JP3588615B2 - 組換えダニアレルゲン - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。
従来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレルギーの原因物質である減感作療法が、最も重要な根本治療とされ、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等の吸入性アレルゲンである回避困難な抗原で引き起こされる疾患においては、その評価は今や確立されたものといえる。
しかしながら、この減感作療法では感作抗原によるアナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与が必要とされ、そのような感作抗原の研究が進められている。
【０００３】
ダニアレルギー疾患については、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）及びコナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）の２種のダニが、屋内塵中のアレルゲン源として重要であると報告されている〔Ａｌｌｅｒｇ． Ａｓｔｈｍａ， １０， ３２９ 〜３３４ （１９６４）； Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ， ４２， １４〜 ２８ （１９６８）］ 。これらのダニから、主要ダニアレルゲンが分画され、それらはダニ排泄物及び／又はダニ虫体中に含有されている分子量２４−２８ｋＤ の糖蛋白（ｐＩ ４．６〜７．２）、及び／又は分子量１４．５−２０ｋＤ の蛋白（ｐＩ ５〜７．２）であると報告されている〔Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５， ５８７〜５９２ （１９８０）； Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７６， ７５３ 〜７６１ （１９８５）； Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４６， ６７９ 〜６８７ （１９８２）； Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８１， ２１４〜２２３ （１９８６）； Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７５， ６８６ 〜６９２ （１９８５）等〕。
しかし、減感作治療用抗原として有効かつ安全なものは、未だ得られていないのが実情である。
【０００４】
ダニアレルゲンの遺伝子クローニングとしては、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるＤｅｒ ｐ Ｉ （分子量：２５，３７１） 及びＤｅｒ ｐ ＩＩ （分子量：１４，１３１） について、また、コナヒョウヒダニの主要アレルゲンであるＤｅｒ ｆ Ｉ （ 分子量：２５，１９１） 及びＤｅｒ ｆ ＩＩ（分子量：１４，０２１）についても、それぞれの遺伝子がクローニングされ塩基配列も決定されており〔Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８５， １２７〜１２９ （１９８８）； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６７， １７５ 〜１８２ （１９８８）； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７ ０， １４５７ 〜１４６２ （１９８９）； Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９１， １１８ 〜１２３ （１９９０）； Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９１， １２４〜１２９ （１９９０）； Ｊｐｎ． Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｏｌ．， ３９， ５５７〜５６１ （１９９０）； Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ， ２１， ２５ 〜３２ （１９９１）； Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ， ２１， ３３ 〜３７ （１９９１） 〕、遺伝子組換え技術によるダニアレルゲンの研究が試みられている。
しかしながら、未だ感作抗原として使用し得るものは得られていない。
【０００５】
一方、ダニアレルギー疾患の診断方法としては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物及び／又はダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験が殆どであり、まれに、ＲＡＳＴ（ｒａｄｉｏ ａｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ ｔｅｓｔ）法による血清中のＩｇＥ 抗体価（相対値）の測定、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験を併用する程度であり、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来、屋内塵性ダニを特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるために投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いのが現状である。
したがって、有効性及び安全性の観点から、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれると同時にそのような高品質減感作治療用抗原の安定供給が期待されている。
しかしながら、このような安全で確実に奏効するに充分量のダニアレルゲンを安定供給するには、ダニ飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法では、量産性がなく量的に限界があるので安定供給は困難である。
【０００７】
本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキシー誘発性の不純物を含まない安全かつ有効な組換えダニアレルゲンを提供することにある。
即ち、本発明の第１の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られるアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲンを提供することにある。
本発明の第２の目的は、該ダニアレルゲンをコードする遺伝子を提供することにある。
本発明の第３の目的は、アレルゲン活性を有する活性断片としてのダニアレルゲン断片を提供することにある。
本発明の第４の目的は、ダニアレルゲンに含まれるエピトープを有するペプチド、又は該エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピトープを有するペプチドを提供することにある。
本発明の第５の目的は、前記のエピトープを有するペプチドをコードする遺伝子を提供することにある。
本発明の第６の目的は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターを提供することにある。
本発明の第７の目的は、該遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
本発明の第８の目的は、該組換えダニアレルゲンの製造方法を提供することにある。
本発明の第９の目的は、本発明の組換えダニアレルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患治療剤を提供することにある。
本発明の第１０の目的は、本発明の組換えダニアレルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ダニ虫体から強いアレルゲン活性を有するダニアレルゲン及びそれをコードする遺伝子を見出し、更に研究を重ねて本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、
（１）ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、配列番号：１〜配列番号：９記載のアミノ酸配列のいずれかを含んでいる組換えダニアレルゲン、
（２）前記（１）記載のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子、
（３） 配列番号：１において示される塩基配列において、少なくとも上流より約１９０ ｂｐ 〜約２４０ ｂｐ 、約２９０ ｂｐ 〜約３８０ ｂｐ または約１９０ ｂｐ 〜約３８０ ｂｐ の領域内にコードされているアミノ酸配列を含有してなるダニアレルゲン断片、
（４） ダニアレルゲンに含まれるエピトープを有するペプチド、又は該エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピトープを有するペプチド、
（５）前記（４）記載のペプチドをコードしている遺伝子、
（６）前記（２）記載の遺伝子を発現させ得る発現ベクター、
（７）前記（６）記載の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞、
（８）前記（７）記載の細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法、
（９）前記（１）記載の組換えダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、並びに
（１０） 前記（１）記載の組換えダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬、
に関する。
【００１０】
本発明の組換えダニアレルゲンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られるものであり、ここで用いられるダニは特に限定されるものではないが、屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダニ等が用いられる。
【００１１】
本発明の組換えダニアレルゲンは、アミノ酸配列として以下のｍａ１０，ｍａ３，ｍａ１５，ｍａ２９，ｍａ４４，ｍａ５０，ｍａ１１３，ｍａ１１４，ｍａ１１５と名付けた９種の各配列（配列番号：１〜配列番号：９）のいずれかを含んでいる蛋白質であって、アレルゲン活性を有するものである。
【００１２】
また、本発明の組換えダニアレルゲンは、各アミノ酸配列のうち１個又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加又は転位によって種々変異されたものであっても、アレルゲン活性を有するものは本発明の組換えダニアレルゲンに含まれる。このような変異体は、天然のアレル変異体又は組換えＤＮＡ技術により、例えばＤＮＡの特定の部位に突然変異を誘発することにより得られる。
【００１３】
本発明の組換えダニアレルゲンには、他の蛋白質との融合蛋白として発現されたものも含まれる。本明細書では、他の蛋白質と融合して発現した組換えダニアレルゲンを特に融合組換えダニアレルゲンという場合がある。融合する他の蛋白質としては特に限定されないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ等が挙げられる。
【００１４】
本発明の組換えダニアレルゲンは、アレルゲン活性に必須な領域のみの蛋白質断片であってもよく、また、アレルゲン活性に必須なドメインからなるものであってもよい。例えば、本明細書においては、アレルゲン活性を有する活性断片を、ダニアレルゲン断片というが、具体的には配列番号：１において示される塩基配列において、少なくとも上流より約１９０ ｂｐ 〜約２４０ ｂｐ 、約２９０ ｂｐ 〜約３８０ ｂｐ または約１９０ ｂｐ 〜約３８０ ｂｐ の領域内にコードされているアミノ酸配列を含有してなる断片が挙げられる。
【００１５】
また、ダニアレルゲン蛋白質のみを発現させて得られたものの他に、融合蛋白質として発現したものから他の蛋白質を脱離せしめて得られたものでもよい。
【００１６】
要約すれば、本発明の組換えダニアレルゲンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる前記のアミノ酸配列を実質的に含んでいる、アレルゲン活性を有する蛋白質である。
【００１７】
本発明の組換えダニアレルゲンとして、大腸菌で発現されたβ−ガラクトシダーゼとの融合組換えダニアレルゲンが以下のように例示される。即ち、大腸菌で発現された融合組換えダニアレルゲンは、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４ （ＩＢＦ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー、抗Ｄｅｒｆ Ｉ抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー及び抗ＤｅｒｆＩＩ抗体固定化アフィニティクロマトグラフィーで精製され、組換えダニアレルゲンとして下記のような性質を持つ。
（１）組換えダニアレルゲンｍａ１０
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約１９，０００である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで｛（融合蛋白質の分子量）−（β−ガラクトシダーゼの分子量）｝
で見積もる。又、以下の組換えダニアレルゲンにおいても同様に見積もる。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：１）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
ダニアレルギー患者プール血清中の特異ＩｇＧ 、ウサギ抗ダニ虫体血清、ウサギ抗β−ガラクトシダーゼとのＥＬＩＳＡ 反応性及び発現蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜にブロットし上記抗血清との反応性により判断する。また、以下の組換えダニアレルゲンにおいても同様にして判断する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いたダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により判断する。また、以下の組換えダニアレルゲンにおいても同様にして判断する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
常法により、融合蛋白質またはダニアレルゲン蛋白質でモルモットを免疫し、追加免疫時にアナフィラキシー反応について観察する。また、以下の組換えダニアレルゲンにおいても同様にして観察する。
【００１８】
（２）組換えダニアレルゲンｍａ３
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約３４，０００である。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：２）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
【００１９】
（３）組換えダニアレルゲンｍａ１５
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約２２，０００である。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：３）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
【００２０】
（４）組換えダニアレルゲンｍａ２９
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約１７，０００である。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：４）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
【００２１】
（５）組換えダニアレルゲンｍａ４４
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約３３，０００である。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：５）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
【００２２】
（６）組換えダニアレルゲンｍａ５０
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約２８，０００である。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：６）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
【００２３】
（７）組換えダニアレルゲンｍａ１１３
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約３８，０００である。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：７）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
【００２４】
（８）組換えダニアレルゲンｍａ１１４
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約１８，０００である。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：８）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
【００２５】
（９）組換えダニアレルゲンｍａ１１５
▲１▼ 色及び性状：白色
▲２▼ 水溶性 ：易溶性
▲３▼ 分子量 ：約３２，０００である。
▲４▼ アミノ酸配列（配列番号：９）として次のものを含む。

