KR20040054760A - 장내 세균의 검출 및 동정 - Google Patents

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KR20040054760A KR10-2004-7006834A KR20047006834A KR20040054760A KR 20040054760 A KR20040054760 A KR 20040054760A KR 20047006834 A KR20047006834 A KR 20047006834A KR 20040054760 A KR20040054760 A KR 20040054760A
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Abstract

본 발명은 엔테로박테리아시애에서만 발견되는 유전자인 데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제 유전자를 검출하기 위한 프로브, 항체, 및 방법을 제공한다. 이러한 프로브 및 방법은, 식품 및 물 샘플을 포함한 시험 샘플들이 장내 세균으로 감염되었는지의 여부를 검출하는데 유용하다.

Description

장내 세균의 검출 및 동정{DETECTION AND IDENTIFICATION OF ENTERIC BACTERIA}
장내병원성 세균에 의해 유발되는 식품 중독 및 기타 식품 매개 질병은 미국에서 매년 수백만명이 질병에 걸리고 수천명이 사망하는 원인이 된다 (1,2). 병원성 세퓬의 급성 섭취로부터 생기는 임상학적 상태는 설사, 구토 및 이질을 포함한다(3). 그러나, 기타 더욱 심각한 의학적 합병증, 예컨대 신장 및 심장병, 신경계 기능장애, 용혈성 요독증 및 사망이 일어날 수도 있다(4). 비-산업화 국가에서의 상황은 더욱 심각한데, 이곳에서는 인구의 10% 이상이 식품 매개 질병으로 만성적으로 고통을 받는 것으로 추산된다(5). 공중 위생 기구는 미국내에서 계속 증가하는 식품 중독 사건 뿐만 아니라 새로 출현되는 세균성 식품 매개 질병에 직면하고 있다 (6,7). 인간 건강 문제 이외에도, 식품 매개 질병은 경제적인 생산성을 낮추고 지역 및 국가 공중 위생 기구의 이용가능한 자원을 무리하게 늘림으로써 계속적이고 무거운 경제적인 손실을 가져온다(8).
이러한 인간 질병의 원인이 되는 세균은 분류학적 과의 엔테로박테리아시애로부터의 세균이다(9). 식품 매개 질병을 통해 인간 건강에 해를 끼치는 이러한 과 내에 있는 세균의 4개 주요 속은 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella) 및 예르시니아(Yersinia)이다. 모든 식료품은 이러한 세균의 세균 오염에 민감하다. 이러한 오염의 근원은 전신성 감염을 품고 있는 동물 숙주(예를들어, 소, 닭 또는 돼지)로부터, 오염되지 않은 식료품의 부적절한 취급(예를들어, 불량한 작업자 위생)으로부터, 또는 오염수로의 식료품 세척으로부터 유래될 수 있다.
전통적인 식품 및 음식점 검열 기술은 식료품 및 식품 제조 구역을 육안 검사하는 것에 의존한다. 그러나, 장내병원성 세균으로 오염된 식료품들은 종종 정상적으로 보이고, 정상적인 냄새가 나고, 정상적인 맛이 느껴진다. 이러한 병원균의 다수가 요리 과정에서 생존할 수 있다(10,11). 세균 배양이 수행될 때, 미생물학적 시험을 위해 샘플을 실험실로 되돌려 보내야 한다. 이러한 시험을 수행하는데 보통 수 주일이 걸린다. 한편, 잠재적인 건강 위험이 계속된다.
쿼크(Quirk) 및 베스만(Bessman)에 의한 연구(12)는, dGTP아제가 엔테로박테리아시애 계통에 속하는 세균에서만 검출된다는 것을 밝혀내었다. 그러나, 이러한참고문헌은, 일반적으로 엔테로박테리아시애를 검출할 수 있고 다양한 유형의 엔테로박테리아시애를 구별할 수 있는 핵산 프로브 및 항체를 제공하지 않는다.
따라서, 식품 및 물 샘플에 장내병원성 세균 오염이 존재하는 것 뿐만 아니라 어떠한 유형의 장내병원성 세균 오염이 존재하는지를 확인하기 위해 충분히 민감하고 특이적인, 더욱 빠르고 더욱 신뢰할 만한 검출 방법을 개발하는 것이 필요하다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, 효소 데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제(dGTP아제; E.C. 3.1.5.1)이 엔테로박테리아시애에서만 발견되고, 이러한 효소의 검출은 엔테로박테리아시애 병원균이 시험 샘플에 존재하는 것에 대한 특정한 지시인자이다. 본 발명은, 엔테로박테리아시애 속 또는 속들이 오염된 샘플에 존재하는지와 엔테로박테리아시애 dGTP아제의 검출을 위해 유용한 항체 및 핵산을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 면역학적, 효소학적 하이브리드형성, 핵산 증폭, 및 엔테로박테리아시애의 검출 및 동정을 위한 관련된 절차를 포함할 수 있다.
본 발명은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은 엔테로박테리아시애 과의 세균으로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될수 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 또는 SEQ ID NO:10을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은, 클레브시엘라, 살모넬라, 시겔라 또는 예르시니아와 같은 엔테로박테리아시애 과의 적어도 하나의 다른 세균 종으로부터의 DNA의 존재하에서도, 에스케리키아 콜리로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은 크레브시엘라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhymurium)으로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 이러한 핵산은 살모넬라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 크레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다.
본 발명은 또한 고체 지지체 및 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 포함하는 핵산을 포함한 바이오센서 칩을 제공한다.
본 발명은 또한, 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와접촉시키고, 시험 샘플 내에서 핵산과 프로브 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플에서 장내 세균의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 프로브는 예를들어 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 포함한 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 장내 세균은 엔테로박테리아시애 과의 세균이다. 이 방법은 DNA 증폭, 예를들어 폴리머라제 연쇄 반응을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중에서 프로브와 핵산 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플 중에 장내 세균 종의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법에서 유용한 프로브는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO.5 또는 SEQ ID NO.6을 가진 핵산을 포함한다. 이 방법은 DNA 증폭, 예를들어 폴리머라제 연쇄 반응을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중에서 프로브와 핵산 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플 중에 에스케리키아의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 프로브는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 또는 SEQ ID NO:10을 포함하는 단리된 핵산일 수도 있다. 이러한 프로브는 크레브시엘라, 살모넬라, 시겔라 또는 예르시니아로부터의 DNA의 존재하에서 에스케리키아 콜리로부터의 DNA에대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다. 이 방법은 DNA 증폭, 예를들어 폴리머라제 연쇄 반응을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중에서 프로브와 핵산 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플 중에서 살모넬라의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 프로브는 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14을 포함하는 단리된 핵산일 수도 있다. 이러한 프로브는 크레브시엘라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 살모넬라 타이피뮤리움으로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다. 이러한 방법은 DNA 증폭, 예를들어 폴리머라제 연쇄 반응을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중에서 프로브와 핵산 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플 중에서 크레브시엘라의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 프로브는 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 포함하는 단리된 핵산일 수도 있다. 이러한 프로브는 살모넬라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 크레브시엘라 옥시토카로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다. 이러한 방법은 DNA 증폭, 예를들어 폴리머라제 연쇄 반응을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 시험 샘플을, 고체 지지체 및 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제에 결합할 수 있는 항체를 가진 바이오센서 칩과 접촉시키고, dGTP아제가바이오센서 칩에 결합되는지의 여부를 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플 중에서 장내 세균의 검출 방법을 제공한다. 고체 지지체 및 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한 바이오센서 칩이 본 발명에 의해 제공된다.
엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제에 결합할 수 있는 항체는 예를들어 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 또는 SEQ ID NO:36을 가진 펩티드에 대항하여 지시된 항체를 포함한다.
본 발명은 엔테로박테리아시애(Enterobacteriaceae)의 검출 및 시험 샘플 중에 존재하는 엔테로박테리아시애 속 또는 속들의 동정에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 엔테로박테리아시애에서만 발견되는 핵산 및 코드화된 효소 (데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제) 모두의 검출 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 핵산 및 방법은 식품, 물 및 다른 유형의 샘플들이 장내 세균으로 오염되었는지의 여부를 결정하는데 유용하다. 본 발명의 방법은 오염된 샘플에 존재하는 장내 세균의 유형을 동정할 수 있다.
도 1은, 증가하는 양의 항-dGTP아제 다클론성 항체(pAb)의 함수로서, 엔테로박테리아시애의 여러 종으로부터의 효소 제제중에서 활성 소실을 예증한다. 항-dGTP아제 다클론성 항체는 이.콜리로부터 단리된 dGTP아제에 대항하여 증가되었다. 항-dGTP아제 pAb에 의한 와이.엔테로콜리티카(Y.enterocolitica) (흰색 원), 이.에어로겐스(E.aerogens) (검은색 세모), 피.불가리스(P.vulgaris) (흰색 마름모), 케이.옥시토카(K.oxytoca) (흰색 세모), 에스.타이피뮤리움(S. typhimurium)(흰색 네모), 에스.보이디이(S.Boydii) (검은색 원) 및 시.다비자에(C.davisae) (검은색 네모)로부터 단리된 dGTP아제의 억제를 나타낸다.
도 2는, 항-dGTP아제 다클론성 항체(pAB)의 증가하는 양의 함수로서, 엔테로박테리아시애의 여러 종으로부터의 효소 제제중에서 활성 소실을 예증한다. 항-dGTP아제 다클론성 항체는 에스.마르세산스로부터 단리된 dGTP아제에 대항하여 증가되었다. 항-dGTP아제 pAb에 의해 에스.타이피뮤리움(흰색 네모), 케이.옥시토카(흰색 세모), 에스.보이디이(검은색 원), 피.불가리스(흰색 마름모), 와이.엔테로콜리티카(흰색 원), 에이치.알베이(검은색 마름모), 이.에어로겐스(검은색 세모) 및 에스.마르세산스(검은색 네모)로부터 단리된 dGTP아제의 억제를 나타낸다.
도 3은 항-이.콜리 dGTP아제 pAb와, 이.콜리 O157(검은색 원), 에스.보이디이(흰색 원), 에스.타이피뮤리움(검은색 네모), 케이.옥시토카(검은색 세모), 이.에어로겐스(검은색 마름모), 시.다비자에(흰색 네모), 와이.엔테로콜리티카(흰색 마름모) 및 시.프뢴디이(흰색 세모)로부터의 1mg의 흡착된 분획 III 효소 제제 사이의 교차 반응성의 ELISA 분석 결과를 제공한다.
도 4는 항-에스.마르세산스 dGTP아제 pAb와, 에스.타이피뮤리움(검은색 세모), 이.콜리 (흰색 세모), 에이치.알베이(흰색 네모), 이.에어로겐스(검은색 원), 와이.엔테로콜리티카(흰색 원) 및 피.불가리스(검은색 네모)로부터의 1mg의 흡착된 분획 III 효소 제제 사이의 교차 반응성의 ELISA 분석 결과를 제공한다.
도 5A는 항-에스케리키아 dGTP아제 pAb (레인 2 내지 5) 또는 항-세라티아 dGTP아제 pAb(레인 6 내지 9)의 면역친화성 컬럼 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 단리된 여러 종으로부터의 장내 dGTP아제의 SDS PAGE 분석을 제공한다. 레인 1, 분자량 마커 (위에서부터 아래로 65kDa, 45kDa, 24kDa); 레인 2, 살모넬라; 레인 3, 시겔라; 레인 4, 크레브시엘라; 레인 5, 세데카; 레인 6, 예르시나; 레인 7, 프로테우스; 레인 8, 엔테로박터; 레인 9, 하프니아.
도 5B는 dGTP아제의 2개의 상이한 단리물에 대해 증가된 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 제공한다. 조 에스.마르세산스 단백질 추출물 (레인 1) 및 조 이.콜리 단백질 추출물 (레인 2)에서 dGTP아제의 검출을 위해 항-이.콜리 dGTP아제 pAb가 사용되었다. 조 에스.마르세산스 단백질 추출물(레인 3) 및 조 이.콜리 단백질 추출물(레인 4)에서 dGTP아제의 검출을 위해 항-에스.마르세산스 dGTP아제 pAb를 사용하였다.
도 6은 각종 세균으로부터의 dGTP아제에 대항하여 연결형(tethered) pAbs의 반응성을 나타내는 표면 플라스몬 공명(SPR) 센소그램을 제공한다. 상대적인 SPR 시그날 강도를, 이.콜리(Ec), 에스.보이디이(Sb), 시.다비지애(Cd), 케이.옥시토카(Ko), 에스.타이피뮤리움(St), 시.프뢴디이(Cf), 이.에어로겐스(Ea), 및 에스.아우레우스 (Sa) (비 장내 세균 대조)의 조 세균 추출물과 반응되는 항-이.콜리 dGTP아제 pAb에 대한 시간의 함수로서 그래프화하였다. 센서 표면 위의 유동 속도는 분당 50㎕이었다.
도 7은 각종 세균으로부터의 dGTP아제에 대항하여 연결형 pAbs의 반응성을 나타내는 SPR 센소그램을 제공한다. 상대적인 SPR 시그날 강도를, 에스.마르세산스(Sm), 이.에어로겐스(Ea), 와이.엔테로콜리티카(Ye), 피.불가리스 (Pv), 이.콜리 (Ec), 및 에스.타이피뮤리움(St)의 조 세균 추출물과 반응되는 항-에스.마르세산스 dGTP아제 pAbs에 대한 시간의 함수로서 그래프화하였다. 센서 표면 위의 유동 속도는 1분당 50㎕이었다.
도 8은 정제된 dGTP아제를 가진 SPR 바이오센서의 적정을 나타내는 곡선을제공한다. 곡선은 400초에서 표면과 반응되는 주어진 양의 효소에 대한 상대적인 SPR 시그날 강도를 나타낸다 (결합이 완결된 후, 도 6 참조). 샘플 지점들 사이에서, 결합된 dGTP아제를 제거하기 위하여 칩을 2M 포타슘 티오시아네이트로 세척한 다음 10분동안 완충액으로 세척하고, 이어서 dGTP아제를 농축한다. 항 이.콜리 pAb 표면 (흰색 원)을 이.콜리 dGTP아제와 반응시키고, 항 에스.마르세산스 pAb 표면 (검은색 원)을 에스.마르세산스 dGTP아제와 반응시켰다. 횡축 눈금은 0에서부터 100ng까지였다.
도 9는 이.콜리 dgt 유전자의 DNA 서열을 제공한다.
도 10은 본 발명의 방법이 시험 샘플 중에서 100개 정도의 엔테로박테리아시애 (이.콜리 경우)를 검출할 수 있음을 예증하다. 프라이머 세트 1은 약 1000개 이.콜리 세균(레인 1), 100개 세균 (레인 2) 및 10개 세균(레인 3)으로부터 184bp 단편을 증폭시키기 위해 사용되었다. PCR 반응의 30회 주기가 사용되었다. 레인 3의 띠는 본래의 겔에서만 볼 수 있다. 겔은 1.2% 아가로스이고, 에티디움 브로마이드로 염색된다.
도 11은 본 발명에 의해 제공된 핵산 프로브의 특이성을 예증한다. 이 실험에서, 엔테로박테리아시애의 다양한 종으로부터 대략 200cfu의 DNA를 수득하였다. 단지 이.콜리 dgt 핵산 만을 특이적으로 증폭시키는 프라이머 세트 5를 사용하여, 이 DNA 단리물을 PCR 증폭시켜 213 bp 단편을 생성하였다. 증폭 생성물을 1.2% 아가로스 겔 위에서 분리하고 에티디움 브로마이드로 염색하였다. 각각의 레인은 별개의 기질 DNA의 속으로부터의 증폭 생성물을 함유한다: 레인 1 - 클레브시엘라;레인 2 - 살모넬라; 레인 3 - 시겔라; 레인 4 - 예르시나, 레인 5 - 에스케리키아. 213bp 단편은 이.콜리 레인에서만 올바르게 증폭된다.
도 12는, 상이한 유형의 세균이 시험 샘플에 존재하고, 프라이머 결합 및 증폭에 대해 경쟁할 수 있는 조건하에서, 본 발명에 의해 제공된 핵산 프로브의 특이성을 더욱 예증한다. 이 실험에서, 2개의 상이한 엔테로박테리아시애 속의 대략 200cfu로부터 DNA가 수득되었으며 함께 혼합하였다. 증폭 후에, 생성물을 1.2% 아가로스 겔 위에서 분리하고, 에티디움 브로마이드로 염색하였다. 샘플에 존재하는 세균 DNA의 종 및 증폭 특이성을 시험하기 위해 사용된 프라이머는 하기에 제공된다.
레인 세균 프라이머 쌍 띠 크기(bp)
1 에스케리키아+크레브시엘라 7 및 11 82(에스케리키아)+213(크레브시엘라)
2 에스케리키아+살모넬라 7 및 8 82(에스케리키아)+213(살모넬라)
3 살모넬라+크레브시엘라 8 및 13 213 (살모넬라)+82 (크레브시엘라)
4 크레브시엘라+에스케리키아 6 251 (에스케리키아)
5 살모넬라+에스케리키아 6 251 (에스케리키아)
프라이머 쌍 5, 6 및 7은 에스케리키아에 대해 특이적이 되도록 설계된다. 프라이머 쌍 8, 9 및 10은 살모넬라에 대해 특이적이 되도록 설계된다. 프라이머 쌍 11, 12 및 13은 크레브시엘라에 대해 특이적이 되도록 설계된다. 실제로 사용된 각각의 프라이머 쌍은 특정한 세균 속에 대해 예측된 크기의 DNA 단편을 합성하였다. 따라서, 본 발명의 방법은, 관련된 엔테로박테리아시애로부터의 DNA를 구별하고, 세균 속이 혼합된 세균 배양액에 존재하는지를 올바르게 동정한다.
도 13은 본 발명의 방법이 실제 고기 샘플(닭고기) 내에서 엔테로박테리아시애를 검출하고 동정할 수 있음을 예증한다. 10㎕의 닭고기 유체(혈액)를 하기 프라이머 세트를 가진 PCR 반응에서 사용하였다.
레인 프라이머 세트 검출을 위해 설계된 세균 종 프라이머 관찰된 띠(예측과 동일)
1 2 임의의 장내 세균 213
2 5 에스케리키아 단독 213
3 11 크레브시엘라 단독 없음
4 8 살모넬라 단독 213
5 8(2x) 살모넬라 단독 213
6 5+7 에스케리키아 단독 251+83
7 1 장내 세균 213
레인 5 및 레인 4를 위한 반응에서 프라이머 세트 8의 2배 량을 사용하였다. 레인 6 및 7에서의 띠는 희미하지만 눈에 보이게 존재하였다. 이러한 결과는, 닭고기 샘플이 살모넬라와 에스케리키아 모두로 오염되었으나 크레브시엘라로는 오염되지 않았음을 나타낸다.
데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제(dGTP아제)는 엔테로박테리아시애에 특이적으로 편재된 것으로 동정되어진 유일한 효소이다. 쥐 및 닭 간의 추출물, 닭 및 트로소필라(Drosophila) 배아, 및 효모 세포의 추출물을 포함한, 진핵 세포의 추출물에서는 dGTP아제 활성이 검출되지 않는다. 효소는 엔테로박테리아시애 속의 모든 병원적으로 중요한 속에서 발현되지만, 에르위니아(Erwinia) 종에서는 발현되지 않는다. 놀랍게도, 밀접하게 관련된 비브리오(Vibrio) 속에서도 효소가 발현되지 않는다. 또한, dGTP아제 폴리펩티드는 발현 수준에서 종간 변형을 거의 나타내지 않는다. 모든 종류의 시험 샘플에서 장내병원성 세균을 동정하기 위하여, dGTP아제의 좁은 분류학적 분포를 사용할 수도 있다.
데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제는, 콘버그(Kornberg) 등(15)에 의해 DNA 폴리머라제 I의 정제 동안에 오염물로서 발견되었다. 효소를 부분적으로 정제하였으며, 데옥시구아노신 트리포스페이트가 데옥시구아노신 및 무기 트리폴리포스페이트로 가수분해되는 것을 촉매작용하는 것으로 밝혀졌다:
dGTP → dGuo + PPPi
이 반응은 모든 공지된 뉴클레오시드 트리포스파타제 중에서 유일하고, 최종 생성물로서 오르소 또는 피로인산염을 형성한다. 지금까지, dGTPs아제는 유일하게 알려진 트리포스포히드롤라제이다. dGTP아제 효소는 열안정성 사량체 단백질이고 (13, 14), 면역원성이다(12). 다른 장내 세균으로부터의 dGTP아제의 효소학적 및 구조적 성질(16)은, 에스케리키아로부터 단리된 dGTP아제와 유사하다.
정의
용어 "아미노산 서열"이란 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 분자에서 아미노산의 위치 배열 및 동정을 가리킨다. 용어 "아미노산 서열"의 사용은, 아미노산서열을 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 완벽한 천연 아미노산 서열로 한정하는 것을 의미하지 않는다.
용어 "코드화 영역"이란, 주요 단백질 또는 주요 기능적 RNA, 예를들어 안티센스 RNA 또는 비번역 RNA를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 단백질의 코드화 영역은 개시인자 메티오닌을 코드화하는 뉴클레오티드 트리플렛 "ATG"에 의해 5'측 위에 결합되고, 정지 코돈을 규정하는 3개의 트리플렛(즉, TAA, TAG, TGA)의 하나에 의해 3'측 위에 결합된다. 코드화 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다.
핵산 사이의 염기-쌍합 또는 하이브리드형성 정도를 정의하기 위해 "상보적" 또는 "상보성"이 사용된다. 예를들어, 당업자에게 공지된 바와 같이, 아데노신(A)은 티민(T)과 수소 결합 또는 염기쌍을 형성할 수 있고, 구아닌(G)은 시토신(C)과 수소 결합 또는 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서 A는 T에 상보적이고, G는 C에 상보적이다. 상보성은, 이중-가닥 핵산에 있는 모든 염기들이 염기 쌍합될 때 완벽할 수 있다. 대안적으로, 핵산에 있는 단지 일부의 염기들이 염기 쌍합 법칙에 따라 조화될 때, 상보성이 "부분적"일 수도 있다. 핵산 가닥들 사이의 상보성 정도는, 핵산 가닥들 사이에서 하이브리드형성의 효율성 및 강도에 영향을 미친다.
