SE515819C2 - Protein från kvalstret Sarcoptes scabiei - Google Patents

Description

25 30 515 819 2 gens och metoder. Den enda väsentliga nackdelen är den begränsade mängden anti- gent material som firms tillgängligt på grund av avsaknaden av ett in vitro- propageringssystem för S. scabiei.

Arlian et al. (J. Med. Entomol. (1988) 25:52) har utvecklat ett in vivo- propageringssystem efter att ha fastställt närvaro av S. scabiei var. canis på kaniner.

Parasitbelasningen är emellertid fortfarande tämligen låg och metoden kan inte an- vändas för framställning av antigener för storskaliga screeningsprojekt. Kvalster från naturligt infekterade rödrävar har framgångsrikt isolerats i stora antal och utnyttjats i ELISA för både hundar och grisar. De svårigheter som följer med att använda vilda rävar som källa till antigentillförsel är emellertid uppenbara.

Denna avsaknad av material har inte bara begränsat storskaliga screeningsansträng- ningar och kontrollprogram bland tamdjur, utan har också begränsat möjligheten att studera andra aspekter av skabb, exempelvis patogenes.

EP 0 473 lll tillhandahåller ett rekombinant kvalsterallergen, vilket är verksamt som ett terapeutiskt medel och diagnostikt reagens för kvalsterallergisjukdomar.

Kvalsterallergenet enligt denna referens härrör emellertid från husdammskvalster, och mer speciellt från Dermatophagoides farinae. Nänmda husdannnskvalster åter- finnes sålunda först och främst fritt i en hushållsrniljö och lever inte som parasit på någon värd. Sålunda är inte sjukdom orsakad därav resultatet av en infektion, utan av inhalering av kvalster eller kvalsterkroppfragment eller kvalsteravföring. Inhale- ring av husdammskvalster kan orsaka allergiska reaktioner i mottagliga individer, vilket resulterar i andningsstömingar, såsom astma och rinit. Följaktligen hänför sig EP O 473 lll till molekyler som är användbara vid diagnos och förebyggande av sådana tillstånd.

Sarnmarifattriing av umlfniningen Problemen som definierades ovan löses enligt föreliggande uppfinning genom att ett nytt väsentligt kvalsterantigen åstadkommes, vilket nu för första gången har isolerats 10 15 20 25 30 515 819 3 och sekvenerats. Sålunda hänför sig uppfinningen till ett isolerat, antigent protein såväl som till nukleinsyran som kodar för nämnda nya protein, såsom defineras i de bifogade patentkraven. Vidare hänför sig uppfirmingen också till olika fördelaktiga ariväiitliiiiigai' av det nya proteinet samt funktionella fragment darav, t ex vid immu- nologisk testning, såsom i ELISA-metoder.

Kort beskrivning av ritningama Figur 1 visar utsträckiiingen av det rekombinanta proteinet enligt uppfinningen järn- fört med det nativa proteinet.

Figur 2 illustrerar den rekombinanta plasmiden pPU17 som används för expression av kvalsterproteinet enligt uppfinningen.

Figur 3 är en sammanfattning av kloningsstrategin för Sïänden av MSA.

Figur 4 visar resultaten av Westem-blotanalys av det rekombinanta kvalsterprotei- net enligt uppfinningen.

Definitioner Uttrycket ”polypeptid”, ”peptid” och ”protein” används utbytbart här avseende en polymer av aminosyraenheter. Uttrycket avser aminosyrapolymerer, i vilka en eller flera aminosyraenheter är artificiella kemiska analoger av en motsvarande naturligt förekommande aminosyra såväl som naturligt förekommande aminosyrapolymerer.

Uttrycket ””nukleinsyra”” avser en deoxiiibonukleotid- eller ribonukleotidpolymer i antingen enkelsträngad eller dubbelsträngad form, och omfattar, om inte armat an- ges, kända analoger av naturliga nukleotider, som kan fimgera på ett liknande sätt som naturligt förekommande nukleotider.

Uttrycket ”hybridiserar specifikt till” avser bindning, duplexbildning eller hybridise- ring av en molekyl enbart till en speciell nukleotidsekvens under stringenta betingel- ser när den sekvensen fmns närvarande i en komplex blandning (t ex en total cellu- lär blandning) av DNA eller RNA. Uttrycket ”stringenta betingelser” avser betingel- ser, under vilka en prob hybridiseras till sin mâlsubsekvens, men inte till några = . | u -n 10 15 20 25 515 819 4 andra sekvenser. Stringenta betingelser är sekvensberoende och är olika under olika omständigheter. Längre sekvenser hybridiserar specifikt' vid högre temperaturer.

Allmänt gäller att stringenta betingelser väljes till att vara cirka 5°C under den ter- miska smäitpunkten Tm for den speciñka sekvensen vid definierad jonstyrka och pH. lfrågavarande Tm är den temperatur (under definierad jonstyrka, pH och nukleinsy- rakoncentration) vid vilken 50% av probema som är komplementära till målsekven- sen hybridiserar till målsekvensen vid (Eftersom målsekvensema i all- mänhet fmns närvarande i överskott gäller att vid Tm är 50% av probema upptagna vid jämnvikt.) Typiskt är stringenta betingelser sådana under vilka saltkoncentratio- nen är lägre än cirka 1,0 M Na-jon, typiskt cirka 0,01 till 1,0 M Na-jonkoncentration (eller av andra salter) vid pH 7,0 till 8,3 och temperaturen är åtminstone cirka 30°C för korta prober (t ex 10 till 50 nukleoder) och åtminstone cirka 60°C för långa pro- ber (t ex mer än 50 nukleotider). Stringenta betingelser kan också erhållas genom tillsats av destabiliserande medel, såsom fonnamid.

En ”märkning” är en komposition som kan detekteras genom spektroskopiska, foto- kemiska, biokemiska, immunokeniiska eller kemiska metoder. Användbara märk- ningar inkluderar exempelvis 32P, fluorescenta färgänmen, elektrontäta reagens, en- zymer (t ex såsom vanligen används i ELISA), biotin, dioxigenin eller haptener och i proteiner, för vilka antisera eller monoklonala antikroppar fmns tillgängliga.

En ”nukleinsyraprob” definieras här som en nukleinsyra, vilken uppvisar förmåga att binda till en målnukleinsyra eller komplementär sekvens genom en eller flera ty- per av kemiska bindningar, vanligen genom komplementär baspaming, vanligen ge- nom vätebindningsbildning. Såsom det används här kan en prob inkludera naturliga (dvs A, G, C, U eller T) eller modifierade baser (7-deazaguanosin, inosin, etc).

Dessutom kan basema i en prob förenas genom någon annan koppling än en fosfo- diesterbindning, så länge som den inte stör hybridisering. 10 15 20 25 30 515 819 5 En ”märkt nukleinsyraprob” är en nykleinsyraprob, som är bunden, antingen kova- lent genom en länk eller genom joniska, van der Waals-eller vätebindningar till en sådan märkning att närvaro av proben kan detekteras genom detektering av närvaro av nlåiluliirgcii hunden vid proben.

Uttrycket ”målnukleinsyra” avser en nukleinsyra (ofta härledd från ett biologiskt prov), till vilken en nukleinsyraprob är skräddarsydd för att hybridisera specifikt.

Det är antingen närvaro eller avsaknad av målnukleinsyran som skall detekteras och mängden av målnukleirisyran som skall kvantifieras. Målnukleinsyran har en se- kvens, som är komplementär med nukleinsyrasekvensen för motsvarande prob riktad mot målet. Uttrycket målnukleinsyra kan avse den specifika subsekvensen av en större nukleinsyra, till vilken proben är riktad, eller till den totala sekvensen (t ex gen eller mRNA), vars expressionsnivå man önskar detektera. Skillnaden i använd- ning framgår av sammanhanget.

”Subsekvens” avser en sekvens av nukleinsyror eller aminosyror, som innefattar en del av en längre sekvens av nukleinsyror respektive aminosyror (t ex en polypeptid).

”Kombinatoriskt bibliotek” betyder ett bibliotek av molekyler som innehåller ett stort antal, typiskt mellan 103 och 106, oligomerer av olika sekvens, vilka typiskt kännetecknas av att de har olika sekvenser eller subenheter, eller en kombination av olika sekvenser av sidokedjor och länkar, eller på olika sätt substituerade föreningar i ett bibliotek av små föreningar.

”Oligomerförenjngar av olika sekvens” är oligomerer, såsom oligonukleotider, oli- gonukleotidanaloger, oligopeptider, oligopeptidanaloger, oligosackarider eller lipo- peptider med olika permutationer av lipid och/eller sekvenser i peptidenhetema, glykoproteiner med olika sekvenspennutationer i sackarid- och/eller peptidenheter- na, icke-biologiska oligomerer med permutationer av olika sekvens, eller på olika sätt substituerade föreningar i ett bibliotek av små föreningar. » . . . n 10 20 25 30 515 819 6 När uttrycket ”rekombinant” används under referens till en cell, en nukleinsyra eller en vektor betyder det att cellen, nukleinsyran eller vektom har modifierats genom införande av en heterolog nukleinsyra eller förändring av en nativ nukleinsyra, eller också att cellen är liärledd från 'en så modifierad cell. Sålunda uttrycker rekombr- nanta celler exempelvis gener som inte återfmnes i nativ (icke-rekombinant) form av cellen eller uttrycker nativa gener, som annars uttryckes i abnonn omfattning, är un- deruttryckta eller inte uttrycks alls. Vidare avser uttrycket ”rekombinant” även en cell, där ytterligare reglerande element har införts i syfte att initiera eller befrämja expression av en för övrigt tyst endogen gen, eller där en manipulering av de regle- rande elementen har utförts för samma ändamål. (För ett exempel på en sådan gen- aktiveringstelcriik, se t ex Genetic Engineering News, 15 april, 1994).

Uttrycket ”identisk” i samband med två nukleinsyra- eller polypeptidsekvenser avser de enheter i de två sekvensema, som är samma då de är uppställda for maximalt motsvarande. Optimal uppställning av sekvenser för järnförelse kan exempelvis ut- föras medelst lokalhomologialgoritmen enligt Smith och Waterman (1981) Adv.

Appl. Math. 2: 482, genom homologiuppställningsalgoritmen enligt Needleman och Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 482443, medelst metoden för sökande efter likhet enligt Pearson och Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, genom datorise- rade implementeringar av dessa algoritmer (GAP, BESTFIT, FASTA och TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) eller genom inspektering.

En ytterligare algoritm som är lämplig för bestämning av sekvenslikhet är BLAST- algoritrnen, vilken beskrivs i Altschul et al. (1990) .I Mol. Biol. 215: 403-410.