▲５▼ 抗原性を有する。
▲６▼ アレルゲン活性を有する。
▲７▼ アナフィラキシー反応を誘導しない。
【００２６】
本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、生ダニ虫体からｍＲＮＡを調製し、そのｍＲＮＡを鋳型として常法によりｃＤＮＡを合成することにより得られるが、分子中に前記のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているものであり、該アミノ酸配列をコードしているＤＮＡとしては、具体的には以下のような配列（配列番号：１〜９）が例示される。
【００２７】
例えば、ｍａ１０（配列番号：１）として、

【００２８】

【００２９】

【００３０】

【００３１】

【００３２】

【００３３】

【００３４】

【００３５】

の配列、を有するものである。
これらのＤＮＡ配列は、主要ダニアレルゲンとして知られる前記のＤｅｒ ｐ Ｉ 、Ｄｅｒ ｐ ＩＩ、Ｄｅｒ ｆ Ｉ 及びＤｅｒ ｆ ＩＩについて報告されているものと比較してｍａ１１５以外は相同性のないものである。
【００３６】
本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、ｍａ１０としては、ｃＤＮＡの全塩基鎖長が約０．５０ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） であるが、実際の発現では、その前の停止コドンで終了するので、翻訳される塩基鎖長は、停止コドンを除いて５５８ｂｐである。ｍａ３としてはｃＤＮＡの全塩基鎖長が約１．０５ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） であり、図４に示す制限酵素地図を有するものである。ｍａ１５としてはｃＤＮＡの全塩基鎖長が約１．６６ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） であり、図５に示す制限酵素地図を有するものである。ｍａ２９としてはｃＤＮＡの全塩基鎖長が約０．７５ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） であり、図６に示す制限酵素地図を有するものである。ｍａ４４としてはｃＤＮＡの全塩基鎖長が約０．９９ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） を有するものである。ｍａ５０としてはｃＤＮＡの全塩基鎖長が約０．９０ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） であり、図７に示す制限酵素地図を有するものである。ｍａ１１３としてはｃＤＮＡの全塩基鎖長が約１．２６ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） であり、図８に示す制限酵素地図を有するものである。ｍａ１１４としてはｃＤＮＡの全塩基鎖長が約０．６２ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） であり、図９に示す制限酵素地図を有するものである。ｍａ１１５としてはｃＤＮＡの全塩基鎖長が約１．０４ ｋｂｐ（アガロース電気泳動法） であり、図１０に示す制限酵素地図を有するものである。
【００３７】
本発明の発現ベクターは、形質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞中において、前記の本発明の遺伝子を発現させ得るように結合している発現ベクターである。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤＮＡは、特に制限されず、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＴＶ１１８ Ｎ （宝酒造社製）、ｐＵＥＸ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等が挙げられる。
【００３８】
本発明の発現ベクターの構築方法は、特に限定されるものではなく常法により行なうことができる。例えば、図１に示されるようにλｇｔ１１ファージに組み込まれたダニアレルゲンのｃＤＮＡを、Ｎｏｔ Ｉ 消化し、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＮｏｔ Ｉ 部位に連結して得られた ｐＡＫをＮｏｔ Ｉ 消化した後、Ｋｌｅｎｏｗ断片で平滑化し、プラスミドベクターｐＵＥＸ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）のＳｍａ Ｉ 部位に連結して発現ベクター ｐＡＥＸを得ることができる。
【００３９】
本発明の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌としては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイセス・シェレビィシェー等が、哺乳動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サルＣＯＳ細胞、マウス・フィブロブラスト等が挙げられる。
【００４０】
本発明の組換えダニアレルゲンの製造方法は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することによる。
ダニ虫体から本発明の組換えダニアレルゲンをコードしているｃＤＮＡを取得するには、後述の実施例において詳述するように、全ＲＮＡ画分からｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ画分を回収し、市販のｃＤＮＡ合成キット等を用いてｃＤＮＡを合成することができる。
また、ダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入された融合蛋白発現プラスミドを含有する大腸菌形質転換株を用いての組換えダニアレルゲンの製造方法として、次のような方法が例示される。
【００４１】
まず、ダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入されたβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白発現プラスミドを含有する大腸菌形質転換株を常法により振盪培養し対数増殖させ、この対数増殖期を維持させながら温度シフトで、又はβ−ガラクトシダーゼ・インデューサー添加で融合蛋白質を誘導合成させる。宿主細胞として用いられる大腸菌としては、例えばＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０５ （ファルマシア社製）が用いられ、発現ベクターで形質転換された株をそれぞれ、ｍａ１０クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１０（ＦＥＲＭＰ − １３４９６号）、ｍａ３クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−３ （ＦＥＲＭＰ − １３８１２号）、ｍａ１５クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１５（ＦＥＲＭＰ − １３８１３号）、ｍａ２９クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−２９（ＦＥＲＭＰ − １３８１４号）、ｍａ４４クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−４４（ＦＥＲＭＰ − １３８１５号）、ｍａ５０クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−５０（ＦＥＲＭＰ − １３８１７号）、ｍａ１１３クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１１３（ＦＥＲＭＰ − １３８１８号）、ｍａ１１４クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１１４（ＦＥＲＭＰ − １３８１９号）、ｍａ１１５クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１１５（ＦＥＲＭＰ − １３８２０号）と命名する。
【００４２】
培養終了後、集菌した菌体は、セリン・システイン・アスパラギン酸・金属プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液に懸濁して超音波処理で破壊される。細胞デブリスにある膜局在性の蛋白をフェニルメタンスルフォニル・フルオリド、モノヨード酢酸、ペプスタチンＡ、エチレンジアミン四酢酸等の蛋白分解酵素阻害剤及びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００ 、ノニデットＰ４０等の界面活性剤を含む緩衝液で抽出する。その抽出液から、又は培養濃縮液から得られたダニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を、例えばＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４ （ＩＢＦ社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー、抗Ｄｅｒｆ Ｉ抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー及び抗ＤｅｒｆＩＩ抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー等で精製する。なお、抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化担体は、抗β−ガラクトシダーゼ抗体（５Ｐｒｉｍｅ →３Ｐｒｉｍｅ 社製）を、活性化されたトレシル担体（例えば、トレシルＧＭゲル（栗田工業社製）、トレシルトヨパール（東ソー社製）、トレシルセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社製）等が用いられる）に共有結合させたものである。また、抗ダニ虫体抗体固定化担体は、上述の活性化担体にウサギ抗ダニ虫体抗体を共有結合させたものである。
【００４３】
精製された組換えダニアレルゲン融合蛋白質は、プロテアーゼで消化し、ＥＬＩＳＡ 及びダニアレルギー疾患患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギー， ３７， ７２５（１９８８） ）でモニター下に、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、クロマトフォカシング、焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせて分画し、活性画分から抗β−ガラクトシダーゼ抗体固定化アフィニティカラムを通してβ−ガラクトシダーゼに由来する蛋白成分を吸収除去する。更に、抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティカラム、抗Ｄｅｒｆ Ｉ抗体固定化アフィニティクロマトカラム及び抗ＤｅｒｆＩＩ抗体固定化アフィニティクロマトカラムで組換えダニアレルゲンの断片の精製を行なう。
【００４４】
また、前記方法で精製されたものの蛋白質分解酵素、例えば、プロナーゼ、スブチリシン、サーモリシン、トリプシン等による消化物や臭化シアン、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、ヒドロキシルアミン等の化学処理による分解物からのダニアレルゲンの断片の精製も前記の方法を単独または組み合わせて行なうことができる。
【００４５】
また、本発明の組換えダニアレルゲンの製造方法は、ダニアレルゲン蛋白質の直接発現に加えて、ダニアレルゲンが他の蛋白質と介在配列を介して融合した融合組換えダニアレルゲンとして発現したものを回収し、次いで融合している他の蛋白質を脱離せしめることにより組換えダニアレルゲンを製造する方法も包含している。融合させる他の蛋白質としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ等、一般的に融合蛋白とすることが知られているものが用いられる。
【００４６】
他の蛋白質を脱離せしめる方法も公知の方法が用いられ、例えば他の蛋白質がβ−ガラクトシダーゼで、ダニアレルゲン蛋白質との間にコラーゲンやフィブリノーゲン蛋白質の一部が介在している場合、コラゲナーゼやトロンビンを用い、前記の方法の単独又は組み合わせによりダニアレルゲン蛋白質が精製される。
【００４７】
また、本発明のダニアレルゲン断片は、該断片のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡを常法により調製して、発現ベクターを構築し、適当な宿主にて発現させることにより容易に組換えダニアレルゲンとして得ることができる。
更に、該ダニアレルゲン断片を、常法の固相合成法により合成して合成ダニアレルゲンとして、単独にまたは、適当な担体、例えばヒト血清アルブミン、皮内投与で安全性が確認されているホヤ抗原等に結合させて用いることも出来る。
【００４８】
また、本発明のダニ虫体由来のダニアレルゲンに含まれるエピトープを有するペプチド又は該エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピトープを有するペプチドとは、ｍａ１０については以下のアミノ酸配列（配列番号：１０）、