"제어 서열" 또는 "조절 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코드화 서열의 발현을 위해 필요한 DNA 서열이다. 원핵 세포를 위해 적절한 제어 서열은 예를들어 프로모터, 및 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다.
"발현"이란, 유기체에서 내인성 또는 외인성 유전자의 전사 및/또는 번역을 가리킨다. 발현은 일반적으로 mRNA의 전사 및 안정한 축적을 가리킨다. 발현은 단백질의 생성을 가리킬 수도 있다.
생물학적 기능과 연관된 핵산의 단편을 일컫기 위하여, 용어 "유전자"가 넓게 사용된다. 용어 "유전자"는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 구조 RNA의 코드화 영역을 포함한다. 용어 "유전자"는 또한 코드화 영역의 어느 한쪽 말단 위에 약 2kb 거리 이하의 서열을 포함한다. 이러한 서열들은 "플랭킹" 서열 또는 영역으로 일컬어진다 (플랭킹 서열은 mRNA 전사물 위에 존재하는 비-번역 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치한다). 5' 플랭킹 영역은 프로모터 및 인핸서와 같은 제어 또는 조절 서열 또는 유전자의 전사를 제어하거나 영향을 미치는 단백질에 대한 기타 인식 또는 결합 서열을 함유할 수도 있다. 3' 플랭킹 영역은 전사의 종료, 후-전사 분열 및 폴리아데닐화 뿐만 아니라 다른 단백질에 대한 인식 서열을 지시하는 서열을 함유할 수 있다. 유전자에 코드화된 단백질 또는 폴리펩티드는 전체 길이이거나 그 일부일 수 있고, 그 결과 모든 활성 또는 기능적 성질이 보유되거나, 또는 전체-길이 단백질 또는 폴리펩티드의 유일한 선택된 활성 (예, 효소 활성, 리간드 결합, 시그날 전도 등)이 보유된다. 단백질 또는 폴리펩티드는 전단백질 또는 전구체 폴리펩티드의 생성을 위해 필요한 서열을 포함할 수도 있다. 용어 "유전자"는 코드화 영역의 cDNA 및 게놈 형태를 모두 포함한다. 코드화 영역의 게놈 형태는 "인트론"이라 불리우는 비-코드화 서열로 중단될 수도 있다. 용어 "천연 유전자"는 비번역된 세포의 게놈에 자연적으로 존재하는 유전자를 가리킨다.
"게놈"은 한 세대로부터 다른 세대까지 전달되고 유기체에 자연적으로 존재하는 완전한 유전 물질을 가리킨다.
용어 "이종 핵산" 또는 "외인성 핵산"이란, 특정한 숙주 세포에 대해 외래의 원천으로부터 유래되거나, 동일한 원천으로부터 유래된다면 본래 형태에서 변형되어진 핵산을 가리킨다. 따라서, 숙주 세포 내의 이종 유전자는, 특정한 숙주 세포에 대해 내인성이지만 예를들어 DNA 셔플링의 사용을 통해 변형되어진 유전자를 포함한다. 이 용어는 자연 발생 핵산의 비-자연 발생 다중 복제를 또한 포함한다. 따라서, 이 용어는 세포에 대해 외래이거나 이종인 핵산 단편, 또는 세포 내이지만 정상적으로 발견되지 않는 세포 또는 게놈 내의 위치에서 보통 발견되는 핵산 단편을 가리킨다.
용어 "상동성"이란, 핵산과 대조 핵산 사이 또는 폴리펩티드와 대조 폴리펩티드 사이의 유사성 정도를 가리킨다. 상동성은 부분적이거나 전체적일 수 있다. 전체적인 상동성은 핵산 또는 아미노산 서열이 동일함을 나타낸다. 부분적 상동성 핵산 또는 아미노산 서열은, 대조 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 동일하지 않은 것이다. 따라서, 부분적 상동성 핵산은, 그것이 비교되는 핵산에 비해, 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 갖는다. 상동성 정도는 서열 비교에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다양한 하이브리드형성 조건하에서 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드형성은 핵산들 사이의 상동성 정도에 관한 평가를 제공할 수 있다 (예를들어, [Haines and Higgins (eds.), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 영국 옥스포드] 참조).
"하이브리드형성"이란, 상보성 핵산 가닥 위에서 뉴클레오티드 염기 사이에 수소 결합을 형성함으로써 상보성 핵산 가닥을 어닐링하는 과정을 가리킨다. 하이브리드형성, 및 핵산 사이의 결합 강도는 하이브리드형성 핵산 사이의 상보성 정도, 관련된 조건의 엄격성, 형성된 하이브리드의 Tm, 하이브리드형성 핵산의 길이 및 핵산의 G:C 비율과 같은 요인에 의해 영향을 받는다.
"개시 부위"는, 위치 +1로서 정의되는, 전사된 서열의 일부인 첫번째 뉴클레오티드의 위치를 둘러싼 영역이다. 유전자의 모든 뉴클레오티드 위치는, 개시 부위내에 있는 전사된 서열의 첫번째 뉴클레오티드를 참조하여 번호를 매긴다. 하류 서열(즉, 3' 방향에서의 서열)은 포지티브로 명명되는 반면, 상류 서열(즉, 5' 방향에서의 서열)은 네가티브로 명명된다.
"단리된" 또는 "정제된" 핵산 또는 "단리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드는, 사람의 손으로 천연 환경으로부터 분리되어 존재하고 따라서 야생상태의 생성물이 아닌 핵산 또는 폴리펩티드이다. 단리된 핵산 또는 폴리펩티드는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 또는 폴리펩티드는 예를들어 트랜스제닉 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
용어 "표지"는, 검출가능한 (바람직하게는 정량화가능한) 시그날을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 핵산 또는 단백질에 부착될 수 있는 원자 또는 분자를 가리킨다. 표지는 형광, 방사능, 비색법, 중량법, X-선 회절 또는 흡수, 자성, 효소 활성 등에 의해 검출될 수 있는 시그날을 제공할 수 있다.
용어 "핵산"은, 당, 포스페이트 및 퓨린 또는 피리미딘인 염기를 함유한 단량체(뉴클레오티드)로 이루어진, 단일- 또는 이중-가닥 형태로 있는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 가리킨다. 구체적으로 한정되지 않는 한, 이 용어는, 대조 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 보존적 변형된 그의 변이체 (예를들어 변성 코돈 치환) 및 상보적인 서열 뿐만 아니라 명백하게 나타낸 대조 서열을 절대적으로 포함한다.
여기에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2 이상, 바람직하게는 3개 이상, 보통 10개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 이루어진 분자로서 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 크기에 대한 정확한 상한선은 없다. 그러나, 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 약 250개 뉴클레오티드보다 짧고, 더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 약 200개 뉴클레오티드보다 짧고, 더욱 더 바람직한 올리고뉴클레오티드는 약 100개 뉴클레오티드보다 짧다. 가장 바람직한 올리고뉴클레오티드는 약 50개 뉴클레오티드보다 더 짧다. 실제 크기는 많은 요인에 의존되고, 다시 이것은 궁극적인 기능 또는 올리고뉴클레오티드의 사용에 의존된다. 올리고뉴클레오티드는 화학 합성, DNA 복제, 역 전사 또는 이들의 조합을 포함한 여러 방식으로 생성될 수 있다.
용어 "개방 판독 프레임" 및 "ORF"는 코드화 서열의 번역 개시 및 종료 코돈 사이에서 코드화된 아미노산 서열을 가리킨다. 용어 "개시 코돈" 및 "종료 코돈"은, 각각 단백질 합성(mRNA 번역)의 개시 및 사슬 종료를 규정하는 코드화 서열에있는 3개의 인접한 뉴클레오티드 단위 ("코돈")을 가리킨다.
"작동적으로 연결된"은, 2개 이상의 핵산이 서로 기능적인 관계로 위치함을 의미한다. 예를들어, 프리시퀀스 또는 분비 리더를 코드화하는 핵산은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산에 작동적으로 연결될 수 있고, 단백질의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현되며; 프로모터 또는 인핸서는 코드화 서열에 작동적으로 연결될 수도 있고 서열의 전사에 영향을 미치거나; 또는 리보좀 결합 부위는 코드화 서열에 작동적으로 연결되고 번역을 촉진하기 위해 위치될 수 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은, 연결되는 DNA 서열들이 연속적이고, 코드화된 폴리펩티드 서열의 경우에 판독 단계에 있고 일반적으로 연속적임을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적이어서는 안된다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 여기에서 서로 바꾸어 사용될 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "엄격성"은, 핵산 하이브리드형성이 수행되는 온도, 이온 강도, 및 다른 화합물, 예컨대 유기 용매의 존재와 같은 조건을 한정하기 위해 사용된다. "고 엄격성" 조건에서는, 높은 빈도의 상보성 염기 서열을 가진 핵산 사이에서만 핵산 염기 쌍합이 일어난다. "약" 또는 "저" 엄격성 조건에서는, 상보성 서열의 빈도가 보통 낮고, 그 결과 상이한 서열을 가진 핵산들이 검출 및/또는 단리될 수도 있다.
용어 "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 상동성"이란, 본 발명의 서열의 기능적 균등물을 나타내는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 가리킨다. 예를들어,유전 암호의 퇴화를 단순히 반영하지만 그럼에도 불구하고 본 발명의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 코드화하는 변경된 뉴클레오티드 서열들은, 실질적으로 본 발명의 서열과 유사하다. 또한, 본 발명의 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열은, 활성적이고 열적으로 안정한 dGTP아제를 제공하기에 충분한 전체 아미노산 동일성을 갖는 것이다. 예를들어, 본 발명의 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열은, 전체 아미노산 동일성이 본 발명의 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상인 서열이다.
"열안정성"이란, 효소가 약 37℃ 내지 42℃보다 높은 온도에서 활성을 위한 적정 온도를 가짐을 의미한다. 바람직한 폴리머라제 효소는 활성을 위해 약 50 내지 75℃의 적정 온도를 갖고, 더욱 바람직한 효소는 55℃ 내지 70℃의 적정 온도를 갖고, 가장 바람직한 효소는 60℃ 내지 65℃의 적정 온도를 갖는다.
핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 "변이체"는, 변이체 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 각각 대조 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 관련되지만 상이한 서열을 가짐을 의미한다. 변이체 핵산은 대조 핵산과는 뉴클레오티드 서열이 상이한 반면, 변이체 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 각각 대조 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 변이체 및 대조 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 서로 조합될 수도 있는 하나 이상의 치환, 삽입, 첨가, 결실, 융합 및 절단에 의해 서열이 달라질 수도 있다. 차이는 아주 적거나 (예를들어, 1개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 차이) 또는 더욱 실질적일 수도 있다. 그러나, 변이체의 서열이 대조서열과 차이가 없어서, 변이체및 대조가 구조적 및/또는 기능적으로 서로 관련된다는 것을 당업자가 인식하지 못할 수도 있다. 일반적으로, 대조 및 변이체는 전체적으로 밀접하게 유사하거나 많은 영역에서 동일하도록 차이가 제한된다.
하나의 세포로부터 다른 세포로 핵산 단편(들)을 운반할 수 있는 핵산을 가리키기 위하여 용어 "벡터"가 사용된다. "벡터"는 특히, 자기 전달가능하거나 이동가능할 수도 있고 아닐 수도 있으며, 원핵 또는 진핵 숙주를 세포 게놈으로의 통합에 의해 또는 기존의 염색체외 방식으로 (예를들어, 복제개시점을 가진 자율 복제 플라스미드) 형질전환시킬 수 있는, 이중 또는 단일 가닥의 선형 또는 원형 형태의 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 핵산을 포함한다. 세균 계에서 사용되는 벡터는 복제 개시점을 종종 함유하고, 그 결과 벡터는 세균 염색체와는 독립적으로 복제할 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 발현 카세트를 함유하는 벡터를 가리킨다.
용어 "야생형"은, 자연 발생적 원천으로부터 단리될 때 그 유전자 또는 유전자 생성물의 특징을 가진 유전자 또는 유전자 생성물을 가리킨다. 야생형 유전자는, 가장 빈번하게 집단으로 발견되는 유전자이고, 임의로 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형태를 나타내는 유전자이다. 반대로, 용어 "변이된" 또는 "돌연변이체"는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교시에 서열 및/또는 기능적 성질에서의 변이(즉, 변경된 특징)를 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 가리킨다. 자연-발생 돌연변이체가 단리될 수도 있고; 이들은 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교시에 변경된 특징을 갖는다는 사실에 의해 동정된다.
엔테로박테리아시애 dGTP아제 핵산
본 발명은, 엔테로박테리아시애 과의 종으로부터의 데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제 효소를 코드화하는 핵산에 관한 것이다. 활성적인 데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제 효소를 코드화하는 변이체 핵산도 본 발명에 의해 의도된다. 핵산의 단편이 엔테로박테리아시애 과의 종으로부터의 데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제 효소를 코드화하는 핵산에 대해 특이적으로 하이브리드형성될 수 있는 한, 이러한 핵산의 단편이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 핵산은 단리되거나 실질적으로 정제된 핵산이다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산은, 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에 있는 핵산과 자연적으로 인접해 있고 단백질을 코드화하는 핵산을 갖지 않는다. 본 발명의 핵산은 엔테로박테리아시애 과의 세균 종을 검출하기 위해 사용될 수도 있다. 검출은 당업자에게 공지된 절차, 예를들어 이용가능한 하이브리드형성, 증폭 또는 관련된 절차에 의해 수행될 수 있다.
예를들어, 본 발명은 세데카(Cedecca), 시트로박터(Citrobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리키아(Escherichia), 하프니아(Hafnia), 크레브시엘라, 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella) 또는 예르시니아(Yersinia) 속으로부터의 데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제 효소의 전부 또는 일부를 코드화하는 핵산에 관한 것이다. 하나의 구현양태에서, 핵산은 에스케리키아 콜리 데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제를 코드화하는 핵산의 전부 또는 일부이고, 이것은 하기서열을 갖는다 (SEQ ID NO:1):
여기에 제공된 데옥시구아노신 트리포스페이트 트리포스포히드롤라제 핵산의 단편 및 변이체 핵산이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 의해 포함된 핵산 "단편"은 2개의 일반적인 유형이다. 첫번째는, 전체 길이 dGTP아제를 코드화하지 않지만dGTP아제 활성을 가진 폴리펩티드를 코드화하는 단편 핵산이 본 발명의 범위 내에 있다. 두번째는, 하이브리드형성 프로브 또는 프라이머로서 유용하지만 일반적으로 dGTP아제 활성을 코드화하지 않는, 여기에서 동정된 핵산의 단편도 본 발명에 포함된다.
이.콜리 dGTP아제 핵산 서열(SEQ ID NO:1) 또는 엔테로박테리아시애 과의 기타 장내 세균 종으로부터의 dGTP아제 핵산 서열을 사용하여, 단편을 수득하거나 발생시킬 수 있다. 다른 dGTP아제 핵산 서열을 유전자뱅크 서열 저장소에서 찾을 수 있다. 프라이머 서열을 장내 종 사이의 서열 동일성 또는 보존성 영역으로부터 선택할 때, 장내 dGTP아제 핵산을 증폭하기 위해 프라이머로서 사용되는 단편을 설계할 수도 있다. 다른 한편, 속 또는 종에 대해 특유의 서열을 선택함으로써, 엔테로박테리아시애의 특이한 속 또는 종에 대해 선택적인 프라이머 서열을 설계할 수 있다. 당업자라면 이러한 프라이머 서열을 쉽게 설계할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 단편은 적어도 약 9개 뉴클레오티드, 약 12개 뉴클레오티드, 약 15개 뉴클레오티드, 약 17개 뉴클레오티드, 약 18개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드 이상의 범위일 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 핵산 단편은, 본 발명의 핵산에 대해 서열적으로 연관되지만 전체 길이가 아닌 이상, 크기 상한선을 가질 수 있다.
본 발명의 핵산 단편은 예를들어 dGTP아제 핵산을 검출하거나 동정하기 위한 하이브리드형성 프로브로서, 또는 dGTP아제 핵산의 DNA 합성, DNA 서열화 또는 DNA 증폭을 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. SEQ ID NO:1로부터 다수의 단편이 수득될 수 있다. 본 발명의 핵산 단편의 예는 SEQ ID NO:1-18을 포함한다.
"변이체"란 실질적으로 유사하거나 실질적으로 상동성인 서열을 의미한다. 뉴클레오티드 서열을 위하여, 변이체는 유전 코드의 퇴화 때문에 천연 dGTP아제 단백질의 동일한 아미노산 서열을 코드화하는 서열을 포함한다. 자연 발생 대립 변이체는 여기에 구체적으로 기재되지 않은 엔테로박테리아시애 dGTP아제 핵산을 포함하며 본 발명 내에 속한다. 변이체 핵산은 잘 알려진 분자 생물학 기술, 예를들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 하이브리드형성 기술을 사용하여 동정될 수 있다. 변이체 핵산은 천연 dGTP아제 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지 않지만 여전히 활성 dGTP아제를 코드화하는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 포함한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 유전 코드는 "퇴화"되고, 이것은 몇 개의 트리뉴클레오티드 코돈이 동일한 아미노산을 코드화할 수 있음을 의미한다. 이러한 퇴화는 표 1로부터 명백하다.
따라서, 변이체의 뉴클레오티드 서열에서의 많은 변화가 잠재성일 수도 있고, 핵산에 의해 코드화된 아미노산 서열을 변경시키지 않을 수도 있다. 핵산 서열 변경이 잠재성인 경우에, 변이체 핵산은 대조 핵산과 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코드화할 것이다.
본 발명의 핵산 서열은 변성 코돈 치환을 가진 변이체, 및 그의 상보성 서열 뿐만 아니라 SEQ ID NO에 의해 명백하게 규정된 서열을 포함한다. 구체적으로, 변성 코돈 치환은, 대조 코돈에 의해 규정된 아미노산을 위한 코돈 중의 어느 것으로 대조 코돈이 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Batzer 등, Nucleic Acid Res., 19, 5081 (1991)] 및/또는 [Ohtsuka 등,J.Biol.Chem., 260, 2605 (1985); Rossolini 등, Mol.Cell.Probes, 8,91 (1994)]에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 선택된 코돈의 세번째 위치를 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환할 수 있다.
그러나, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열에서의 잠재성 변화에 한정되는 것이 아니라, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키는 변이 핵산 서열을 포함한다. 본 발명에 따르면, 활성의 dGTP아제가 변이체 핵산에 의해 코드화되는 이상, 본 발명의 변이체 및 대조 핵산은, 조합되어 존재할 수도 있는 하나 이상의 치환, 첨가, 삽입, 결실, 융합 및 절단에 의하여, 코드화된 아미노산 서열에서 상이할 수도 있다. 이러한 변이체 핵산은 실제로 대조 핵산과 동일한 아미노산 서열을 코드화하지 않으며, 이것은 "비-잠재성" 서열 변화를 갖는 것으로 설명된다.
잠재성 및 비-잠재성 변화를 가진 변이체 핵산은 대조 핵산에 대한 상동성 정도에 의해 정의되고 특징화될 수 있다. 바람직한 변이체 핵산은 본 발명의 대조 핵산과 "실질적으로 상동성"이다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 이러한 실질적으로 유사한 핵산은 엄격한 조건하에서 본 명세서에서 SEO ID NOS로 동정된 대조 핵산과 하이브리드형성할 수 있다. 이러한 유형의 실질적으로 상동성의 핵산이 본 발명에 포함된다.
일반적으로, 본 발명의 핵산 변이체는 여기에 정의된 대조 뉴클레오티드 서열과 적어도 50%, 60% 내지 70% 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 바람직한 핵산 변이체는 여기에 정의된 대조 뉴클레오티드 서열과 적어도 71%, 72%, 73%,74%, 75%, 76%, 77%, 78% 내지 79%의 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 더욱 바람직한 핵산 변이체는 여기에 정의된 대조 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83% 또는 84% 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 핵산은 여기에 정의된 대조 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89% 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 핵산은 여기에 정의된 대조 뉴클레오티드의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94% 서열 동일성을 가질 것이다. 본 발명의 가장 바람직한 핵산은 여기에 정의된 대조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97% 내지 98% 서열 동일성을 가질 것이다.
변이체 핵산은 표준 하이브리드형성 절차에 의해 검출되고 단리될 수 있다.
이러한 서열을 검출하거나 단리하기 위한 하이브리드형성은 일반적으로 엄격한 조건하에서 수행된다. 사우던 및 노던 하이브리드형성과 같은 핵산 하이브리드형성 실험에서 "엄격한 하이브리드형성 조건" 및 "엄격한 하이브리드형성 세척 조건"은 서열 의존적이고, 상이한 환경 매개변수 하에서 서로 상이하다. 더욱 긴 서열이 더욱 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드형성된다. 핵산의 하이브리드형성에 관한 광범위한 지침은 문헌 [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, page1, chapter2 "Overview of priciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York (1993)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 문헌 [J.Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp.9.31-9.58 [1989]] 참조.
본 발명은 또한 dGTP아제 활성을 코드화하는 변이체 핵산의 검출 및 단리 방법을 제공한다. 방법은, SEQ ID NOS: 1 내지 14를 포함하는 핵산의 적어도 일부를 샘플 핵산에 대해 하이브리드형성시키고, 이에 의해 하이브리드형성 착물을 형성하고, 하이브리드형성 착물을 검출하는 것을 포함한다. 착물의 존재는 변이체 dGTP아제 핵산의 존재와 상관관계를 갖는다. 일반적으로, 하이브리드형성을 위해 사용되는 핵산의 일부는 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 하이브리드형성 방법에서 사용되는 핵산의 예는 SEQ ID NOS:1-18을 포함하는 핵산을 포함한다. 하이브리드형성은 동종의 핵산을 검출 및 단리할 수 있기에 충분히 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 수행된다.
대안적인 구현양태에서, SEQ ID NOS: 2-18로부터 선택된 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하는 DNA 증폭에 의해 샘플에서 핵산을 검출한다. 이러한 한가지 증폭 방법은 이하 더욱 상세히 설명되는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이다.