Mjukvara för utförande av BLAST-analyser finns allmänt tillgängliga genom Natio- nal Center for Biotechnology Information (httpzwvvwnbcbinlmnihgovl). (Se He- nikoff och Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919; samt Karlin och Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787; for ytterliga- re information i detta sammanhang.) « . . - . -ø 10 15 20 25 30 515 819 7 Uttrycket ”väsentlig identitet” eller ”väsentlig likhet” i samband med en polypeptid betyder att en polypeptid irmefattar en sekvens med åtminstone 70% sekvensidenti- tet med en referenssekvens, eller företrädesvis 80% eller ärmu hellre 85% sekvens- identitet med referensselcvelisell, eller allra helst 90% identitet i ett järnrörelsetöns- ter av cirka 10-20 aminosyraenheter. En indikation på att två polypeptidsekvenser är väsentligen identiska är att en peptid är immunologiskt reaktiv med antikroppar rikt- ade mot den andra peptiden. Sålunda är en polypeptid väsentligen identisk med en andra polypeptid exempelvis då de två peptiderna skiljer sig åt enbart genom en konservativ substitution.

En indikation att två nukleinsyrasekvenser är väsentligen identiska är att den poly- peptid som den första nukleinsyran kodar för är irnmunologiskt korsreaktiv med den polypeptid som kodas av den andra nukleinsyran. En annan indikation på att två nukleinsyrasekvenser är väsentligen identiska är att de två molekylema hybridiserar till varandra under stringenta betingelser.

”Binder väsentligen” avser komplementär hybridisering mellan en probnukleinsyra och en målnukleinsyra och omfattar mindre felmatchningar som kan infogas genom reduktion av stringensen av hybridiseringsmediet för att erhålla önskad detektion av målpolynukleotidsekvensen.

Uttrycket ”antikropp” avser en polypeptid, som huvudsakligen kodas av en immu- noglobulingen eller flera immunoglobulingener, eller fragment därav, vilka binder specifikt till, och känner igen, en analyt (antigen). De igenkända irnmunoglobulin- genema inkluderar kappa-, larnbda-, alfa-, gamma-, delta-, epsilon- och mu- konstanta regiongener, såväl som ett otal gener för den variabla regionen av irnmu- noglobulin. Lätta kedjor klassificeras antingen som kappa eller lambda. Tunga ked- jor klassificeras som garnrna, mu, alfa, delta eller epsilon, vilka i sin tur definierar immunoglobulinklassema IgG, IgM, IgA, lgD respektive IgE. (Se i detta samman- hang Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. 1993) . . . | .- 10 15 20 25 30 515 819 En ”chimär antikropp” är en antikroppsmolekyl, i vilken (a) den konstanta regionen, eller en del därav, har förändrats, ersatts eller bytts ut så att det antigenbindande sä- tet (den *Jaiabla fenomen) är kopplad till en koiistaiii region av en annan eller för- ändrad klass, effektorfuriktion och/eller art, eller en helt annan molekyl, vilken ger den chimära antikroppen nya egenskaper, t ex enzym, toxin, hormon, tillväxtfaldor, läkemel etc; eller (b) den variabla regionen, eller en del därav, har förändrats, ersatts eller bytts ut mot en variabel region, som har en arman eller förändrad antigenspeci- ficitet.

Uttrycket ”irnmunoassay” är en assay eller analys, där en antikropp utnyttjas för att specifikt binda en analyt. Iinmunoanalysen karakteriseras genom användning av specifika bindningsegenskaper av en speciell antikropp för att isolera, söka upp och/eller kvantifiera analyten.

Uttrycken ”isolerad”, ”renad” eller ”biologiskt ren” avser material, vilket är väsent- ligen eller huvudsakligen fritt från komponenter som normalt åtföljer det som det återfinnes i sitt naturliga tillstånd.

Uttrycken ”binder specifikt till ett protein” eller ”är specifikt iinmunoreaktiv med”, under referens till en antikropp, avser en bindningsreaktion som är bestämmande för närvaron av proteinet i närvaro av en heterogen population av proteiner eller andra biologiska substanser. Under angivna irnmunoanalysbetingelser binder sålunda de specificerade antikropparria huvudsakligen till ett speciellt protein och det binder inte i någon väsentlig omfattning till andra proteiner som finns närvarande i provet.

Specifik bindning till ett protein under sådana betingelser kräver en antikropp, som har valts ut för sin specificitet för ett speciellt protein. Ett antal olika inirnunoassay- forrnat kan användas för selektering av antikroppar som är specifikt irnmunoreaktiva med ett speciellt protein. Exempelvis använder man rutinmässigt fastfas-ELISA- immunoanalyser för att selektera monoklonala antikroppar som är specifikt iinmu- noreaktiva med ett protein. Se Harlow och Lane (1988) Antibodzfes, A Laboratory 10 20 25 30 515 819 9 Manual, Cold Spring Harbour Publications, New York, för en beskrivning av irn- munoanalysformat och betingelser som kan användas för bestämning av specifik immunoreaktivitet.

En ”konservativ substitution” avser då man beskriver ett protein en förändring i aniinosyrasanunansätming av proteinet, vilken inte väsentligen förändrar proteinets aktivitet. ”Konservativt modifierade variationer” av en speciell aminosyrasekvens avser sålunda aniinosyrasubstitutioner av de aminosyror, som inte är kritiska för proteinaktivitet, eller substitution av aminosyror med andra aminosyror som har lik- nande egenskaper (t ex sura, basiska, positivt eller negativt laddade, polära eller opolära etc), så att substitutionema av till och med kritiska aminosyror inte väsentli- gen förändrar aktiviteten. Se t ex Creighton (1984) Protein, W.H. Freeman och Company. Dessutom är också enskilda substitutioner, deletioner eller additioner, vilka förändrar, lägger till eller tar bort en enda aminosyra, eller en liten procentan- del av aminosyroma, i en kodad sekvens ”konservativt modifierade variationer”.

Såsom uttrycket ”genprodukt” används här avses en nukleinsyra, vars närvaro, av- saknad, kvantitet eller nukleinsyrasekvens är en indikation på närvaro, avsaknad, kvantitet eller nukleinsyrasaniinansättriing av genen. Genprodukter som inkluderar, men inte är begränsade till, ett mRNA-transkiipt, en cDNA som har transkiiberats omvänt från mRNA samt RNA transkiiberad från sådan cDNA, DNA amplifierad från närrmda cDNA, RNA transkiiberad fiån nämnda amplifierade DNA eller sub- sekvenser av vilken som helst av dessa nukleinsyror. Polypeptider uttryckta av ge- nen, eller subsekvenser därav, är också genprodukter. Den speciella typen av gen- produkt framgår klart av sammanhanget då uttrycket används.

Detaljerad beskrivning av unnfiririíngen En första aspekt av föreliggande uppfinning är ett isolerat protein härlett från kvals- ter, vilket är ett antigen härlett från kvalstret Sarcoptes scabiei. Mer specifikt består proteinet enligt uppfinningen av delar av, eller hela, den sekvens som visas i SEKV.

ID NR 2. Uppfinningen hänför sig mer speciellt till ett protein som består av åtmin- 10 15 20 25 30 515 819 10 stone ca 83 aminosyror av nämnda sekvens, företrädesvis de som beskrivs i SEKV.

ID NR 3, en analog eller ett funktionellt fragment därav. I en specifik utföringsfonn består proteinet enligt uppfinningen av åtminstone cirka 100 aminosyror, företrädes- vis åtminstone cirka 200, såsom åtrniiistoiie cirka 400 aminosyror av sekvensen vi- sad i SEKV. ID NR 2. I en specifik utföringsfonn innefattar proteinet enligt uppfin ningen cirka 400 av de sista aminosyrorna av SEKV. ID NR 2 och ännu hellre se- kvensen från cirka aininosyra nr 344 till aminosyra nr 770 av nämnda sekvens, vil- ket protein har betecknats ”Major Sarcoptes Antigen l” (MSA 1) av föreliggande uppfnmare. I en annan speciell utföringsfonn innefattar aminosyrasekvensen för fö religgande protein en större del av nämnda sekvens, såsom åtminstone cirka 400, företrädesvis åtminstone cirka 500, tex åtminstone cirka 600 och allra helst åtmin- stone cirka 700, såsom 770 aminosyror av nänmda sekvens, i vilket fall den är vä- sentligen identisk med sekvensen visad i SEKV. ID NR 2. I detta sammanhang för- stås det att alla derivat, analoger och funktionella fragment och funktionella subse- kvenser av föreliggande proteiner också faller inom ramen för uppfinningen såsom den definieras av patentkraven.

Sålunda hänför sig ovan nänmda EP 0 473 111 till isolering av en organism, hus- damrnskvalster, vilken naturligt förekommer i andra rniljöer än Sarcoptes scabiei, som är en parasit i huden hos djur, såsom vilda rävar, svin etc, samt människa. Följ- aktligen är de fairnaceutiska och diagnostiska applikationer som möjliggörs genom EP 0 473 111-antigenet lämpade för andra förhållanden och andra individer än anti- genet enligt föreliggande uppfmning, vilket huvudsakligen hänför sig till behandling och/eller diagnos av lantbriiksdjur, såsom svin, eller hundar. Även om det existerar en viss likhet mellan proteinet härlett från husdammskvalster enligt EP 0 473 111 och Sarcoptes scabiei-proteinet isolerat och sekvenerat enligt föreliggande uppfin- ning är följaktligen skillnadema i miljöer och betingelser för att förebygga och/eller diagnostisera av sådan betydelse att O 473 111 måste betraktas som avseende ett an- nat område än föreliggande uppfinning. « | v v H 10 15 20 25 30 515 819 11 I en speciellt fördelaktig utföringsfonn är proteinet enligt uppfmningen ett rekombi- nant protein, vilket utöver en fimktionell del av, eller hela, sekvensen som beskrivs i SEKV. ID NR 2 också innefattar ett ”handtag” (tag), såsom en konventionell ytterli- Je niiinosyrasekvens, 'vilken ger egenskaper som underlättar rening, nedströms- analys, såsom Westem-blot, reversibel immobilisering, immunoutfällning, immuno- fluorescensanalys etc. Ett sådant handtag kan t ex vara peptid His6. I en speciell ut- föringsform är föreliggande uppfmning ett fusionsprotein, där föreliggande protein, eller en funktionell subsekvens därav, är fusionerad med ett armat protein, såsom ß- galaktosidas, glutation-S-transferas, protein A etc. Vad gäller fusionsproteiner, se tex Smith och Johnson (1988) Gene 67:31; Hopp et al. (1988) Biotechnology 6: 1204; La Vallie et al. (1993) Biotechnology 11:187.