又は、以下のアミノ酸配列（配列番号：１１）を含有するペプチドが挙げられる。

【００４９】
また、これらのペプチドをコードしている遺伝子としては、以下のＤＮＡ配列（配列番号：１０）を含有するもの、

又は、以下のＤＮＡ配列（配列番号：１１）を含有するものが挙げられる。

【００５０】
本発明のダニ虫体由来のダニアレルゲンに含まれるエピトープを有するペプチド又は該エピトープと免疫学的に同一であるとみなされ得るエピトープを有するペプチドは、前記のようなものが挙げられ、ダニアレルギー疾患治療剤あるいはダニアレルギー疾患診断薬における有効成分として用いる場合、いずれも用いることができる。
【００５１】
本発明のダニアレルギー疾患治療剤は前記の精製された組換えダニアレルゲン、ダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有するペプチドを有効成分とするものであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤として用いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患をいう。
【００５２】
本発明のダニアレルギー疾患治療剤の調製方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により精製された組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて精製されたダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有するペプチドを乾燥して粉末状で採取し、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤として用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉末状の精製された組換えダニアレルゲンをフェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
【００５３】
本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法により行なうことができる。更に、例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することができる。本発明のダニアレルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて成人１回あたり約２０μｇ以下の範囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、ダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。また、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安全に用いることができる。
【００５４】
本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニアレルギー診断用滴定試薬として用いられる。
皮内反応診断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製された組換えダニアレルゲン、前記の方法に準じて精製されたダニアレルゲン断片あるいはエピトープを有するペプチドを常法により調製して得るが、例えば組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、これをフェノールを含む生理食塩水で溶解・希釈して用いる。皮内反応診断試薬として用いる方法は、常法に従って用いられる。
【００５５】
また、ダニアレルギー診断用滴定試薬として用いる場合も同様に常法により調製されるが、例えば、組換えダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用いる。この方法は通常、次の操作手順によりなされる。即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球（白血球の一種）から遊離するヒスタミン量をＨＰＬＣを用いて測定する〔アレルギー，３７， ７２５（１９８８） 〕。
【００５６】
このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量の５０％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタミン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することになる。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応させた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（血液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血球浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値）より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能を持つＩｇＧ 抗体（遮断抗体）が存在するためである。
従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。アレルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギーの正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用である。
【００５７】
【実施例】
以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。尚、各実施例において使用した試薬はナカライテクス、片山工業、和光純薬などから購入した市販のものを使用した。また、制限酵素などの遺伝子工学用試薬は宝酒造などから購入したものを使用した。また、実施例においてウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清は、未精製のダニ虫体粗抗原をウサギに免疫し、抗体価の上昇を確認した後、全採血して得たものを使用した。ウサギ抗Ｄｅｒｆ Ｉ血清及びウサギ抗ＤｅｒｆＩＩ血清は、国立相模原病院の安枝博士より入手した。
【００５８】
実施例１
ダニ全ＲＮＡの抽出とダニアレルゲンＰｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡの分離：
常法によりコナヒョウヒダニを培養増殖させて得られる生ダニ虫体６ｇ を２００ ｍｌの５．５ Ｍイソチアン酸グアニジン （片山化学社製） 液中で石英砂１０ｇとともに乳鉢中ですりつぶし遠心分離（９０００ｒｐｍ、 １０分間、４℃）し、その上清を、１８Ｇの注射針をつけた５０ｍｌ容のシリンジで吸入、射出を繰り返すことにより、ＤＮＡを部分切断した。再度遠心分離した上清を、１７ｍｌのトリフルオロ酢酸セシウム溶液 （片山化学社製） に対して１６ｍｌの割合で重層し、８５，０００×ｇで２４時間 （１５℃， ＨＩＴＡＣＨＩ ＳＣＰ５５Ｈ ｓｗｉｎｇ ＰＲＳ−２７−２）密度勾配遠心分離を行い、管底にペレットを形成する全ＲＮＡ画分を回収した。
次に、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、得られた全ＲＮＡ画分からｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ画分を回収した。濃度既知のＲＮＡ溶液希釈系列とともにスポットテストを行なって収量を測定したところ、約２０μｇであった。
【００５９】
実施例２
ダニアレルゲンｃＤＮＡの合成：
次に、このｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社製） を用いてそのマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、その両端にＮｏｔ Ｉ 部位を含んだ１３ｍｅｒ のＥｃｏＲＩ リンカーを接続した。
【００６０】
実施例３
ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの作製：
このｃＤＮＡのうちの１／１０量を、１μｇのＥｃｏＲＩ 消化λｇｔｌｌ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ 社製）と混合し、これをエタノールで濃縮した後２００ ｕｎｉｔｓのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ を加えて１２℃で１５時間反応させることにより、ｃＤＮＡをλｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ 部位に挿入した。この反応液から、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングキット （Ｇｉｇａｐａｃｋ ＰＬＵＳ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ社製） を用いてそのマニュアルにしたがって、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリー作製操作を７度行い、最終的に６．６μｇのｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡから合計１３６，０００ ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ） のｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００６１】