본 발명의 변이체 핵산을 검출하고 단리하기 위해 고 내지 중간 정도의 엄격한 하이브리드형성 조건이 일반적으로 사용되지만, 만일 이들이 코드화하는 폴리펩티드들이 실질적으로 동일하다면, 엄격한 조건하에서 서로 하이브리드형성되지 않는 핵산들은 대조 핵산과 여전히 실질적으로 동일하다. 이것은 예를들어 유전 코드에 의해 허용된 최대 코돈 변성을 사용하여 핵산의 복제가 생성될 때 일어날 수 있다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 한가지 암시는, 첫번째 핵산에 의해 코드화된 폴리펩티드가 두번째 핵산에 의해 코드화된 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응할 경우이다. 따라서, 당업자에게 알려진 바와 같이, 대조 핵산에대해 실질적으로 상동성인 핵산을 검출하고 단리하기 위하여 고 내지 중간 정도의 엄격한 하이브리드형성 조건이 사용될 수 있지만, 저 엄격성 하이브리드형성 조건을 사용하여 실질적으로 상동성인 핵산들을 검출하거나 단리하는 것도 또한 가능하다.
일반적으로, 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정한 이중-가닥 서열을 위한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮게 되도록, 고 엄격성 하이브리드형성 및 세척 조건을 선택한다. 예를들어, "고 엄격성 조건" 또는 "고 엄격성 하이브리드형성 조건" 하에서, 핵산은 다른 서열에 대해서 보다 더욱 높은 검출 정도로 그의 보체에 하이브리드형성될 것이다 (예를들어, 배경에 비해 적어도 2배 이상). 하이브리드형성 및/또는 세척 조건의 엄격성을 조절함으로써, 100% 상보성인 핵산이 동정될 수 있다.
대안적으로, 더 낮은 정도의 유사성이 검출되도록 하기 위해서는, 일부 서열 부조화가 가능하도록 엄격성 조건을 조절할 수 있다 (이종 프로브). 전형적으로, 엄격한 조건은, pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.5M Na 이온 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0M Na 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예를들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드)를 위해 약 30℃ 이상, 긴 프로브(예를들어, 50개 뉴클레오티드 이상)를 위해 약 60℃ 이상이다. 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 엄격한 조건이 달성될 수 있다.
일례의 낮은 엄격성 조건은, 37℃에서 30 내지 35% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS (소듐 도데실 설페이트)의 완충용액을 사용하여 하이브리드형성하고, 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC (20X SSC = 3.0M NaCl 및 0.3M 트리소듐 시트레이트)중에서 세척하는 것을 포함한다. 일례의 중간 엄격성 조건은, 37℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1.0M NaCl, 1% SDS중에서 하이브리드형성하고, 55 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC중에서 세척하는 것을 포함한다. 일례의 높은 엄격성 조건은 37℃에서 50% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS중에서 하이브리드형성하고, 60 내지 65℃에서 0.1X SSC중에서 세척하는 것을 포함한다.
하이브리드형성 동안에 수득된 하이브리드의 상보성 또는 상동성 정도는, 전형적으로 후-하이브리드형성 세척의 함수이고, 중요한 인자는 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도이다. 하이브리드형성 핵산의 종류 및 길이는, 하이브리드가 일어나는지의 여부와 형성된 하이브리드가 주어진 하이브리드형성 및 세척 조건에서 안정한지의 여부에 영향을 미친다. DNA-DNA 하이브리드를 위하여, 문헌 [Meinkoth and Wahl Anal. Biochem. 138:267-284 (1984)]에 기재된 방정식으로부터 Tm을 어림할 수 있다:
Tm = 81.5℃ + 16.6(logM) + 0.41(% GC) - 0.61(% 형태) - 500/L
상기 식에서, M은 1가 양이온의 몰농도이고, %GC는 DNA에 있는 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 퍼센트이고, % 형태는 하이브리드형성 용액 중의 포름아미드의 퍼센트이고, L은 염기쌍에서의 하이브리드의 길이이다. Tm은, 상보성 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치된 프로브에 하이브리드형성되는 온도이다. 특정한 프로브를 위한 Tm과 동일하도록 매우 엄격한 조건이 선택된다.
사우던 또는 노던 블롯에서 필터 위에 100개 이상의 상보성 잔기를 가진 상보성 핵산의 하이브리드형성을 위한 엄격한 하이브리드형성 조건의 예는 42℃에서1mg의 헤파린을 가진 50% 포름아미드이고, 하이브리드형성을 밤새 수행한다. 고 엄격성 조건의 예는 약 15분 동안 72℃에서 0.15M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 15분 동안 65℃에서 0.2x SSC 세척이다 (상기 Sambrook의 문헌 참조). 종종, 배경 프로브 시그날을 제거하기 위하여 저 엄격성 세척 전에 먼저 고 엄격성 세척을 수행한다. 예를들어 100개 이상의 뉴클레오티드의 듀플렉스를 위한 중간 엄격성 세척의 예는 15분 동안 45℃에서 1x SSC이다. 예를들어 100개 이상의 뉴클레오티드의 듀플렉스를 위한 일례의 저 엄격성 세척은, 15분동안 40℃에서 4-6x SSC이다. 짧은 프로브(예를들어, 약 10 내지 50개 뉴클레오티드)를 위하여, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M Na 이온 미만의 염 농도, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0M Na 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 온도는 전형적으로 약 30℃ 이상이다.
포름아미드와 같은 탈안정화 제를 첨가하여 엄격한 조건이 달성될 수 있다. 일반적으로, 특별한 하이브리드형성 분석에서 관련없는 프로브에 대해 관찰되는 것보다 2배 (또는 그 이상)의 시그날 대 잡음 비율은, 특이적인 하이브리드형성의 검출을 나타낸다. 엄격한 조건하에서 서로 하이브리드형성되지 않는 핵산은, 이들이 코드화하는 단백질이 실질적으로 동일하다면, 여전히 실질적으로 동일하다. 이것은, 예를들어 유전 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 퇴화를 사용하여 핵산의 복제를 생성할 때 일어난다.
다음은, 본 발명의 대조 핵산과 실질적으로 동일한 상동성 핵산을 검출하고 단리하기 위해 사용될 수 있는 일련의 하이브리드형성/세척 조건의 예이다: 대조뉴클레오티드 서열을 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 대조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드형성하고, 50℃에서 2X SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하고, 더욱 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 대조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드형성하고, 50℃에서 1X SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하고, 더욱 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 대조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드형성하고, 50℃에서 0.5X SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하고, 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 대조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드형성하고, 50℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하고, 더욱 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, 1mM EDTA 중에서 대조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드형성하고, 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS 중에서 세척한다.
일반적으로, 각각 1%의 부조화에 대해 약 1℃씩 Tm이 감소된다. 따라서, 바람직한 서열 동일성의 서열에 대해 하이브리드형성 하기 위하여, Tm, 하이브리드형성, 및/또는 세척 조건을 조절할 수 있다. 예를들어, 90% 초과의 동일성을 가진 서열을 구한다면, Tm이 10℃ 저하될 수 있다. 일반적으로, 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정한 서열 및 그의 보체에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 또는 훨씬 더 낮도록 엄격한 조건을 선택한다. 그러나, 상당히 엄격한 조건은 열 융점(Tm)보다 1,2, 3 또는 4℃ 낮은 온도에서의 하이브리드형성 및/또는 세척을 사용할 수 있다; 중간의 엄격한 조건은 열 융점(Tm)보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 낮은 온도에서의 하이브리드형성 및/또는 세척을 사용할 수 있다; 낮은 엄격성 조건은 열 융점(Tm)보다 11, 12, 13, 14, 15 또는 20℃ 낮은 온도에서의 하이브리드형성 및/또는 세척을 사용할 수 있다.
바람직한 부조화 정도가 45℃ (수용액) 또는 32℃ (포름아미드 용액) 미만의 Tm을 가져온다면, 더욱 높은 온도가 사용될 수 있도록 SSC 농도를 조절하는 것이 바람직하다. 핵산의 하이브리드형성에 관한 광범위한 지침은 문헌 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part 1, Chapter 2 (Elsevier, New York)] 및 [Ausubel 등, eds. (1995) Currents Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 문헌 [Sambrook 등(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York]을 참조한다. Tm, 부조화와 하이브리드형성 및 세척 조건 사이의 관계에 관한 참고문헌 및 교시내용을 사용하여, 당업자라면 본 발명의 dGTP아제 핵산의 변이체를 생성할 수 있을 것이다.
서열 동일성을 결정하기 위해 서열 비교를 위하여 컴퓨터 분석을 사용할 수 있다. 이러한 분석은, 이에 한정되지 않지만, PC/Gene 프로그램(미국 캘리포니아주, 마운틴뷰, 인텔리제네틱스(Intelligenetics)로부터 입수가능함); ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 및 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지, 버젼 8에서의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575, 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG)으로부터 입수가능함)을 포함한다. 이러한 프로그램을 이용한 얼라인먼트는 디폴트 매개변수를 사용하여 실행될 수 있다. CLUSTAL 프로그램은 문헌 [Higgins 등, Gene 73:237-244 (1988); Higgins 등, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet 등, Nucleic Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang 등, CABIOS 8:155-65 (1992); 및 Pearson 등, Meth.Mol.Biol. 24:307-331 (1994)]에 기재되어 있다.
BLAST 프로그램은 문헌 [Altschul 등, J.Mol.Biol. 215:403 (1990)]에 기재되어 있다. 비교 목적을 위한 갭 얼라인먼트를 수득하기 위하여, 문헌 [Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997)]에 기재된 바와 같이 갭 BLAST (BLAST 2.0)을 사용할 수 있다. 대안적으로, 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검사를 수행하기 위해 PSI-BALST (BLAST 2.0)을 사용할 수 있다. 상기 Altschul 등의 문헌 참조. BLAST, 갭 BLAST, PSI-BLAST를 사용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수 (예를들어, 뉴클레오티드 서열을 위한 BLASTN, 단백질을 위한 BLASTX)를 사용할 수 있다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열)은 11의 워드길이(W), 10의 기대치(E), 100의 컷오프, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열을 위하여, BLASTP 프로그램은 3의 워드길이(W), 10의 기대치(E), 및 블로섬(BLOSUM) 62 채점 행렬을 사용한다 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89, 10915 (1989)] 참조).http://www.ncbi.n1m,nih.gov. 참조. 얼라인먼트는 정밀검사에 의해 수작업으로 수행될 수도 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 여기에 개시된 dGTP아제 서열에 대한 % 서열 동일성을 결정하기 위한 뉴클레오티드 서열의 비교는 디폴트 매개변수를 가진 BlastN 프로그램(버젼 1.4.7 또는 그 이후) 또는 균등한 프로그램을 사용하여 바람직하게 수행된다. "균등한 프로그램"이란, 바람직한 프로그램에 의해 생성된 상응하는 얼라인먼트와 비교할 때, 당해 2개의 서열에 대하여, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 조화 및 동일한 % 서열 동일성을 가진 얼라인먼트를 생성하는 서열 비교 프로그램을 가리킨다.
엔테로박테리아시애 dGTP아제 단백질
본 발명은 엔테로박테리아시애 종으로부터의 단리된 dGTP아제 폴리펩티드 뿐만 아니라 그의 단편 및 dGTP아제 활성을 보유하는 변이체 dGTP아제 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 구현양태에서, 본 발명은 야생형 에스케리키아 콜리 dGTP아제 폴리펩티드인 SEQ ID NO:19의 폴리펩티드를 제공한다:
다른 구현양태에서, 본 발명은 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 dGTP아제 폴리펩티드인 SEQ ID NO:20의 폴리펩티드를 제공한다:
다른 구현양태에서, 본 발명은 야생형 클레브시엘라 옥시토카 dGTP아제 폴리펩티드인 SEQ ID NO:21의 폴리펩티드를 제공한다:
본 발명은 또한 특정한 엔테로박테리아시애 세균 종에서 유일하게 발견되는 펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드들을 하기 표 2에 나타낸다.
종 위치 서열 SEQ ID NO:
살모넬라 141-147 HPDEAES 22
에스케리키아 141-147 HPDEAES 22
크레브시엘라 141-147 APGDALG 23
예르시니아 141-147 DPNGGGA 24
살모넬라 156-159 VVFS 25
에스케리키아 156-159 SVAA 26
크레브시엘라 156-159 EVQA 27
예르시니아 156-159 LVNT 28
살모넬라 163-171 QEGEENLND 29
에스케리키아 163-171 RDGEEPLNE 30
크레브시엘라 163-171 HDGETSLNA 31
예르시니아 163-171 REGETELNI 32
살모넬라 221-227 RSRIPIR 33
에스케리키아 221-227 ETPETHH 34
크레브시엘라 221-227 ETPASHS 35
예르시니아 221-227 DIPTSHN 36
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 단리되거나 실질적으로 정제된 폴리펩티드이다. 특히, 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 엔테로박테리아시애 세균에서 보통 존재하는 다른 단백질을 실질적으로 갖지 않는다. 본 발명의 폴리펩티드의 제제 및 조성물은 실질적으로 세포 물질을 갖지 않는다. 예를들어, 이러한 제제 및 조성물은 약 30%, 20%, 10% 또는 5%(건조 중량) 미만의 오염 단백질을 갖는다.
"변이체" 폴리펩티드는, dGTP아제 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 대한 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 첨가; dGTP아제 폴리펩티드 내의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 첨가; 또는 dGTP아제 폴리펩티드 내의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 치환에 의한, 이.콜리 이외의 엔테로박테리아시애 세균 종으로부터의 폴리펩티드 또는 엔테로박테리아시애 dGTP아제로부터 유래된 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함한 다양한 방식으로 변경될 수 있다.
이러한 변이체 폴리펩티드는 예를들어 유전자 다형성으로부터 또는 인간 조작으로부터 얻어질 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를들어, 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를들어, 문헌 [Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82, 488 (1985); Kunkel 등, Methods in Enzymol., 154, 367 (1987); 미국 특허 4,873,192호; Walker and Gaastra, eds., Techniques in Molecular biology, MacMillan Publishing Company, New York (1983)] 및 이들에 인용된 참고문헌을 참조한다. 주요 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은, 여기에서 참고문헌으로 인용된 문헌 [Dayhoff 등, Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Biomed.Res.Found., Washington, C.D. (1978)]의 모델에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 단리된 폴리펩티드의 변이체는 SEQ ID NO:19-36의 아미노산 위치의 적어도 약 60%와 동일성을 갖는다. 바람직한 구현양태에서, 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:19-36의 아미노산 위치의 적어도 약 70%와 동일성을 갖는다. 더욱 바람직한 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:19-36의 아미노산 위치의 적어도 약 80%와 동일성을 갖는다. 더욱 더 바람직한 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:19-36의 적어도 약 90%와 동일성을 갖는다. 가장 바람직한 변이체 폴리펩티드는 SEQ ID NO:19-36의 아미노산 위치의 적어도 약 95%와 동일성을 갖는다. 특히 바람직한 변이체 폴리펩티드는 SEQ ID NO:20-36의 아미노산 위치의 적어도 약 95%와 동일성을 갖는다. 이러한 변이체는 dGTP아제 활성을 가질 수 있고/있거나, 본 발명의 dGTP아제 폴리펩티드 및 펩티드에 대해 증가된 항체와 면역학적으로 반응성을 가질 수 있다.
단리된 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 아미노산 잔기는 유전적으로 코드화된 L-아미노산, 자연 발생 비-유전적으로 코드화된 L-아미노산, 합성 L-아미노산 또는 이들의 D-거울상이성질체일 수도 있다. 20개의 유전적으로 코드화된 L-아미노산 및 일반적인 비-코드화 아미노산을 위해 여기에서 사용된 아미노산 표기법은 통상적이고, 하기 표 3에 나타낸다.
아미노산 1-문자 기호 일반약어
알라닌 A Ala
아르기닌 R Arg
아스파라긴 N Asn
아스파르트산 D Asp
시스테인 C Cys
글루타민 Q Gln
글루탐산 E Glu
글리신 G Gly
히스티딘 H His
이소류신 I Ile
류신 L Leu
리신 K Lys
메티오닌 M Met
페닐알라닌 F Phe
프롤린 P Pro
세린 S Ser
트레오닌 T Thr
트립토판 W Trp
티로신 Y Tyr
발린 V Val
β-알라닌 bAla
2,3-디아미노프로피온산 Dpr
α-아미노이소부티르산 Aib
N-메틸글리신(사르코신) MeGly
오르니틴 Orn
시트룰린 Cit
t-부틸알라닌 t-BuA
t-부틸글리신 t-BuG
N-메틸이소류신 MeIle
페닐글리신 Phg
시클로헥실알라닌 Cha
노르류신 Nle
나프틸알라닌 Nal
피리딜알라닌
3-벤조티에닐 알라닌
4-클로로페닐알라닌 Phe(4-Cl)
2-플루오로페닐알라닌 Phe(2-F)
3-플루오로페닐알라닌 Phe(3-F)
4-플루오로페닐알라닌 Phe(4-F)
페니실아민 Pen
1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산 Tic
β-2-티에닐알라닌 Thi
메티오닌 술폭시드 MSO
호모아르기닌 hArg
N-아세틸 리신 AcLys
2,4-디아미노 부티르산 Dbu
ρ-아미노페닐알라닌 Phe(pNH2)
N-메틸발린 MeVal
호모시스테인 hCys
호모세린 hSer
ε-아미노헥산산 Aha
δ-아미노발레르산 Ava
2,3-디아미노부티르산 Dab
이러한 변이체 폴리펩티드가 dGTP아제 활성을 보유하고/하거나 SEQ ID NO:19-36을 가진 dGTP아제 폴리펩티드에 대해 증가된 항체와 면역학적으로 반응성을 유지하는 이상, 본 발명의 범위에 속하는 폴리펩티드 변이체는 유사한 화학적 및/또는 물리적 성질의 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산을 가질 수 있다.
서로 치환가능한 아미노산은 일반적으로 유사한 부류 또는 하위부류에 존재한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 아미노산은 3개의 주요 부류에 속할 수 있다: 주로 아미노산 측쇄의 특징에 의존하여, 친수성 아미노산, 소수성 아미노산 및 시스테인-유사 아미노산. 이러한 주요 부류들을 더욱 하위부류로 나눌 수 있다. 친수성 아미노산은 산성, 염기성, 극성 측쇄를 가진 아미노산을 포함하고, 소수성 아미노산은 방향족 또는 비극성 측쇄를 가진 아미노산을 포함한다. 비극성 아미노산은 다른 것들 중에서 지방족 아미노산을 포함하도록 더욱 세분될 수 있다. 여기에서 사용된 아미노산 부류의 정의는 다음과 같다:
"소수성 아미노산"은 생리학적 pH에서 비하전되고 수용액에 의해 반발되는 측쇄를 갖는 아미노산을 가리킨다. 유전적으로 코드화된 소수성 아미노산의 예는 Ile, Leu 및 Val를 포함한다. 비-유전적 코드화 소수성 아미노산의 예는 t-BuA를 포함한다.
"방향족 아미노산"은 공액 π-전자 체계를 가진 적어도 하나의 고리(방향족 기)를 함유하는 측쇄를 가진 소수성 아미노산을 가리킨다. 방향족 기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 히드록실, 술포닐, 니트로 및 아미노기 뿐만 아니라 기타 기와 같은치환기로 더욱 치환될 수도 있다. 유전적으로 코드화된 방향족 아미노산의 예는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 포함한다. 통상적으로 직면하는 비-유전적 코드화 방향족 아미노산은 페닐글리신, 2-나프틸알라닌, β-2-티에틸알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다.
"비극성 아미노산"은, 생리학적 pH에서 일반적으로 하전되지 않고 극성이 아닌 측쇄를 가진 소수성 아미노산을 가리킨다. 유전적 코드화 비극성 아미노산의 예는 글리신, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 비-코드화 비극성 아미노산의 예는 Cha을 포함한다.
"지방족 아미노산"은, 포화 또는 불포화 직쇄, 분지쇄 또는 고리형 탄화수소 측쇄를 가진 비극성 아미노산을 가리킨다. 유전적 코드화 지방족 아미노산의 예는 Ala, Leu, Val 및 Ile을 포함한다. 비-코드화 지방족 아미노산의 예는 Nle을 포함한다.
"친수성 아미노산"은 수용액에 의해 끌리는 측쇄를 가진 아미노산을 가리킨다. 유전적 코드화 친수성 아미노산의 예는 Ser 및 Lys을 포함한다. 비-코드화 친수성 아미노산의 예는 Cit 및 hCys를 포함한다.
"산성 아미노산"이란, 7 미만의 측쇄 pK 값을 가진 친수성 아미노산을 가리킨다. 산성 아미노산은 수소 이온의 소실에 기인하여 전형적으로 생리학적 pH에서 음 전하를 띤 측쇄를 갖는다. 유전적 코드화 산성 아미노산의 예는 아스파르트산(아스파테이트) 및 글루탐산 (글루타메이트)을 포함한다.
"염기성 아미노산"이란 7보다 큰 측쇄 pK 값을 가진 소수성 아미노산을 가리킨다. 염기성 아미노산은 전형적으로 히드로늄 이온과의 결합에 기인하여 생리학적 pH에서 양 전하를 띤 측쇄를 갖는다. 유전적 코드화 염기성 아미노산의 예는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 비-유전적 코드화 염기성 아미노산의 예는 비-고리형 아미노산 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산 및 호모아르기닌을 포함한다.
"극성 아미노산"은, 생리학적 pH에서 비하전되지만, 2개의 원자에 의해 공유된 전자 쌍이 하나의 원자에 의해 더욱 밀접하게 유지되는 결합을 가진 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 가리킨다. 유전적 코드화 극성 아미노산의 예는 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 비-유전적 코드화 극성 아미노산의 예는 시트룰린, N-아세틸 리신 및 메티오닌 술폭시드를 포함한다.