I en ytterligare utföiingsforrn används föreliggande protein, eller en fiinktionell sub- sekvens därav, för framställning av peptidomimetiska föreningar, dvs molekyler som avspeglar peptidens biologiska aktivitet, men som inte längre är fullständigt pepti- diska till sin natur. Sålunda framställs peptidomimetiska föreningar enligt uppfm- ningen för att åstadkomma molekyler som är mer fördelaktiga än peptidema i sig vad gäller t ex storlek, biotillgänglighet, varaktighet av effekten, stabilitet, förvaring, irnmunoreaktivitet etc. Se i detta sammanhang t ex Dean (1994), BioEssays, 683- 687, Cohen och Shatzmiller (1993), J Mol. Graph., 112166-173.

Vidare kan antigenet enligt uppfinningen användas i olika andra metoder för design ocli/eller identifiering av nya föreningar, såsom i kombinatoriska bibliotek. Sådana metoder möjliggör för ett modemt läkemedelslaboratorium att producera och scree- na niiljoner nya kemiska och/eller biologiska föreningar på ett par veckor med avse- ende på ett antal olika användningsområden. Av det stora antal föreningar som pro- duceras analyseras enbart de som uppvisar intressant biologisk aktivitet för ytterliga- re testning och experiment. Metoder for kombinatoriska bibliotek är välkända, se t ex US-patentskriftema nr 5 753 187 och 5 763 263, och kan lätt arrangeras baserat på föreliggande uppfinning. En ytterligare aspekt av föreliggande uppfinning är an- 10 15 20 25 30 515 819 12 vändning av antigenet enligt uppfinningen i metoder för så kallad high-throughput- screening för identifiering av en ny förening. Sådana metoder finns tillgängliga för automatiserad, kostnadseffektiv high-throughput-sceeriing och kan användas direkt ett brett område *v prograiii för utveckling av diagnostiskt och/eller farmaceu- tiskt aktiva föreningar. Vidare omfattar föreliggande uppfinning även vilken som helst förening, som kan erhållas genom, dvs nås genom, användning av vilken som helst av de här beskrivna metodema.

Mer specifikt jämför sig uppfinningen sålunda till ett förfarande för screening avse- ende protein- eller peptidanaloger, vilka avspeglar åtminstone en del av strukturen av proteinet enligt uppfinningen, vilket förfarande innefattar stegen att man (a) framställer ett stort antal analoga strukturer och (b) selekterar en analog struktur, där den tredimensionella konfigurationen och rymdairangemanget av en eller flera biologiskt aktiva regioner, företrädesvis an- tigena regioner, förblir väsentligen bevarade.

I en specifik utföringsfonn avser screeningen analoger som avspeglar ett protein, vilket har aminosyrasekvensen som visas i SEKV. ID NR 3. Vidare omfattar upp- finningen även en analog identifierad såsom beskrivits ovan. Analoger identifierade medelst föreliggande förfarande används fördelaktigt för samma ändamål som prote- inema enligt uppfinningen, där nänmda användningsområden är beskrivna på andra ställen i föreliggande beskrivningsdel.

Föreliggande proteiner, funktionella subsekvenser därav etc kan syntetiseras med användning av standardmässiga tekniker för kemisk peptidsyntes. Där de önskade subsekvenserna är tämligen korta (t ex när en speciell antigen determinant önskas), då kan molekylen syntetiseras som en enda sammanhängande polypeptid. När större molekyler önskas kan subsekvenser syntetiseras separat (i en eller flera enheter) och sedan fusioneras genom kondensering av aminoänden av en molekyl med karboxyl- änden av en annan molekyl, varpå en peptidbindning bildas. . | v | H 20 30 5815 819 13 Fastfassyntes, i vilken den C-terminala aminosyran av sekvensen anknyts till en olöslig bärare, vilket följs av successiv tillsats av de återstående arninosyrorna i sek- vensen, är den föredragna metoden för kemisk syntes av polypeptidema enligt upp- firniingen. Tekniker för fastfassyiites beskrivs av Barany och lvlerrífield, Solid- Phase Peptide Synthesis; s. 3-284 i The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, PartA., Merrifield, et al. J. Am. Chem.

Soc., 85: 2149-2156 (1963), samt Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2:a uppl. Pierce Chem. Co., Rockford, Il 1. (1984).

I en alternativ utföringsfonn syntetiseras föreliggande proteiner, eller subsekvenser därav, med användning av rekombinant DNA-metodologi, Allmänt innefattar detta att man skapar en DNA-sekvens, som kodar för fusionsproteinet, placerar ifrågava- rande DNA i en expressionskassett under kontroll av en speciell promotor, uttrycker proteinet i en värd, isolerar det uttryckta proteinet och, om så erfordras, renaturerar proteinet.

DNA som kodar för föreliggande proteiner, eller subsekvenser därav, kan framstäl- las medelst vilken som helst lämplig metod, inklusive t ex kloning och restriktion av lämpliga sekvenser eller direkt kemisk syntes medelst sådana metoder som fosfotri- esterrnetoden enligt Narang et al. Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979); fosfodiester- metoden enligt Brown et al., Meth Enzymol. 68: 109-151 ( 1979); dietylfosforami- ditmetoden enligt Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (l98l); samt metoden med fast bärare enligt US-patentskrift nr 4,458,066.

Kemisk syntes ger en enkelsträngad oligonukleotid. Denna kan omvandlas till dub- belsträngad DNA genom hybridisering av komplementär sekvens eller genom poly- merisering med ett DNA-polymeras med användning av enkelsträngen som mall.

Fackmannen inser att även om kemisk syntes av DNA är begränsad till sekvenser av cirka 100 baser kan längre sekvenser erhållas genom ligering av kortare sekvenser.

Likaledes kan subsekvenser klonas och lämpliga subsekvenser avspjälkas med an- | . | | v: 10 15 20 25 30 515 819 14 vändning av lämpliga restriktionsenzymer. Fragmenten kan sedan ligeras för åstad- kommande av den önskade DNA-sekvensen.

I en utforingsform kan proteinerna enligt uppfinningen klonas med användning av DNA-amplifieringsmetoder, såsom polymeraskedjereaktion (PCR). Nukleinsyrase- kvensen eller subsekvensen PCR-amplifieras sålunda exempelvis med användning av en sens-primer som innehåller ett restriktionssäte, t ex XhoI, och en antisens- primer som innehåller ett armat restriktionssäte, t ex Ban1HI. Detta ger en nukleinsy- ra som kodar för önskad sekvens eller subsekvens och som har tenninala restrik- tionssäten. Denna nukleinsyra kan sedan lätt ligeras in i en vektor som innehåller en nukleinsyra kodande för den andra molekylen och som har lärnpliga motsvarande resuiktionssäten. Lämpliga PCR-primers kan bestämmas av fackmarmen inom om- rådet med användning av irifonnationen som tillhandahålles i den bifogade sekvens- listan. Lämpliga restriktionssäten kan också sättas till nukleinsyran som kodar för proteinet eller proteinsubsekvensen genom sätesriktad mutagenes. Plasmiden som innehåller sekvensen eller subsekvensen klyvs med lämpligt restriktionsendonukleas och ligeras sedan in i vektom kodande för den andra molekylen med hjälp av stan- dardmetoder.

En andra aspekt av föreliggande uppfinning är följaktligen en isolerad nukleinsyra, som kodar för proteinet enligt föreliggande uppfinning. Mer specifikt hänför sig fö- religgande uppfinning till en nukleinsyra, som innefattar delar av, eller hela, bas- sekvensen beskriven i SEKV. ID NR 1, såsom cirka 200-2000, tex åtminstone cirka 400, såsom åtminstone cirka 1000 och företrädesvis åtminstone cirka 2300 baser därav. I en specifik utföringsform av denna aspekt innefattar nukleinsyran enligt uppfinningen ungefär den andra halvan av sekvensen av SEKV ID NR 1, företrä- desvis åtminstone cirka 1200, tex 1284 och allra helst de 1284 baser som kodar för proteinet betecknat MSAl, vilket diskuterades ovan. I en annan utföringsfoim av denna aspekt av uppfinningen är nukleinsyran väsentligen identisk med sekvensen enligt SEKV. ID NR 1. I en speciellt fördelaktig utföringsform kodar föreliggande nuklcinsyra för ett protein såsom beskrivs av SEKV. ID NR 3. I föreliggande sam- r i i . i n- 10 20 25 30 515 819 15 manhang inses det att uppfinningen även irmefattar vilken som helst av de ovan de- finierade sekvenserna, som är ett degenerat eller en variant därav.

Vidare omfattar denna aspekt av uppfinningen också vilken som helst nukleinsyra, vilken hybridiseras specifikt under stringenta betingelser till en sådan nukleinsyra som beskrivits ovan såväl som vilken som helst genprodukt som erhålles därav. En sådan hybridiserande nukleinsyra kan t ex vara DNA, en genomisk DNA-sekvens som innefattar introner såväl som exoner, RNA, såsom mRNA etc.

Framställningen av föreliggande nukleinsyror har redan beskrivits ovan. Mer speci- ñkt klonas sålunda sekvensema, eller också amplífieras de med in vitro-metoder, såsom polymeraskedjereaktionen (PCR), ligaskedjereaktionen (LCR), transkrip- tionsbaserat amplifieringssystem (TAS), självunderhållande sekvensreplikations- system (SSR). Ett stort antal olika klonings- och in vitro-amplifieringsmetoder är kända för fackmännen inom området. Exempel på dessa tekniker och instruktioner som är tillräckliga för att leda fackmännen genom många kloningsövningar återfin- nes i Berger och Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in En- zymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloníng - A Laboratory manual (2:a uppl.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.); Cur- rent protocols in Molecular Biology, F .M. Ausubel et al., Durrent Protocols, ett samarbete mellan Greene Publishing Associates, Inc. och John Wiley and Sons, Inc., (1994 Supplement) (Ausubel); Cashion et al., U.S. patentnumrner 5,017,478; och Carr, EP 0,246,864. Exempel på tekniker som leder fackmärmen genom in- vitro-amplifieringsmetoder återfmnes i Berger, Sambrook, och Ausubel, såväl som Mullis et al., (1987) U.S. patentnr 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. Eds) Acedemic Press Inc. San Diego, CA (1990 (In- nis); Amheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal of NIH Re- search (1991) 3: 81-94 (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J.

Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science, 241: 1077-1080; Van - . . « » n 10 15 20 25 30 515 819 16 Brunt (1990) Biotechnology, 8: 291-294; Wu och Wallace (1989) Gene, 4: 560; och Barringer et al. (1990) Gene, 89: 117.