実施例４
ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニング：
実施例３より得られたｃＤＮＡライブラリーの１３６，０００個の組換え体について、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清を用いて免疫スクリーニングを行なった。本実施例で行なった免疫スクリーニングの詳しいプロトコールを以下に記載する。ファージおよび宿主（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ 社製） を、３７℃で３０分間インキュベートし、溶けた状態のＬＢ−ｓｏｆｔ ａｇａｒと共にＬｂプレート上に重層し、４２℃で３〜４時間インキュベートを行なった。その後、１０ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを含有させたニトロセルロースフィルターで上部を覆い３７℃で３時間インキュベートしてレプリカ（複製）フィルターを得た。
【００６２】
前記フィルターを、１０ｍＭトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．６）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を加えた溶液（ＴＢＳＴ）を用いて１０分間の洗浄を３回繰り返した後、２％の脱脂粉乳を含有したＴＢＳと共に、室温にて１時間以上インキュベートを行なった。この後、ＴＢＳを用いて１０分間の洗浄を３回繰り返した後、５００倍に希釈したウサギ抗血清（Ｅ．ｃｏｌｉライゼートで前処理を行なったもの）を含むＴＢＳＴと共に、室温にて１時間インキュベートを行なった。さらに、ＴＢＳを用いた１０分間の洗浄を３回繰り返した後、２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを用い、室温にて１時間以上インキュベートを行なった。次に、０．６ｍｇ／ｍｌの３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ０．３％のＮｉＣｌ_２ および０．０１％のＨ_２ Ｏ_２ を含有するＴＢＳとの酵素反応を行ない、黒灰色〜黒色のシグナルが得られたものを陽性のクローンとして回収した。その結果、１次スクリーニングで２６９個のクローンが陽性を示した。
【００６３】
実施例５
クロスハイブリダイゼーションによるダニアレルゲンｃＤＮＡの分類：
実施例４の免疫スクリーニングによって取得したウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清陽性クローンに組み込まれているｃＤＮＡには同じ配列をコードしているものがあるのではないかと考え、クロスハイブリダイゼーションによってダニアレルゲンｃＤＮＡの分類を行なった。
【００６４】
まず、前記実施例４で得られた陽性クローンのうち、最初に取得した２０個の陽性クローンに組み込まれたｃＤＮＡを、λｇｔｌｌファージからＮｏｔ Ｉ 消化で切り出し、これらのｃＤＮＡの各々をプローブとしてナイロン膜上のｃＤＮＡに対してハイブリダイズさせて大まかにグループに分けた。
【００６５】
次に、既にグループ分けが行なわれた前記の２０個の陽性クローンとは別の４６個の陽性クローンについてλｇｔｌｌファージからＮｏｔ Ｉ 部位でｃＤＮＡを切り出してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋） ＤＮＡのＮｏｔ Ｉ 部位にサブクローニングした後、Ｎｏｔ Ｉ 部位で切り出したｃＤＮＡをナイロン膜上にスポットして、先に得られた各グループ分けが行なわれたｃＤＮＡのうち、グループ内で塩基鎖長が最大のものをプローブとしてナイロン膜上のｃＤＮＡに対してハイブリダイズさせた。ここでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋） ＤＮＡをＮｏｔ Ｉ 部位にサブクローニングした後、Ｎｏｔ Ｉ 部位で消化し、アガロースゲル電気泳動を行ないｃＤＮＡを含む断片をＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＫＩＴ（東洋紡社製）を用いて抽出精製しプローブ用ＤＮＡとした。
【００６６】
また、残りの１３４個のクローンについては、λｇｔｌｌファージにｃＤＮＡが挿入されたままの状態で、液体培地でＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０に感染させることによりファージを増殖させたライセートをナイロン膜にスポットし、以下の方法によりＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガーマンハイム社製）プローブとハイブリダイズさせた。
【００６７】
ハイブリダイゼーションのプロトコール：
変性させたｃＤＮＡフラグメントまたはλｇｔｌｌファージライゼートをナイロン膜上にスポットした。変性溶液（０．５Ｎ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌ）を５分間浸透させ、さらに中性溶液（１Ｍ トリス−ＨＣｌ〔ｐＨ８．０〕，１．５Ｍ ＮａＣｌ）を５分間浸透させたのち、通風乾燥を１時間以上行なった。ＵＶ Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ でＤＮＡを３分間固定化した。
ＤＮＡ固定化膜をハイブリダイゼーションバッファーでプレハイブリダイズした（６０℃、１時間）。ラベル化プローブＤＮＡを含むハイブリダイゼーションバッファーでハイブリダイズした（６０℃、６時間以上）。これを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄し（室温、５分間）、さらに０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄して（６８℃、１５分間）、ハイブリダイズされた膜を得た。
【００６８】
得られた膜をバッファーＡで１分間平衡化し、０．５％のブロッキングリージェントを含有するバッファーＡで３０分間インキュベートした。バッファーＡで５分間洗浄し、バッファーＡのアルカリフォスフォターゼとコンジュゲートした抗ヒツジｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ Ｆａｂ フラグメントとインキュベートした。これをバッファーＡで１５分間２回洗浄し、バッファーＢで１分間平衡化してｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ， ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ｔｏｌｕｉｄｉｎｉｕｍ ｓａｌｔを含有するバッファーＢで免疫反応を行ない、ＴＥ（ｐＨ８．０）で反応を停止した。このようにして行なったクロスハイブリダイゼーションの結果、新規ダニアレルゲンをコードすると思われる本発明の遺伝子（ｍａ１０クローン、ｍａ３クローン、ｍａ１５クローン、ｍａ２９クローン、ｍａ４４クローン、ｍａ５０クローン、ｍａ１１３クローン、ｍａ１１４クローン、ｍａ１１５クローン）を得た。
【００６９】
実施例６
λｇｔｌｌファージＤＮＡの調製：
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０の一晩培養物２００μｌおよびλｇｔｌｌファージ溶解液（１０^５ 〜１０^７ ｐｆｕ）１００μｌを３７℃で１５分間インキュベートした。５ｍｌのＬＢ培養液を加えて振盪しながら３７℃で６〜８時間インキュベートした後、４℃、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行なった。
ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡを最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように加えて３７℃で３０分間インキュベートした。等量の２０％ＰＥＧ ６０００／２Ｍ ＮａＣｌを加えて４℃で一晩冷却した後、４℃、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行なった。
３５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）および１ｍＭ ＥＤＴＡ含有）に溶解し、プロティナーゼＫ、ＳＤＳおよびＥＤＴＡを各々の最終濃度が５０μｇ／ｍｌ、０．５％および１２．５ｍＭとなるように加えて５５℃で１５分間インキュベートした後、フェノール／クロロホルム溶液にて抽出し、エタノールで沈澱させた。次いでＴＥに溶解して、λｇｔｌｌファージＤＮＡ溶液を調製した。
【００７０】
実施例７
ダニアレルゲンｃＤＮＡのクローニング：