"시스테인-유사 아미노산"은, 다른 아미노산 잔기의 측쇄와 공유 결합, 예컨대 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 가진 아미노산을 가리킨다. 전형적으로, 시스테인-유사 아미노산은 일반적으로 적어도 하나의 티올(SH)기를 함유하는 측쇄를 갖는다. 유전적 코드화 시스테인-유사 아미노산의 예는 시스테인을 포함한다. 비-유전적 코드화 시스테인-유사 아미노산의 예는 호모시스테인 및 페니실아민을 포함한다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 상기 부류는 절대적인 것은 아니다. 몇 개의 아미노산은 하나 이상의 특징적인 성질을 나타내고, 따라서 하나 이상의 부류에 포함될 수 있다. 예를들어, 티로신은 방향족 고리 및 극성 히드록실 기를 모두갖는다. 따라서, 티로신은 이중 성질을 갖고, 방향족 및 극성 부류에 포함될 수 있다. 유사하게, 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 것 이외에도, 시스테인은 비극성 특징을 갖는다. 즉, 소수성 또는 비극성 아미노산으로서 엄격하게 분류되지 않지만, 많은 경우에 펩티드에 소수성을 부여하기 위하여 시스테인을 사용할 수 있다.
본 발명의 변이체 폴리펩티드에 존재할 수 있거나 아미노산을 대체할 수 있고, 유전적으로 코드화되지 않는 일반적으로 직면하는 아미노산들은, 이에 한정되지는 않지만, β-알라닌(b-Ala) 및 기타 오메가-아미노산, 예컨대 3-아미노프로피온산 (Dap), 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr), 4-아미노부티르산 등; α-아미노이소부티르산 (Aib); ε-아미노헥산산 (Aha); δ-아미노발레르산 (Ava); N-메틸글리신 (MeGly); 오르니틴(Orn); 시트룰린(Cit); t-부틸알라닌(t-BuA); t-부틸글리신(t-BuG); N-메틸이소류신 (MeIle); 페닐글리신 (Phg); 시클로헥실알라닌(Cha); 노르류신(Ile); 2-나프틸알라닌 (2-Nal); 4-클로로페닐알라닌(Phe(4-Cl)); 2-플루오로페닐알라닌 (Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라닌(Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌 (Phe(4-F)); 페니실아민 (Pen); 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산 (Tic); 베타-2-티에틸알라닌(Thi); 메티오닌 술폭시드(MSO); 호모아르기닌(hArg); N-아세틸 리신(AcLys); 2,3-디아미노부티르산 (Dab); 2,3-디아미노부티르산 (Dbu); p-아미노페닐알라닌 (Phe(pNH2)); N-메틸 발린 (MeVal); 호모시스테인(hCys) 및 호모세린(hSer)을 포함한다. 이러한 아미노산들은 상기 정의된 부류에 속한다.
상기 기재된 유전적 코드화 및 비-코드화 아미노산의 부류들을 이하 표 4에요약한다. 표 4는 단지 예증 목적을 위한 것이며, 여기에 기재된 변이체 폴리펩티드를 포함할 수 있는 아미노산 잔기의 포괄적인 목록을 뜻하는 것이 아님을 이해해야 한다. 여기에 기재된 펩티드 및 펩티드 유사체를 제조하기 위해 유용한 다른 아미노산 잔기는 예를들어 문헌 [Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc.] 및 여기에 인용된 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 여기에 구체적으로 언급되지 않은 아미노산은, 구체적으로 동정된 아미노산과 비교해서 알려진 거동 및/또는 특징적인 화학적 및/또는 물리적 성질을 기초로 하여, 상기-기재된 부류로 편리하게 분류할 수 있다.
분류 유전적 코드화 유전적 비-코드화
소수성 F,L,I,V
방향족 F,Y,W Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), 피리딜 Ala, 벤조티에닐 Ala
비극성 M,G,P
지방족 A,V,L,I t-BuA, t-BuG, MeIle, Nle, MeVal, Cha, bAla, MeGly, Aib
친수성 S,K Cit, hCys
산성 D,E
염기성 H,K,R Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2), DBU, A2 BU
극성 Q,N,S,T,Y Cit, AcLys, MSO, hSer
시스테인-유사 C Pen, hCys, β-메틸 Cys
펩티드 변이체가 dGTP아제 활성을 보유하고/하거나, SEQ ID NO:19-36의 어느 하나를 가진 dGTP아제 폴리펩티드에 대항하여 증가된 항체와 함께 면역학적으로 반응성인 이상, 본 발명의 폴리펩티드는 변이체 펩티드를 생성하기 위해 유사하게 분류된 아미노산에 의해 치환된 아미노산을 가질 수 있다.
즉, 본 발명의 폴리펩티드는 자연 발생 단백질 뿐만 아니라 그의 변형 및 변이된 형태를 모두 포함한다. 이러한 변이체는 계속 바람직한 활성을 가질 것이다. 여기에 포함된 폴리펩티드 서열의 결실, 삽입 및 치환은 폴리펩티드의 특징에서 라디칼 변화를 생성할 것으로 기대되지 않는다. 당업자라면, 일반적인 선별 분석에 의하여 본 발명의 폴리펩티드 및 변이체 폴리펩티드의 열 안정성 및 dGTP아제 활성을 쉽게 평가할 것이다.
dGTP아제 및 변이체 dGTP아제 폴리펩티드의 활성은 당업자에게 공지된 절차에 의해 평가될 수 있다. 예를들어, PPPi로의 dGTP의 가수분해를 측정하는 것을 포함하는, 세토(Seto)등 (13)에 의해 설명된 방법이 사용될 수 있다. 일반적으로, 시험되는 dGTP, MgCl2및 dGTP아제 폴리펩티드를 사용하여 혼합물을 제조한다. 37℃에서 배양한 후에, 반응을 종료하고, 혼합물을 원심분리하고, 상층액의 분취액을 산성화하고 비등시킨다. 산성화 및 비등은 트리폴리포스페이트를 오르소포스페이트로 가수분해시킨다. 전체 오르소포스페이트 농도는 이용가능한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를들어, 아스코르베이트-몰르브데이트 용액의 첨가에 의해 오르소포스페이트를 비색적으로 검출할 수 있고, 이것은 780nm에서 검출가능한 생성물을 유발한다.
dGTP아제 폴리펩티드의 제조
적절한 전사/번역 제어 시그날을 가진 dGTP아제 폴리펩티드를 코드화하는 본 발명의 핵산을 함유한 벡터 및 발현 카세트를 구축하기 위한 방법이 당업자에게 쉽게 이용될 수 있다. 예를들어, 발현 카세트 및 벡터를 형성하기 위하여, 시험관내재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 기술이 사용될 수 있다. 예를들어, 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (제2판) (1989)] 및 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (제3판) (2001)]에 기재된 기술을 참조한다.
일반적으로, 발현 카세트는 키메라 DNA의 형태이고, 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 단편의 발현을 촉진하거나 발현을 정지시키는 제어 서열과 인접해 있는, 주요 폴리펩티드(들)을 코드화하는 핵산 및 플라스미드 DNA를 포함하는 발현 벡터의 일부일 수 있다. dGTP아제 폴리펩티드를 위한 발현 카세트로서 작용하는 헥산과는 별개로, 조절, 복제 또는 구조 기능을 수행하는 발현 벡터의 일부는 전사되지 않을 수도 있다. 발현 벡터의 추가의 전사된 부분은 선택가능한 마커, 벡터-특이적 복제 기능 등을 포함할 수 있다. 인핸서, 폴리아데닐화 서열 등과 같은, 숙주 세포내에서 작용하는 기타 요소들이 발현 벡터의 일부일 수도 있다. 이러한 요소들은 전사, mRNA 안정성, 또는 숙주 세포내에서 발현 벡터의 성능에 영향을 미치는 기타 요인에 작용함으로써 dGTP아제 핵산의 발현을 개선시킬 수 있다.
즉, 이용되는 숙주/벡터 체계에 의존하여, 구성 및 유도 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 터미네이터, 등을 포함한 다수의 적절한 전사 및 번역 요소를 발현 벡터에서 사용할 수 있다 (예를들어 문헌 [Bitter 등, 1987; WO 97/11761 및 WO 96/06167] 참조). 예를들어, 세균 체계에서 클로닝할 때, 박테리오파지 λ의 pL; plac, ptrup, ptac (ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등과 같은 유도 프로모터가 사용될 수 있다. 삽입된 코드화 서열의 조절된 높은 수준의 전사를 제공하기 위하여, 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 생성된 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
발현 카세트는 다른 펩티드를 코드화할 수도 있다. 예를들어, 본 발명의 단리된 핵산을 포함하는 발현 카세트는, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코드화하는 다른 핵산에 프레임내 융합될 수 있고, 이것은 적어도 dGTP아제 폴리펩티드의 단편을 함유하는 융합 단백질로서 발현된다. 이 구현양태에서, 단리된 핵산은 면역원성 dGTP아제 펩티드를 코드화하는 첫번째 DNA 단편 및 캐리어 단백질을 코드화하는 두번째 DNA 단편을 포함한다. 캐리어 단백질은 얻어지는 융합 폴리펩티드의 정제를 촉진할 수 있고/있거나, T 헬퍼 세포를 활성화하는 것을 도울 수 있다. 캐리어 단백질은 바람직하게는 낮은 면역반응성을 갖는다.
세포 내에 도입되는 발현 카세트는, 형질전환시키고자 하는 세포의 집단으로부터 형질전환 세포를 동정하고 선택하는 것을 수월하게 하기 위하여, 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자의 하나 또는 양쪽 모두를 함유할 수 있다. 대안적으로, 선택가능한 마커는 DNA의 별개의 조각 위에 담지될 수 있고 공동-형질전환 절차에서 사용될 수 있다. 숙주 세포에서 발현이 가능하도록 하기 위하여, 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 양쪽 모두 적절한 조절 서열과 인접할 수 있다. 유용한 선택가능한 마커가 당 기술분야에 공지되어 있고, 예를들어 항생물질-내성 유전자를 포함한다.
조절 서열의 기능성을 평가하고 형질전환된 세포를 동정하기 위하여 리포터 유전자를 사용한다. 바람직한 리포터 유전자는 쉽게 분석될 수 있는 폴리펩티드를코드화한다. 다수의 리포터 유전자가 당 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용체 유기체 또는 조직에 의해 발현되거나 여기에 존재하지 않는 유전자이고, 일부 쉽게 검출가능한 성질, 예를들어 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 코드화한다. 바람직한 유전자는 이.콜리의 Tn9로부터의 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(cat), 이.콜리의 uidA 좌의 베타-글루쿠로니다제 유전자(gus), 및 반딧불이 포티너스 파이라리스(Photinus pyralis)로부터의 루시퍼라제 유전자(luc)를 포함한다. DNA를 수용체 세포내에 도입한 후에 적절한 시기에서 리포터 유전자의 발현을 분석한다.
발현 벡터는, 특정한 세포 내로의 도입을 위해 유용한 절차, 예를들어 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙틴, 마이크로주입, 전기영동 등에 의하여, 발현 카세트로의 형질이입에 의해 포유동물, 식물, 세균, 효모 또는 곤충 세포와 같은 숙주 세포 내로 쉽게 도입될 수 있고, 그에 의해 형질전환된 세포가 얻어지며, 그 결과 본 발명의 펩티드, 예를들어 융합 단백질이 숙주 세포에 의해 발현된다.
숙주 세포로부터 재조합적으로 발현된 단백질을 단리하고 정제하기 위한 일반적인 방법이 당업자에게 이용될 수 있다. 예를들어, 특정한 세포 쇄편을 제거하기 위하여, 배양 배지 또는 세포용해물을 원심분리할 수 있다. 이어서, 불용성 및 가용성 폴리펩티드 분획을 분리한다. 이어서, 가용성 분획 또는 불용성 분획, 즉 굴절체들로부터 본 발명의 펩티드를 정제할 수 있다 (예를들어 미국 특허 4,518,526호, 이의 개시내용이 참고문헌으로 인용된다). 암모늄 설페이트 침전, 친화력 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 당 기술분야의 표준절차에 따라서 펩티드를 정제할 수 있다 (일반적으로, Scopes, 1982; Deutscher 1990 참조). 적어도 약 90% 내지 95% 균일성을 가진 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 98 또는 99% 또는 그 이상의 균일성을 가진 조성물이 더욱 바람직하다. 재조합 폴리펩티드 및 단백질의 단리 및 정제 예들이 상기 인용된 Sambrook 등의 문헌에 기재되어 있다.
예를들어, 본 발명의 dGTP아제 폴리펩티드는 원심분리에 의해 수집된 장내 또는 재조합 세균 세포로부터 제조될 수 있다. 완충액 중에서 세척한 후에, 초음파처리에 의해 세포를 붕괴시키고, 초음파처리물을 원심분리에 의해 정화시킨다. 본 발명의 dGTP아제가 열안정성이기 때문에, 초음파 단계로부터의 상층액을 약 60℃로 가열할 수 있고, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 제거한다. KCl의 구배를 사용하여 용출시키는 DEAE 세파로스 컬럼을 사용하여, dGTP아제 폴리펩티드를 함유하는 상층액을 더욱 정제할 수 있다. 단일-가닥 DNA 셀룰로스 컬럼을 사용하여 추가의 정제를 달성할 수 있다. 반-정제된 dGTP아제 제제를 적용하고, 불순물을 KCl로 세척한 후에, 고 농도의 KCl을 사용하여 컬럼으로부터 활성 dGTP아제를 용출시킬 수 있다. 가압 여과에 의해 dGTP아제 효소를 농축하고, 필요한 새로운 완충액 내로 투석할 수 있다.
당업자에게 공지된 절차에 의하여 dGTP아제의 활성을 평가할 수 있다. 예를들어, dGTP의 PPPi로의 가수분해를 측정하는 것을 포함하는, 세토(Seto) 등에 의해 기재된 방법(13)이 사용될 수 있다. 일반적으로, 시험하고자 하는 dGTP, MgCl2및dGTP아제를 사용하여 혼합물을 제조한다. 37℃에서 배양한 후에, 반응을 종료시키고, 혼합물을 원심분리하고, 상층액의 분취액을 산성화하고 비등시켰다. 산성화 및 비등은 트리폴리포스페이트를 오르소포스페이트로 가수분해시킨다. 이용가능한 방법에 의해 총 오르소포스페이트 농도를 측정할 수 있다. 예를들어, 아스코르베이트-몰리브데이트 용액의 첨가에 의해 비색분석으로 오르소포스페이트를 검출할 수 있고, 이것은 780nm에서 검출가능한 생성물을 유발한다.
항체
본 발명은 또한, 예를들어 SEQ ID NO:19-36의 어느 하나를 포함한 엔테로박테리아시애 dGTP아제에 대해 지시된 항체를 제공한다. 더욱 바람직한 항체 제제는 SEQ ID NO:20-36의 어느 하나를 가진 펩티드 또는 폴리펩티드에 대해 지시된다. 본 항체의 면역학적 활성 단편, 예를들어 F(ab) 단편도 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 항체를 제조할 수 있다. 예를들어, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참조한다. 하나의 기술에서, 전체 dGTP아제 폴리펩티드 또는 dGTP아제 폴리펩티드의 항원성 일부를 포함하는 면역원을 다양한 종류의 포유동물(예를들어, 새, 생쥐, 쥐, 토끼, 양 및 염소) 중의 하나에 주입한다. 생물학적으로 적절한 유화제, 예컨대 프뢴드의 불완전 아쥬반트를 사용하여 면역원을 담체 펩티드에 결합시킬 수 있고/있거나 유화시킬 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 추가 면역을 포함하는 미리결정된 스케쥴에 따라서, 면역원을 동물 숙주에 주입한다.
면역화 후에, 동물을 주기적으로 사혈시키고, 혈액 세포를 제거하고, 혈청(항혈청)을 다클론성 항체의 공급원으로서 사용할 수 있다. 예를들어, 적절한 고체 지지체에 결합된 폴리펩티드를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의하여, 항혈청으로부터 다클론성 항체를 정제할 수 있다.
예를들어 문헌 [Kohler and Milstein, Eur.J.Immunol. 6:511-519, 1976]의 기술 및 그의 개선책을 사용하여, 주요 항원성 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체를 제조할 수도 있다. 간략하게, 이러한 방법들은 원하는 특이성(즉, 주요 폴리펩티드와의 반응성)을 가진 항체를 생성할 수 있는 불사 세포주의 제조를 포함한다. 예를들어, 상기 기재된 바와 같이 면역화된 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 이러한 세포주를 제조할 수 있다. 이어서, 당 기술분야에 알려진 다양한 기술 중의 하나를 사용하여, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동일유전자형인 파트너와의 융합에 의해 비장 세포를 불사화할 수도 있다.
얻어진 하이브리도마 콜로니의 상층액으로부터 단클론성 항체를 단리할 수도 있다. 또한, 수율을 향상시키기 위하여, 적절한 척추동물 숙주, 예컨대 생쥐의 복강 내에 하이브리도마 세포주를 주입하는 것과 같은 다양한 기술을 사용할 수 있다. 이어서, 숙주의 복수액 또는 혈액으로부터 단클론성 항체를 수집할 수도 있다.
단클론성 항체는 다클론성 항체에 비해 특정한 장점을 제공한다. 특히, 단클론성 항체는 고 특이적이고 민감하며, 비교적 면역화학적으로 "순수"하다. 본래의 단클론성 항체의 특이성을 보유하는 다른 유도체 항체, 인체화 또는 키메라 분자 또는 항체 단편을 생성하기 위하여, 단클론성 항체를 재조합 DNA 테크놀로지의 기술로 처리할 수도 있다. 이러한 기술은, 예를들어 마우스-유래 단클론성 항체를 더욱 큰 인간 면역글로블린 특징을 가진 항체로 전환시키기 위하여, 면역글로블린 가변부를 코드화하는 DNA 또는 단클론성 항체의 상보성 결정 영역(CDRs)을, 상이한 면역글로블린의 불변부 또는 불변부 + 프레임워크 영역을 코드화하는 DNA와 조합하는 것을 포함할 수 있다 (예를들어 여기에서 참고문헌으로 인용된 EP 184187A 및 EP 2188638A 참조).
바이오센서
엔테로박테리아시애의 검출을 촉진하기 위하여 본 발명의 항체 또는 핵산을 고체 지지체 또는 기질에 흡수시키거나 부착시킬 수 있다. 이러한 물품은 세균의 어떠한 속 또는 종이 시험 샘플내에 존재하는지를 검출하기 위해 유용하다. 고체 지지체 또는 기질은 바이오센서 또는 딥스틱일 수 있다. dGTP아제 폴리펩티드 또는 상보성 핵산을 결합시킬 수 있는 양 및 방식으로 항체 및 핵산을 지지체에 결합시킨다. 주어진 기질에 대해 사용된 항체 및 핵산의 양은 사용되는 특정한 항체 또는 핵산, 특정한 기질, 및 항체-폴리펩티드 결합 또는 핵산 하이브리드형성 효율성에 의존된다.
본 발명의 항체 및 핵산은 적절한 방식으로 기질에 결합될 수 있다. 공유, 비공유 또는 이온 결합이 사용될 수 있다. 항체 또는 핵산을 기질 위의 반응성 기에 직접적으로 또는 결합 잔기를 통해 부착시킴으로써 공유 결합을 달성할 수 있다.
고체 지지체는, 항체 또는 핵산이 결합될 수 있고 본 발명의 분석에서 편리하게 사용될 수 있는 불용성 물질일 수 있다. 바이오센서 또는 고체 지지체가 경질 지지체로부터 형성될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 핵산이 다공성 또는 액체 투과성 물질, 예컨대 섬유성 (종이, 펠트, 니트로셀룰로스 등) 조각 또는 시트, 또는 스크린 또는 망, 또는 당업자들이 엔테로박테리아시애의 분석에서 편리하게 사용할 수 있는 기질 재료에 결합될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 투과성 및 반투과성 막, 석영, 유리 비이드, 플라스틱 비이드, 라텍스 비이드, 플라스틱 마이크로티터 웰 또는 튜브, 아가로스 또는 덱스트란 입자, 세파로스 및 규조토를 포함한다. 고체 지지체의 기질은 작용화 유리, 석영, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO2, SiN4, 개질 규소, 또는 다양한 겔 또는 중합체, 예컨대 (폴리)테트라플루오로에틸렌, (폴리)비닐리덴디플루오라이드, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 또는 이들의 조합일 수도 있다. 본 개시내용을 검토하면, 당업자라면 다른 기질 물질을 쉽게 알 수 있을 것이다. 바람직한 구현양태에서, 기질은 석영, 평판 유리, 실리카 또는 실리콘 웨이퍼이다.
고체 기질 또는 칩의 표면을 다른 재료, 예를들어 중합체, 플라스틱, 수지, 폴리사카라이드, 카르복시메틸덱스트란, 실리카 또는 실리카-기재 재료, 탄소, 금속, 무기 유리, 막, 또는 상기-기재된 기질 재료의 하나로 코팅할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 기질 또는 칩은 하나 이상의 금속으로 코팅된 다음 폴리사카라이드로 코팅된 실리콘 웨이퍼이다. 예를들어, 기질 또는 칩을 금, 은, 크롬 및/또는크롬 및 금과 같은 금속의 조합 또는 층으로 코팅할 수 있다. 금속 침착은 전기-침착에 의해, 스퍼터링 장치의 사용에 의해, 또는 낮은 공기압에서 저온-펌프 증발기의 사용에 의해 수행될 수 있다. 이어서, 카르복시메틸덱스트란과 같은 다당류로 금속 코트를 코팅할 수 있다.
상이한 유형의 항체 및 핵산을 기질 또는 칩 위에 주소지정가능한 열 및 행으로 배열할 수 있다. 이러한 열 및 행의 배열로부터 정보를 판독하기 위한 절차 및 장치를 이용할 수 있다. 용이하고/하거나 자동적인 검출을 위하여, 별개의 항체 또는 핵산 좌의 크기가 일정하다. 예를들어, 각각의 좌는 약 1 마이크론2내지 약 500 마이크론2의 면적을 가진 정사각형, 직사각형, 또는 기타 간단한 기하 형태일 수 있다. 좌의 크기는 흡착되거나 고정화된 항체의 특이성 및 친화성, 주어진 좌에서 항체의 밀도, 시그날의 강도 또는 검출 절차의 민감도에 의존하여 변할 수 있다. 유사하게, 핵산 프로브와 표적 사이의 상보성 정도, 기질 위에서 프로브 분자의 밀도 및 검출 절차의 민감도에 따라서, 좌의 크기가 변할 수 있다.
