＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（９６穴）
に、ディスクプレパラティブＳＤＳ−ＰＡＧＥでの各フ
ラクション５０μｌ、またはマウス、ウサギの抗体価の
測定の時には免疫抗原を重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）
に溶かしたものを、５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間
インキュベートした。溶液を吸引除去し、ウエルを洗浄
用緩衝液で３回洗浄後、２００μｌの１％牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）溶液をウエルに入れ、３７℃で１時間イ
ンキュベートした（ブロッキング）。

【００７０】ウエルを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用希釈用緩衝
液で適当な濃度に希釈した血清（患者血清、ウサギ抗血
清）を５０μｌ入れ室温で、１時間インキュベートし
た。ウエルを洗浄後、希釈用緩衝液で希釈したペルオキ
シダーゼ標識の第二抗体溶液を５０μｌ入れ、室温で１
時間インキュベートした。ウエルを洗浄後、基質として
０．１％のＡＢＴＳを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、
０．３％過酸化水素を１００μｌ加え室温で反応させ
た。反応時間は、１〜４０分（発色の度合いで決定）続
けて、１０ｍＭアジ化ナトリウム溶液を１００μｌ加え
ることにより反応を停止し、溶液の４２０ｎｍの吸収を
測定した。

【００７１】（３）皮内反応試験 サンプルを０．９％塩化ナトリウム、０．５％フェノー
ル溶液に溶解しツベルクリン用注射器で、２０μｌをダ
ニアレルギー患者の前腕、屈側皮内に注射し、約１５分
後に現れた、赤疹、膨疹の長径、短径を測定し、その平
均値で検定を行った。検定の基準は表５のとおりであ
る。但し、紅斑が１９ｍｍ以下でも膨疹が８ｍｍ以上な
らば、陽性とする。

【００７２】

【表５】

【００７３】（４）白血球ヒスタミン遊離試験 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際の各フラクションのアレルゲン活
性の測定を本法で行った。 １．洗浄全血球浮遊液の調製法 血液サンプル１０ｍｌを遠心分離（１４００ｒｐｍ、１
０分）にかけ、血球と血漿に分ける。血球は、５０ｍｌ
の遠心管に入れ、ハンクス緩衝液を４０ｍｌ加えて遠心
洗浄（１４００ｒｐｍ、１０分）を行う。上清はアスピ
レーターで吸引除去し、得られた血球部分を後二回ハン
クス緩衝液で洗浄する。この血球をハンクス緩衝液で１
０ｍｌに定容し洗浄全血球浮遊液とする。

【００７４】２．ヒスタミン遊離試験法 抗原画分をハンクス緩衝液に溶かし、用いた抗原濃度の
４倍濃度の抗原液を調製する。この抗原液１００μｌに
ハンクス緩衝液を１００μｌ、上記１で調製した洗浄全
血球浮遊液を２００μｌ加え、３７℃で３０分間インキ
ュベートする。ヒスタミンが遊離した上清を、１４００
ｒｐｍ、１０分の遠心分離によって２００μｌ採取し、
この上清中に６０％過塩素酸を１０μｌ加え撹拌後、遠
心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）によって、除タンパ
クした上清１４０μｌを採取する。これをヒスタミン定
量ＨＰＬＣにかけ、上清中に含まれるヒスタミンを定量
する。

【００７５】血球中に含まれる全ヒスタミン量測定のた
めに、全血球浮遊液２００μｌに直接６０％過塩素酸４
０μｌを加えて、血球を破壊する。これを、３０００ｒ
ｐｍ、１０分の遠心分離にかけ、得られた上清中に含ま
れるヒスタミンをヒスタミン定量ＨＰＬＣで測定し、総
ヒスタミン量とする。また、非特異的に遊離するヒスタ
ミン量を測定するために、抗原液の代わりにハンクス緩
衝液を用いてヒスタミン遊離試験を行い、コントロール
とする。

【００７６】（５）フェノール硫酸法（中性糖の定量
法） フェノール硫酸法により、サンプル中の中性糖量を定量
した。サンプル２５０μｌを試験管にとり、７％（ｗ／
ｗ）フェノール水１２５μｌ加え、１０分間攪拌した。
これに８５％ 濃硫酸２ｍｌを氷冷中で加えた後、１０
０℃、１０分間加熱し、流水で３０分間冷却する。この
後ＯＤ４９０ｎｍ吸収を測定する。Ｇｌｕｃｏｓｅを用
いて検量線を作成し、サンプル中の中性糖量をＧｌｕｃ
ｏｓｅ換算で示す。