実施例５で得られた各ｃＤＮＡの挿入されたλｇｔｌｌファージを懸濁したＳＭ （１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５， ０．１Ｍ ＮａＣｌ１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４， ２％ ｇｅｌａｔｉｎ） 液と一晩培養したＥ． ｃｏｌｉ Ｙ１０９０ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ 社）とを３７℃で３０分間振盪培養することにより、宿主にファージを感染させ、これをＬＢ寒天培地 （１％ Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ０．５％ Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ， １．５ ％ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ （Ｄｉｆｃｏ社製）， ０．５％ ＮａＣｌ ，ｐＨ７．６）上に、１プレート当り約２，０００ 個のプラークを形成するように撒いた。４２℃で３時間培養後、予め１０ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ） を浸漬させて乾燥したニトロセルロースメンブレン （Ｈｉｂｏｎｄ−Ｃ， Ａｍｅｒｓｈａｍ 社製） で培地表面を覆い、さらに３７℃で３時間培養して誘導合成されるβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白を転写した。
このニトロセルロースメンブレンを２％ＢＳＡ を含むＴＢＳ （１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， ０．９％ ＮａＣｌ） 溶液中で一晩ブロッキングした後、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清 （１００ 倍２％ ＢＳＡ を含むＴＢＳ 希釈） 、ウサギ抗Ｄｅｒｆ Ｉ血清 （１，２００ 倍２％ ＢＳＡ を含むＴＢＳ 希釈） 、ウサギ抗ＤｅｒｆＩＩ血清 （１，０００ 倍２％ ＢＳＡ を含むＴＢＳ 希釈） 、さらにパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ 抗体 （Ｃａｐｐｅｌ社製， ２０００倍ＴＢＳ 希釈） とそれぞれ１時間ずつ反応させ、発色は０．０１％過酸化水素の存在下、０．４ ｍｇ／ｍｌのジアミノベンジジン四塩酸塩を含むＴＢＳ 溶液中で行なった。なお、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清は全ダニ飼育物から飽和食塩、ＰＢＳでダニ虫体を浮遊させ、更にＰＢＳで洗浄したダニ虫体を磨砕して、これを免疫原としてウサギに１０週間毎週追加免疫して得られた抗血清である。茶褐色を呈したシグナルの位置と合致するプラークをピックアップしてＳＭに懸濁し、陽性クローンとして保存した。
【００７１】
実施例８
プラスミドＤＮＡの調製：
実施例７により得られた形質転換体の一夜培養物１００〜５００μｌを７，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離を行ない、１００μｌのＳｏｌ．Ｉ（５０ｍＭのグルコース、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ〔ｐＨ８．０〕、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に懸濁し、２００μｌのＳｏｌ．ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ，１％ ＳＤＳ）を加え、氷上で５分間冷却した。次に、１５０μｌの氷冷したＳｏｌ．ＩＩＩ（５ＭのＣＨ_３ ＣＯＯＫ，ｐＨ４．８）を加えて氷上に５分間静置し、１２，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離を行なった。その上層をフェノール／クロロホルム溶液で抽出し、エタノールで沈澱させてプラスミドＤＮＡ溶液を得た。
【００７２】
実施例９
高発現ベクターｐＵＥＸ２による発現：
ダニアレルゲン遺伝子の転写産物の免疫化学的分析を行うために、最初のクロスハイブリダイゼーション（実施例５）にプローブとして使用したものを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）からＮｏｔ Ｉ 部位で切り出しＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化後、高発現ベクターｐＵＥＸ２のＳｍａ Ｉ 部位に転写方向とフレームが合うように連結し、Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０５ の形質転換株を取得した（図１）。取得した形質転換株は、ｍａ１０クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１０（ＦＥＲＭＰ − １３４９６号）、ｍａ３クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−３ （ＦＥＲＭＰ − １３８１２号）、ｍａ１５クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１５（ＦＥＲＭＰ − １３８１３号）、ｍａ２９クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−２９（ＦＥＲＭＰ − １３８１４号）、ｍａ４４クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−４４（ＦＥＲＭＰ − １３８１５号）、ｍａ５０クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−５０（ＦＥＲＭＰ − １３８１７号）、ｍａ１１３クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１１３（ＦＥＲＭＰ − １３８１８号）、ｍａ１１４クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１１４（ＦＥＲＭＰ − １３８１９号）、ｍａ１１５クローンの形質転換株をＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ １０５ ＯＬ−１１５（ＦＥＲＭＰ − １３８２０号）と命名した。
この形質転換株を用いて、２８℃での培養及び４２℃での発現後、ＳＤＳ可溶化全菌体をサンプルとした。
【００７３】
実施例１０
発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによる免疫染色：
菌体ペレットをＰＢ（ｐＨ７．４）蒸留水に懸濁したものに、最終濃度６２．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％のＳＤＳ、２％の２−メルカプトエタノールを加えて、１００℃にて３分間熱処理した後、５〜１０％アクリルアミドゲルを用いたスラブゲル電気泳動を行なった。
ウエスタンブロットは、セミブロッティング装置（ＡＴＴＯ）を用いてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ^ＴＭ（ミリポア社製）あるいはニトロセルロースフィルター（アドバンテック社製）に転写し、以下のプロトコールに従い免疫染色した。
【００７４】
ウエスタンブロット法のプロトコール：
得られた転写膜をＴＢＳＴを用いて１０分間３回洗浄した後、５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳＴと共に室温で１時間以上インキュベートした。これを、Ｅ．ｃｏｌｉライセートで前処理した希釈第一抗体と共にインキュベートした後、ＴＢＳで１０分間、３回洗浄してから希釈第二抗体とともに１時間インキュベートし、次いでＴＢＳで１０分間、３回洗浄した。
次に、０．６ｍｇ／ｍｌの３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ０．３％のＮｉＣｌ_２ および０．０１％のＨ_２ Ｏ_２ を含有するＴＢＳ中で酵素反応を行ない、黒灰色〜黒色のシグナルが得られたものを回収した。
【００７５】
実施例１１
抗β−ガラクトシダーゼ抗体による発現の確認：
得られたｍａ１０クローンについて、前記と同様にして発現し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、抗β−ガラクトシダーゼ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによる免疫染色を行った結果、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパクであることが確認された（図２）。また、他の各クローン（ｍａ３〜ｍａ１１５クローン）についても同様にして発現し、免疫染色を行った結果、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパクであることが確認された。この結果も併せて図２に示す。
【００７６】
実施例１２
ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清による活性の確認：