I en föredragen utföringsform isoleras nukleinsyrorna enligt uppfinningen genom kloningsmetoder av rutintyp. DNA-sekvensen enligt SEKV. ID NR 1, eller en sub- sekvens därav, kan användas för att åstadkomma prober som specifikt hybridiserar till den kodande genen i ett genomiskt DNA-prov, t ex i en Southern-blöt, eller till mRNA, i ett total-RNA-prov (t ex i en Northem-blot). När väl mâlnukleinsyran har identifierats (t ex i en Northem- eller Southem-blot) isoleras den enligt standard- metoder som är kända för fackmännen inom området (se t ex Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2:a uppl. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; Berger och Kimmel (1987) Methods in enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular C loning Techniques, San Diego: Academic press, Inc.; eller Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biologz, Greene Publishing och Wiley- lnterscience, New York).

Nukleinsyroma enligt uppfinningen kan användas i assays, såsom i hybridiserings- assays, som prober, i vilket fall de företrädesvis är märkta, vid framställning av protein enligt uppfinningen etc, såsom framgår av andra avsnitt av föreliggande be- skrivningsdel.

En annan aspekt av uppfinningen är en expressionsvektor, såsom en plasniid eller ett virus, såsom en fag, vilken iimefattar en nukleinsyra enligt ovan. Sådana vektorer är t ex användbara för expression av proteinerna enligt uppfinningen för åstadkom- mande av iinmunogener för antikroppsprodiiktion. Sålunda är vektorema som kodar för proteinema också användbara för transforrnering av celler in vitro eller in vivo för expression av föreliggande protein eller en funktionell subsekvens därav. Utöver föreliggande kodande sekvens innefattar vektorema enligt uppfinningen också lärnpliga promotorer, enhancers och ytterligare reglerande element operativt bundna därvid (Queen et al. (1986) Immunol. Rev. 89:49). Vektom kan vara en plasmid, ett virus etc. Vidare kan vektom vara en oligonukleotid, i vilket fall den kodande sek- i . | i | ~ u 10 15 20 _25 30 515 819 17 vensen kan åtföljas av erfordrade märkningssekvenser (tags) för användning i såda- na metoder som homolog rekombinering, såsom beskrivs i litteraturen. lin ytterligare aspekt av föreliggande uppfinning är sålunda en rekombinant cell, som innefattar en vektor enligt uppfinningen. Odlingen av celler, inklusive cell- linjer och odlade celler från vävnad- eller blodprover är välkänd inom området (se tex Freshney Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 3:e uppl., Wiley-Liss, New York, NY (1994). Celler som uttrycker föreliggande nukleinsyra kan användas för att följa expressionsnivåer av proteinet enligt uppfinningen i ett stort antal olika sammanhang. Cellema enligt uppfinningen kan vara prokaryota, så- som bakterier, såsom E. coli, eukaiyota, såsom jäst, däggdjursceller, såsom från hunddjur, från grisar eller från människa, av protosourspnmg, etc.

En ytterligare aspekt av uppfinningen är ett förfarande för framställning av ett pro- tein enligt uppfinningen, eller en funktionell subsekvens därav, vilket förfarande in- nefattar stegen att man (a) åstadkommer DNA kodande för önskat protein eller önskad polypeptid; (b) inför nämnda DNA i lämplig expressionsvektor eller expressionskassett; (c) överför nämnda vektor eller kassett in i en lämplig cell; (d) odlar närrmda cell för att erhålla den önskade produkten; och eventuellt (e) renar proteinet eller polypeptiden. Överföring av vektom kan utföras medelst välkända metoder beroende på typen av cellulär värd, såsom kalciumkloridtransfektering, vilket ofta används med prokary- ota celler, eller kalciumfosfatbehandling, elektroporation, lipofektering, rnikroirijek- tion etc. Väl uttryckta kan produktema renas enligt standardprocedurer inom områ- det, såsom HPLC-rening, fraktionkolonnkromatografi, gelelektrofores och liknande (se t ex Scopes, Protein Purifcation, Springer-Verlag, NY, 1982).

En ytterligare aspekt av uppfinningen är en antikropp, som är väckt mot ett protein enligt uppfinningen, eller en fiinktionell del därav. Antikroppen enligt uppfinningen 10 15 20 25 30 515 819 18 innefattar företrädesvis åtminstone cirka 10, ärmu hellre åtminstone 20, 40 eller 50 och allra helst åtminstone 100 eller 200, eller t o m 400, aminosyror. I en specifik utföringsform binder antikroppen till ett protein, som består av väsentligen hela se- kvensen beskriven i SEKV. ID NR 2.

Mer specifikt hänför sig föreliggande uppñrming till antikroppar, inkluderande en- skilda, alleliska, stamspecifika eller artspecifika varianter, och fragment därav, både i sina naturligt förekommande (av fullständig längd) former och i rekombinanta former. Dessutom är antikroppama väckta mot dessa polypeptider i antingen sina nativa konfigurationer eller i icke-nativa konfigurationen Anti-ideotypiska och chi- mära eller bispecifika antikroppar kan också alstras.

För att framställa antikroppar-na som är specifikt reaktiva med polypeptider enligt uppfmningen används ett antal immunogener. Rekombinanta eller syntetiska poly- peptider av 8-15, företrädesvis 10 aminosyror i längd, eller större, valda bland ami- nosyrasubsekvenser enligt SEKV. ID NR 2 är föredraget polypeptidimrnunogen (antigen) för framställning av monoklonala eller polyklonala antikroppar. I en klass av föredragna utföringsformer inkluderas även ett immunogent peptidkonjugat som immunogen. Naturligt förekommande polypeptider används också, antingen i ren eller oren form.

Rekombinanta polypeptider uttryckes i eukaryota eller prokaryota celler (såsom be- skrivits ovan) och renas med användning av standardtekniker. Polypeptiden, eller en syntetisk version därav, injiceras sedan i ett djur som uppvisar förmåga att produce- ra antikroppar. Antingen monoklonala eller polyklonala antikroppar kan alstras för efterföljande användning i immunoassays för mätning av närvaro och mängd av polypeptiden.

Metoder för frarnställning av polyklonala antikroppar är välkända för fackmännen inom området, se t ex Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/- . - v . n 10 20 25 30 515 819 ¿::=¿::¿:___:¿;:_i_:s, 19 Greene, NY; samt Harlow och Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY).

Monoklonala antikroppar framställes från celler, som utsöndrar den önskade anti- kroppen. Dessa antikroppar screenas med avseende på bindning till normala eller modifierade polypeptider eller också screenas de med avseende på agonistisk eller antagonistisk aktivitet, t ex aktivitet föimedlad av ett suppressor of fused-protein.

Specifika monoklonala och polyklonala antikroppar binder vanligen vid ett KD av åtminstone cirka 0,1 mM, vanligare åtminstone cirka 50 uM och allra helst åtmin- stone cirka 1 uM eller bättre.

I några fall är det önskvärt att framställa monoklonala antikroppar från olika dägg- djursvärdar, såsom hundar, svin, gnagare, primater, märmiskor etc. Beskrivning av tekniker för framställning av sådana monoklonala antikroppar återfirmes t ex i Stites et al. (utg): Basic and Clinical Immunology (4:e uppl.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, och referenser givna däri; Harlow och Lane, ovan; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2:a uppl.) Academic Press, New York, NY; samt Kohler och Milstein (1975) Nature 256: 495-497.

Andra lämpliga tekniker innefattar selektering av bibliotek av rekombinanta anti- kroppar i fagvektorer eller liknande vektorer (se t ex Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; och Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546; samt Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnology, 14: 309-314).

En ytterligare aspekt av föreliggande uppfinning är ett protein såsom det har definie- rats ovan, eller en funktionell subsekvens därav, för användning i ett farmaceutiskt preparat, företrädesvis som ett vaccin. Uppfinningen hänför sig sålunda även till ett vaccinpreparat, vilket innefattar ett enligt ovan defmierat protein samt en farmaceu- tiskt godtagbar bärare, såsom en vattenbaserad bärare. Ett antal olika vattenbaserade bärare kan användas, t ex buffrad saltlösning. Lösningen är steril och vanligen fri 10 15 20 25 30 515 819 20 från eventuellt oönskat material. Den kan innehålla ytterligare hjälpsubstanser så- som erfordras för att approximera fysiologiska betingelser, såsom pH-justerande medel och buffertar, toxicitetsjusterande medel, t ex natriumacetat, natriumklorid, kaliumklorid, natriuinlaktat erc§ Den kan framställas för injiceiing eller for vilken arman lämplig administreringsväg som helst, såsom oral administrering. För en kort- fattad översikt av läkemedelsadmiriistrering, se Langer, Science 2492527-1533 (1990).

Vaccinpreparatet enligt uppfinningen uppvisar mer specifikt förmåga att framkalla en immunrespons i en individ, såsom ett djur eller en människa, och därigenom fö- rebygga att nämnda individ infekteras med Sarcoptes scabiei, varpå Sarcoptes sca- biei-infektion eller skabb undvikes. Sålunda kan vaccinkompositionen enligt upp- finningen fördelaktigt användas för att immunisera djur, t ex hundar eller svin. Som ett exempel kan hundar infekteras med skabb eller Sarcoptes scabiei-infektion från vilda djur i omgivningarna, såsom rödräv. Svin år en annan art som kan infekteras med skabb eller Sarcoptes scabiei-infektion. När giiskultingar exempelvis transpor- teras till nya platser under uppfödningen därav kan de råka i kontakt med andra be- sättningar och infektionen kan sedan spridas. Vaccinkompositionen kan vara avdö- dat eller inaktiverat, attenuerat, rekombinant eller subenhetsvaccin, såsom erfordras, beroende på rådande betingelser.

Uppfinningen hänför sig också till ett förfarande för att förebygga kvalstersjukdo- mar, speciellt tillstånd orsakade av kvalster, såsom Sarcoptes scabiei, i en individ, såsom en människa eller ett djur, såsom hund- eller grisdjur, vilket förfarande inne- fattar administrering av ett farmaceutiskt preparat enligt uppfinningen till nänmda individ i en verksam dos. I en specifik utföringsforin är nänmda sjukdom Sarcoptes scabiei-infektion eller skabb.

Föreliggande uppfinning hänför sig också till medicinsk användning av proteinerna och polypeptidema enligt uppfinningen. Vad gäller de farmaceutiska användningar- na av föreliggande polypeptider förstås det att i många fall kan det vara mer fördel- - . | ~ .- 20 25 30 5-15 819 21 aktigt att använda peptidomimetiska föreningar enligt uppfinningen än de ursprung- liga polypeptidema. Sådana användningar faller också inom ramen för uppfinning- C11.