항체 및 핵산 프로브는 당업자에게 공지된 이용가능한 절차에 의하여 기질 또는 칩 위에 흡수되거나 부착되거나 또는 고정화될 수 있다. 흡착 또는 공유 부착에 의하여, 선택된 항체 또는 프로브를 기질, 지지체 또는 칩에 고정화할 수 있다. 공유 결합이 선택된다면, 지지체를 하기 작용기: 벤조일 아지드, 브로모아세트아미드, 아지도아릴, 알데히드, 이소티오시아네이트, 디아조늄 염, 산 클로라이드, 활성 에스테르, 이미노카르보네이트, 히드라지드, 에폭시 및 아민으로 유도체화하는 것을 포함한, 다양한 종류의 공지된 방법을 사용할 수 있다.
바람직한 구현양태에서, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 검출과 함께, 부착된 핵산 또는 항-dGTP아제 항체를 가진 바이오센서를 사용한다. 선택된 항체 또는 핵산이 금 코팅된 석영 기질의 표면에 결합된다. dGTP아제 폴리펩티드 또는 핵산을 함유할 수도 있는 시험 샘플이 적용되고 바이오센서의 표면 위를 유동한다. 바이오센서의 표면을 헹군 후에, 발현된 표면 플라스콘을 측정함으로써, 결합된 dGTP아제 폴리펩티드 또는 핵산을 검출한다.
본 발명의 방법을 예를들어 측 유동 분석, PCR, ELISA, 및 효소 검출을 포함한 검출 방법과 함께 사용할 수도 있긴 하지만, 표면 플라스콘 공명 기술은 다른 검출 방법에 비하여 더욱 높은 검출 민감도 및 속도를 제공한다 (32-34). 바이오센서-표면 플라스몬 공명 기술은 dGTP아제 효소의 나노그램 양을 검출할 수 있다. 이러한 검출 민감도는 공개된 PCR 기초 검출 방법에 비해 양호한 정도이고, 그 결과는 약 1/2 시간으로 수득될 수 있다 (29-31).
하나의 구현양태에서, 바이아코어 인코포레이티드(BiaCore, Inc.)로부터의 CM5 비변형 바이오센서 칩이 사용된다. 이 칩은 얇은 금속 층으로 코팅된 대략 1cm2석영 결정이다. 금 층에 부착된 것은 카르복시메틸덱스트란의 테더(tether)였다. 단백질 또는 핵산 결합을 위한 반응성 기를 생성하기 위하여, 카르복시메틸덱스트란의 말단 카르복실기가 쉽게 변형된다. 예를들어, 칩 표면을 25mM 중탄산나트륨(pH 8.5)중의 100mM N-에틸-N'(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 50mM N-히드록시숙신이미드(NHS)의 용액과 5분간 반응시킨 다음, 100mM 붕산염(pH 8.5)으로 짧게 헹군다. 이것은 활성화된 CM5 칩을 제공한다. 이어서, 활성화된 칩을 80mM 2-(2-피리디닐디티오)에탄아민(PDEA), 0.1M 붕산염(pH 8.5)중에서 4분동안 항온처리한 다음, 0.1M 붕산염(pH 8.5)중에서 짧게 헹군다. 이어서, 칩을 정제된 항체 또는 핵산 용액과 접촉시킨다. 마지막으로, 모든 반응성 디설파이드를 불활성화시키고, 염(예, NaCl)을 함유하는 시스테인 용액 중에 칩 표면을 침지시킴으로써, 비-공유 결합 단백질 또는 핵산을 제거한다.
따라서, 본 발명은 고체 기판을 그것에 흡착되거나 공유결합으로 부착된 항체 또는 핵산과 함께 포함되는 바이오센서를 제공한다. 바이오센서의 고체 기질은 상이한 항체 또는 핵산 프로브 유형의 패턴 또는 어레이를 가질 수 있다. 또한, 바이오센서의 표면은 그것에 흡착되거나 공유결합으로 부착된 상이한 항체 또는 핵산 프로브 농도를 가질 수 있다. 이러한 어레이는 cm2당 적어도 약 10개 항체 또는 핵산 프로브 좌의 밀도를 갖고, cm2당 약 1백만개 이하의 항체 또는 핵산 프로브 좌를 가질 수 있다.
결합된 항원 또는 핵산의 검출을 위하여 표면 플라스몬 공명 장치를 사용할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 비교적 훈련되지 않은 인원이, 조사관 또는 소비자의 요구에 따라 상이한 항-dGTP아제 항체 또는 핵산을 함유하는 각종 센서 칩을 사용하여 전체 검출 절차를 수행할 수 있기 때문에, 텍사스 인스트루먼츠 포터블 SPR 장치 (TISPR-1)가 바람직하다.
dGTP아제 검출 방법
본 발명의 dGTP아제 핵산 및/또는 dGTP아제 효소는, 엔테로박테리아시애를 검출하는 방법 및 이 방법을 수월하게 수행하기 위한 진단 장치를 위한 주요 기초로서 작용할 수 있다. 일반적으로, 여기에 기재된 dGTP아제 폴리펩티드 및 핵산을 검출하기 위하여 핵산 또는 단백질을 검출하기 위해 당업자에게 공지된 절차를 사용할 수 있다. 예를들어, 면역분석, 하이브리드형성 또는 PCR 절차를 포함하여, 임의의 분자 생물학적 기술이 사용될 수 있다. 생체물리학적 검출 절차는, 예를들어 표면 플라스몬 공명, 형광, 측방 유동 절차와 같은 절차에서 당업자에 의해 지시되는 바에 따라, 별도로 사용되거나 또는 이러한 절차와 결합하여 사용될 수 있다. 이러한 절차들은 시험 샘플에서 장내 세균 오염을 검출하고 동정하는 강하고 유용한 수단을 생성한다.
하나의 구현양태에서, 본 발명은, 엔테로박테리아시애 세균으로부터 단리된 dGTP아제 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 시험 샘플과 접촉시키고, 시험 샘플로부터의 dGTP아제 폴리펩티드가 항체에 결합되었는지의 여부를 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플에서 엔테로박테리아시애를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 검출 방법은 항원-항체 상호작용을 위해 충분한 조건 하에서 충분한 온도에서 수행된다.
다른 구현양태에서, 본 발명은, 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 핵산 프로브를 시험 샘플과 접촉시키고, 핵산 프로브가 시험 샘플에 있는 dGTP아제 핵산과 하이브리드형성되었는지의 여부를 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플 내에서 엔테로박테리아시애를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 엔테로박테리아시애를 위한 프로브로서 유용한 핵산은 본 발명에 의해 제공된 핵산, 예를들어 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 가진 핵산을 포함한다.
하나의 구현양태에서, 본 발명은 시험 샘플에서 장내 세균 종(엔테로박테리아시애)의 존재를 검출할 수 있는 프로브, 예를들어 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6를 제공한다. 그러나, 본 발명은 엔테로박테리아시애 과 내의 하나 이상의 선택된 세균 속을 검출하기 위한 방법 및 프로브를 제공한다. 이러한 프로브 및 방법은 엔테로박테리아시애 종이 시험 샘플에 존재하는지를 동정하기 위해 유용하다. 즉, 예를들어, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 또는 SEQ ID NO:10을 가진 핵산으로부터 만들어진 프로브가 크레브시엘라, 살모넬라, 시겔라 또는 예르시니아로부터의 DNA의 존재하에서 에스케리키아 콜리로부터의 DNA에 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다. SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14를 가진 핵산으로부터 형성된 프로브는 크레브시엘라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 살모넬라 타이피뮤리움으로부터의 DNA에 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다. SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 가진 핵산으로부터 형성된 프로브가 살모넬라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 크레브시엘라 옥시토카로부터의 DNA에 선택적으로 하이브리드형성될 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 하이브리드형성 및 PCR 방법에 제한되는 것이 아니라, 당업자가 존재하는 항체 및 dGTP아제 폴리펩티드와 함께 사용하기 위해 적합할 수 있는 면역학적 또는 면역분석 방법을 또한 포함한다. 예를들어, 본 발명은 고체 지지체 및 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 바이오센서 칩과 시험 샘플을 접촉시키고, dGTP아제가 바이오센서 칩에 결합되었는지의 여부를 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플 내의 장내 세균을 검출하는 방법을 포함한다.
본 발명의 하이브리드형성, 면역학적 및 PCR 절차에서 사용될 수 있는 시험 샘플은, 예를들어 인간 또는 동물로부터의 생리학적 유체 및 샘플, 식품 샘플, 물, 토양 뿐만 아니라 작업 구역, 계산대, 선반, 식품 저장소, 동물 또는 가금류 우리로부터 취해진 샘플, 또는 동물의 피부, 털 또는 표면으로부터의 샘플을 포함한다. 이러한 적용은 인간 질병 상태 시험을 포함한다.
항체는 dGTP아제 항원에 결합함으로써 엔테로박테리아시애 및 그의 종 또는 속의 존재를 검출하기 위한 진단 시험에서 사용될 수 있다. 당업자에 의해 공지된 항체-항원 절차가 본 발명의 항체 및 dGTP아제 폴리펩티드와 함께 사용하기 위해 적합할 수 있다. 본 발명에 의해 계획된 면역분석법은 바람직하게는 본 발명의 바이오센서의 사용을 포함하지만, 다른 항체 제제 및 절차, 예컨대 방사능면역분석법, ELISA 또는 면역형광 분석을 포함한 절차를 사용할 수도 있다. 즉, 예를들어, 본 발명의 dGTP아제 폴리펩티드와 같은 항원을 검출하기 위해 적절한 면역분석법은미국 특허 3,791,932호; 3,817,837호; 3,839,153호; 3,850,752호; 3,850,578호; 3,853,987호; 3,867,517호; 3,879,262호; 3,901,654호; 3,935,074호; 3,984,533호; 3,996,345호; 4,034,074호; 및 4,098,876호에 기재된 것을 포함한다.
하나의 구현양태에서, 본 발명은, 항체가 dGTP아제 폴리펩티드에 결합하기에 충분한 시간동안 충분한 조건하에서 본 발명의 항체를 샘플과 접촉시켜, 항체의 적어도 일부와 dGTP아제 폴리펩티드의 일부 사이에서 2원 착물을 형성하는 것을 포함하는, 엔테로박테리아시애를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 시간, 조건 및 반응 매질은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를들어, 엔테로박테리아시애 세균 세포의 존재를 시험하기 위하여, 샘플의 일부를 배양하고 다른 일부를 용혈시켜 세포 단백질을 포함한 추출물을 수득할 수 있다. 이어서, 예를들어, 여기에 제공된 바이오센서 칩, 또는 웨스턴 블롯, 또는 엔테로박테리아시애 dGTP아제와 함께 검출가능한 착물을 형성할 수 있는 여기에 제공된 항체의 기타 제제를 사용하여, 항-dGTP아제 항체를 단백질 추출물과 함께 배양한다. 예를들어 표지의 결정 또는 검출을 통하여 착물의 존재 또는 양을 결정하거나 검출한다.
임의로, 항체의 첨가에 앞서, 또는 항체를 시험 샘플에 첨가할 때, 또는 비-결합된 항체를 헹구어 낸 후에, 차단제를 사용하여, 원한다면 비-특이적 결합 부위를 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 단백질로 차단할 수 있다. 이어서, 두번째 시약, 예를들어 1차 항체의 Fc에 결합하는 항체를 첨가할 수 있다. 이러한 두번째 배양 후에, 반응되지 않은 항체를 세척에 의해 제거한다. 따라서, 항체, 1차 항체 및 2차 항체의 3원 착물이 형성된다. 2차 항체를 표지화하여 3원 착물의 검출을 수월하게 할 수도 있다. 이러한 표지는 예를들어 형광 염료일 수 있다. 대안적으로, 1차 또는 2차 항체가 검출가능한 표지를 결합할 수도 있다.
이러한 착물의 형성을 검출 또는 측정하는 것은, dGTP아제 폴리펩티드 및 항체, 및/또는 표지, 리포터 분자 또는 기타 검출가능한 잔기에 의해 형성된 착물에 결합할 수 있는 시약을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 항체일 수 있고, 이것은 검출가능한 표지 또는 리포터 분자에 접합된다.
많은 면역분석을 위하여 완전한 원상태의 항체의 사용이 필요한 것은 아니다. 그 대신, 항원 결합 부위 단독이 사용될 수 있거나, 또는 단쇄 재조합 항체가 사용될 수 있다. 이러한 항체 결합 부위의 예는, 각각 당 기술분야에 공지된 바와 같이, 파파인 및 펩신을 사용한 단백질분해에 의해 제조되는 Fab 및 F(ab')2항체로서 당 기술분야에 알려져 있다.
하나의 구현양태에서, DNA 증폭과 연관된 절차에서 본 발명의 dGTP아제 핵산이 사용된다. 이러한 DNA 증폭 절차는 예를들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석, 사슬 치환 증폭 및 기타 증폭 절차에서 사용될 수 있다. 문헌 [Walker 등 (1992) Nucl.Acids Res. 20, 1691-1696]에 기재된 바와 같이 사슬 치환 증폭을 사용할 수 있다. 용어 "폴리머라제 연쇄 반응"("PCR")이란, K.B.Mullis 미국 특허 4,683,195호; 4,683,202호; 및 4,965,188호 (여기에서 참고문헌으로 인용됨)의 방법을 가리킨다. Mullis에 의한 이러한 참고문헌들은, 클론화 또는 정제 없이도, 게놈 또는다른 DNA의 혼합물 중에서 표적 서열의 단편의 농도를 증가시키는 방법을 설명한다.
표적 서열을 증폭시키기 위한 PCR 방법은, 목적하는 표적 서열을 함유한 DNA 혼합물에 과량의 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입한 다음, DNA 폴리머라제의 존재하에서 정확한 순서로 열 순환시키는 것으로 구성된다. 2개의 프라이머들은 이중 가닥 표적 서열의 각각의 사슬에 대해 상보성이다. 증폭을 수행하기 위하여, 혼합물을 변성시키고, 프라이머를 표적 분자 내의 상보성 서열에 어닐링시킨다. 어닐링 후에, 폴리머라제를 사용하여 프라이머를 연장시켜 새로운 쌍의 상보성 가닥을 형성한다. 변성, 프라이머 어닐링 및 폴리머라제 연장 단계를 "주기"라 일컫는다. 다수의 주기가 존재하고, 생성되는 증폭된 DNA의 양은 각 주기에서 증가한다. 따라서, 고 농도의 증폭된 표적 핵산을 수득하기 위하여, 다수의 주기를 수행한다.
PCR 핵산 증폭 방법에 연관된 단계들이 이하에서 더욱 상세히 설명된다. 용이한 언급을 위하여, 증폭되어지는 핵산을 이중-가닥으로 기재한다. 그러나, 최종 생성물이 일반적으로 이중-가닥 DNA이긴 하지만, mRNA와 같은 단일-가닥 핵산을 증폭시키기 위해서도 방법이 동일하게 사용될 수 있다. 단일-가닥 핵산의 증폭에서, 첫번째 단계는 예를들어 2개의 증폭 프라이머 중의 하나를 사용하여 상보성 가닥을 합성하는 것을 포함한다. 이후의 단계들은 일반적으로 다음과 같이 진행된다:
(a) 각각의 핵산 가닥을, 증폭되어지는 각각의 핵산 가닥에 대해 4개의 상이한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 및 1개의 올리고뉴클레오티드 프라이머와접촉시키고, 이때 각각의 프라이머는 증폭되어지는 핵산 가닥의 일부에 대해 실질적으로 상보성이 되도록 선택되며, 그 결과 하나의 프라이머로부터 합성된 연장 생성물이 그의 보체로부터 분리될 때, 다른 프라이머의 연장 생성물의 합성을 위한 주형으로서 작용할 수 있다. 프라이머(들) 및 증폭되어지는 핵산 가닥의 적절한 어닐링을 촉진하기 위하여, 상보성 핵산 가닥에 대해 각각의 프라이머를 하이브리드형성시킬 수 있는 온도가 사용된다.
(b) 프라이머 어닐링 후에, 프라이머에 의해 하이브리드형성된 가닥에 대해 상보성인 성장하는 핵산 가닥 내에, 뉴클레오시드 트리포스페이트를 혼입하는 프라이머 연장을 위하여, DNA 폴리머라제를 사용한다. 일반적으로, 이러한 프라이머 연장 반응은 효소의 활성을 촉진하기 위해 그리고 "전체 길이" 상보성 핵산 가닥을 합성하기 위해 효과적인 온도에서 효과적인 시간동안 수행되며, 완전한 두번째 프라이머 결합을 통해 연장된다. 그러나, 온도는 핵산 주형 가닥으로부터 각각의 연장 생성물을 분리할 정도로 높지 않다.
(c) 상보성 주형으로부터 프라이머 연장 생성물을 분리하기에 충분한 시간동안 충분한 온도에서 단계(b)로부터의 혼합물을 가열한다. 선택된 온도는 혼합물에 존재하는 DNA 폴리머라제를 불가역적으로 변성시킬 정도로 높지 않다.
(d) (c)로부터의 혼합물을, 단계(b)에서 생성된 각각의 단일-가닥 분자에 대한 프라이머의 하이브리드형성을 촉진하기에 효과적인 온도에서 효과적인 시간동안 냉각시킨다.
(e) "전체 길이" 연장 생성물을 생성하기 위해 DNA 폴리머라제에 의해 프라이머 연장을 촉진하기에 충분한 온도에서 충분한 시간동안, 단계(d)로부터의 혼합물을 유지시킨다. 사용되는 온도는 상보성 가닥 주형으로부터 각각의 연장 생성물을 분리하기에 그다지 높지 않다. 원하는 수준의 증폭을 수득할 때까지 단계 (c) 내지 (e)를 반복한다.
본 발명은 또한 샘플 중의 dGTP아제 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하기 위한 시약 및 키트를 포함한다. 하나의 시약 또는 키트는, 의도하는 분석에서 항체의 활성에 악영향을 미치지 않는 액체, 예를들어 염 용액 중에 본 발명의 정제된 항체를 포함할 수 있다. 다른 시약 또는 키트는 의도하는 분석에서 핵산의 하이브리드형성에 악영향을 미치지 않는 액체 중에 본 발명의 단리된 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 시약 또는 키트는 의도하는 분석에서 폴리펩티드의 활성에 악영향을 미치지 않는 액체 중에 본 발명의 단리된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 시약 또는 키트는 상기 언급된 기질에 부착되어진 정제된 항체, 폴리펩티드 또는 핵산을 포함할 수 있다. 바람직한 기질은 불용성 고체 지지체, 예를들어 여기에 기재된 바이오센서 또는 마이크로티터 플레이트의 웰(들)이다.
즉, 본 발명의 구현양태에서, 본 발명은 본 발명의 바이오센서 또는 고체 지지체를 엔테로박테리아시애의 dGPT아제에 결합할 수 있는 부착 항체와 함께 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 대조 샘플을 함유할 수 있다. 대조 샘플은 예를들어 엔테로박테리아시애 dGTP아제의 하나 이상의 샘플을 포함한다. 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 용액, 예를들어 시험 샘플을 희석하고, 시험 샘플을 바이오센서 또는 항체-고체 지지체와 항온처리하고, 결합되지 않은 시험 샘플을 세척해 내기 위한 용액을 또한 함유할 수 있다. 키트는 또한, 샘플과의 접촉 전 또는 접촉 동안에 바이오센서와 접촉되는 차단제를 포함할 수 있다. 바람직한 대조 및 기타 용액은 무균성이고, 결합된 dGTP아제의 검출을 방해할 수 있는 물질을 갖지 않는다.
다른 구현양태에서, 본 발명은 엔테로박테리아시애의 하나 이상의 종을 함유할 수 있는 시험 샘플 내에서 dGTP아제 핵산에 결합할 수 있는 부착된 핵산 프로브와 본 발명의 바이오센서 또는 고체 지지체를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 대조 샘플을 함유할 수 있다. 대조 샘플은 예를들어 하나 이상의 엔테로박테리아시애 dGTP아제 핵산을 포함한다. 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 용액, 예를들어 시험 샘플을 희석하고, 시험 샘플을 바이오센서 또는 고체 지지체와 배양하고, 비결합된 시험 샘플을 세척해내기 위한 용액을 함유할 수 있다. 목적하는 대조 및 기타 용액은 무균성이고, dGTP아제 핵산의 검출을 방해할 수도 있는 물질을 갖지 않는다.
항원-항체 또는 하이브리드형성 착물을 가능하게 하는 표지 또는 리포터 분자가 본 발명의 키트에 또한 제공될 수 있다. 이러한 표지 또는 리포터 분자는 바이오센서, 핵산 또는 항체와는 별도로 포장될 수도 있다.
dGTP아제 핵산을 검출하기 위해 유용한, 본 발명의 하나의 측면을 구현하는 키트 형태의 일례의 진단 체계는, 본 발명의 핵산 프로브, 예를들어 하나 이상의 SEQ ID NO:2-18을 가진 핵산을 함유하는 적어도 하나의 용기 또는 바이알이다.
표지화된 핵산, 폴리펩티드 및 항체
본 발명은 표지화 항체, 표지화 핵산 프로브 및 표지화 dGTP아제 폴리펩티드를 이용한다. 사용될 수 있는 표지는 방사선핵종, 형광 표지, 화학발광 표지, 비색 염료, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 효소 보조단위, 금속 이온, 입자 등을 포함한다. 리포터 분자 또는 표지로서 보통 사용되는 방사능동위원소는32P,125I 및131I를 포함한다. 리포터 분자 또는 표지로서 통상 사용되는 효소는 알칼리성 포스파타제, 고추냉이 퍼옥시다제, 베타-D-갈락토시다제 및 글루코스 옥시다제를 포함한다. 통상 사용되는 형광 리포터 분자 또는 표지는 예를들어 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인, 로다민, 로다민 B 이소티오시아네이트 (RITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 4,4'-디이소티오시아노스틸벤-2,2'-디술폰산(DIDS)와 같은 염료를 포함한다. 예를들어, 미국 특허 3,766,162호; 3,791,932호; 3,817,837호 및 4,233,402호 참조. 다른 통상적으로 사용되는 유형의 표지 또는 리포터 분자는 텍사스 레드, 피코에리트린, 움벨리페론, 루미놀, NADPH 등을 포함한다.