ｍａ１０クローンについて、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによる免疫染色を行ったところ、図３のような結果が得られた。他の各クローン（ｍａ３クローン、ｍａ１５クローン、ｍａ２９クローン、ｍａ４４クローン、ｍａ５０クローン、ｍａ１１３クローン、ｍａ１１４クローン、ｍａ１１５クローンの８種のクローン）についても図３のような結果が得られた。この結果も併せて図３に示す。尚、図３より明らかなようにｍａ１１３クローン、ｍａ１１４クローン、ｍａ１１５クローンの各クローンについては染色されなかったが、ｍａ１１３クローン、ｍａ１１５クローンについてはウサギ抗Ｄｅｒｆ Ｉ血清により、又ｍａ１１４クローンについてはウサギ抗ＤｅｒｆＩＩ血清により免疫染色が認められた。
これらのことから、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清、ウサギ抗Ｄｅｒｆ Ｉ血清及びウサギ抗ＤｅｒｆＩＩ血清を用いた免疫染色により全てのクローンが抗原活性を保持することが確認された。
【００７７】
実施例１３
ダニアレルギー患者プール血清による免疫染色：
各クローン（ｍａ１０クローン〜ｍａ１１５クローンの９種のクローン）についてダニアレルギー患者１０検体をプールした血清を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによるＩｇＥの免疫染色を行ったところ、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清を用いた免疫染色（実施例１２）と同様の結果が得られた。
【００７８】
実施例１４
ダニアレルゲン遺伝子（ｍａ１０クローン〜ｍａ１１５クローンの９種のクローン）の制限酵素地図の作製：
ｐＡＥＸ上で転写産物の発現が確認できたクローンについて、そのｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）に挿入された状態でプラスミド ＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で消化した。これをアガロースゲル電気泳動にかけた結果を分析した。
その結果を図４〜図１０に示す。尚、ｍａ１０クローン及びｍａ４４クローンは、用いた制限酵素の範囲では制限酵素切断部位を有しなかった。
【００７９】
実施例１５
ダニアレルゲン遺伝子（ｍａ１０クローン〜ｍａ１１５クローンの９種のクローン）の全塩基配列の決定：
前記実施例１４において作製した制限酵素地図をもとに、ジオキシターミネーション法により、ｍａ１０クローン、ｍａ３クローン、ｍａ１５クローン、ｍａ２９クローン、ｍａ４４クローン、ｍａ５０クローン、ｍａ１１３クローン、ｍａ１１４クローン、ｍａ１１５クローンについて全塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定したところ、それぞれ配列番号：１〜配列番号：９に示される塩基配列およびアミノ酸配列が得られた。
【００８０】
実施例１６
デレーション変異株の取得：
ダニアレルゲン遺伝子（ｍａ１０クローン）の転写産物におけるエピトープ解析を行なう目的で、本実施例および実施例１７を行なった。即ち、ｍａ１０クローンについて、ｃＤＮＡをｐＵＥＸ２上に挿入した状態でＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ （宝酒造社製）を用いてｃＤＮＡの下流からデレーションを行い、それらによるＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０５ の形質転換株を取得した。その方法は以下のプロトコールに従った。
【００８１】
デレーション変異プラスミドＤＮＡの調製のプロトコール：
ｃＤＮＡを挿入したｐＵＥＸ２（１０μｇ）をＢａｍ ＨＩおよび Ｐｓｔ Ｉで切断し、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのＭｇＣｌ_２ ，１０ｍＭのメルカプトエタノールを含む溶液１００μｌに溶解した後、２７０ユニットのエキソヌクレアーゼＩＩＩ を加え、２５℃でインキュベートしながら、１２０または２００秒間隔で１０μｌの反応混合液を採取した。直ちにこれを氷上で冷却し、１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＺｎＣｌ_２ ，１０％ グリセロールを含む１００μｌの４０ｍＭ Ｎａ−アセテート（ｐＨ４．５）を加え、６５℃で１０分間インキュベートした後、３７℃に冷却し、５ユニットのＭｕｎｇ Ｂｅａｎ ヌクレアーゼを添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。次いでフェノール／クロロホルム溶液で抽出しエタノールで沈澱させた。これを、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ，０．１ｍＭｄＮＴＰｓを含む５０μｌの７ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。この溶液に２ユニットのｋｌｅｎｏｗフラグメントを加えて３７℃で３０分間インキュベートした後、エタノールで沈澱させて４０μｌのＴＥに溶解し、Ｔ４のＤＮＡリガーゼによりライゲートさせて変異プラスミドＤＮＡを調製した。
【００８２】
図１１において、レーン１はデレーション前のｍａ１０クローンを示し、レーン２〜１２は各デレーション変異株を示し、レーン番号が大きくなるとともにデレーション変異株の塩基鎖長が短くなっている。なお、本実施例におけるデレーション変異株の取得方法については以下に詳しく記述する。
【００８３】
ｃＤＮＡを挿入したプラスミドベクターを用いて下記に示した方法に従い、デレーション変異プラスミドＤＮＡを調製した。これを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５への形質転換を行ない、デレーション変異株を取得した。
【００８４】
実施例１７
デレーション変異株の発現産物の免疫染色：
実施例１６で得られたデレーション変異株のうち、ｍａ１０クローンについて、実施例９（高発現ベクターｐＵＥＸ２による発現）で行ったのと同様に発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清及びダニアレルギー患者プール血清を用いて免疫染色した結果を図１１に示した。
【００８５】
ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清を用いた免疫染色の結果は、「 Ａｎｔｉ−Ｄｆｂ 」と記載された欄に示した。ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清では、２段階で活性が消失していると考えられた。図中の表示は、活性がレーン１とほぼ同一であったレーンは＋＋で、弱い活性であったレーンは＋で、活性が消失したものは−で示した。
ダニアレルギー患者プール血清を用いた免疫染色の結果は、「 ＩｇＥ 」 と記載された欄に示した。図中の表示は、活性を示したレーンは＋で、活性が消失したものは−で示した。
【００８６】
図１１に示す結果から、少なくともＥ１およびＥ２の部分にエピトープ部位の一部が含まれると考えられ、活性がレーン１とほぼ同一の活性を所持し且つ最小のｃＤＮＡをもつ変異株（レーン６）、ＩｇＥ に対する活性を所持せず且つ最大のｃＤＮＡ鎖長をもつ変異株（レーン７）のｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、少なくともエピトープの一部を含むと考えられるＥ２の一次配列を決定した（配列番号：１１）。同様に、弱いながらもＡｎｔｉ−Ｄｆｂに対する活性を所持し且つ最小のｃＤＮＡをもつ変異株（レーン９）、活性を所持せず且つ最大のｃＤＮＡ鎖長をもつ変異株（レーン１０）のｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、少なくともエピトープの一部を含むと考えられるＥ１の一次配列を決定した（配列番号：１０）。
【００８７】
実施例１８
ヒト由来７１ＫＤ熱ショックコグネートタンパク質（ｈｓｃ７１）と組換えダニアレルゲンｍａ２９との相同性
実施例４と同様の実験を行ない、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清に反応する２７３クローンを得た。該クローンには、ダニアレルギー患者血清中の特異ＩｇＥ抗体に反応し、その遺伝子断片が互いにハイブリダイズしない９クローンが含まれていた。決定したＤＮＡ塩基配列と推定アミノ酸配列のホモロジー検索の結果、７０ＫＤ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）に相同性を示す一遺伝子が見出された。７５２ｂｐから成る本遺伝子は１４５個のアミノ酸をコードしうるものであり（ｍａ２９，配列番号：４）、そのＮ末端の残基は、最も高い相同性（６５．５％）を示したヒト由来７１ＫＤ熱ショックコグネートタンパク質（ｈｓｃ７１）のアミノ酸配列（６４５個）中の５１２番目の残基に対応していた（図１２）。
【００８８】
ｍａ２９の遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ内発現産物に対する患者血清特異ＩｇＥ抗体の結合は、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清で阻害されたが、本発現産物はいわゆる主要抗原Ｄｅｒ ｆＩ及びＤｅｒ ｆＩＩと交差反応を示すものではなかった。また、患者血清から精製した本遺伝子産物に特異的なＩｇＥ抗体は、ダニ虫体抽出物中のＡＴＰ結合性６７ＫＤ成分に特異的に反応した。これらの結果は、屋内塵性ダニＤ．ｆａｒｉｎａｅ由来のｈｓｐ７０ファミリーが、これまで見逃されてきたダニアレルゲンの一つである可能性を強く示唆するものである。