I en ytterligare aspekt hänför sig uppfinningen till olika assays, där en antikropp en- ligt uppfinningen används för bestämning av närvaro och/eller kvantitet av polypep- tiden. Metodema inkluderar analytiska biokemiska metoder, såsom elektrofores, högupplösande vätskekromatografi (HPLC) tunnskiktskromatografi (TLC), hyper- diffusionskromatografi och liknande, såväl som olika immuriologiska metoder, så- som fluid- eller gelfallriingsreaktioner, immunodiffusion, imrnunoelektrofores, radioimmunoassay (RlA) emzyrrikopplad irnmunosorbent assay (ELISA-metoder), immunofluorescensassays etc. Såsom det används här är en irnmunoassay en assay eller analys, där en antikropp används för att binda specifikt till analyten. I förelig- gande sammanhang används fördelaktigt ett sådant assayformat, som beskrivs i EP 291 194 (Unilever), eller varianter av nämnda format som specifikt har anpassats till föreliggande ändamål. För en genomgång av allmänna immunoassays, se Methods in Cell Biology, Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, utg., Academic Press, Inc., New York (1993); och Basic and Clinical Immunology, 7:e uppl., Stites & Teir, utg., (1991).

Kompetitiva assaysforrnat är föredragna i föreliggande sammanhang, där mängden analyt, företrädesvis en okänd mängd antikroppar i en individ, i ett prov uppmätes indirekt genom mätning av mängden tillsatt analyt, som förskjuts från ett infångande medel av analyten som finns närvarande i provet. Mest föredragna är metoder med enzymkopplad irnmunosorbent assay (ELISA), där en antikropp typiskt binds till ett enzym, såsom peroxidas eller fosfatas, vilket kan frarnkalla färgade reaktionspro- dukter från en lämplig buffert. Sålunda utnyttjas en märkt antigenmolekyl av känd kvantitet för bestämning av ett omärkt antigen av okänd kvantitet. Proteinet enligt uppfinningen, eller ett lärnpligt funktionellt fragment därav, används företädesvis kopplat till en konventionell märkning, såsom His6. Denna assay är t ex användbar för diagnostisering av Sarcoptes scabiei-irifektion i hundar. . i | - .- 10 20 25 30 515 819 22 l ett ELISA-fonnat enligt uppfiririingen detekteras sålunda antikroppar mot förelig- gande polypeptid och/eller de kvantifieras, företrädesvis i ett biologiskt prov. Provet kan vara vilket som helst prov av biologisk vävnad eller fluid, såsom blod. Blodet förbehandlas såsom erfordras genom spädning i lämplig buffertlösning eller kon- centreras, om så önskas. Önskat antal vattenbaserade buffertlösnjngar av standard- typ kan användas, såsom Tris eller liknande, vid ett fysiologiskt pH-värde. Prover inkluberas med ett överskott av proteinet enligt uppfinningen som antigen. Efter sköljning för att avlägsna eventuell obunden antikropp kvantifieras mängden bunden antikropp genom tillsats av en lösning av den enzyiiikonjugerade antikropp, som binder till konstanta domäner av antikroppar i provet. Överskott av konjugerad anti- kropp sköljs av och aktiviteten av det bundna enzymet bestäms genom tillsats av subratet till reaktionen och uppmätning av bildningen av produkter. Då produkterna från reaktionema som utnyttjas i ELISA-procedurer är färgade kan den bildade mängden produkt lätt bestämmas genom intensiteten av den färg, som har utveck- lats, med användning av spektrofotometer. Aktiviteten av det bundna enzymet är proportionell med mängden antigenbindande antikropp i provet; varför den ur- spnmgliga koncentrationen av sådana antikroppar kan uppskattas från en serie kon- trollanalyser, där kända koncentrationer av specifika antikroppar utnyttjas.

Mer specifikt gäller att om ett protein såsom definieras av SEKV. ID NR 2 kopplat till His6 används, då har det visats av föreliggande uppfinnare att en antigenkon- centration av cirka 30-60 ng/nil är fördelaktigt. Det är väsentligt att proteinkontami- nering förhindras för att undvika en förstärkt bakgrund. Vidare bör beläggiiingsför- hållandet anpassas på lärnpligt sätt för att förbättra bakgrunden. Sarmolikt är efter- beläggiiingen inte kritisk.

Följaktligen hänför sig uppfinningen också till ett kit för diagnos av en individ som har infekterats med ett kvalster, företrädesvis Sarcoptes scabiei. Mer föredraget har ifrågavarande kit enligt uppfmningen anpassats för att utföra ovan beskrivna ELISA- metod. Ett sådant kit inkluderar ett eller flera reagens för bestämning av närvaro el- . . ~ n .- 10 20 25 30 515 819 23 ler avsaknad av antikroppar i individen vilka är veckta mot polypeptidema enligt uppfinningen. Antigenet kan vara fritt eller irnmobiliserat på en fast bärare, såsom ett provrör, en mikrotiterplatta, en provsticka eller liknande. Nämnda kit kan också innefatta instruktioner tör användningen därav. Nänmda kit kan också innehålla or- gan för detektering av märkningar, positiva och negativa kontroll, tvättlösningar etc.

Mer specifikt kan ett kit enligt föreliggande uppfinning fördelaktigt innefatta konju- gat, positiva och negativa kontrollprover, en serumspädningsbuffert, ett substrat, lämpliga tvättlösningar såväl som en lämplig konjugatspädningsbuffert.

Detalierad beskrivning av ritningarna.

Figur 1 visar utsträckningen av det rekombinanta proteinet enligt uppfinningen i förhållande till det nativa proteinet.

Figur 2 illustrerar den rekombinanta plasmid pPUl7 som utnyttjas för expression av kvalsteiproteinet MSAl enligt uppfinningen. Amp är ampicillinresistensgen, lacI är lac-repressorgen och malE är maltosbindande protein fusionerat med föreliggande MSAl.

Figur 3 är en översikt av kloningsstrategin för Sïänden av MSA.

Figur 4 visar resultaten av Westernblot-analys av det rekombinanta kvalsterproteinet MSA1 enligt uppfinningen. Proteinet uttrycktes i E.coli, renades och separerades medelst SDS-PAGE före överföring till nitrocellulosa. Banorna 1, 2 och 4 visar re- sultaten efter analys med positiva hundsera och banoma 3, 5 och 6 visar resultaten efter analys med negativa hundsera. Bana M är molekylviktsmarkörema.

F ÖRSÖKSDEL Material och metoder Unnsamling av parasiter Levande kvalster av båda kön och olika utvecklingsstadier av S. scabiei isolerades från huden på vilda rödrävar såsom beskrivits i Bomstein & Zakrisson (1993) Vet.

Dermatol. 4: 107. Kortfattat länmades hudbitar med pälsen nedklippt till cirka 10 mm i Petri-skålar vid rumstemperatur i elektriskt ljus. Kvalster som inigrerade över till lockets undersida uppsamlades och förvarades vid -70°C till vidare användning.

. . . - I» 10 20 25 515 819 24 Irnmunosera S. scabiei-proteiner av en storlek över 90 kD storleksselekterades på 10 procentiga geler genom natriumdodecylsuIfat-polyakrylarmdgelelektrotores (SDS-PAGE) och elektroeluerades såsom beskrivits tidigare, se Jacobs & Clad (1986) Anal. Biochem. 154:583. Kaniner av rasen New Zeeland White immuniserades med de selekterade proteinerna och Freunds fullständiga adjuvans.

RNA-nrenarering och konstruktion av cDNA-bibliotek.

Totalt 160 mg kvalster testades med PBS och homogeniserades sedan i en glaskvarn vid 4°C. Total-RNA extraherades med RNAgents®-kit från Promega och mRN A isolerades medelst oligo(dÛ-cellulosakromatografi (Pharmacia Biotech). Dubbel- strangad cDNA syntetiserades från cirka 5 ug S. scabiei-mRNA (ZAP-cDNA, Stratagene), delar ligerades in i UNI-ZAP XR-vektom (Stratagene) och packeterades i Ä-fag (Gigapack Gold II, Stratagene).

Kloning och sekvenering av MSAl Det amplifierade biblioteket screenades med sera från kaniner som tidigare hade immuniserats med gelrenade antigener. Immunoreaktiva placker klonades och fa- gerna eluerades. Från en positiv Ä-fagklon alstrades en pBluescript SK-subklon med användning av fagsystemet ExAssistTM (Stratagene). Den resulterande klonen be- tecknades pPU3 och S. scabiei-cDNA-insatsen ”mappades” avseende positioner för reshiktionsendonukleasspjälkriing med användning av enzymer från Pharmacia Bi- otech (Uppsala, Sverige) och New England Biolabs. För sekveneringen av pPU3 användes ansamlade deletioner och cDNA-sekvensspecifika primers kombinerade med T7-sekvenskit från Pharmacia Biotech.

Subkloning och expression av MSA1 Konstruktion av högexuressionsvektor . a - ~ -a 20 25 30 515 819 25 Den öppna läsramen av den rekombinanta plasmiden pPU3 amplifierades med PCR med användning av Pfu-DNA-polymeras (Stratagene) och subklonades in i Xmnl- XbaI-säten av vektom pPUl6. pPU16-vektorn är ett derivat av pMal-c2-vektorn (New England Biolabs), som har en DNA-sekvens kodande tör 6 konsekutiva histi- dinenheter och ett stoppkodon mellan Pstl- och HindlII-sätet. Den resulterande plasmiden pPU17 kodar för det rekombinanta kvalsterproteinet med det maltosbin- dande proteinet fusionerat vid sin N-tenninala ände och His6-tag fusionerad vid sin C-terrninala ände. Kopplingen mellan det maltosbindande proteinet och det rekom- binanta kvalsterproteinet har ett faktor Xa-bindande säte (IEGR).

Expression som fusionsprotein.

Den rekombinanta plasmiden pPU17 transfonnerades in i E. coli stam BL21 (DE3).

Det resulterande transfonnatet ympades in i 10 ml minimal medium med kasamino- syror och tungmetaller (MM/CA) (Pryor & Leiting, Protein Expre Purif 102309) in- nehållande ampicillin (100 mg/ml) och odlades över natten vid 37°C under kontinu- erlig skakning. 5 ml av den nattgamla kulturen späddes i 500 ml färskt MM/CA- medium med arnpicíllin (100 mg/ml) och odlades i en Ehrlenmeyer-kolv med voly- men 2 liter under effektiv skakning vid 37°C till OD-värdet vid 600 nm blev 0,8.

Kulturen kyldes sedan till 18°C, inducerades med 0,5 mM IPTG och överfördes se- dan till en skakare vid 18°C för fortsatt odling under 20 timmar. Efter expressionen uppsamlades cellema genom centrifirgering vid 4000xg under 20 minuter och åter- suspenderades i 25 ml fosfatbuffert av halten 20 mM (pH 7,6) med 0,5 M NaCl och 30 mM imidazol, kompletterad med CompleteTM-proteasinhibitor (Roche) och frystes över natten vid -70°C. Den frysta cellsuspensionen tinades i kallvatten, pla- cerades i isvattenbad och sonikerades. Suspensionen klargjordes genom centrifuge- ring vid 9000xg under 30 minuter och den resulterande supematanten användes för affmitetsrening.