표지의 성질에 의존하여 표지의 존재를 검출하고 정량화하기 위한 다양한 기술이 사용될 수 있다. 형광 표지를 위하여, 다수의 상이한 형광측정계 및 형광 현미경이 이용될 수 있다. 화학발광 표지를 위하여, 광도계 또는 필름이 이용될 수 있다. 형광, 화학발광 또는 착색 생성물을 생성하는 효소는 형광측정방식으로, 발광측정방식으로, 분광측정방식으로 또는 육안으로 검출될 수 있다. 이러한 표지는 여기에 기재된 면역분석 및 하이브리드형성 분석에서 사용될 수 있다.
핵산에 결합된 표지를 제공하기 위한 다양한 수단이 예를들어 문헌 [Leary 등, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) (1983) 80:4045; Renz and Kurz, Nucl.Acid Res. (1984) 12:3435; Richardson and Gumport, Nucl.Acid Res. (1983) 11: 6167; Smith 등, Nucl.Acid Res. (1985) 13:2399] 및 [Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem. (1984) 138:267]에 기록되어 있다. 표지들은 상보성 서열에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합될 수 있다. 즉, 예를들어, 착물 형성 또는 하이브리드형성에 해로운 영향을 미치지 않으면서, 다양한 표지를 카르복시, 티올, 아민, 히드라진 또는 기타 작용기를 통해 항체, 핵산 또는 폴리펩티드에 부착시킬 수 있다.
본 발명은 이하 실시예에 의해 더욱 설명될 것이다.
실시예 1 : 재료 및 방법
일반적 절차
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 모든 세균 균주를 구입하였다. 균주의 ATCC 기탁 번호를 표 5에 기록한다. 세균 생육 조건 및 배양을 밀러(Miller)의 문헌(18)에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다. 단백질 농도는, 소 혈청 알부민(BSA)을 표준으로 사용하여 브래드포드(Bradford)의 방법(9)에 따라 결정되거나, 또는 86,300 M-1cm-1의 계산된 몰 흡수 계수를 사용하여 분광분석법으로 결정되었다(20). 모든 단백질 농도는 dGTP아제 사량체에 대한 것이었다.
세파크릴 S-300을 사용하여 시에겔(Siegel)과 몬티(Monti)의 문헌(21)에 따라서 분석학적 겔 여과 실험을 수행하였다. 래믈리(Raemmli)의 문헌(22)에 따라서, 단백질 SDS PAGE 겔을 형성하고, 주행시키고, 처리하였다.
워글러(Wurgler)와 리차드슨(Richarson)의 문헌(23)에 따라서 단일-가닥 DNA 결합 분석을 수행하였다. 제조업자에 의해 제공된 지시에 따라 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.)로부터의 VENT 서모폴리머라제를 사용하여, DNA의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행하였다. 모든 PCR 반응을 테크네 인코포레이티드(Techne, Inc.)로부터의 프로진 서모사이클러 (ProGene thermocycler)에서 수행하였다.
효소 분석 절차
dGTP가 노리트(Norit) 비-흡수성 PPPi로 가수분해되는 것을 측정함으로써, 세토(Seto) 등(13)에 의해 기재된 것과 유사한 방식으로 효소 분석 절차를 수행하였다. 배양 혼합물은 55㎕의 부피를 가졌으며 2.0mM dGTP; 67mM 글리신, pH 8.5; 6.7mM MgCl2; 및 0.02 내지 0.2 밀리유닛의 효소를 포함하였다. 37℃에서 20분 후에, 노리트 A의 산성 현탁액의 첨가에 의해 반응을 종료하였다. 혼합물을 원심분리하고, 상층액의 분취액을 0.15N HCl에 넣고, 15분간 비등시켰다. 이러한 단계에 의해, 트리폴리포스페이트가 오르소포스페이트로 가수분해된다. 아스코르베이트-몰리브데이트 용액의 첨가에 의해 전체 오르소포스페이트 농도를 비색법에 의해 결정하였다. 45℃에서 15분동안 혼합물을 항온처리한 후에 780nm에서의 흡광도를 결정하였다. 결과를 포스페이트 표준 곡선과 비교하였다. 효소의 1단위는 이러한조건하에서 1 마이크로몰의 트리폴리포스페이트를 형성한다. 50㎍/mL의 m13mp18 DNA를 표준 분석에 첨가함으로써 ssDNA의 자극 효과를 분석하였다.
천연 이.콜리 dGTP아제의 정제
수집 전에, 1% 접종액으로부터 루리아 브로쓰 중에서 세포를 37℃에서 10시간 동안 배양하였다. 전형적으로, 리터 당 4g의 세포를 수득하였다. 10,000×g에서 10분 동안 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고, 10mM 트리스-HCl pH 8.0의 1부피내에 재현탁하였다. 상기 기재된 바와 같이 세포를 재회전시키고, 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA, 1mM 소듐 아지드 (완충액 1)의 2부피 중에 재현탁하였다. 브랜슨(Branson) 소니케이터를 사용하여 얼음 위에서의 초음파처리에 의해 세포를 붕괴시켰다. 12,000×g에서 20분동안 원심분리에 의해 추출물을 정화시키고, 상층액을 분획 I로 명명하였다. 모든 이후의 크로마토그래피 단계를 실온에서 수행하였다.
분획 I을 60℃의 수욕조에서 20분동안 서서히 휘저으면서 가열하였다. 이 기간 동안에, 많은 침전물이 형성되었다. 이러한 가열 처리 후에, 단백질 용액을 빙욕에서 4℃로 즉시 냉각시켰다. 상층액을 매회 15,000× g에서 30분동안 2회 연속 원심분리에 의해 정화시켰다. 두번째 원심분리 단계로부터의 경사분리된 상층액 분획 내의 단백질을 분획 II라 명명하였다.
분획 II를 완충액 I중의 DEAE 세파로스 (시그마 케미칼 컴퍼니)의 4.9cm2× 30cm 컬럼에 적용하였다. 2.0mL/분의 유동 속도에서 0 내지 0.5M KCl의 오목형 구배를 사용하여 컬럼으로부터 효소를 용출시켰다. dGTP아제 활성을 함유하는 주요피크가 0.35M KCl에 집중된 넓은 피크로서 용출되었다. 활성 피크의 중심 90%를 모으고 분획 III을 구성하였다.
완충액 I로 평형화된 단일-가닥 DNA 셀룰로스 컬럼 (4.9cm2×15cm)에 이 물질을 즉시 적용하였다. 부하 후에, 컬럼을 완충액 I의 5배 컬럼 부피로 세척한 다음, 완충액 I, 1.0M KCl의 10배 컬럼 부피 로 세척하였다. 완충액 I, 3.0M KCl의 10배 컬럼 부피를 사용하여 컬럼으로부터 활성 dGTP아제를 용출시켰다. 균질한 효소를 반투과성 막(아미콘 YM3)을 통한 가압 여과에 의해 농축하고, 필요에 따라 새로운 완충액 성분 내로 투석시켰다.
천연 에스.마르세산스(S.marcescens) dGTP아제의 정제
세라티아 배양액으로부터의 효소를 상기 기재된 바와 같이 분획 III으로 제조하였다. 이 효소가 ssDNA에 결합할 수 없기 때문에, 대안적인 정제 방법이 사용되었다. 분획 III을 미리충진된 모노 Q 컬럼(바이오래드 랩스 인코포레이티드, 컬럼 부피 1.0mL) 위에 부하하고, 이것을 완충액 I로 평형화하였다. 3.0mL/분의 유동 속도에서 0 내지 1.0M NaCl 선형 구배로 50mL를 용출시켰다. 구배를 통해 대략 중간쯤에서 컬럼으로부터 기능적 dGTP아제가 용출되었다. 활성 피크의 처음 90%를 모으고, 4℃에서 완충액 I에 대해 투석하고, 분획 IV를 구성하였다.
완충액 I로 평형화된 미리 충진된 모노 S 컬럼(바이오래드 인코포레이티드; 컬럼 부피 1.0mL)에 분획 IV을 적용하였다. 2.0mL/분의 유동 속도에서 0 내지 2.0M KCl의 50mL 오목형 구배를 사용하여 컬럼으로부터 효소를 용출시켰다. 구배의 처음 1/4 동안에 컬럼으로부터 효소가 용출되었다. 활성 피크의 가운데 95%를 모으고 분획 V를 구성하였다.
최종 정제 단계는 분획 V dGTP아제 (이전의 투석 없이)를 완충액 I중에서 90cm×4.9cm2세파크릴 200-HR 크기 배타적 컬럼에 적용하는 것으로 구성되었다. 전체 용출 dGTP아제 피크 (SDS-PAGE에 의해 가시화됨)를 모으고 균질한 분획 VI 효소를 구성하였다. 효소를 반투과성 막(아미콘 YM3)을 통한 가압 여과를 통해 농축하고, 필요에 따라 새로운 완충 성분 내로 투석하였다. 분획 VI 단백질을 사용하여 모든 이후의 조사를 실행하였다.
재조합 효소 발현
pET11d 벡터를 사용하여 노바겐 인코포레이티드로부터의 T7 RNA 폴리머라제 과다-발현 체계에 의해 발현을 수행하였다. 발현 플라스미드 구축물 (이.콜리에 대해 pEdgte 및 에스.마르세산스에 대해 pSdgte)을 함유하는 BL 21(DE3)-pLysS 세포의 1% 접종물을 60mg/mL 암피실린으로 보충된 루리아 브로쓰내에서 37℃에서 배양시켰다. 세포가 0.8의 A595값(대략 3시간의 후 접종)에 이르렀을 때, IPTG를 0.5mM의 최종 농도로 첨가하였다. 수집 전에 세포 생육을 추가로 5시간동안 계속하였다. 효소를 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
다클론성 항체의 생성
에스케리키아 또는 세라티아 dGTP아제에 대하여 항-dGTP아제 다클론성 항체(pAb)를 생성하였다. 프뢴드의 완전 아쥬반트와 1:1 균질화물 상태인 균일한 dGTP아제(300mg)를 암컷 뉴질랜드 화이트 래빗에 피하 주사함으로써, 항 dGTP아제 항체의 중화를 유도하였다. 불완전 아쥬반트와 함께 항원(200mg)을 3회 연속 주사하는 것을 주 간격으로 수행하였다. 마지막 주사 후 1주째에, 귀 카눌라를 통해 토끼를 사혈시켰다. 맑은 혈장을 14,000 ×g에서 원심분리에 의해 수집하고 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
다클론성 항체의 정제
DEAE 어피-겔 블루(Affi-gel Blue) 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 pAbs를 균질상태로 정제하였다. 공급자의 지시에 따라 약간의 작은 변형과 함께, 바이오래드 랩스 인코포레이티드의 토끼 다클론성 항체 단리 키트를 사용하였다. 프로토콜은 다음과 같았다: 깨끗한 토끼 혈청(5mL)을 이코노-팩 10DG 탈염 컬럼 위로 통과시켰다. 공급된 주행 완충액 (0.02M 트리스 HCl (pH 8.0), 0.028M NaCl)을 사용하여 컬럼으로부터 pAbs를 용출시키고, 단일 분획으로서 수집하였다. 브래드포드 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
전체 혈청 샘플(약 25mL)을 5mL 회분으로 컬럼을 통해 통과시켰다. 회분 사이에서, 컬럼을 40mL의 주행 완충액 (2배 컬럼 부피)로 세척하였다. 각각의 컬럼으로부터의 최종 탈염 샘플을 모았다. 모은 샘플을 단일 부하로서 DEAE 어피-겔 블루에 적용하고, 컬럼을 주행하는 완충액의 5배 컬럼 부피(50mL)로 세척하고, 용출 완충액 (0.025M 트리스 HCl(pH 8.0), 0.025M NaCl)의 5배 컬럼 부피를 적용하여 컬럼으로부터 pAb 분획을 용출시켰다. 용출된 물질을 5mL 분획으로서 수집하였다. IgG 분획의 순도를 SDS PAGE에 의해 평가하였다. 적절한 분획을 모으고, 가압 여과에 의해 2mg/mL로 농축하고, 필요할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 주행 완충액 중의 2M NaCl, 1.5M 소듐 티오시아네이트(10배 컬럼 부피)로 컬럼을 세척함으로써 DEAE 어피-겔 블루 컬럼을 재생시킨 다음, 주행-완충액 중에서 다시 평형화시켰다. 모든 크로마토그래피 단계를 위한 유동 속도를 1.0mL/분으로 유지하였다.
ELISA 및 웨스턴 블롯 분석
카이저(Kaiser)와 폴래드(Pollard) (24)에 따라서, 또는 쿼크(Quirk) 등(25)에 따라서 ELISA를 수행하였다. 부분 정제된 단백질 추출물 10㎍ 또는 정제된 dGTP아제 1㎍을 96-웰 마이크로티터 평판 (이뮬론(Immulon) 2, 다이나테크 랩스(Dynatech Labs))의 표면에 흡착시켰다. 웰을 10% 무지방 건조유로 보충된 포스페이트 완충 염수(PBS)로 차단시키고, 차단 완충액 중의 단클론성 항체를 여러 희석비로 첨가하고, 실온에서 1시간동안 항원과 반응시켰다. PBS중에서 3회 세척 후에, 고추냉이 퍼옥시다제(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인코포레이티드)와 접합된 염소 항-토끼 2차 항체를 통해 육안관찰하였다. 2차 항체를 차단 완충액 중에 1:2000 희석비로 첨가하였으며 실온에서 1시간동안 배양하였다. PBS중에서 3회 세척 후에, 50mM 시트르산나트륨, 50mM 시트르산, 1mg/ml o-페닐렌디아민 및 0.006% H2O2를 함유한 용액을 첨가함으로써 색 발현을 달성하였다. 적절한 색 발현 후에 (전형적으로, 실온에서 5 내지 1분 항온처리), 50㎕의 2M 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고 생성물을 안정화하였다. 자동 ELISA 평판 판독기 (몰레큘라 다이나믹스 인코포레이티드(Molecular Dynamics, Inc.))를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. (26)에 따라 웨스턴 블롯을 수행하고, 항체 특이성 및 교차 반응성을 분석하기 위해 이것을 사용하였다.
CNBr 활성화 아가로스에 대한 pAb 풀의 접합
사용 직전에, CNBr 활성화 아가로스 수지 (시그나 케미칼 코포레이션)을 약 200mL의 0.001N HCl 중에서 실온에서 미리 팽윤시켰다. 수지의 결합 능력은 매 10mg의 단백질에 대해 1g 건조 수지였다. 정제된 pAb 풀을 결합 완충액 (0.1M H3BO3, 25mM Na2B4O7, 75mM NaCl, pH8.4)에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다. 수지를 소결된 유리 깔때기에 쏟아붓고, 결합 완충액 (수지 1mL당 약 25mL의 완충액)으로 광범위하게 세척하였다. 필터로부터 수지를 제거하고 pAb 풀과 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 4시간동안 일정하게 서서히 흔들면서 배양한 다음 4℃에서 밤새 배양하였다. 수지를 유리 필터 위에 수집하였다. 결합 수율을 계산하기 위하여(보통 90% 이상) 브래드포드 분석을 통해 저장된 여액 중의 단백질 농도를 결정하였다. 필터로부터 면역친화성 수지를 제거하고, 남아있는 미반응된 CNBr 기를 차단하기 위하여 1M 에탄올아민(pH 8.0) 15ml중에 재현탁시켰다. 실온에서 2시간동안 배양한 후에 (서서히 일정하게 진탕하면서), 수지를 유리 필터 위에 수집하고 붕산염 완충액 (0.1M H3BO3, 25mM Na2B4O7, 1M NaCl; pH 8.4)로 광범위하게 세척 (보통각각 10배 부피)한 다음, 아세테이트 완충액(75mM NaCOOCH3, 1M NaCl)으로 세척하였다. 이 세척 단계로 비-공유결합된 단백질을 제거하였다. 마지막으로, 수지를 결합 완충액으로 세척 (보통 10배 부피)하고, 과량의 트리스 완충 염수(TBS), pH 7.6중에 재현탁하고, 사용시까지 4에서 보관하였다. 이하 기재된 바와 같이 엔테로박테리아시애의 다른 속으로부터 dGTP아제를 정제하기 위하여 면역친화성 수지를 사용하였다.
면역친화성 크로마토그래피에 의한 장내 dGTP아제의 단리
2리터의 밤새 배양액으로부터 장내 dGTP아제를 정제하기 위하여, 20mL의 면역친화성 수지를 사용하였다 (LB 배지 중에서 30℃에서 2시간동안 배양). 이 물질로부터 다음과 같이 조 단백질 추출물을 제조하였다. 세균 세포를 펠릿화하기 위하여 배양액 배지를 6000×g에서 원심분리하였다. 펠릿을 40mL의 30mM 글리신(pH 7.5)중에 재현탁시키고 재원심분리하였다. 최종 펠릿을 10mL의 30mM 글리신(pH 7.5)중에 재현탁시키고, 마이크로팁이 장착된 브랜슨 소니케이터를 사용하여 3회 주기로 초음파처리하였다. 다른 규정이 없는 한 모든 절차를 4℃에서 수행하였다. 초음파처리된 재료를 10,000× g에서 20분동안 원심분리한 다음, 상층액을 경사분리하고 유지시켰다.
조 단백질 추출물을 서서히 휘저으면서 15분동안 60℃로 가열하였다. 이 배양기간 동안, 유백색 침전물이 형성되었다. 10,000 ×g에서 20분동안 원심분리에 의해 물질을 정화시켰다. 상층액을 다시 경사분리하고 유지시켰다. 조 추출물을 0.1부피의 5% 스트렙토마이신 설페이트와 혼합하고, 얼음 위에서 60분동안 항온처리하고, 12,000 ×g에서 20분동안 원심분리하였다. 펠릿을 서서히 혼합 및 교반하면서 2mL의 30mM Kpi (pH 7.5)로 분쇄하고 앞에서와 같이 재원심분리하였다. 최종 상층액을 30mM Kpi (pH 7.5)에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다. 이 물질을 서서히휘저으면서 15분동안 60℃로 가열하고, 10,000 ×g에서 20분동안 원심분리하고, 상층액을 경사분리하였다. 단백질 분획을 친화성 수지 제제와 조합하고, 때때로 휘저으면서 8시간동안 얼음 위에서 항온처리하였다. 슬러리를 컬럼에 쏟아부었다. 컬럼을 50mL의 20mM 글리신 (pH 7.5)으로 세척한 다음, 시간당 10mL의 유량으로 20mL의 20mM 글리신 (pH 7.5), 3M 포타슘 티오시아네이트로 세척하였다. 용출된 단백질을 단일 분획으로서 수집하고, 즉시 반투과성 막(아미콘)을 통한 가압 여과에 의해 0.1mL의 부피로 농축하였다. 최종 샘플을 4℃에서 20mM KPi (pH 7.5)에 대해 광범위하게 투석하였다. 연구를 위해 충분한 물질을 갖기 위하여, 여러 번의 정제를 수행하였다.
바이오센서 칩 설계
바이아코어 인코포레이티드(BiaCore, Inc.)로부터 CM5 비변형 바이오센서 칩(27)을 수득하였다. 이러한 칩은 얇은 금 층으로 코팅된 1cm2석영 결정이었다. 금 층에 카르복시메틸덱스트란의 테더를 부착시켰다. 단백질 결합을 위한 반응성 기를 형성하기 위하여 말단 카르복실 기가 쉽게 변형된다. 연결 반응은 칩 테더의 활성화와 함께 시작되었다. 칩을 25mM 중탄산나트륨(pH 8.5)중의 100mM N-에틸-N'(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 50mM N-히드록시숙신이미드(NHS)의 용액과 5분동안 반응시킨 다음, 100mM 붕산염(pH 8.5)로 짧게 헹구었다. 활성화된 CM5 칩을 80mM 2-(2-피리디닐디티오)에탄아민(PDEA), 0.1M 붕산염(pH 8.5)와 4분동안 항온처리한 다음, 0.1M 붕산염(pH 8.5)중에서 짧게 헹구었다. 이어서, 칩을 0.05mg/mL의 농도로 정제된 pAb를 함유하는 용액(200㎕)과 10분동안 접촉시켰다. 마지막으로, 모든 반응성 디설파이드를 불활성화시키고, 200㎕의 50mM 시스테인, 1M NaCl중에 칩 표면을 10분간 침지시킴으로써 비-공유 결합된 단백질을 제거하였다. 모든 반응을 실온에서 수행하였다. 제조업자의 지시에 따라 바이아코어 표면 플라스몬 장치에서 최종 바이오센서를 사용하였다. 센서 표면 위의 유동 속도는 1분당 50㎕였다.
실시예 2
엔테로박테리아시애 dGTP아제들 사이의 면역학적 관계
단백질을 위한 효소학적 분석과 조합된 정제 항-dGTP아제 다클론성 항체(pAbs)를 사용함으로써, 여러 엔테로박테리아시애 속 중에서 dGTP아제의 면역학적 관계를 시험하였다. 이러한 접근법은 매우 민감하고 dGTP아제 활성에 대해 매우 특이적이다. 표 5는 실시예 1에 기재된 바와 같이 부분 정제된 엔테로박테리아시애의 여러 속으로부터의 dGTP아제의 비활성 및 일반적인 항체 반응성을 제공한다 (분획 II 및 III). 2개의 별개의 항체 제제와의 면역학적 반응성을 관찰하였다: 항-에스케리키아 콜리 dGTP아제 및 항-세라티아 마르세산스 dGTP아제.