【００８９】
実施例１９
組換えダニアレルゲンの精製
２−メルカプトエタノールの存在下に変性させた蛋白質を１２．５％ポリアクリルアミド上で分離し、クマシ−プリリアントブルーＲ−２５０で染色した。その結果を図１３に示す。図中、分子量はキロダルトンで左側に表してあり、レーン１は分子量マーカー、レーン２はｍａ２９挿入ｐＧＥＸ−２Ｔを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５形質転換体の全細胞溶解物（１０μｌ）、レーン３はグルタチオン固定セファロースカラムにより精製されたＧＳＴ−ｍａ２９（３μｇ）、レーン４は精製されたｍａ２９（３μｇ）、の泳動パターンをそれぞれ示す。
この結果はｍａ２９が精製されたことを示している。
【００９０】
実施例２０
ＩｇＥ−イムノブロティング
２−メルカプトエタノールの非存在下に変性させたＤｆｂ（２０μｇ／レーン、パネルＡ）と２−メルカプトエタノールの存在下に変性させた精製ｍａ２９（１μｇ／レーン、パネルＢおよびＣ）を１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースフィルムにブロットした。ブロット上でｍａ２９等とヒトＩｇＥとの特異的な結合を検出するために、ブロットを、ビオチン結合ヤギ抗−ヒトＩｇＥ抗体で処理し、続いてペロオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで処理した。
【００９１】
ヒト血清としては次のものを用いた。即ち、レーン１〜４ではダニアレルギーの個々の患者の血清を、レーン５および６では、ＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆＩＩに感受性（レーン５）または非感受性（レーン６）のダニアレルギー患者１０人の血清をプールしたものを、レーン７および８ではスギ花粉およびカンジダにそれぞれ特異的なアレルギー患者の血清であって、高いＩｇＥ濃度（それぞれ１，５００および１，６００ＩＵ／ｍｌ）を示すものを、レーン９では非アトピー性供与者の血清を、レーン１０では血清無添加を用いた。
パネルＣにおいては、ブロットのインキュベーション前にヒト血清をＤｆｂ（１０μｇを１００μｌの血清で希釈したもの）で前処理した。
図１４にその結果を示す。この結果は、パネルＡにおいてはダニアレルギー患者の血清のみが反応したことを示しており、パネルＢにおいては患者がＤｅｒｆＩまたはＤｅｒｆＩＩに感受性を有するか否かにかかわらず、反応したことを示しており、更にダニアレルギー患者の血清に対して特異的に反応したことを示している。パネルＣの結果は、Ｄｆｂの中にｍａ２９に相当するものが含まれていることを示している。
【００９２】
実施例２１
ｍａ２９特異的ＩｇＥに結合したネイティブ抗原の同定：
図１５中、分子量（キロダルトン表示）は左側に示してある。（Ａ）２−メルカプトエタノールの非存在下に変性させた蛋白質を１２．５％のポリアクリルアミドゲル上で分離し、クマシ−ブリリアントブル−Ｒ−２５０で染色した。（Ｂ）蛋白質のブロットをダニアレルギー血清から調製されたｍａ２９に特異的な抗体で覆った。ついでビオチン結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体およびペロオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで処理することにより、ｍａ２９とＩｇＥとの特異的結合を検出した。各パネルにおいて、蛋白質は次のようにチャージした。レーン１にはＤｆｂの１０ｍｇからのＡＴＰ結合画分を、レーン２には組換えｍａ２９（２μｇ）、レーン３にはネイティブのＤｅｒｆＩ（２μｇ）を、レーン４にはネイティブのＤｅｒｆＩＩ（２μｇ）をそれぞれチャージした。
図１５にその結果を示す。この結果は、ｍａ２９のネイティブなアレルゲンが、ＡＴＰと結合性を示す６７ＫＤの蛋白質であることを示している。
【００９３】
実施例２２
融合蛋白質として発現して得られる融合蛋白質（ＧＳＴ−ｍａ４４）及び組換えダニアレルゲンｍａ４４の精製：
プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ （アマシャム社製）のＳｍａＩ部位にダニアレルゲンｍａ４４の遺伝子を挿入し、Ｔ−４ ＤＮＡリガーゼで連結し、得られた組換えプラスミドをＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０５ に形質転換した。この形質転換株をストレプトマイシン３０μｇ／ｍｌ、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ｘＹＴ培地中、３７℃で、６００ｎｍのＯＤが１．０になるまで培養した。ついで、最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加した後３時間目に集菌し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した。再度集菌した細胞を２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％の２−メルカプトエタノールを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で超音波処理することにより溶解し、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合したｍａ４４を含む不溶性画分を回収した。次いで、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、２リットルの培養液から３．７５ｍｇの融合蛋白質（ＧＳＴ−ｍａ４４）を６７ＫＤのバンドから得た。得られた融合蛋白質を、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２．５ｍＭのＣａＣｌ_２ を含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）中、トロンビン（１μｇ／５００μｇ融合蛋白質）で消化し、ｍａ４４からＧＳＴを切り離し、ついでＧＳＴを除去するため、５０％（Ｖ／Ｖ）グルタチオン固定化セファロースカラムにかけ、さらにブチル−セファロースカラムでｍａ４４の精製を行った。得られた精製ｍａ４４はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４０ＫＤの単一のバンドを還元条件下のゲル上で示した。
【００９４】
実施例２３
組換えダニアレルゲンｍａ４４における皮内反応試験
組換えダニアレルゲンｍａ４４のアレルゲン活性をダニアレルギー患者９例及び健常者１例に対して皮内反応試験で検定した。尚、皮内反応試験の前に、組換えダニアレルゲンｍａ４４中に含まれるエンドトキシンの量をトキシカラーシステム（ＬＳ−６セット、生化学工業社製）を用いて測定したところ、エンドトキシンの量は１．０ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【００９５】
実施例２４
ドットブロットテスト（Ｄｏｔ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ｔｅｓｔ）
組換えダニアレルゲンｍａ４４の０．１、０．０１、０．００１％溶液の１μｌをニトロセルロースフィルム（ハイボンド−Ｃ、アマシャム社製）にブロットし、ブロッキング溶液（３％スキムミルク、１５０ｍｌのＮａＣｌ、０．０２％チメロサール、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍｍｏｌトリス塩酸バッファー〔ｐＨ７．５〕溶液）に室温で１時間浸漬した。ついで、ＩｇＧ染色のために、ダニアレルギー患者のプール血清の１０倍希釈液をシート上に注ぎ、冷所で一夜インキュベートした。
【００９６】
このシートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で完全に洗浄したのち、ビオチンと結合したヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ザ バインディンサイト社製）を含むＴＢＳＴ溶液中に室温で１時間反応した。ついで、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（タゴ社製）を含むＴＢＳＴ溶液に室温で１時間浸漬した。ＴＢＳＴで完全に洗浄した後、免疫反応をしたスポットは、シートを０．０３％の過酸化水素、０．０３％塩化ニッケル、０．０６％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を含む５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）とともにインキュベートすることにより、検出した。
シートを乾燥した後、着色したスポットを対照として用いたＤｆｂ、ＤｅｒｆＩ（ダニアレルゲンＤｅｒ ｆＩ）、Ｄｅｒ ｆＩＩ（ダニアレルゲンＤｅｒｆＩＩ）およびスギ（スギ花粉）と比較した。
【００９７】
その結果を表１に示す。表中、＋、＋＋および＋＋＋は、それぞれ着色した抗原濃度が０．１％、０．０１％および０．００１％であることを示す。その結果、Ｄｅｒ ｆＩ、Ｄｅｒ ｆＩＩに匹敵する強力なアレルゲンであることを示している。
【００９８】
【表１】