Minimalmedium med kasamínosyror och tungmetall (MM/CA) är: 5 g/1 glukos, 1 mg/ 1 (+) biotin, 2 mg/l tiamin, 1 g/l (NH4)2SO4, 4 ml tungmetall-lagerlösning om 20 25 30 515 819 26 250x, 50 m1 sterila 10% kasaminosyror samt 200 m1 steril 5x fosfatbuffert. En liter lagerlösníng av tungmetall om 250x är 500 mg MoNa2042H20, 250 mg CoCl2, 175 mg CuS045 H20, 1 g MnS04 H20, 8,75 g MgS047 H20, 1,25 g ZnS047 H20, 1,25 g FeCL24 H20, 2,5 g CaCl22 H20, och 1,0 g H3B03 i l M HCl. En liter 5x fosfat- buffert innehåller 53 g K2HP04 och 24,7 g KH2P04.

Renine av rekombinant kvalsterantigenfiisionsprotein Supematanten laddades på en kelateringskolonn om 1 ml av typen HiTrap® (Amer- sham Pharmacia Biotech) laddad med Nz* vid en flödestakt av 1 rnl/min. Efter tvätt- ning med 10 ml 20 mM fosfatbuffert (pH 7,6) med 0,5 M NaCl och 30 mM irnida- zol eluerades det uppfångade rekombinanta proteinet med 3 ml 20 mM fosfatbuffert (pH 7,6) med 0,5 M NaCl och 500 mM imidazol. Efter buffertbyte till 20 mM Tris- HCl (pH 8,0) med 150 mM NaCl och 1 mM EDTA avspjälkades det maltosbindan- de proteinet med faktor Xa vid rumstemperatur under 20 timmar, varefter det re- kombinanta kvalsterproteinet renades på en HiTrap® Q-kolonn. Som konser- veringsmedel tillsattes Micro-0-Protect (Roche) till det renade rekombinanta pro- teinet vid en koncentration av 0, 1%.

Kloning av en del av 5°cDNA-änden av MSAl En PCR-strategi användes för att klona regioner uppströms om cDNA-insatsen i pPU3. I ifrågavarande första PCR, skapades primem KBE 5 (5” CAC TAT CGG AGA ACG TAA CTT CGG 3 '), komplementär med anti-senssträngen av insatsen i pPU3, och användes tillsammans med en T3-primer, komplementär med den vektor som användes för konstruktion av cDNA-biblioteket. Som mall användes S. scabiei- cDNA-biblioteket. Det resulterande fragmentet klonades in i Smal-sätet av pUC18 och sekvenerades enligt ovan. Detta nya fragment användes sedan för design av en andra primer KBE8 (5' CCT GGC ATT CTA CTT GAG ATG TA 3') för amplifie- ring av ett ytterligare SïändeS-cDNA-fragrnent. Det andra Sïändes-fragrnentet klo- nades och sekvenerades enligt ovan. En kontinuerlig cDNA som inkluderade ifråga- varande ursprimgliga MSA1-cDNA och båda Sïändesfragrnenten alstrades med an- vändning av RT-PCT-systemet TitanTM One Tube (tillverkat av Roche). För steget 1 | , , u a u ø 20 25 30 515 819 27 med omvänt transkriptas användes den omvända primem MSA1Xba (5' CGC TCT AGA CTC AAC AAT GAA TGT CTG CAA 3”). I ifrågavarande PCR användes den omvända primem kombinerad med framåtprimern LDL2 (5° CGG GAT CCG AAT ATT TCG TCT CGA AAC CG 3*). Det resulterande fragmentet klonades in i BamHI-Åfbal-sätena av pPU16 under användning av igenkänningssäten införda un- der ifrågavarande PCR (visade med fetstil). En grafisk översikt av kloningsstrategin visas i Figur.

EngQg-kopplad irnmunosorbent assay Det rekombinanta kvalsterproteinet MSA1 späddes i 0,1 M karbonatbuffert, pH 9,6, till en koncentration av 62,5 ng/rnl och belades över natten vid 4°C på mikrotiter- plattor (Polysorp, tillverkade av Nune) i volymer av 100 ul per brunn. Plattoma tvättades en gång med fosfatbuffrad saltlösning med 0,05% Tween20 (PBS-T) följd av tillsats av serumprover vid en spädning av 1: 100 i PBS-T. Efter inkubering under 1 timme vid 37°C tvättades plattoma tre gånger med PBS-T och monoklonal från mus härrörande anti-hund-IgG-antikropp, spädning 1: 1000, och från kanin härrö- rande anti-mus-Ig konjugerad till HRP (tillverkad av Dako), spädning 1: 1000 i PBS- T plus 1% normalt kaninserum sattes till brunnarna och inkuberades under 1 timme vid 37°C. Efter tvättning tre gånger med PBS-T sattes 100 ul TMB (tillverkat av Sigma) till varje brunn. Substratinkuberingen stoppades med 50 ul H2SO4 och mängden slutprodukt analyserades vid 450 nm i en spektrofotometer av typen Dy- natech MR5 000 (tillverkad av Dynatech).

Affinitetsrening av antikroppar Renat rekombinant kvalsterprotein eller rekombinanta fager i E. coli uttryckande det rekombinanta kvalsterproteinet överfördes till ett nitrocellulosafilter. Efter blocke- ring av filtret med 1% BSA (Stratagene) i 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween20, pH 7,5 (TTBS) sattes anti-S. scabiei-kaninserum till filtret och det inku- berades under 1 timme vid rumstemperatur. Efter grundlig tvättning med TTBS elu- erades de bundna antikroppar-na och de användes i Western-blot analys på S. scabi- 10 515 819 28 ei-antigener (Beall & Mitchell, J. lmmunol. Method. (1986) 862217). De affmitets- renade antikropparna användes också för att lokalisera proteinet i S. scabiei- kvalster.