세균 유형 비활성 (유닛/mg) pAB 반응성1
세균 종 ATCC No. 분획 II 분획 III 항-E 항-S
세데카 다비자애 33431 1.4 20.0 ++ -
시트로박터 프뢴디이 8090 0.8 15.0 + -
엔테로박터 에어로겐스 13048 0.6 11.0 - +++
에스케리키아 콜리 25257 1.3 27.0 +++ -
에스케리키아 콜리 O157:H7 35150 1.2 25.0 +++ -
에스케리키아 콜리 O111 33780 1.3 26.0 +++ -
에스케리키아 콜리 O124:NM 43893 1.3 25.8 +++ -
에스케리키아 페르구소니이 35469 1.2 26.2 +++ -
하프니아 알베이 29926 0.5 9.0 - ++
크레브시엘라 옥시토카 43165 2.3 20.6 + -
크레브시엘라 뉴모니애 13883 2.2 20.2 + -
프로테우스 미라빌리스 7002 3.1 19.9 - +
프로테우스 불가리스 13315 2.8 18.6 - ++
살모넬라 엔테리티디스 13076 1.5 14.8 ++ -
살모넬라 갈리나룸 9184 1.7 14.2 ++ -
살모넬라 타이피 6539 1.2 14.3 ++ -
살모넬라 타이피뮤리움 14028 1.1 14.0 ++ -
세라티아 마르세산스 8100 1.6 17.3 - +++
세라티아 오도리페라 33077 1.5 17.0 - +++
시겔라 보이디이 9207 2.4 19.7 +++ -
시겔라 디센테리애 13313 2.3 19.0 +++ -
예르시니아 엔테로콜리티카 23715 0.6 8.4 - +++
예르시니아 인터메디아 29909 0.8 9.1 - +++
1.상대 반응성은 항 이.콜리(E) 또는 항 에스.마르세산스(S) dGTP아제 다클론성 항체의 함수로서 효소 활성의 소실에 의해 측정된다.+++는 고 반응성이고; ++는 중간 정도의 반응성이고; +는 약간의 반응성이고; -는 반응성이 없다.
이.콜리로부터의 dGTP아제에 대해 관찰되는 것보다 훨씬 낮은 것에서부터 훨씬 높은 것의 범위에 걸친 효소 비활성이 밝혀졌다. 모든 장내 dGTP아제는 부분 정제 프로토콜에 걸쳐 유사한 분획화 거동을 나타내었으며, 이것은 다양한 dGTP아제들의 많은 물리-화학적 성질이 유사하다는 것을 시사한다. 그러나, 표 5에 나타낸 것과 같이, 각종 dGTP아제의 면역학적 반응성은 동일하지 않았다.
또한, 하나의 유형의 dGTP아제에 대해 증가된 항체는 엔테로박테리아시애 속의 유일한 부분집합으로부터의 dGTP아제의 효소 활성을 억제할 수 있다. 이.콜리또는 에스.마르세산스 효소에 대해 생성된 다클론성 항체를, 다양한 세균 중에서 dGTP아제 활성을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 도 1 내지 도 4에 나타낸 바와 같이, dGTP아제 활성을 억제하기 위한 항체의 능력은 항체를 생성하기 위해 사용되는 항원의 원천에 의존되었다. pAb의 농도에 대한 항체 억제의 의존성을 도 1 내지 도 4에 나타낸다.
도 1은, 와이.엔테로코리티카 (흰색 원), 이.에어로겐스 (검은색 세모), 피.불가리스(흰색 마름모), 케이.옥시토카 (흰색 세모), 에스.타이피뮤리움(흰색 네모), 에스.보이디이(검은색 원) 및 시.다비사애로부터 단리된 dGTP아제의 효소 활성에 대한 이.콜리 dGTP아제 다클론성 항체의 효과를 나타낸다. 효소(분획 III)를 다양한 양의 pAb와 25℃에서 15분동안 배양한 다음, 트리폴리포스페이트의 생성에 대한 방사능 분석을 사용하여 잔류 효소 활성을 측정하였다 (16). 대조 효소 제제(pAb 비첨가)의 % 활성을 임의로 100%로 설정하였다. 3개의 시험된 장내 세균 속, 살모넬라, 시겔라 및 세데카가 항-에스케리키아 pAbs에 의해 효과적으로 억제되었다. 3개의 시험된 속, 프로테우스, 예르시니아 및 엔테로박터는 pAb 제제의 첨가에 의해 억제되지 않았다. 크레브시엘라는 항-에스케리키아 pAbs의 첨가에 의해 억제되었으나, 살모넬라, 시겔라 및 세데카 속에서의 효과의 단지 1/2 정도이다.
dGTP아제의 효소 활성을 억제하기 위한 항-세라티아 마르세산스 dGTP아제 pANs의 능력을 상기와 같이 분석하고 도 2에 나타낸다. 항-세라티아 마르세산스 dGTP아제의 존재하에서 에스.타이피뮤리움 (흰색 네모), 케이.옥시토카(흰색 세모), 에스.보이디(검은색 원), 피.불가리스(흰색 마름모), 와이.엔테로콜리티카 (흰색 원), 에이치.알베이(검은색 마름모), 이.에어로겐스(검은색 세모) 및 에스.마르세산스 (검은색 네모)로부터 단리된 dGTP아제의 효소 활성을 도 2에 나타낸다. 항-세라티아 마르세산스 dGTP아제 pAbs는 크레브시엘라, 살모넬라 또는 시겔라 속의 효소 활성을 상당히 변경시키지 않는다. 그러나, 이러한 항체들은 엔테로박터, 예르시니아의 효소 활성을 억제하는데 효과적이고 더 작은 정도로 프로테우스의 효소 활성을 억제한다. 따라서, pAb의 존재하에서 효소 활성의 손실은 상이한 종으로부터의 dGTP아제의 기능적 관계 또는 교차 반응성에 대한 분석을 제공한다. 또한, 이것은 ELISA 분석에 비하여 민감도가 비교적 빠른 분석이다.
추가의 면역학적 교차 반응성을 도 3에 나타낸 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 2차 항체를 결합된 pAb와 반응시킴으로써, 항-에스케리키아 dGTP아제 pAb와 이.콜리 O157 (검은색 원), 에스.보이디이 (흰색 원), 에스.타이피뮤리움 (검은색 네모), 케이.옥시토카 (검은색 세모). 이.에어로겐스(검은색 마름모), 시.다비자애(흰색 네모), 와이.엔테로콜리티카 (흰색 마름모) 및 시.프뢴디이 (흰색 세모)로부터의 고정화 dGTP아제의 반응성을 관찰하였다. 항-에스케리키아 dGTP아제 pAbs는 시겔라, 세데카, 살모넬라, 클레브시엘라로부터의 효소에 효과적으로 결합되고 더 적은 정도로 시트로박터로부터의 효소에 결합한다. pAb는 또한 다른 에스케리키아 종으로부터의 dGTP아제에 결합한다. ELISA 분석은 엔테로박터 또는 예르시니아 dGTP아제에 대해 반응성을 나타내지 않는다.
ELISA 분석에 의해 각종 dGTP아제에 대한 항-세라티아 dGTP아제 pAb 결합을 도 4에 나타낸다. 에스.타이피뮤리움 (검은색 세모), 이.콜리 (흰색 세모), 에이치.알베이(흰색 네모), 이.에어로겐스(검은색 원), 와이.엔테로콜리티카(흰색 원) 및 피.불가리스(검은색 네모)로부터의 분획 III 효소 제제를 마이크로티터 평판 위에 흡착시키고, 결합된 항-세라티아 dGTP아제 pAbs의 양을 2차 항체로 검출하였다. 항-세라티아 dGTP아제 항체 제제는 엔테로박터, 예르시니아, 프로테우스 및 하프니아로부터의 항원을 효율적으로 검출한다. 살모넬라 및 에스케리키아로부터의 dGTP아제는 항-세라티아 pAbs로 검출되지 않았다. 이러한 ELISA 결과는 도 1 및 2에 나타낸 효소 활성의 손실과 완전히 일치하였으며, 이것을 표 5에 요약한다.
중요하게, 에스케리키아 콜리 및 세라티아 마르세산스로부터의 항체 제제 만을 사용함으로써, 모든 주요 장내 세균 속으로부터 dGTP아제를 검출할 수 있었다. 또한, 이러한 2개의 항체 제제만을 사용함으로써, 검출되는 세균 종류 사이에서 분별이 가능하였다. 이러한 분별은 시험 샘플에 어떠한 세균이 존재하는지를 동정하는데 도움을 줄 수 있다.
9개의 장내 세균으로부터 거의 균질한 dGTP아제 제제를 단리하기 위하여 항-세라티아 또는 항-에스케리키아 면역친화성 컬럼을 사용하였다. 도 5A는 면역친화성 컬럼-정제된 효소의 SDS PAGE 분석을 제공하였다. 9개 종으로부터의 면역정제된 dGTP아제는 dGTP를 데옥시구아노신 및 트리폴리포스페이트로 가수분해할 수 있었다. 이들은 모두 열적으로 안정하였다. 세라티아 dGTP아제를 제외하고는 모든 단리된 dGTP아제들이 단일-가닥 DNA에 결합한다. 그러나, 대부분의 dGTP아제가 사량체이지만, 세라티아 dGTP아제는 이량체이다. 이러한 결과를 표 6에 요약한다.
dGTP아제 안정성 구조 ssDNA 결합
세균 종 Km(μM) kcat(s-1) 65℃에서 t1/2 (분) 4차 구조 Ka(M-1×106) 자극(배)
시.다비자애 7.9 3379 16.8 사량체 5.3 1.5
이.에어로겐스 5.6 3720 23.0 사량체 5.6 1.5
이.콜리 O157:H7 6.2 4032 21.5 사량체 6.3 1.7
이.콜리 6.0 4020 22.0 사량체 6.2 1.6
에이치.알베이 9.1 3655 17.5 사량체 4.7 1.4
케이.뉴모니애 6.0 4002 23.0 사량체 6.0 1.5
피.불가리스 3.7 4112 31.5 사량체 7.1 1.9
에스.엔테리티디스 6.2 3218 23.3 사량체 6.1 1.6
에스.마르세산스 3.0 3975 18.7 이량체 nd* 1.0
와이.엔테로콜리티카 5.8 3982 27.0 사량체 7.0 1.8
* nd, 검출가능한 결합이 아님
도 5B는, 이러한 연구에서 사용되는 항-세라티아 및 항-에스케리키아 dGTP아제 항체가 dGTP아제 효소의 검출을 위해 특이적이며, 조 추출물에서 다른 세균 단백질과 교차 반응하지 않는다는 것을 보여준다. 도 5B에 나타낸 웨스턴 블롯 상에 단지 한개의 띠가 관찰되었으며, 이것은 항-세라티아 pAbs가 단지 세라티아 dGTP아제 만을 검출한다는 것과 항-에스케리키아 pAb가 단지 에스케리키아 dGTP아제 만을 검출한다는 것을 암시한다. 교차-반응성은 관찰되지 않았다. 이러한 관찰은 효소적 연구에 의해 더욱 뒷받침되며, 이 경우에 항-세라티아 pAb가 에스케리키아 dGTP아제에 쉽게 결합하지 못하고, 에스케리키아에 관련된 속으로부터의 dGTP아제의 효소 활성을 억제하지 못하며, 그 반대도 성립된다. 이러한 면역-특이성은 장내 세균 오염을 위한 정확한 진단 시험의 구축을 위해 매우 바람직하다.
실시예 3 : 엔테로박테리아시애의 검출을 위한 바이오센서 칩
장내 dGTP아제의 용이한 검출을 위하여 바이오센서 칩을 형성하고 이용하였다. 실시예 1에 기재된 유도된 티올 결합 방법을 사용하여, 항-에스케리키아 또는 항-세라티아 dGTP아제 pAbs를 부착시킴으로써 CM5 칩의 표면을 변형시켰다. 이러한 바이오센서는 바이아코어 2000 표면 플라스몬 공명(SPR) 장치를 사용하여 장내 dGTP아제를 검출하는데 사용되었다.
이러한 실험의 결과를 도 6 및 도 7에 나타낸다. 도 6은 연결형 항-이.콜리 dGTP아제 pAb와 이.콜리(Ec), 에스.보이디이(Sb), 시.다비시애(Cd), 케이.옥시토카(Ko), 에스.타이피뮤리움 (St), 시.프뢴디이(Cf) 및 이.에어로겐스(Ea)로부터의 조 세균 추출물과의 반응성을 나타내는 표면 플라스몬 공명(SPR) 센소그램을 제공한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 항-이.콜리 dGTP아제 pAbs는 이.콜리(Ec), 에스.보이디이(Sb), 에스.타이피뮤리움(St) 및 시.다비지애(Cd)과 매우 강력하게 반응한다.
도 7은 연결형 항-세라티아 마르세산스 dGTP아제 pAb와 에스.마르세산스(Sm), 이.에어로겐스(Ea), 와이.엔테로콜리티카(Ye), 피.불가리스(Pv), 이.콜리(Ec) 및 에스.타이피뮤리움(St)으로부터의 조 세균 추출물와의 반응성을 나타내는 표면 플라스몬 공명(SPR) 센소그램을 제공한다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 항-세라티아 마르세산스 dGTP아제 pAb는 에스.마르세산스(Sm), 이.에어로겐스(Ea), 와이.엔테로콜리티카(Ye) 및 피.불가리스(Pv)와 매우 강력하게 반응한다.
도 6 및 도 7에 나타낸 센소그램은 결합 등온에 걸쳐 시그날 강도의 ±1%의 표준 편차로 상당히 재현가능하다. 바이오센서 칩은 SPR 시그날의 분해 없이도 10배 이하로 재활용된다.
바이오센서 칩은 모두 조 세균 추출물에서 dGTP아제를 검출하는 능력을 가지며, dGTP아제의 유형들을 구별할 수 있다. SPR 시스템에서 관찰되는 결합 상호작용 친화성은 ELISA 분석을 사용하여 관찰되는 것을 반영한다. 또한, 바이오센서는 센소그램 결합 등온에 의해 나타나는 것과 같이 세균 속을 판별적으로 검출할 수 있다. 그램 포지티브, 비 장내 세균(에스.아루에우스, 도 6에서 Sa로 표시)에 대해 거의 평평한 결합 등온에 의해 증명되는 바와 같이, 검출가능한 배경 결합이 거의 존재하지 않았다 (조 단백질 추출물을 사용하더라도).
시스템내에서 검출 한계를 결정하기 위하여, 상기 사용된 칩을 증가하는 양의 dGTP아제로 적정하였다. 이 실험의 결과를 도 8에 나타낸다. 항-에스케리키아 pAb를 가진 칩은 정제된 이.콜리 dGTP아제의 1pg을 검출할 수 있었다. 항-세라티아 pAb를 가진 바이오센서 칩이 정제된 세라티아 dGTP아제와 반응될 때 유사한 검출 한계가 관찰되었다.
따라서, 여기에 기재된 다클론성 항체 제제는 모두 400초 내에 다른 세균 단백질의 배경 내에서 적은 양의 효소를 특이적으로 검출할 수 있다. 이러한 상이한 반응성은, 엔테로박테리아시애가 착물 시험 샘플에서 관찰될 수 있을 뿐만 아니라 엔테로박테리아시애의 유형을 동정할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4:
엔테로박테리아시애의 PCR 검출 및 동정
본 발명은 샘플 중에 엔테로박테리아시애의 속이 존재하는 지를 동정하고 엔테로박테리아시애를 검출하기 위해 사용될 수 있는 핵산을 제공한다. 이 실시예에서, 본 발명의 검출 및 동정 방법의 특이성 및 민감성을 증명하기 위하여, 일련의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 실험에서 핵산이 사용된다.
이.콜리 유전자의 DNA 서열 (SEQ ID NO:1, 도 9)을 사용하여, 장내 dgt 유전자를 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머를 동정하고 합성하였다 (표 7). 단일 장내 속으로부터 dgt 서열을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 별개의 PCR 프라이머를 동정하고 합성하였다(표 7a 내지 7c). 표 6 및 7a 내지 7c에 나타낸 바와 같이, 표지화된 프라이머 쌍 1 내지 13으로 프라이머를 사용하였다.
장내 dgt 유전자 서열을 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍
쌍 번호 서열 SEQ ID NO: SEQ ID NO:1에서의 위치 증폭된 DNA 길이(bp)
11 CCACTGGAGCGCAATGTGCATCAGGCATGACAT 23 166-181334-350 184184
22 CCACTGGAGCGCAATGAAAATGACCAAACGGCGG 24 166-181364-381 215215
33 GGGCGCTACATCGCTGCATCAGGCATGACAT 53 229-242334-350 121121
44 GGGCGCTACATCGCAATGACCAAACGGCGG 56 229-242364-381 152152
에스케리키아 콜리 dgt 핵산을 특이적으로 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍
쌍 번호 서열 SEQ ID NO: SEQ ID NO:1에서의 위치 증폭된 DNA 길이(bp)
55 GCTGCAGCGTGGCGGCACTCAGGCGTTTCGCCACG 78 461-477656-673 213213
66 CCCGGAAGATGCCGAAACTCAGGCGTTTCGCCACG 98 423-439656-673 251251
77 CCCGGAAGATGCCGAAACGGTTCTTCCCCGTCCC 910 423-439488-504 8282
살모넬라 타이피뮤리움 핵산을 특이적으로 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍
쌍 번호 서열 SEQ ID NO: SEQ ID NO:1에서의 위치 증폭된 DNA 길이(bp)
88 GCTGTGTGGTTTCCTCGAATCCGGCACCGGCCCTC 1112 461-477656-673 213213
99 TCCGGAAGATGCGGAAAAATCCGGCACCGGCCCTC 1312 423-439656-673 251251
1010 TCCGGAAGATGCGGAAAATTTTCTTCACCTTCCT 1314 423-439488-504 8282
크레브시엘라 옥시토카 핵산을 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍
쌍 번호 서열 SEQ ID NO: SEQ ID NO:1에서의 위치 증폭된 DNA 길이(bp)
1111 GCTGCGAAGTGCAGGCCTGGCCGGCGTCTCCTCAG 1516 461-477656-673 213213
1212 GCCCGGCGATGCGCTCGTGGCCGGCGTCTCCTCAG 1716 423-439656-673 251251
1313 GCCCGGCGATGCGCTCGCGATGTCTCTCCGTCAT 1718 423-439488-504 8282
제조업자에 의해 제공된 지시에 따라서, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드로부터의 VENT 서모폴리머라제를 사용하여 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행하였다. 테크네 인코포레이트로부터의 프로진 서모사이클러에서 모든 PCR 반응을 수행하였다. 일반적으로, 에티디움 브로마이드로의 염색에 의해 1.2% 아가로스 겔 상에서 크기 분리한 후에 증폭 생성물이 가시화되었다.
도 10은, 본 발명의 방법이 시험 샘플 중에 10 내지 100개 정도의 엔테로박테리아시애를 검출할 수 있음을 나타낸다. 레인 1에서 약 1000개의 이.콜리 세균, 레인 2에서 약 100개의 이.콜리 세균, 및 레인 3에서 약 10개의 이.콜리 세균으로부터 184bp 단편을 증폭시키기 위해 프라이머 세트 1을 사용하였다. 단지 30회 주기의 PCR 반응을 수행하였다. 레인 3의 띠는 본래의 겔에서만 볼 수 있고, 이 경우 단지 10개 카피의 주형 DNA가 존재하였다.
표 7a 내지 7c에 제공된 프라이머는 나타낸 엔테로박테리아시애 속에 대해 특이적이다. 도 11은 에스케리키아에 대해 특이적인 것으로 표시된 프라이머 세트 5가 단지 에스케리키아로부터 단리된 DNA 만을 증폭시킨다는 것을 예증한다. 주형DNA가 크레브시엘라, 살모넬라, 시겔라 또는 예르시니아로부터 유래된 것일 때 DNA 증폭이 관찰되지 않았다.
또한, 표 7a 내지 7c에 제공된 프라이머는, DNA와 하나 이상의 프라이머 세트의 혼합물이 증폭 반응이 존재할 때라도, DNA 기질들을 여전히 구별할 수 있다. 도 12 및 13에 나타낸 바와 같이, 상이한 길이의 띠가 각각에 의해 증폭되도록 속-특이적 프라이머를 설계하는 것은, 혼합된 배양액에서 특정한 세균 유형의 동정을 수월하게 하는 한 방법이다.
도 12는, 본 발명에 의해 제공된 속-특이적 프라이머가, 상이한 프라이머들이 존재하고 프라이머 결합 및 증폭을 위해 경쟁할 수 있는 조건하에서, 상이한 유형의 엔테로박테리아시애 DNA들을 구별할 수 있음을 나타낸다. 2개 종의 엔테로박테리아시애의 약 200cfu로부터 수득되는 DNA의 혼합물이 증폭되었다. 생성물을 1.2% 아가로스 겔 상에서 분리하고 에티디움 브로마이드로 염색하였다. 샘플에 존재하는 세균 DNA의 종 및 증폭의 특이성을 시험하기 위해 사용되는 프라이머들을 이하에 제공한다.
레인 세균 프라이머 쌍 띠 크기(bp)
1 에스케리키아+크레브시엘라 7 및 11 82(에스케리키아)+213(크레브시엘라)
2 에스케리키아+살모넬라 7 및 8 82(에스케리키아)+213(살모넬라)
3 살모넬라+크레브시엘라 8 및 13 213(살모넬라)+82(크레브시엘라)
4 크레브시엘라+에스케리키아 6 251(에스케리키아)
5 살모넬라+에스케리키아 6 251(에스케리키아)
표 7a 내지 7c에 나타낸 바와 같이, 프라이머 쌍 5, 6 및 7은 에스케리키아에 대해 특이적이 되도록 설계되었고; 프라이머 쌍 8, 9 및 10은 살모넬라에 대해 특이적이 되도록 설계되었고; 프라이머 쌍 11, 12 및 13은 크레브시엘라에 대해 특이적이 되도록 설계되었다. 사용된 각각의 프라이머 쌍들은 실제로 특정한 세균 속에 대해 예측된 크기의 단편을 합성하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 연관된 엔테로박테리아시애로부터의 DNA를 구별하였으며, 세균 속이 혼합된 세균 배양액 중에 존재하는지를 올바르게 동정하였다. 도 12는 혼합된 배양액 중에 세균으로부터 dgt 서열을 증폭시키기 위해 프라이머 세트들을 조합하여 사용할 수 있음을 나타낸다.