【００９９】
【発明の効果】
本発明により、ダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキシー誘発性の不純物を含まない安全かつ有効な組換えダニアレルゲンを提供することが可能となった。
【０１００】
【配列表】

【０１０１】

【０１０２】

【０１０３】

【０１０４】

【０１０５】

【０１０６】

【０１０７】

【０１０８】

【０１０９】

【０１１０】

【図面の簡単な説明】
【図１】組換えプラスミドｐＡＥＸの構築を示した図である。
【図２】実施例１１において発現されたダニアレルゲン融合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、抗β−ガラクトシダーゼ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによる免疫染色を行った結果を示す。図中、レーンｍａ１０〜ｍａ１１５は融合蛋白質の免疫染色を、レーンＣは分子量マーカー（β−ガラクトシダーゼ：約１１．６万）を示す。
【図３】実施例１２において、各クローン（ｍａ１０クローン〜ｍａ１１５クローン）について、ウサギ抗ダニ虫体粗抗原血清を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによる免疫染色を行った結果を示す。
【図４】ダニアレルゲン（ｍａ３クローン）をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示した図である。
【図５】ダニアレルゲン（ｍａ１５クローン）をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示した図である。
【図６】ダニアレルゲン（ｍａ２９クローン）をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示した図である。
【図７】ダニアレルゲン（ｍａ５０クローン）をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示した図である。
【図８】ダニアレルゲン（ｍａ１１３クローン）をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示した図である。
【図９】ダニアレルゲン（ｍａ１１４クローン）をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示した図である。
【図１０】ダニアレルゲン（ｍａ１１５クローン）をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図を示した図である。
【図１１】実施例１７において、ｍａ１０クローンのディレーションミュータントに関する抗原活性の有無を示した図である。
【図１２】ダニアレルゲンｍａ２９とヒト由来７１ＫＤ熱ショックコグネートタンパク質（ｈｓｃ７１）のアミノ酸配列における相同性を示す図である。
【図１３】ダニアレルゲンｍａ２９およびＧＳＴ−ｍａ２９の電気泳動パターンを示す図である。
【図１４】ダニアレルゲンｍａ２９のヒトＩｇＥに対する特異的結合を示す図である。
【図１５】ダニアレルゲンｍａ２９に特異的なＩｇＥに結合するネイティブな抗原の同定を示す図である。

Claims (60)

1. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：１）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
2. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：２）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
3. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：３）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
4. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：４）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
5. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：５）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
6. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：６）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
7. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：７）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
8. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：８）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
9. ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：９）を含んでいる組換えダニアレルゲン。
   

   
10. 請求項１〜９いずれか記載の遺伝子がコナヒョウヒダニ虫体由来の遺伝子である請求項１〜９いずれか記載の組換えダニアレルゲン。
11. 分子量が約19,000(SDS-PAGE)である請求項１又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
12. 分子量が約34,000(SDS-PAGE)である請求項２又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
13. 分子量が約22,000(SDS-PAGE)である請求項３又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
14. 分子量が約17,000(SDS-PAGE)である請求項４又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
15. 分子量が約33,000(SDS-PAGE)である請求項５又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
16. 分子量が約28,000(SDS-PAGE)である請求項６又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
17. 分子量が約38,000(SDS-PAGE)である請求項７又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
18. 分子量が約18,000(SDS-PAGE)である請求項８又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
19. 分子量が約32,000(SDS-PAGE)である請求項９又は１０記載の組換えダニアレルゲン。
20. 全塩基鎖長が約０．５０ kbp（アガロース電気泳動法）である請求項１記載の組換えダニアレルゲン。
21. 全塩基鎖長が約１．０５ kbp（アガロース電気泳動法）であって、図４の制限酵素地図を有する遺伝子の発現によって得られるものである請求項２記載の組換えダニアレルゲン。
22. 全塩基鎖長が約１．６６ kbpアガロース電気泳動法）であって、図５の制限酵素地図を有する遺伝子の発現によって得られるものである請求項３記載の組換えダニアレルゲン。
23. 全塩基鎖長が約０．７５ kbp（アガロース電気泳動法）であって、図６の制限酵素地図を有する遺伝子の発現によって得られるものである請求項４記載の組換えダニアレルゲン。
24. 全塩基鎖長が約０．９９ kbpアガロース電気泳動法）である請求項５記載の組換えダニアレルゲン。
25. 全塩基鎖長が約０．９０ kbp（アガロース電気泳動法）であって、図７の制限酵素地図を有する遺伝子の発現によって得られるものである請求項６記載の組換えダニアレルゲン。
26. 全塩基鎖長が約１．２６ kbp（アガロース電気泳動法）であって、図８の制限酵素地図を有する遺伝子の発現によって得られるものである請求項７記載の組換えダニアレルゲン。
27. 全塩基鎖長が約０．６２ kbp（アガロース電気泳動法）であって、図９の制限酵素地図を有する遺伝子の発現によって得られるものである請求項８記載の組換えダニアレルゲン。
28. 全塩基鎖長が約１．０４ kbp（アガロース電気泳動法）であって、図１０の制限酵素地図を有する遺伝子の発現によって得られるものである請求項９記載の組換えダニアレルゲン。
29. 請求項１〜９のいずれかに記載の組換えダニアレルゲンが他の蛋白質と融合していることを特徴とする融合組換えダニアレルゲン。
30. 請求項２９記載の他の蛋白質がβ−ガラクトシダーゼである請求項２９記載の融合組換えダニアレルゲン。
31. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：１）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
32. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：２）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
33. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：３）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
34. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：４）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
35. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：５）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
36. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：６）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
37. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：７）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
38. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：８）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
39. 分子中に以下のアミノ酸配列（配列番号：９）を含むアレルゲン活性を有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
40. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：１）を含むものである請求項３１記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
41. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：２）を含むものである請求項３２記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
42. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：３）を含むものである請求項３３記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
43. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：４）を含むものである請求項３４記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
44. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：５）を含むものである請求項３５記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
45. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：６）を含むものである請求項３６記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
46. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：７）を含むものである請求項３７記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
47. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：８）を含むものである請求項３８記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
48. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：９）を含むものである請求項３９記載のダニ虫体由来の遺伝子。
    

    
49. 配列番号：１において示される塩基配列において、少なくとも上流より約１９０ bp 〜約２４０ bp 、約２９０ bp 〜約３８０ bp または約１９０ bp 〜約３８０ bp の領域内にコードされているアミノ酸配列を含有してなるダニアレルゲン断片。
50. 以下のアミノ酸配列（配列番号：１０）：
    

    

    を含有してなり、抗原性を有するダニ虫体由来ペプチド。
51. 以下のアミノ酸配列（配列番号：１１）：
    

    

    を含有してなり、抗原性を有するダニ虫体由来ペプチド。
52. 請求項５０または５１記載のペプチドをコードしている遺伝子。
53. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：１０）を含有する請求項５２記載の遺伝子。
    

    
54. 以下のＤＮＡ配列（配列番号：１１）を含有する請求項５２記載の遺伝子。
    

    
55. 形質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞中において、請求項３１〜４８いずれかに記載の遺伝子を発現させ得る発現ベクター。
56. 請求項５５記載の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞。
57. 請求項５６記載の細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法。
58. 請求項５６記載の細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、融合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダニアレルゲンを回収し、次いで、融合している他の蛋白質を脱離せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法。
59. 請求項１〜２８記載の組換えダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。
60. 請求項１〜２８記載の組換えダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。

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