Westem-blot analys Renade rekombinanta kvalsterproteiner separerades medelst SDS-PAGE i 12% mi- nigeler i Mini PROTEAN II-ce1l(Bio-Rad Laboratories). Blottning av proteinema till nitrocellulosa gjordes med användning av en elektroforetisk överföringscell (Bio-Rad Laboratories). Efter fullbordande av överför-ingen kontrollerades de mem- branbundna proteinerna genom hastig inkubering av membranet i O,2% Ponceau-S- lösning (Sigma), följt av sköljning i destillerat vatten. Ifrågavarande blotter blocke- rades med fosfatbuffiad saltlösning (PBS) innehållande fettfri torrmjölk, inkubera- des med sera fiån försökshundar (Bomstein & Zakrisson (1993) Vet. Dermatol. 4: 107), inkuberades sedan med en mus-anti-hund-IgG-monoklonal antikropp och kanin-anti-mus-IgG. Efter tvättning visualiserades bundna antikroppar genom ke- miluminescensdetektering och exponering för filrn med användning av ECL- systemet (Amersham Pharmacia Biotech). 20 25 30 35 40 45 515 8191 29 SEKVENSLISTA <110> STATENS VETERINÄRMEDICINSKA AN STALT <120> KVALSTERPROTEIN <130> 53631 <140> <141> <160> 3 <1 70> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <21 1> 23 13 <2 12> DNA <213> Sarcoptes scabiei <22o> <221> CDs <22z> (1)..(231o) <22o> <221> CDs <2z2> (1ø3o)..(127s) <400> 1 gaa tat ttc gtc tcg aaa ccg aac aaa gat gtc aat gcg atc gaa ttg Glu Tyr Phe Val Ser Lys Pro Asn Lys Asp Val Asn Ala Ile Glu Leu 1 5 10 15 gaa ttc aaa cac gag agt gat gat tct aaa aag aat cga aaa tat acc Glu Phe Lys His Glu Ser Asp Asp Ser Lys Lys Asn Arg Lys Tyr Thr 20 25 30 gcc gaa ttg aga gaa gtt ggt ccg gct acc ccg aaa acg gca aaa ctt Ala Glu Leu Arg Glu Val Gly Pro Ala Thr Pro Lys Thr Ala Lys Leu 35 40 45 gag atc gat gtt gcc aaa gga gag gaa tac aaa gtg aca atg aaa tca Glu Ile Asp Val Ala Lys Gly Glu Glu Tyr Lys Val Thr Met Lys Ser 50 55 60 ccg aac aat gaa ttc cat act gaa ttc act ttt gct gcc gat aag aat Pro Asn Asn Glu Phe His Thr Glu Phe Thr Phe Ala Ala Asp Lys Asn 65 70 75 80 48 96 144 192 240 20 25 30 35 40 45 515 819 30 cat ttg aaa atg aaa gcc gat ttt ccg gat aga ttc cgt gcc gat gtc His Leu Lys Met Lys Ala Asp Phe Pro Asp Arg Phe Arg Ala Asp Val 85 90 95 acc ggt aca ttc gag cat gat aaa gag act ggt gta cgt aaa aac aaa Thr Gly Thr Phe Glu His Asp Lys Glu Thr Gly Val Arg Lys Asn Lys 100 105 110 ttg aat gtc gaa tac aaa ttg ggt agc gat gat aaa gct cat aca att Leu Asn Val Glu Tyr Lys Leu Gly Ser Asp Asp Lys Ala His Thr Ile 115 120 125 gaa tat gag aac gag atg gct ttc aaa ttg aaa cga tca tcg aaa gag Glu Tyr Glu Asn Glu Met Ala Phe Lys Leu Lys Arg Ser Ser Lys Glu 130 135 140 aag aat aca aat ttg atg tat aaa tcc aaa tac atc tca agt aga atg Lys Asn Thr Asn Leu Met Tyr Lys Ser Lys Tyr Ile Ser Ser Arg Met 145 150 155 160 cca ggt cta aat cat aaa aca gcg ctg gaa ttc aaa tat cga cca ttc Pro Gly Leu Asn His Lys Thr Ala Leu Glu Phe Lys Tyr Arg Pro Phe 165 170 175 aaa acg aat gat ttg tat cta gaa ttg gaa ttc ggt aat gat tta caa Lys Thr Asn Asp Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Phe Gly Asn Asp Leu Gln 180 185 190 cac aaa tat caa ttg caa cga aaa acc gat atg gaa gtg gaa gag atg His Lys Tyr Gln Leu Gln Arg Lys Thr Asp Met Glu Val Glu Glu Met 1 95 200 205 cga cca ttt aaa ttg aaa gga aat agt gat atc aaa ttg gtt gcg acc Arg Pro Phe Lys Leu Lys Gly Asn Ser Asp Ile Lys Leu Val Ala Thr 210 215 220 gat ttc gat gtc gat tac gat ctc aaa tcg gat ttc aaa tat gaa agc Asp Phe Asp Val Asp Tyr Asp Leu Lys Ser Asp Phe Lys Tyr Glu Ser 225 230 235 240 aat aaa ggt acg ccg atg gaa ttg caa tac aat ctc aaa ggt aaa gat Asn Lys Gly Thr Pro Met Glu Leu Gln Tyr Asn Leu Lys Gly Lys Asp 245 250 255 cga tca aaa cgg gcg gcg gaa aag aat caa gag gaa atc gaa gga aag Arg Ser Lys Arg Ala Ala Glu Lys Asn Gln Glu Glu Ile Glu Gly Lys 260 265 270 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720 768 816 20 25 30 40 45 515 819 31 att gat tac aaa aat aat gga tct ccg atc gat tca aaa atg aat gcc Ile Asp Tyr Lys Asn Asn Gly Ser Pro Ile Asp Ser Lys Met Asn Ala 275 280 285 aat ctc caa gct tgg ggt aat caa tat gct tac gaa agt gaa ttg aaa Asn Leu Gln Ala 'l'rp Gly Asn Gln Tyr Ala Tyr Glu Ser Glu Leu Lys 290 295 300 caa gtt gaa cca caa cga tat gag gga aag att acg atg tcg aaa aat Gln Val Glu Pro Gln Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Met Ser Lys Asn 305 3 10 3 15 320 gat aag aag atc ttc atc act cac aaa gat gaa atg gct aaa cca acc Asp Lys Lys Ile Phe Ile Thr His Lys Asp Glu Met Ala Lys Pro Thr 325 330 335 gat aca ttc cat ctg aaa tcc gaa gcg gaa gtt acg ttc tcc gat agt Asp Thr Phe His Leu Lys Ser Glu Ala Glu Val Thr Phe Ser Asp Ser 340 345 350 gaa gat aag aaa aat tat ttc gtc gaa ctt aaa aaa gat aaa gat tta Glu Asp Lys Lys Asn Tyr Phe Val Glu Leu Lys Lys Asp Lys Asp Leu 355 360 365 tat tcg atg aaa tcg aat gtg aaa cga aac aat gag att ttc tat gag Tyr Ser Met Lys Ser Asn Val Lys Arg Asn Asn Glu Ile Phe Tyr Glu 370 375 380 aac aat atg gat ttg gag aag aac ggt aaa atg aat tgg tat tac aaa Asn Asn Met Asp Leu Glu Lys Asn Gly Lys Met Asn Trp Tyr Tyr Lys 385 390 395 400 cga aac gat cga aca tgg aat atg gat ctc gat aat gca ttc aat cca Arg Asn Asp Arg Thr Trp Asn Met Asp Leu Asp Asn Ala Phe Asn Pro 405 4 10 4 1 5 aga gat ggt aca atg aaa ctt caa gtg aaa gat cgt atc tat gat atc Arg Asp Gly Thr Met Lys Leu Gln Val Lys Asp Arg Ile Tyr Asp Ile 420 425 430 aaa ttg aaa cga gaa ccg ttc cga tac ggt gat cta cat atc gaa gga Lys Leu Lys Arg Glu Pro Phe Arg Tyr Gly Asp Leu His Ile Glu Gly 435 440 445 aat gag aat cct ttg atc aaa aag ggt gat tta cat atg tct ctc gtc Asn Glu Asn Pro Leu Ile Lys Lys Gly Asp Leu His Met Ser Leu Val 450 455 460 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1 200 1248 1296 1344 1392 20 25 30 35 40 45 515 819 32 gat ccg ctt act ttg aat gtt ttg acc aag aat gat gga atc gtc gat Asp Pro Leu Thr Leu Asn Val Leu Thr Lys Asn Asp Gly Ile Val Asp 465 470 475 480 atg aca ttg gat ttg gtc tct ccc aac acc aaa aaa gca gcg cta aaa Met Thr Leu Asp Leu Val Ser Pro Asn 'lhr Lys Lys Ala Ala Leu Lys 485 490 495 atc aat tcg aaa aaa tac gat ctt gat cat gat ggt gag att acc gtt Ile Asn Ser Lys Lys Tyr Asp Leu Asp His Asp Gly Glu Ile Thr Val 500 505 510 tcg atc ttt aat cct cga atg act tgg aaa cat cac act aga aaa ggt Ser Ile Phe Asn Pro Arg Met Thr Trp Lys His His Thr Arg Lys Gly 515 520 525 gat atg gaa ttg aat att gat gct gat atc act cga aaa ggt tca ttg Asp Met Glu Leu Asn Ile Asp Ala Asp Ile Thr Arg Lys Gly Ser Leu 530 535 540 atc acc tat tct cgt aaa gag cca gat gat tcg aca aaa gtt cga tat Ile Thr Tyr Ser Arg Lys Glu Pro Asp Asp Ser Thr Lys Val Arg Tyr 545 550 555 560 tca aga caa gga aat caa gtt tcg atg gaa gtc gat tct aaa ttg atc Ser Arg Gln Gly Asn Gln Val Ser Met Glu Val Asp Ser Lys Leu Ile 565 570 575 gaa ggc cat gcg aac gga act ttg acc gat ggc aaa att cat gtc aaa Glu Gly His Ala Asn Gly Thr Leu Thr Asp Gly Lys Ile His Val Lys 580 585 590 ggt cga gag agt gat ttc gaa atc gaa agc acc tat aaa gtt gaa gat Gly Arg Glu Ser Asp Phe Glu Ile Glu Ser Thr Tyr Lys Val Glu Asp 595 600 605 ggt aag ctt atg att gag cca acc aaa act cag aat gga aaa tta gaa Gly Lys Leu Met Ile Glu Pro Thr Lys Thr Gln Asn Gly Lys Leu Glu 610 615 620 ggt ctt ctt tcg aga aaa gta cca tca cat ctt gtt ctt gaa aca cca Gly Leu Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Val Leu Glu Thr Pro 625 630 635 640 aga gtg aaa atg aac atg aaa tat gat aga ttt gct ccg gtg aag ata Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Phe Ala Pro Val Lys Ile 645 650 655 1440 1488 1536 1584 1632 1680 1728 1776 1824 1872 1920 1968 10 20 25 30 35 40 45 515 819 33 ttg aaa tta gat tac gat ggt ttg aat tat gag aaa cat atc gat gct 2016 Leu Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Leu Asn Tyr Glu Lys His Ile Asp Ala 660 665 670 gaa tac gag cca tca aat cat tac aaa tac ttt acc gat ggt aaa tcg 2064 Glu Tyr Glu Pro Ser Asn His Tyr Lys Tyr Phe Thr Asp Gly Lys Ser 675 680 685 aag aga agt ggc aaa ggt tat tcg atc aaa atc gat gga aaa cca aag 2112 Lys Arg Ser Gly Lys Gly Tyr Ser Ile Lys Ile Asp Gly Lys Pro Lys 690 695 700 aaa gca ttg aaa gtt gat gtc gat atg ccg gat ttt aaa ttc aat gtg 2160 Lys Ala Leu Lys Val Asp Val Asp Met Pro Asp Phe Lys Phe Asn Val 705 710 715 720 aac aaa ccg gaa gat agt aac aaa gct caa ttt agt tat aca ttc aat 2208 Asn Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn 725 730 735 gat tat acc gaa acg gaa gag tat gaa ttc gat cca cat cgt gca tat 2256 Asp Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr 740 745 750 atc ttg aat tgg gcc aga gct atc aga caa tat ttg cag aca ttc att 2304 Ile Leu Asn Trp Ala Arg Ala Ile Arg Gln Tyr Leu Gln Thr Phe Ile 755 760 765 gtt gag gatcgtatct atgatatcaa attgaaacga gaaccgttcc gatacggtga 2360 Val Glu 770 tctacatatc gaaggaaatg agaatccttt gatcaaaaag ggtgatttac atatgtctct 2420 cgtcgatccg cttactttga atgttttgac caagaatgat ggaatcgtcg atatgacatt 2480 ggatttggtc tctcccaaca ccaaaaaagc agcgctaaaa atcaattcga aaaaatacga 2540 tcttgatcat gatggtgaga ttaccgtttc gatctttaat cctcgaatga cttggaaaca 2600 tcacactaga aaaggtgata tggaattgaa tattgatgct gatatcactc gaaaaggttc 2660 attgatcacc tattctcgta aagagccaga tgattcgaca aaagttcgat attcaagaca 2720 aggaaatcaa gtttcgatgg aagtcgattc taaattgatc gaaggccatg cgaacggaac 2780 tttgaccgat ggcaaaattc atgtcaaagg tcgagagagt gatttcgaaa tcgaaagcac 2840 ctataaagtt gaagatggta agcttatgat tgagccaacc aaaactcaga atggaaaatt 2900 20 25 30 35 40 45 515 819 34 agaaggtctt ctttcgagaa aagtaccatc acatcttgtt cttgaaacac caagagtgaa 2960 aatgaacatg aaatatgata gatttgctcc ggtgaagata ttgaaattag attacgatgg 3020 tttgaattat gagaaacata tcgatgctga atacgagcca tcaaatcatt acaaatactt 3080 taccgatggt aaatcgaaga gaagtggcaa aggttattcg atcaaaatcg atggaaaacc 3140 aaagaaagca ttgaaagttg atgtcgatat gccggatttt aaattcaatg tgaacaaacc 3200 ggaagatagt aacaaagctc aatttagtta tacattcaat gattataccg aaacggaaga 3260 gtatgaattc gatccacatc gtgcatatat cttgaattgg gccagagcta tcagacaata 3320 tttgcagaca ttcattgttg agtag 3345 <210> 2 <211> 770 <212> PRT <213> Sarcoptes scabiei <400> 2 Glu Tyr Phe Val Ser Lys Pro Asn Lys Asp Val Asn Ala Ile Glu Leu 1 5 10 15 Glu Phe Lys His Glu Ser Asp Asp Ser Lys Lys Asn Arg Lys Tyr Thr 20 25 30 Ala Glu Leu Arg Glu Val Gly Pro Ala Thr Pro Lys Thr Ala Lys Leu 3 5 40 45 Glu Ile Asp Val Ala Lys Gly Glu Glu Tyr Lys Val Thr Met Lys Ser 50 55 60 Pro Asn Asn Glu Phe His Thr Glu Phe Thr Phe Ala Ala Asp Lys Asn 65 70 75 80 His Leu Lys Met Lys Ala Asp Phe Pro Asp Arg Phe Arg Ala Asp Val 85 90 95 Thr Gly Thr Phe Glu His Asp Lys Glu Thr Gly Val Arg Lys Asn Lys 100 105 110 Leu Asn Val Glu Tyr Lys Leu Gly Ser Asp Asp Lys Ala His Thr Ile 1 15 120 125 ~ . - » s: 20 25 30 35 40 45 515 819 35 Glu Tyr Glu Asn Glu Met Ala Phe Lys Leu Lys Arg Ser Ser Lys Glu 13 O 1 3 5 140 Lys Asn Thr Asn Leu Met Tyr Lys Ser Lys Tyr Ile Ser Ser Arg Met 145 150 _ 155 160 Pro Gly Leu Asn His Lys Thr Ala Leu Glu Phe Lys Tyr Arg Pro Phe 165 170 175 Lys Thr Asn Asp Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Phe Gly Asn Asp Leu Gln 1 80 1 8 5 190 His Lys Tyr Gln Leu Gln Arg Lys Thr Asp Met Glu Val Glu Glu Met 195 200 205 Arg Pro Phe Lys Leu Lys Gly Asn Ser Asp Ile Lys Leu Val Ala Thr 210 215 220 Asp Phe Asp Val Asp Tyr Asp Leu Lys Ser Asp Phe Lys Tyr Glu Ser 225 230 235 240 Asn Lys Gly Thr Pro Met Glu Leu Gln Tyr Asn Leu Lys Gly Lys Asp 245 250 255 Arg Ser Lys Arg Ala Ala Glu Lys Asn Gln Glu Glu Ile Glu Gly Lys 260 265 270 Ile Asp Tyr Lys Asn Asn Gly Ser Pro Ile Asp Ser Lys Met Asn Ala 275 280 285 Asn Leu Gln Ala Trp Gly Asn Gln Tyr Ala Tyr Glu Ser Glu Leu Lys 290 295 300 Gln Val Glu Pro Gln Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Met Ser Lys Asn 305 3 10 3 15 320 Asp Lys Lys Ile Phe Ile Thr His Lys Asp Glu Met Ala Lys Pro Thr 325 330 335 Asp Thr Phe His Leu Lys Ser Glu Ala Glu Val Thr Phe Ser Asp Ser 340 345 3 50 Glu Asp Lys Lys Asn Tyr Phe Val Glu Leu Lys Lys Asp Lys Asp Leu 355 360 365 Tyr Ser Met Lys Ser Asn Val Lys Arg Asn Asn Glu Ile Phe Tyr Glu 3 70 3 75 3 80 . . . - .u 20 30 35 40 45 515 819 §§$,%ß:i2“ 36 Asn Asn Met Asp Leu Glu Lys Asn Gly Lys Met Asn Trp Tyr Tyr Lys 385 390 395 400 Arg Asn Asp Arg Thr Trp Asn Met Asp Leu Asp Asn Ala Phe Asn Pro 405 _ 410 415 Arg Asp Gly Thr Met Lys Leu Gln Val Lys Asp Arg Ile Tyr Asp Ile 420 425 430 Lys Leu Lys Arg Glu Pro Phe Arg Tyr Gly Asp Leu His Ile Glu Gly 435 440 445 Asn Glu Asn Pro Leu Ile Lys Lys Gly Asp Leu His Met Ser Leu Val 450 455 460 Asp Pro Leu Thr Leu Asn Val Leu Thr Lys Asn Asp Gly Ile Val Asp 465 470 475 480 Met Thr Leu Asp Leu Val Ser Pro Asn Thr Lys Lys Ala Ala Leu Lys 485 490 495 Ile Asn Ser Lys Lys Tyr Asp Leu Asp His Asp Gly Glu Ile Thr Val 500 505 5 l0 Ser Ile Phe Asn Pro Arg Met Thr Trp Lys His His Thr Arg Lys Gly 5 15 520 525 Asp Met Glu Leu Asn Ile Asp Ala Asp Ile Thr Arg Lys Gly Ser Leu 530 535 540 Ile Thr Tyr Ser Arg Lys Glu Pro Asp Asp Ser Thr Lys Val Arg Tyr 545 550 555 560 Ser Arg Gln Gly Asn Gln Val Ser Met Glu Val Asp Ser Lys Leu Ile 565 570 575 Glu Gly His Ala Asn Gly Thr Leu Thr Asp Gly Lys Ile His Val Lys 580 585 590 Gly Arg Glu Ser Asp Phe Glu Ile Glu Ser Thr Tyr Lys Val Glu Asp 595 _ 600 605 Gly Lys Leu Met Ile Glu Pro Thr Lys Thr Gln Asn Gly Lys Leu Glu 610 615 620 Gly Leu Leu Ser Arg Lys Val Pro Ser His Leu Val Leu Glu Thr Pro 625 630 635 640 . . . - .s 20 30 35 40 45 515 819 37 Arg Val Lys Met Asn Met Lys Tyr Asp Arg Phe Ala Pro Val Lys Ile 645 650 655 Leu Lys Leu Asp Tyr Asp Gly Leu Asn Tyr Glu Lys His Ile Asp Ala 660 665 670 Glu Tyr Glu Pro Ser Asn His Tyr Lys Tyr Phe Thr Asp Gly Lys Ser 675 680 685 Lys Arg Ser Gly Lys Gly Tyr Ser Ile Lys Ile Asp Gly Lys Pro Lys 690 695 700 Lys Ala Leu Lys Val Asp Val Asp Met Pro Asp Phe Lys Phe Asn Val 705 710 715 720 Asn Lys Pro Glu Asp Ser Asn Lys Ala Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Asn 725 730 735 Asp Tyr Thr Glu Thr Glu Glu Tyr Glu Phe Asp Pro His Arg Ala Tyr 740 745 750 Ile Leu Asn Trp Ala Arg Ala Ile Arg Gln Tyr Leu Gln Thr Phe Ile 755 760 765 Val Glu 770 <210> 3 <211> 83 <212> PRT <213> Sarcoptes scabiei <400> 3 Glu Ala Glu Val Thr Phe Ser Asp Ser Glu Asp Lys Lys Asn Tyr Phe 1 5 10 15 Val Glu Leu Lys Lys Asp Lys Asp Leu Tyr Ser Met Lys Ser Asn Val 20 25 30 Lys Arg Asn Asn Glu Ile Phe Tyr Glu Asn Asn Met Asp Leu Glu Lys 35 _ 40 45 Asn Gly Lys Met Asn Trp Tyr Tyr Lys Arg Asn Asp Arg Thr Trp Asn 50 55 60 Met Asp Leu Asp Asn Ala Phe Asn Pro Arg Asp Gly Thr Met Lys Leu 65 70 75 80 om var Lys - ~ » ~ -ø