【００７７】（６）フォリンローリー法（蛋白質の定量
法） 常法により、サンプル０．５ｍｌを試験管にとり、Ｃ試
薬を１ｍｌ加え、室温で１０分間インキュベートした。
これにＤ試薬を０．２５ｍｌ加え、撹拌した後、室温で
３０分間インキュベートし、ＯＤ７５０ｎｍの吸収を測
定した。 （Ａ試薬） ２％ Ｎａ₂ ＣＯ₃ ，０．１Ｎ ＮａＯＨ
溶液 （Ｂ試薬） ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ，１％ クエン酸ソ
ーダ溶液 （Ｃ試薬） アルカリ性銅塩溶液（Ａ試薬５０ｍｌ＋Ｂ
試薬１ｍｌを含む） （Ｄ試薬） １Ｎ フェノール試薬

【００７８】（７）蛋白質のアミノ酸分析 ０．１％サンプル溶液２００μｌを１２Ｎ ＨＣｌ ２
００μｌと混合し、Ｎ₂ 置換をした密封試験管内で、１
１０℃、２４時間加水分解した。乾固させた後少量の水
を加えて乾固させるという操作を３回繰り返すことによ
り脱塩酸を行い、アミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝
液１ｍｌに溶解し、アミノ酸アナライザー（高速液体ク
ロマトグラフ；（株）日立製作所製）により、アミノ酸
組成分析を行った。

【００７９】

【発明の効果】本発明のダニアレルゲンは有効性および
安全性の観点から有用な減感作治療用抗原であり、ダニ
アレルギー疾患に対する減感作治療剤・予防剤として有
用である。また、本発明のダニアレルゲンは、ダニアレ
ルギー疾患の迅速かつ正確な診断において有用である。
更に、本発明のダニアレルゲンを哺乳動物に免疫するこ
とにより、抗血清を調製することができる。こうして得
られる抗血清はダニ虫体のｍＲＮＡから調製したｃＤＮ
Ａライブラリーの免疫スクリーニングに使用することが
可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例３において得られた７つの画分
（Ｄｆｂ−Ａ、Ｄｆｂ−Ｂ、Ｄｆｂ−Ｃ、Ｄｆｂ−Ｄ、
Ｄｆｂ−Ｅ、Ｄｆｂ−Ｆ、Ｄｆｂ−Ｇ）についてＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）により分子量を測定した
結果を示す図である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有するダニアレルゲン。 ダニ虫体の抽出液に含まれる、 約１０％の糖質を含む糖蛋白質である、 分子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約１
   ４，０００である、 アレルゲン活性を有する。
2. 【請求項２】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有するダニアレルゲン。 ダニ虫体の抽出液に含まれる、 約１３％の糖質を含む糖蛋白質である、 分子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約２
   ３，０００である、 アレルゲン活性を有する。
3. 【請求項３】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有するダニアレルゲン。 ダニ虫体の抽出液に含まれる、 約１０％の糖質を含む糖蛋白質である、 分子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約３
   ０，０００である、 アレルゲン活性を有する。
4. 【請求項４】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有するダニアレルゲン。 ダニ虫体の抽出液に含まれる、 約１５％の糖質を含む糖蛋白質である、 分子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約４
   ０，０００である、 アレルゲン活性を有する。
5. 【請求項５】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有するダニアレルゲン。 ダニ虫体の抽出液に含まれる、 約６％の糖質を含む糖蛋白質である、 分子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約６
   ５，０００である、 アレルゲン活性を有する。
6. 【請求項６】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有するダニアレルゲン。 ダニ虫体の抽出液に含まれる、 約３３％の糖質を含む糖蛋白質である、 分子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約８
   ７，０００である、 アレルゲン活性を有する。
7. 【請求項７】 下記の理化学的性質および生物学的性質
   を有するダニアレルゲン。 ダニ虫体の抽出液に含まれる、 約２６％の糖質を含む糖蛋白質である、 分子量（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が約１
   ００，０００である、 アレルゲン活性を有する。
8. 【請求項８】 ダニ虫体を磨砕した後、飽和食塩水およ
   び／または中程度イオン強度の緩衝液により抽出処理
   し、得られた抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびダニアレ
   ルギー患者血清ＩｇＥを用いる免疫染色法により分画す
   ることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載のダニア
   レルゲンの製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１〜７いずれか記載のダニアレル
   ゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。
10. 【請求項１０】 請求項１〜７いずれか記載のダニアレ
    ルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。
11. 【請求項１１】 請求項１〜７いずれか記載のダニアレ
    ルゲンを哺乳動物に免疫することにより得られる抗血
    清。