다수의 띠들이 가시화될 때 (예를들어 도 12, 레인 1), 동정을 수행하는 것이 수월하다. 마지막으로, 샘플로부터 dgt 유전자 물질을 증폭시키기 위해 PCR 기본 시험을 사용할 수 있다. 도 13은, 다수의 프라이머를 사용하는 일련의 증폭 결과를 나타낸다. 샘플은 시판 닭고기의 밀봉된 포장의 바닥에서 발견된 유체였다. 결과는, 유체가 상당한 양의 장내 세균을 함유하고(레인 1 및 7), 이것이 에스케리키아이고 (레인 2 및 6), 크레브시엘라가 아니며(레인 3), 이것이 살모넬라임(레인 4 및 5)을 명백히 나타낸다. 이 결과는, 각각의 레인에 추가의 띠가 없는 것에 의해 증명되는 바와 같이, PCR 기초 시험이 위조 물질을 증폭시키지 않음을 나타내고, 시험이 혈청 또는 액체 중의 기타 성분에 의해 억제되지 않음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Quirk, S. <120> Detection and identification of enteric bacteria <130> K-C Case 15465 <140> US 09/991,552 <141> 2001-11-21 <160> 36 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1518 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atggcacaga ttgatttccg aaaaaaaata aactggcatc gtcgttaccg ttcaccgcag 60 ggcgttaaaa ccgaacatga gatcctgcgg atcttcgaga gcgatcgcgg gcgtatcatc 120 aactctccgg caattcgtcg tctgcaacaa aagacccagg tttttccact ggagcgcaat 180 gccgccgtgc gcacgcgtct tacccactcg atggaagtcc agcaggtggg gcgctacatc 240 gccaaagaaa ttttaagccg tctgaaagag cttaaattac tggaagcata cggcctggat 300 gaactgaccg gtccctttga aagcattgtt gagatgtcat gcctgatgca cgatatcggc 360 aatccgccgt ttggtcattt tggcgaagcg gcgataaatg actggtttcg ccaacgtttg 420 cacccggaag atgccgaaag ccagcctctg actgacgatc gctgcagcgt ggcggcacta 480 cgtttacggg acggggaaga accgcttaac gagctgcggc gcaagattcg tcaggactta 540 tgtcattttg aggggaatgc acaaggcatt cgcctggtgc atacattgat gcggatgaat 600 ctcacctggg cacaggttgg cggtatttta aaatataccc gtccggcgtg gtggcgtggc 660 gaaacgcctg agacacatca ctatttaatg aaaaagccgg gttattatct ttctgaagaa 720 gcctatattg cccggttgcg taaagaactt aatttggcgc tttacagtcg ttttccatta 780 acgtggatta tggaagctgc cgacgacatc tcctattgtg tggcagacct tgaagatgcg 840 gtagagaaaa gaatatttac cgttgagcag ctttatcatc atttgcacga agcgtggggc 900 cagcatgaga aaggttcgct cttttcgctg gtggttgaaa atgcctggga aaaatcacgc 960 tcaaatagtt taagccgcag tacggaagat cagtttttta tgtatttacg ggtaaacacc 1020 ctaaataaac tggtacccta cgcggcacaa cgatttattg ataatctgcc tgcgattttc 1080 gccggaacgt ttaatcatgc attattggaa gatgccagcg aatgcagcga tcttcttaag 1140 ctatataaaa atgtcgctgt aaaacatgtg tttagccatc cagatgtcga gcggcttgaa 1200 ttgcagggct atcgggtcat tagcggatta ttagagattt atcgtccttt attaagcctg 1260 tcgttatcag actttactga actggtagaa aaagaacggg tgaaacgttt ccctattgaa 1320 tcgcgcttat tccacaaact ctcgacgccg catcggctgg cctatgtcga ggctgtcagt 1380 aaattaccgt cagattctcc tgagtttccg ctatgggaat attattaccg ttgccgcctg 1440 ctgcaggatt atatcagcgg tatgaccgac ctctatgcgt gggatgaata ccgacgtctg 1500 atggccgtag aacaataa 1518 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 2 ccactggagc gcaatg 16 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 3 tgcatcaggc atgacat 17 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 4 aaaatgacca aacggcgg 18 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 5 gggcgctaca tcgc 14 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 6 aatgaccaaa cggcgg 16 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 7 gctgcagcgt ggcggca 17 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 8 ctcaggcgtt tcgccacg 18 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 9 cccggaagat gccgaaa 17 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 10 cggttcttcc ccgtccc 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 11 gctgtgtggt ttcctcg 17 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 12 aatccggcac cggccctc 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 13 tccggaagat gcggaaa 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 14 attttcttca ccttcct 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 15 gctgcgaagt gcaggcc 17 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 16 tggccggcgt ctcctcag 18 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 17 gcccggcgat gcgctcg 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer. <400> 18 cgatgtctct ccgtcat 17 <210> 19 <211> 496 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 19 Met Ala Gln Ile Asp Phe Arg Lys Lys Ile Asn Trp His Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Arg Ser Pro Gln Gly Val Lys Thr Glu His Glu Ile Leu Arg Ile Phe 20 25 30 Glu Ser Asp Arg Gly Arg Ile Ile Asn Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu 35 40 45 Gln Gln Lys Thr Gln Val Phe Pro Leu Glu Arg Asn Ala Ala Val Arg 50 55 60 Thr Arg Leu Thr His Ser Met Glu Val Gln Gln Val Gly Arg Tyr Ile 65 70 75 80 Ala Lys Glu Ile Leu Ser Arg Leu Lys Ser Leu Asn Thr Glu Leu Thr 85 90 95 Gly Pro Phe Glu Ser Ile Val Glu Tyr Ala Cys Leu Met His Asp Ile 100 105 110 Ala Ile Arg Arg Leu Val Ile Leu Ala Lys Arg Thr Ile Asn Asp Trp 115 120 125 Phe Gly Gln Arg Leu His Pro Glu Asp Ala Glu Ser Gln Pro Leu Thr 130 135 140 Asp Arg Cys Ser Val Ala Ala Leu Arg Leu Arg Thr Gly Lys Asn Arg 145 150 155 160 Leu Thr Ser Cys Gly Ala Arg Phe Val Arg Thr Tyr Val Ile Leu Arg 165 170 175 Gly Met His Lys His Ser Pro Gly Ala Tyr Ile Asp Ala Asp Glu Ser 180 185 190 His Leu Gly Thr Gly Trp Arg Tyr Phe Lys Ile Tyr Pro Ser Gly Val 195 200 205 Val Ala Cys Glu Thr Pro Glu Thr His His Tyr Leu Met Lys Lys Pro 210 215 220 Gly Tyr Tyr Leu Ser Glu Glu Ala Tyr Ile Ala Arg Leu Arg Lys Glu 225 230 235 240 Leu Asn Leu Ala Leu Tyr Ser Arg Phe Pro Leu Thr Trp Ile Met Glu 245 250 255 Ala Ala Asp Asp Ile Ser Tyr Cys Val Ala Asp Leu Glu Asp Ala Val 260 265 270 Glu Lys Arg Ile Phe Thr Val Glu Gln Leu Tyr His His Leu His Glu 275 280 285 Ala Trp Gly Gln His Glu Lys Gly Ser Leu Phe Ser Leu Val Val Glu 290 295 300 Asn Ala Trp Glu Lys Ser Arg Ser Asn Ser Leu Ser Arg Ser Thr Glu 305 310 315 320 Asp Gln Phe Phe Met Tyr Leu Arg Val Asn Thr Leu Asn Lys Leu Val 325 330 335 Pro Tyr Ala Ala Gln Arg Phe Ile Asp Asn Leu Pro Ala Ile Phe Ala 340 345 350 Gly Arg Phe Asn His Ala Leu Leu Glu Asp Ala Ser Glu Cys Ser Asp 355 360 365 Leu Leu Lys Leu Tyr Lys Asn Val Ala Val Lys His Val Phe Ser His 370 375 380 Pro Asp Val Glu Arg Leu Glu Leu Gln Gly Tyr Arg Val Ile Ser Gly 385 390 395 400 Leu Leu Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Leu Ser Leu Ser Leu Ser Asp Phe 405 410 415 Thr Glu Leu Val Glu Lys Glu Arg Val Lys Arg Phe Pro Ile Glu Ser 420 425 430 Arg Leu Phe His Lys Leu Ser Thr Pro His Arg Leu Ala Tyr Val Glu 435 440 445 Ala Val Ser Lys Leu Pro Ser Asp Ser Pro Glu Phe Pro Leu Trp Glu 450 455 460 Tyr Tyr Tyr Arg Cys Arg Leu Leu Gln Asp Tyr Ile Ser Gly Met Thr 465 470 475 480 Asp Leu Tyr Ala Trp Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Met Ala Val Glu Gln 485 490 495 <210> 20 <211> 495 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 20 Met Ala Ser Ile Asp Phe Arg Asn Lys Ile Asn Trp His Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Arg Ser Pro Gln Gly Val Lys Thr Glu His Glu Ile Leu Arg Ile Phe 20 25 30 Glu Ser Asp Arg Gly Arg Leu Ile Asn Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu 35 40 45 Gln Gln Lys Thr Gln Val Phe Pro Leu Glu Arg Asn Ala Ala Val Arg 50 55 60 Thr Arg Leu Thr His Ser Met Glu Val Gln Gln Val Gly Arg Tyr Ile 65 70 75 80 Ala Lys Glu Ile Leu Ser Arg Leu Lys Glu Gln Asp Arg Leu Glu Glu 85 90 95 Tyr Gly Leu Asp Ala Leu Thr Gly Pro Phe Glu Ser Ile Val Glu Met 100 105 110 Ala Cys Leu Met His Asp Ile Gly Asn Pro Pro Phe Gly His Phe Gly 115 120 125 Glu Ala Ala Ile Asn Asp Trp Phe Arg Gln Arg Leu His Pro Glu Asp 130 135 140 Ala Glu Ser Gln Pro Leu Thr His Asp Arg Cys Val Val Phe Ser Leu 145 150 155 160 Arg Leu Gln Lys Tyr Val Arg Asp Ile Cys His Leu Lys Ala Cys Thr 165 170 175 Arg Glu Phe Val Cys Thr Ile Arg Ser Cys Gly Gly Ile Leu Thr Trp 180 185 190 Ala Ala Val Arg Pro Asn Phe Lys Asn Ile Pro Val Pro Ala Cys Trp 195 200 205 Pro Arg Gly Arg Ser Arg Ile Pro Ile Arg Tyr Leu Met Lys Lys Pro 210 215 220 Arg Tyr Tyr Leu Ser Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Arg Leu Arg Lys Glu 225 230 235 240 Leu Gln Leu Arg Pro Tyr Ser Arg Phe Pro Leu Thr Trp Ile Met Glu 245 250 255 Ala Ala Asp Asp Ile Ser Tyr Cys Val Ala Asp Leu Glu Asp Ala Val 260 265 270 Glu Lys Arg Ile Phe Ser Val Glu Gln Leu Tyr His His Leu Tyr His 275 280 285 Ala Trp Cys His His Glu Lys Asp Ser Leu Phe Glu Leu Val Val Gly 290 295 300 Asn Ala Trp Glu Lys Ser Arg Ala Asn Thr Leu Ser Arg Ser Thr Glu 305 310 315 320 Asp Gln Phe Phe Met Tyr Leu Arg Val Asn Thr Leu Asn Lys Leu Val 325 330 335 Pro Tyr Ala Gln Arg Phe Ile Asp Asn Leu Pro Gln Ile Phe Ala Gly 340 345 350 Thr Phe Asn Gln Ala Leu Leu Glu Asp Ala Ser Gly Phe Ser Arg Leu 355 360 365 Leu Glu Leu Tyr Lys Asn Val Ala Val Glu His Val Phe Ser His Pro 370 375 380 Asp Val Glu Gln Leu Glu Leu Gln Gly Tyr Arg Val Ile Ser Gly Leu 385 390 395 400 Leu Asp Ile Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Leu Ser Leu Asn Asp Phe Arg 405 410 415 Glu Leu Val Glu Lys Glu Arg Leu Lys Arg Phe Pro Ile Glu Ser Arg 420 425 430 Leu Phe Gln Lys Leu Ser Thr Arg His Arg Leu Ala Tyr Val Glu Val 435 440 445 Val Ser Lys Leu Pro Thr Asp Ser Ala Glu Tyr Pro Val Leu Glu Tyr 450 455 460 Tyr Tyr Arg Cys Arg Leu Ile Gln Asp Tyr Ile Ser Gly Met Thr Asp 465 470 475 480 Leu Tyr Ala Trp Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Met Ala Val Glu Gln 485 490 495 <210> 21 <211> 332 <212> PRT <213> Klebsiella oxytoca <400> 21 Met Ala Lys Ile Asp Phe Arg Asn Lys Ile Asn Trp Arg Arg Arg Phe 1 5 10 15 Arg Ser Pro Pro Arg Val Glu Thr Glu Arg Asp Ile Leu Arg Ile Phe 20 25 30 Glu Ser Asp Arg Gly Arg Ile Val Asn Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu 35 40 45 Gln Gln Lys Thr Gln Val Phe Pro Leu Glu Arg Asn Gly Arg Val Arg 50 55 60 Thr Arg Leu Thr His Ser Leu Glu Val Gln Gln Val Gly Arg Tyr Ile 65 70 75 80 Ala Lys Glu Val Leu Ser Arg Leu Lys Glu Leu Arg Leu Leu Glu Glu 85 90 95 Tyr Gly Leu Glu Glu Leu Thr Gly Pro Phe Glu Ser Val Val Glu Met 100 105 110 Ala Cys Leu Met His Asp Ile Gly Asn Pro Pro Phe Gly His Phe Gly 115 120 125 Glu Ala Ala Ile Asn Asp Trp Phe Arg Gln Arg Leu Ala Pro Gly Asp 130 135 140 Ala Leu Gly Gln Pro Leu Thr Asp Asp Arg Cys Glu Val Gln Ala Leu 145 150 155 160 Arg Leu His Asp Gly Glu Thr Ser Leu Asn Ala Leu Arg Arg Lys Val 165 170 175 Arg Gln Asp Leu Cys Ser Phe Glu Gly Asn Ala Gln Gly Ile Arg Leu 180 185 190 Val His Thr Leu Met Arg Met Asn Leu Thr Trp Ala Gln Val Gly Cys 195 200 205 Ile Leu Lys Tyr Thr Arg Pro Ala Trp Trp Ser Glu Glu Thr Pro Ala 210 215 220 Ser His Ser Tyr Leu Met Lys Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu Ala Glu Glu 225 230 235 240 Glu Tyr Val Ala Arg Leu Arg Lys Glu Leu Asp Leu Ala Pro Tyr Asn 245 250 255 Arg Phe Pro Leu Thr Trp Ile Met Glu Ala Ala Asp Asp Ile Ser Tyr 260 265 270 Cys Val Ala Asp Leu Glu Asp Ala Val Glu Lys Arg Ile Phe Ser Ala 275 280 285 Glu Gln Leu Tyr Gln His Leu Tyr Asp Ala Trp Gly Ser His Val Lys 290 295 300 Arg Ser Arg Tyr Ser Gln Val Val Glu Asn Ala Trp Glu Lys Ser Arg 305 310 315 320 Ala Asn Tyr Leu Lys Gln Ser Ala Glu Asp Gln Phe 325 330 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Salmonella <400> 22 His Pro Asp Glu Ala Glu Ser 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Klebsiella <400> 23 Ala Pro Gly Asp Ala Leu Gly 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Yersinia <400> 24 Asp Pro Asn Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Salmonella <400> 25 Val Val Phe Ser 1 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Escherichia <400> 26 Ser Val Ala Ala 1 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Klebsiella <400> 27 Glu Val Gln Ala 1 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Yersinia <400> 28 Leu Val Asn Thr 1 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Salmonella <400> 29 Gln Glu Gly Glu Glu Asn Leu Asn Asp 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia <400> 30 Arg Asp Gly Glu Glu Pro Leu Asn Glu 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Klebsiella <400> 31 His Asp Gly Glu Thr Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Yersinia <400> 32 Arg Glu Gly Glu Thr Glu Leu Asn Ile 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Salmonella <400> 33 Arg Ser Arg Ile Pro Ile Arg 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Escherichia <400> 34 Glu Thr Pro Glu Thr His His 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Klebsiella <400> 35 Glu Thr Pro Ala Ser His Ser 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Yersinia <400> 36 Asp Ile Pro Thr Ser His Asn 1 5

Claims (40)

  1. SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 포함하는 단리된 핵산.
  2. SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, 또는 SEQ ID NO:18을 포함하고, 엔테로박테리아시애(Enterobacteriaceae) 과의 세균으로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있는, 단리된 핵산.
  3. SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:10을 포함하고, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있는, 단리된 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 엔테로박테리아시애 과의 적어도 하나의 다른 세균 종으로부터의 DNA의 존재하에서, 핵산이 에스케리키아 콜리로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성되는 것인, 단리된 핵산.
  5. 제3항에 있어서, 크레브시엘라(Klebsiella), 살모넬라(Salmonella), 시겔라 (Shigella) 또는 예르시니아(Yersinia)로부터의 DNA의 존재하에서, 핵산이 에스케리키아 콜리로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성되는 것인, 단리된 핵산.
  6. SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14를 포함하고, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhymurium)으로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있는 것인, 단리된 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 엔테로박테리아시애 과의 적어도 하나의 다른 세균 종으로부터의 DNA의 존재하에서, 핵산이 살모넬라 타이피뮤리움으로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성되는 것인, 단리된 핵산.
  8. 제3항에 있어서, 크레브시엘라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서, 핵산이 살모넬라 타이피뮤리움으로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성되는 것인, 단리된 핵산.
  9. SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 포함하고, 크레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성될 수 있는 단리된 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 엔테로박테리아시애 과의 적어도 하나의 다른 세균 종으로부터의 DNA의 존재하에서, 핵산이 크레브시엘라 옥시토카로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성되는 것인, 단리된 핵산.
  11. 제9항에 있어서, 핵산이 살모넬라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 크레브시엘라 옥시토카로부터의 DNA에 대해 선택적으로 하이브리드형성되는 것인, 단리된 핵산.
  12. SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, 또는 SEQ ID NO:18을 포함하는 핵산을 포함한 바이오센서 칩.
  13. 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중의 핵산과 프로브 사이에서 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하며, 상기 프로브가 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17,또는 SEQ ID NO:18을 포함하는 것인, 시험 샘플 중에서 장내 세균의 존재를 검출하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 장내 세균이 엔테로박테리아시애 과의 세균인 방법.
  15. 제13항에 있어서, DNA 증폭을 더욱 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, DNA 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 것인 방법.
  17. 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중에서 핵산과 프로브 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하고, 상기 프로브가 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6을 포함하는 것인, 시험 샘플 중에서 장내 세균 종의 존재를 검출하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 장내 세균이 엔테로박테리아시애 과의 세균인 방법.
  19. 제17항에 있어서, DNA 증폭을 더욱 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, DNA 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 것인 방법.
  21. 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중에서 핵산과 프로브 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하고, 상기 프로브가 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 또는 SEQ ID NO:10을 포함하는 단리된 핵산을 포함하는 것인, 시험 샘플 중에서 에스케리키아의 존재를 검출하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 프로브가 크레브시엘라, 살모넬라, 시겔라 또는 예르시니아로부터의 DNA의 존재하에서 에스케리키아로부터의 DNA에 선택적으로 하이브리드형성되는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, DNA 증폭을 더욱 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, DNA 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 것인 방법.
  25. 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중에서 핵산과 프로브 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하고, 상기 프로브가 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14를 포함한 단리된 핵산을 포함하는 것인, 시험 샘플 중에서 살모넬라의 존재를 검출하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 프로브가 크레브시엘라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 살모넬라 타이피뮤리움으로부터의 DNA에 선택적으로 하이브리드형성되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, DNA 증폭을 더욱 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, DNA 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 것인 방법.
  29. 엄격한 하이브리드형성 조건하에서 시험 샘플을 프로브와 접촉시키고, 시험 샘플 중에서 핵산과 프로브 사이의 하이브리드형성을 검출하는 것을 포함하고, 상기 프로브가 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18을 포함한 단리된 핵산을 포함하는 것인, 시험 샘플 중에서 크레브시엘라의 존재를 검출하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 프로브가 살모넬라 또는 에스케리키아로부터의 DNA의 존재하에서 크레브시엘라 옥시토카로부터의 DNA에 선택적으로 하이브리드형성되는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, DNA 증폭을 더욱 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, DNA 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 것인 방법.
  33. 고체 지지체 및 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제에 결합할 수 있는 항체를 포함한 바이오센서 칩과 시험 샘플을 접촉시키고; dGTP아제가 바이오센서 칩에 결합되었는지의 여부를 검출하는 것을 포함하며; 항체가 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 또는 SEQ ID NO:36을 가진 펩티드에 대해 지시된 것인, 시험 샘플 중에서 장내 세균을 검출하는 방법.
  34. 항체가 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 또는 SEQ ID NO:36을 가진 폴리펩티드에 대해 지시되는 것인, 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제에 선택적으로 결합할 수 있는 단리된 항체.
  35. 항체가 dGTP아제 폴리펩티드에 결합하기에 충분한 조건하에서 충분한 시간 동안 제34항의 단리된 항체를 시험 샘플과 접촉시켜, 항체의 적어도 일부와 dGTP아제 폴리펩티드의 일부 사이에서 2원 착물을 형성하고, 2원 착물을 검출하는 것을 포함하는, 시험 샘플 중에서 엔테로박테리아시애를 검출하는 방법.
  36. 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제를 함유할 수 있는 샘플을, 고체 지지체 부착된 제34항의 항체와 접촉시키고, 고체 지지체를 세척하고, 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제 폴리펩티드를 용출시키는 것을 포함하는, 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제 폴리펩티드를 단리하는 방법.
  37. 고체 지지체 및 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 바이오센서 칩.
  38. 제36항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 또는 SEQ ID NO:36을 가진 폴리펩티드에 대해 지시된 것인 바이오센서 칩.
  39. 고체 지지체 및, 엔테로박테리아시애로부터의 dGTP아제를 코드화하는 핵산에 선택적으로 하이브리드형성될 수 있는 핵산 프로브를 포함하는 바이오센서 칩.
  40. 제38항에 있어서, 프로브가 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18를 포함한 핵산인 바이오센서 칩.
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