Claims (1)

1. 515 819 38 PATENTKRAV . Isolerat kvalsterprotein innefattande åtminstone cirka 83 aminosyror av den sek- vens, som beskrivs i SEKV. ID NR 2, vilka 83 aminosyror är de aminosyror som visas i SEKV. ID NR 3. . Protein enligt krav 1, vilket innefattar åtminstone cirka 400, såsom cirka 427, aminosyror av sekvensen som visas i SEKV. ID NR 2. . Protein enligt krav 2, vilket innefattar de sista cirka 427 aminosyrorna av sek- vensen visad i SEKV. ID NR 2. . Isolerad nukleinsyra som kodar for ett protein enligt vilket som helst av kraven 1-3. . Nukleinsyra enligt krav 4, vilken nukleinsyra är väsentligen identisk med basema nr 1030-1279 av sekvensen som visas i SEKV. ID NR 1. . Nukleinsyra som hybridiserar specifikt under stringenta betingelser till en nukleinsyra enligt krav 4 eller 5. . Expressionsvektor vilken innefattar en nukleinsyra enligt vilket som helst av kraven 4-6. . Rekombinant cell vilken innefattar en vektor enligt krav 7. . Förfarande for framställning av ett protein, vilket forfarande innefattar stegen att man (a) åstadkommer en DNA enligt vilket som helst av kraven 4-6; (b) infor nämnda DNA i en expressionsvektor; (c) infor nämnda vektor i en lämplig värdcell; (d) odlar nämnda värdcell for att erhålla den önskade proteinprodukten; och eventuellt (e) renar ifrågavarande framställda protein eller polypeptid. 10. Antikropp väckt mot ett protein enligt vilket som helst av kraven 1-3. 11.Antikropp enligt krav 10, vilken är en monoklonal antikropp. l2.Användning av ett protein enligt vilket som helst av krav 1-3 i en immunosorbent analys, såsom en enzymkopplad immunosorbent analys (ELISA). 13. Användning av ett protein enligt vilket som helst av kraven 1-3 i en screeningsmetod, där föreningar som har samma eller liknande biologiska aktiviteter som nämnda protein identifieras. 5 1 5 8 'l 9 39 14. Förfarande för screening av protein- eller peptidanaloger som avspeglar åtminstone en del av strukturen av proteinet enligt vilket som helst av kraven l-3, vilket innefattar stegen att man (a) framställer en mångfald av analoga strukturer och (b) selektcrar en analog struktur, där den tredimensionella konfigurationen och det spatiala arrangemanget av en eller flera biologiskt aktiva regioner förblir väsentligen bevarade. 15. Förfarande enligt krav 14, där analoger som avspeglar ett protein vilket har väsentligen aminosyrasekvensen som beskrivs i SEKV. ID NR 3 är målet för screeningen. 16. Protein enligt vilket som helst av kraven 1-3 för användning som vaccin. I7.Användning av ett protein enligt vilket som helst av kraven 1-3 vid framställning av ett vaccinpreparat. 18. Vaccinpreparat vilket innefattar ett protein enligt vilket som helst av kraven 1-3 samt en farmaceutiskt och/eller veterinärt godtagbar bärare. 19. Vaccinpreparat enligt krav 18 för förebyggande av Sarcoptes scabiei-infektion eller skabb. 20. F örfarande för diagnos av en kvalsterassocierad sjukdom, vilket innefattar stegen att man (a) immobiliserar ett protein enligt vilket som helst av kraven 1-3; (b) åstadkommer ett prov som misstänks vara infekterat med nämnda kvalsterassocierade sjukdom; (c) inkuberar nämnda prov med nämnda immobiliserade protein; och (d) detekterar eventuell antikropp bunden till det immobiliserade antigenen och sålunda specifik för nämnda kvalsterassocierade sjukdom; varpå en slutsats avseende det diagnostiserade tillståndet erhålles. 21 . Förfarande enligt krav 20, där den kvalsterassocierade sjukdomen är Sarcoptes scabiei-infektion eller skabb. 22. Kit för utförande av förfarandet enligt krav 20 eller 21.